Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Особенности изменения морфофункционального состояния эозинофилов при эозинофилиях различного генеза.

На правах рукописи

ЭЛЬКАНОВА АЙШАТ БОРИСОВНА

ОСОБЕННОСТИ ИЗМЕНЕНИЯ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ЭОЗИНОФИЛОВ ПРИ ЭОЗИНОФИЛИЯХ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА

14.03.03 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 У

• Ш 2СН

005549263

Владикавказ - 2014

005549263

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Кавказский федеральный университет» Министерства образования и науки России

Научный руководитель: БОНДАРЬ Татьяна Петровна - доктор медицинских

наук, профессор

Официальные оппоненты: ТРИЗНО Николай Николаевич - доктор медицинских

наук, профессор, заведующий кафедрой патологической физиологии ГБОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

ЩЕТИНИН Евгений Вячеславович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой патологической физиологии ГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский

университет» Минздрава России

Защита состоится «17» июня 2014 года на заседании диссертационного совета Д 208.095.01 в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Осетинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Владикавказ, ул. Пушкинская, 40)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «СевероОсетинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (г. Владикавказ, ул. Пушкинская, 40) и на сайте академии www.sogma.ru

Автореферат разослан «_»_2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Л /

доктор медицинских наук, профессор И.Г. Джиоев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Механизм инфекционно-аллергического воспаления является патогенетической основой многих социально значимых заболеваний современного общества. К ним относятся гельминтозы и аллергические заболевания.

Согласно данным официальной статистике, в нашей стране, аллергическими заболеваниями страдают от 15 до 20% населения. При этом на Северном Кавказе число больных достигает около 18% (Горячкина Л.А., 2011). За последние годы заболеваемость поллинозом у детей увеличилась в пять раз (Базанова Г.А., 2009). Изучение поллинозов приобретает особенно большое значение в связи с увеличивающимися масштабами озеленения городов, а также создания больших зон лесопарков, газонов и бульваров.

Другими, не менее социально значимыми заболеваниями, являются глистные инвазии. По данным крупномасштабных эпидемиологических исследований токсо-кароз является одним из распространенных тканевых гельминтозов. Высокая зараженность почвы яйцами собачей аскариды, теплый влажный климат делает эту проблему актуальной для Ставропольского края (Солдатова М.В., 2007).

Стойкая эозинофилия является постоянным показателем развития как аллергических заболеваний так и инвазирования организма. Изменения в эозинофильных гранулоцитах, возникающие в условиях развития заболевания, выражаются изменениями цитохимического состава клеток и их дегрануляцией (Новицкий В.В., 2006). Необходимо учитывать, что при обычных методах исследования невозможно оценить модификацию поверхности мембраны и оптических характеристик эозинофилов.

В доступной нам научной литературе не найдено четкой информации о зависимости морфофункционального состояния иммунокомпетентной клетки - эозино-фила с развитием и течением эозинофилий различного генеза. Благодаря разнообразию исследований в лабораторной диагностике и внедрению новейших методов, появилась возможность глубокого изучения морфофункциональных особенностей эозинофильных гранулоцитов периферической крови с помощью методов компьютерной морфометрии эозинофилов и сканирующей зондовой микроскопии. В соответствии, с вышеизложенным, исследование количественных, морфометрических, оптических и функциональных особенностей эозинофилов имеет практический и теоретический интерес, что и определило цель и задачи исследования.

Цель исследования: Изучение особенностей изменения морфофункционального состояния эозинофилов при эозинофилиях в зависимости от этиологических

факторов, обусловливающих их патогенное воздействие на организм взрослых и детей.

Задачи исследования:

1. Выявить зависимость активности эозинофилопоэза у взрослых и детей от этиологических факторов, обусловливающих патофизиологический механизм эозинофилий.

2. Изучить морфологическое состояние эозинофильных гранулоцитов у больных амброзийным поллинозом и токсокарозом различных возрастных групп.

3. Выявить закономерности изменения функционального состояния эозинофи-лов у взрослых и детей при инфекционно-аллергических состояниях.

4. Оценить взаимосвязь морфологических и функциональных характеристик эозинофилов периферической крови взрослых и детей при эозинофилиях различного генеза.

5. Установить механизм изменения морфофункциональных свойств эозинофилов в зависимости от степени выраженности эозинофилии.

6. Оценить взаимосвязь морфофункциональных показателей эозинофилов периферической крови у больных с эозинофилиями различного генеза.

7. Определить прогностические критерии развития механизма эозинофилии при атопических и паразитарных заболеваниях.

Научная новизна. Новизна работы подтверждается 1 патентом на изобретение. Полученные данные расширили представления о механизме развития изменений морфофункционального состояния эозинофилов при эозинофилиях различного генеза. Выявлены особенности патофизиологических механизмов развития изменения морфологических, функциональных характеристик эффекторных клеток ин-фекционно-аллергического воспаления - эозинофильных гранулоцитов в зависимости от генеза эозинофилии. Впервые было проведено комплексное изучение морфофункциональных характеристик эозинофилов и выявлена зависимость от этиологических факторов, обусловливающих генез эозинофилии и возрастных особенностей организма. Доказана возможность применения сканирующей зондовой микроскопии в исследовании эозинофильных гранулоцитарных лейкоцитов. Впервые с помощью данного метода микроскопии получены изображения плазматических мембран эозинофилов у лиц, страдающих аллергическими заболеваниями (амбро-зийный поллиноз) и лиц, больных токсокарозом. На основании полученных данных показаны характерные особенности высоты поверхности мембраны клетки в зависимости от цитохимического состава и оптических характеристик эозинофилов у здоровых и больных эозинофилиями различного генеза в разных возрастных группах. Впервые установлена корреляционная зависимость морфофункциональных по-

казателей эозинофильных гранулоцитов при эозинофилиях различного генеза. Впервые с помощью последовательного анализа Вапьда рассчитаны диагностические коэффициенты эозинофильных показателей, имеющие прогностическую значимость выявления инициирующих патогенетических механизмов развития эозинофилии.

Практическая значимость. Полученные результаты расщиряют современные представления о значении морфофункционального состояния эозинофилов периферической крови в формировании противопаразитарного и противоаллергического иммунитета, что может быть использовано для дифференциальной диагностики эозинофилий. Выявлена возможность использования компьютерной цито-морфометрии эозинофилов сканирующей зондовой микроскопии для определения морфофункционального состояния эозинофилов у пациентов больных амброзий-ным поллинозом и токсокарозом. Установлены нормы методов компьютерной ци-томорфометрии и сканирующей зондовой микроскопии для здоровых взрослых и детей. Разработан алгоритм обследования, включающий комплекс, позволяющий устанавливать патофизиологический механизм развития эозинофилии. Полученные данные не только расширяют знания о патогенетических механизмах развития эозинофилий, но и могут быть положены в основу для разработки методов патогенетической терапии. Оценка диагностических коэффициентов дает возможность дифференцировать механизм развития эозинофилии.

Положения, выносимые на защиту. 1. При эозинофилиях различного генеза имеются отличия в морфофункциональном состоянии эозинофилов.Так при атопии (амброзийном поллинозе) определяется усиление эозинофилопоэза, повышение функциональной активности эозинофилов, что определяется уменьшением размеров клетки (снижение средней площади, диаметра клетки, площади цитоплазмы и ядра) и увеличение удельной оптической плотности цитоплазмы. При эозинофилиях, вызванных глистными инвазиями отмечается большое количество клеток с низкой интегральной оптической плотностью и усиление фагоцитарной активнсоти гранулоцитарных лейкоцитов.

2. Независимо от этиологических факторов, обусловливающих механизм развития эозинофилии высота клетки, определяемая методом атомно-силовой микроскопии, увеличивается пропорционально снижению содержания миелопероксидазы и внутриклеточных катионных белков.

3. У больных с «эозинофилией > 500 кл/мкл» выявлены изменения морфофункционального состояния эозинофилов, обусловленные усилением эозинофилопоэза и длительности рециркуляцией эозинофилов.

4. Наиболее значимыми прогностическими критериями, характеризующими звенья патофизиологического механизма развития эозинофилии являются показатели мор-

фофункциональной активности эозинофилов: снижение диаметра клетки (коэффициент Кубальта +6,21), увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения (+5,58), снижение содержания катионных белков (+3,4), снижение содержания мие-лопероксидазы (+2,85) и увеличение высоты клетки (+2,16).

Личный вклад диссертанта. Автором самостоятельно проведен сбор и анализ отечественной и зарубежной литературы по теме диссертации. Диссертантом лично проводились микроскопические и цитохимические исследования, расчет формул, статистическая обработка полученных результатов, их обобщение и написание текста диссертации, подготовлены публикации.

Реализация результатов исследования. Внедрение полученных результатов в практику осуществляется следующими путями:

1. Основные результаты исследований, представленные в диссертации опубликованы в печатных работах, докладывались на международном и междисциплинарном конгрессах, научных и научно-практических конференциях по клинической лабораторной диагностике.

2. Результаты работы используются в диагностическом процессе клинико-диагностических лабораторий города Ставрополя.

3. Результаты работы используются при обучении студентов специальности «Медицинская биохимия» и врачей-интернов по специальности «Клиническая лабораторная диагностика» на кафедре медицинской биохимии, клинической лабораторной диагностики и фармации, ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский Федеральный Университет» (заведующий кафедрой профессор, д.м.н. Т.П. Бондарь).

Апробация диссертации.Материалы работы докладывались и обсуждались на: Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в медицине и физиологии» (Санкт-Петербург, 2010); 55 Научно - практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2010); 56 Научно - практической конференции «Университетская наука - региону» (Ставрополь, 2011); XIX Итоговая научная конференция студентов с международным участием (Ставрополь, 2011); Научно-практическая конференция «Обеспечение доступности современных клинических лабораторных исследований: аналитические возможности, клинические потребности, организационно-экономические условия» (Москва, 2011); VII съезд казахского физиологического общества с международным участием «Современная физиология: от клеточно-молекулярной до интегративной. Основа здоровья и долголетия», посвященного 100-летию академиков АН КАЗССР Н.У. Базановой и Ф.М. Мухамедга-лиева (Алматы, 2011); XVI Форум «Национальные дни лабораторной медицины России - 1021» (Москва, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 6 в рецензируемых журналах перечня ВАК РФ, получен патент №2464559 «Способ оценки морфофункциональной активности эозинофилов при глистной инвазии» от 20.10.2012, в соавторстве с профессором Бондарь Т.П. опубликована монография «Роль эозинофилов в развитии инфекционно-аллергического воспаления», Ставрополь, 2014, 106с.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав с изложением результатов исследования, заключения, выводов, библиографического указателя, включающего 181 наименование (98 отечественных и 83 иностранных источника). Изложена на 133 страницах, содержит 22 таблицы и иллюстрирована 24 рисунками.

Диссертация подготовлена и выполнена в соответствии с Федеральной целевой программой «Развитие научного потенциала Высшей Школы» Министерства образования и науки РФ (2009-2012) «Биохимические и патофизиологические нарушения наноструктуры эозинофильных гранулоцитов при социально значимых болезнях» на кафедре медицинской биохимии, клинической лабораторной диагностики и фармации, ФГАОУ ВПО «Северо-Кавказский Федеральный Университет» (заведующий кафедрой профессор, д.м.н. Т.П. Бондарь).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. Для решения поставленных в исследовании задач в течение 2010-2012 гг. было обследовано 218 человек. Первую группу составили 73 пациента городского аллергологического кабинета с установленным клиническим диагнозом Амброзийный поллиноз. Вторая группа-47 пациентов гельминтологического центра Ставропольской Краевой клинической инфекционной больницы с положительной серологической реакцией крови к токсокарозу и клинически подтвержденным диагнозом Токсокароз, висцеральная форма. Критериями отбора явились установленный диагноз и относительная эозинофилия более 6-7%

Контрольную группу составили 98 добровольцев с сопоставимыми возрастными и половыми характеристиками, не имеющих аллергических заболеваний в анамнезе, специфических антител к антигенам токсокар и нормальным уровнем эозинофилов в периферической крови.

Все пациенты были обследованы при первом обращении за медицинской помощью в специализированное лечебно-профилактическое учреждение до назначения соответствующей терапии (кортикостероидов и других противоаллергических препаратов). Методами кожных проб выявляли сенсибилизацию на цветение сор-

ных трав (лебеда, полынь, амброзия). Исследование проводилось в период цветения причинно-значимых аллергенов (август - сентябрь).

Распределение пациентов по возрасту и полу представлены в таблице 1.

Таблица 1

_Контингент обследованных_

Здоровые (чел) Амброзийный поллиноз(чел) Токсокароз (чел) Всего (чел)

Взрослые мужчины 32 22 10 64

женщины 20 16 16 52

Средний возраст 37,0+2,3 29,0±1,12 44,7±6,1

Дети мальчики 21 18 11 50

девочки 25 17 10 52

Средний возраст 7,4±0,3 9,3+0,5 8,4±1,б

ВСЕГО 98 73 47 218

Методы исследования. Для исследования эозинофильных гранулоцитов, пациентам выполнялись как унифицированные лабораторные методики (гематологические, цитохимические), так и исследования с применением компьютерных технологий. Оценка функционального состояния периферической крови и определение относительного количества эозинофилов проводилась с помощью автоматического гематологического анализа с подсчетом лейкоцитарной формулы. Абсолютное количество эозинофилов рассчитывали по пропорции, исходя из данных лейкоцитарной формулы (Гриншпун, Г.Д., 1983). Рассчитывались эозинофильный индекс (ЭИ) (Островский, В.К., 2003) и индекс аллергизации (ИА) (Островский, В.К., 2003).

Содержание пероксидазы в гранулах эозинофилов периферической крови определяли по методу Грэхэма-Кнолля. Для установления содержания неферментативных катионных белков эозинофильных гранулоцитов использовался метод М.Г. Шубича с бромфеноловым синим (Меньшиков В.В., 1987). Оценка общей функциональной активности гранулоцитарных лейкоцитов определяли методом НСТ-теста (Пол У., 1989). Исследование геометрических и оптических показателей эозинофилов проводили с помощью метода компьютерной цитоморфометрии. Для изучения закономерности изменения структурных свойств мембраны эозинофилов на нано-метровом пространственном разрешении использовался метод сканирующей зондо-вой микроскопии. Статистическую обработку данных лабораторного обследования пациентов проводили с использованием последовательного анализа Вальда, что позволило выделить ряд информативных признаков для предварительного суждения о роли эозинофилов в генезе эозинофилии. С помощью этого метода составлены таблицы диагностически значимых коэффициентов для каждого изученного признака.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Активность эозинофилопоэза у взрослых и детей в зависимости от патофизиологического механизма эозинофилий . С целью изучения различий эозино-фильных показателей периферической крови пациентов разных возрастных групп, страдающих заболеваниями инфекционно-аллергического генеза (токсокароз и ам-брозийный поллиноз), имеющих в крови лейкемоидную реакцию в виде гиперэози-нофилии (критерий отбора для обследования), использовали методы гематологического анализа, визуальной микроскопии мазка с подсчетом процентного соотношения различных пулов лейкоцитов, и последующим расчетом эозинофильного индекса и индекса аллергизации. Статистический анализ полученных результатов иллюстрирует таблица 2.

Таблица 2

Изменения лейкоцитов и эозинофильных показателей гемограммы

(Х±т, р<0,001)

Показатели (Х±т) У/ВС, 109/л Эозинофилы, % Абсолютное, количество эозинофилов, кл/мл Эозинофильный индекс, у.е. Индекс аллергизации, у.е.

Взрослы«

Группа сравнения (п=32) 6,19+0,27 1,94±0,02 114,9±24,2 0,93±0,01 0,75±0,07

Больные с аллергией (п=38) 7,31 ±0,42 10,67±0,48 782,4±86,5 0,65±0,02 2,43±0,12

Больные токсокарозом (п=26) 7,74+0,50 6,77±0,73 611,3±65,3 0,79±0,02 2,02±0,09

Р <0,05 <0,01 <0,001 <0,01 <0,001

Р| <0,1 <0,01 <0,001 <0,01 <0,01

Рз >0,1 <0,001 >0,1 <0,001 <0,005

Дети

Группа сравнения (п=46) 5,74+0,25 3,18+0,38 177,6±23,3 0,86±0,02 2,08±0,15

Больные с аллергией (п=35) 8,42±0,57 11,81±1,00 1028,7±131,6 0,55±0,04 3,22±0,37

Больные токсокарозом (п=21) 10,83±0,61 8,01±0,91 1660,0±109,6 0,74±0,03 237±0,31

Р <0,00! <0,001 <0,001 <0,001 <0,005

Р1 <0,05 <0,01 <0,001 <0,001 >0,1

Р2 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 >0,1

Рз >0,1 <0,001 >0,1 <0,05 <0,001

Р4 >0,1 >0,1 >0,1 >0,05 <0,001

Р5 <0,05 >0,1 <0,001 >0,1 >0,1

Примечание: уровень достоверности внугригрупповых различий показателей: Р- здоровых и больных с аллергией; Р1 -здоровых и больных токсокарозом; Рг -больных с аллергией и больных токсокарозом; уровень достоверности межгрупповых различий показателей: Рз здоровых взрослых и детей; Р4 -больных с аллергией взрослых и детей; Р5 больных токсокарозом взрослых и детей

Как видно из представленной таблицы 2, в периферической крови взрослых пациентов, независимо от генеза эозинофилии, количество лейкоцитов определяется в пределах референтных значений метода, однако выявлено достоверное увеличение данных клеток как при токсокарозе, так и при амброзийном поллинозе по сравнению с результатами, полученными в группе сравнения (р<0,001). Установлено значительное повышение относительного количества эозинофильных грануло-цитов в крови больных инфекционно-аллергическими заболеваниями, при этом эозинофилия аллергического генеза более выражена, чем паразитарного.При подсчете у детей обнаружено, что абсолютное количество эозинофилов значительно выше в группе больных токсокарозом и может быть расценено, как умерено выраженная гиперэозинофилия (1660,0±109,6 кл/мкл). При этом абсолютное содержание эозинофилов в крови взрослых и детей с амброзийным поллинозом является легкой степенью гиперэозинофилии (782,4±86,5кл/мкл и 1028,7±131,6 кл/мкл, соответственно).

Полученные данные подтверждаются значениями эозинофильного индекса, который снижается при нарастании в крови количества эозинофилов. При оценке индекса аллергизации, оказалось, что при амброзийном поллинозе, сопровождающемся более выраженной эозинофилией, индекс аллергизации достоверно выше, чем при токсокарозе (р<0,001).

Аналогичные изменения обнаружены при оценке результатов обследования в группах детей, страдающих заболеваниями, сопровождающимися эозинофилиями. Так в периферической крови детей с амброзийным поллинозом отмечается повышение относительного содержания эозинофилов, снижение эозинофильного индекса и повышение индекса аллергизации с высокой степенью достоверности.

2. Морфологическое состояние эозинофильных гранулоцитов у больных амброзийным поллинозом и токсокарозом различных возрастных групп Комплекс морфометрических параметров является информативным показателем функционального состояния клеточного иммунитета и используется для диагностики характера и степени дисфункции клеточного состава. В этой связи, в данном разделе, нам представляется актуальным с использованием современных цитометрических методов получить сравнительную характеристику эозинофилов периферической крови в группах детей и взрослых пациентов с амброзийным поллинозом и токсокарозом. Результаты статистической оценки представлены в таблице 3.

Таблица 3

Изменения геометрических эозинофильных показателей, полученных

методом компьютерной цитоморфометрии эозинофилов (Х±т, р<0,001)

Показатели (Х±т) Средняя площадь клетки, мкм2 Средняя площадь ядра, мкм2 Средняя площадь цитоплазмы, мкм2 Ядерно-цшоплазма-таческоесо-отаошение,у.е Коэффициент выпуклости ядра, у.е.

Взрослые

Группа сравнения (п=32) 162,8±5,2 52,6±2,9 110,1±4,1 0,55±0,03 0,25±0,02

Больные с аллергией (п=38) 107,0±5,4 42,7±1,8 64,3±2,3 0,9б±0,07 0,15+0,01

Больные токсокарозом (п=2б) 156,9±4,4 55,1±2,1 101,8+3,8 0,70±0,04 0,18±0,02

Р <0,05 <0,01 <0,001 <0,01 <0,001

Р. >0,1 >0,1 >0,1 <0,01 <0,01

Р2 <0,1 <0,001 <0,001 <0,001 >0,1

Дети

Группа сравнения (п=46) 177,5±6,2 57,3±1,5 120,2±4,6 0,49±0,01 0,21 ±0,02

Больные с аллергией (п=35) 91,1 ±7,1 38,1 ±2,2 52,9±2,7 0,97±0,07 0,15+0,01

Больные токсокарозом (п=21) 144,7±10,0 51,8+1,4 92,9±3,1 0,59±0,07 0,17±0,02

Р <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 <0,005

Р1 <0,05 <0,01 <0,001 >0,1 >0,1

Рг <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 >0,1

Рз >0,1 >0,1 >0,1 >0,1 >0,1

Р4 >0,1 >0,1 <0,001 >0,1 >0,1

Р5 >0,1 >0,1 >0,1 >0,1 >0,1

Примечание: уровень достоверности внугригрупповых различий показателей: Р-здоровых и больных с аллергией; Р1 -здоровых и больных токсокарозом; Рг -больных с аллергией и больных токсокарозом; уровень достоверности межгрупповых различий показателей: Рз здоровых взрослых и детей; Р4 -больных с аллергией взрослых и детей; Р5 больных токсокарозом взрослых и детей.

Как видно из таблицы 3, наименьшая площадь наблюдается в группах взрослых пациентов и детей с амброзийным поллинозом (107,0±5,4 и 91,1±7,1 мкм2), изменение размеров клетки происходит за счет снижения площади ядра (42,7+1,8 и 38,1 ±2,2 мкм2) и площади цитоплазмы (64,3±2,3 и 52,9±2,7 мкм2). При этом достоверные различия аналогичных показателей в разных возрастных группах характерны только для показателя средняя площадь цитоплазмы (р<0,001). Расчет ядерно-цитоплазматического соотношения и коэффициента выпуклости ядра показал, что для эозинофилий аллергического генеза характерна однонаправленность и пропорциональность уменьшения геометрических размеров внутриклеточных структур

эозинофильных гранулоцитов, преобладающих в периферической крови пациентов независимо от возраста.

3. Закономерности изменения оптической плотности цитоплазмы эозино-филов в зависимости от генеза эозинофилии и возраста. Для изучения параметров зернистости эозинофилов, применяли распределение гистограммы яркости по объекту с помощью показателя удельной оптической плотности (УОП).

При сравнении значений индекса интегральной оптической плотности отражающего суммарную оптическую плотность по красной (УОПК), зеленой (УОПЗ), и синей (УОПС), компоненте, в группах обследованных отмечается достоверное снижение показателя (р<0,05) во всех группах. Результаты иллюстрированы в таблице 4.

Таблица 4

Оптические эозинофильные показатели (Х±т, р<0,001)_

Показатели (Х±т) Удельная оптическая плотность, у.е. Интегральная оптическая плотность, у.е.

Красный спектр Зеленый спектр Синий спектр

Взрослые

Группа сравнения (п=32) 0,28±0,01 0,50±0,03 0,27±0,01 0,721 ±0,004

Больные с аллергией (п=38) 0,35±0,02 0,54±0,03 0,29±0,02 0,706±0,003

Больные токсокарозом (п=26) 0,28±0,02 0,56±0,04 0,33±0,02 0,б90±0,004

Р <0,05 >0,1 >0,1 <0,001

Р1 >0,1 >0,1 >0,1 <0,001

Рз <0,01 >0,1 >0,1 <0,001

Дети

Группа сравнения (п=46) 0,33±0,01 0,53±0,03 0,31+0,02 0,774±0,008

Больные с аллергией (п=35) 0,40±0,02 0,60±0,04 0,32±0,01 0,725±0,007

Больные токсокарозом (п=21) 0,27±0,02 0,51 ±0,05 0,27±0,03 0,677±0,009

Р <0,001 >0,1 >0,1 <0,001

Р. <0,05 >0,1 >0,1 <0,001

Р2 <0,001 >0,1 >0,1 <0,001

Рз <0,001 >0,1 >0,1 <0,001

Р4 >0,1 >0,1 >0,1 <0,01

Р5 >0,1 >0,1 >0,1 >0,1

Примечание: уровень достоверности внутригрупповых различий показателей: Р-здоровых и больных с аллергией; Р1 -здоровых и больных токсокарозом; Рг -больных с аллергией и больных токсокарозом; уровень достоверности межгрупповых различий показателей: Рз здоровых взрослых и детей; Р4 -больных с аллергией взрослых и детей; Р5 - больных токсокарозом взрослых и детей.

Как видно из таблицы 4 у больных с амброзийным поллинозом, по сравнению со значениями в группах больных токсокарозом и здоровых добровольцев, независимо от возраста наблюдается достоверное увеличение удельной оптической плотности по красному спектру, который характеризует большую интенсивность окраски и количество цитоплазмы в эозинофилах периферической крови.

Известно, что удельная оптическая плотность по зеленой и синей компонентам являются спектральной характеристикой гранул эозинофилов, имеющих красно-оранжевую окраску. При сопоставлении текстурных характеристик эозинофилов в группе больных с аллергическим генезом эозинофилии выявлено повышение УОПзел и УОПсин как у взрослых, так и детей, хотя достоверных различий показателей не наблюдается. При этом в группе взрослых больных с токсокарозом также отмечается тенденция к увеличению спектральных характеристик по синей и зеленой компонентам. Однако в группе детей больных токсокарозом показатели УОПзел и УОПсин снижены, как по сравнению с данными взрослых пациентов, так и здоровых детей из группы сравнения.

4. Взаимосвязь морфологических и функциональных характеристик эозинофилов периферической крови взрослых и детей при эозинофилиях различного генеза. Особенностью эозинофилии инфекционно-аллергической природы является повышение фагоцитарной активности эозинофилов. Основываясь на факте, что обусловливающее значительное усиление цитотоксичности эозинофилов может быть повышение их дегрануляции (Семенкова, E.H., 2004), нами проведено изучение функциональной активности эозинофилов на основании исследования цитохимического состава эозинофилов на присутствие в клетках миелопероксидазы, внутриклеточных катионных протеинов, зависимость высоты профиля мембраны клеток от насыщенности гранул, а также фагоцитарную активнсоть гранулоцитар-ных лейкоцитов. Результаты статистической обработки полученных материалов представлены в таблице 5.

Как видно из таблицы 5 средний цитохимический коэффициент миелопероксидазы для здоровых взрослых и детей несколько различается (2,50±0,10 у.е. и 3,2±0,09 у.е., р<0,001 соответственно). При амброзийном поллинозе значения пе-роксидазы снижаются как у взрослых (2,32±0,08 у.е, р<0,001), так и у детей (2,8+0,07 у.е., р<0,001). В группах больных токсокарозом у взрослых и у детей показатель пероксидазы также снижается (1,97±0,05 у.е. и 1,6±0,06 у.е., р<0,001 соответственно). Внутриклеточные катионные белки (СЦКкб) в группах здоровых взрослых и детей особо не отличаются (2,6±0,13 у.е. и 2,4±0,02 у.е., р<0,001 соответственно). При амброзийном поллинозе количество внутриклеточных катионных белков снижается в группах и взрослых и детей (1,95±0,11 у.е. и 2,1±0,04 у.е., р<0,001 соответственно). Также снижаются они и при токсокарозе (2,2±0,06 у.е. и 2,1±0,03 у.е., р<0,001 соответственно). Анализ данных высоты профиля мембраны эозинофила показал, что в норме у здоровых взрослых и здоровых детей высота клетки примерно одинакова (290±30,0 нм и 230±20,0 нм). При амброзийном поллинозе высота

клетки увеличивается как в группе взрослых так и в группе детей (580±40,0 нм и 490±40,0 нм, соответственно). У больных токсокарозом взрослых и у детях высота клетки также увеличивается (670±50,0 нм и 580±30,0нм, р<0,001 соответственно). Следует отметить, что наиболее яркие изменения наблюдаются при токсокарозе. Определение функциональной активности лейкоцитарных гранулоцитов методом НСТ-теста показал, что максимально повышение показателей отмечается у взрослых и детей больных токсакарозом (74+8,5% и 78±9,2%, соответственно). Достоверных различий этого показателя у взрослых и детей больных амброзийным пол-линозом не установлено.

Таблица 5

Сравнение цитохимических характеристик, фагоцитоза и высоты _профиля мембраны эозинофилов (Х±ш, р<0,001)_

Показатели Пероксидаза Внутрикле- НСТ-тест, Высота про-

(Х±ш) (СЦКп).у.е.2 точные кати- % филя мембра-

онные белки ны эозинофи-

(СЦКкб), у.е. ла *10"9м

Взрослые

Группа сравнения (п=32) 2,50±0,Ю 2,6±0,13 14,1 ±0,3 290,0±30,0

Больные с аллергией (п=38) 2,32±0,08 1,95±0,11 37±3,3 580±40,0

Больные токсокарозом (п=2б) 1,97±0,05 2,2±0,06 74±8,5 670+50,0

Р <0,001 <0,001 <0,001 <0,001

Р1 <0,001 <0,01 <0,001 <0,001

Р2 <0,01 <0,05 >0,1 >0,1

Дети

Группа сравнения(п=46) 3,2±0,09 2,4±0,02 10,3±0,8 230+20,0

Больные с аллергией (п=35) 2,8±0,07 2,1 ±0,04 33±3,0 490±40,0

Больные токсокарозом (п=21) 1,6±0,06 2,1 ±0,03 78±9,2 500±30,0

Р <0,001 <0,001 <0,001 <0,001

Р1 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001

Р2 <0,001 >0,1 >0,1 >0,1

Рз <0,001 >0,1 >0,1 >0,1

Р4 <0,001 >0,1 >0,1 >0,1

Р5 <0,001 >0,1 >0,1 >0,1

Примечание: уровень достоверности внугригрупповых различий показателей: Р-здоровых и больных с аллергией; Р1 -здоровых и больных токсокарозом; Р2 -больных с аллергией и больных токсокарозом; уровень достоверности межгрупповых различий показателей: Рз здоровых взрослых и детей; Р4 -больных с аллергией взрослых и детей; Р5 больных токсокарозом взрослых и детей.

Таким образом, полученные результаты согласуются с данными компьютерной цитоморфомметрии эозинофилов об изменении оптической плотности клеток и являются подтверждением повышенной функциональной активности эозинофилов при формировании противоаллергического и противоглистного иммунитета.

5. Механизм изменения морфофункциональных свойств эозинофилов в зависимости от степени выраженности эозинофилии. Считается, что выраженность патологических изменений, опосредованных эозинофилами зависят не столько от их количества, сколько от их активности (Адаскевич В.П., 2001). В связи этим для изучения свойств эозинофилов высокотехнологическими методами нами выделено четыре группы больных:

I группа - больные амброзийным полинозом («эозинофилия < 500 кл/мкл» -17 человек); II группа - больные амброзийным полинозом(«эозинофилия > 500 кл/мкл» - 56 человек); III группа - больные токсокарозом («эозинофилия < 500 кл/мкл » - 4 человека); IV группа - больные токсокарозом («эозинофилия > 500 кл/мкл» - 23 человека).

Для установления изменения свойств эозинофилов в зависимости от уровня эозинофилии, в ходе исследования обследуемые группы были разделены на подгруппы в зависимости от количества эозинофилов (менее 500 кл/мкл или более 500 кл/мкл), но не зависимо от возраста. Таким образом, в группах обследуемых выявлены частота встречаемости эозинофилии. Так при амброзийном поллинозе количество людей с «эозинофилией>500» составляют - 73%, а при токсокарозе - 49%. Анализ полученных результатов показал, что эозинофильный индекс снижен в группе больных с «эозинофилией > 500 кл/мкл» на 28% по сравнению с группой пациентов с «эозинофилией < 500 кл/мкл». Индекс аллергизации повышен в группах больных с «эозинофилиями > 500 кл/мкл» не зависимо от генеза эозинофилии на 57%.

Таким образом, у больных инфекционно-аллергическими заболеваниями с высокой активностью эозинофилопоэза («эозинофилия > 500 кл/мкл») отмечается достоверные увеличения относительного и абсолютного количества эозинофилов, снижение эозинофильного индекса и увеличение индекса аллергизации.

6. Анализ взаимосвязи морфофункциональных показателей эозинофилов периферической крови с механизмом развития эозинофилии у больных. В рамках настоящего исследования вызывает интерес вероятность взаимосвязи морфофункциональных показателей эозинофилов между собой. Проведенный корреляционный анализ показал, что между высотой клетки и ее геометрическими показателями (средняя площадь клетки, средний диаметр клетки) как в группе больных амброзийным поллинозом, так и в группе больных токсокарозом существует обратно пропорциональная зависимость (г=-0,531 и г=-0,487, р<0,01, соответственно). В то же время в сравнении с оптическими характеристиками эозинофилов, установлена обратная однонаправленная зависимость во всех группах обследуемых. Между индексом интегральной оптической плотности, отражающего текстурную характеристику зернистости эозинофила и количественными и геометрическими показателя-

ми эозинофилов существует как прямая линейная зависимость так и обратная линейная зависимость, в зависимости от генеза эозинофилии.

Активация эозинофилов приводит к снижению плотностных характеристик, за счет выброса из клетки медиаторов, содержащихся в гранулах. Секреция и выделение в повышенном количестве протеинов (СЦКп, СЦКкб), содержащихся в гранулах, способствует набуханию и вакуолизации гранул, а петля позитивной обратной связи способствует нарастанию клеточного объема.

7. Прогностические критерии развития патофизиологического механизма эозинофилии при амброзийном поллинозе и глистной инвазии. В ходе решения поставленных в исследовании задач было установлено, что наблюдаются однотипные реакции изменения активности эозинофилопоэза, рециркуляции эозинофиль-ных гранулоцитов, геометрические и структурные изменения, обусловливающие морфофункциональную активность эозинофилов при эозинофилиях, вызванных различными этиологическими факторами, обусловливающими патогенное влияние на организм обследованных. При этом выявлены достоверные различия выраженности эозинофильных показателей при атопическом и инфекционно-аллергическом механизмах эозинофилий, а также отмечены возрастные особенности реакций. Это побудило к поиску наиболее прогностически значимых показателей цитоморфоло-гического своеобразия эозинофилов в механизме развития Для этого нами использован последовательный статистический анализ Вальда, основанный на теории вероятности, что позволило выделить ряд наиболее информативных признаков для предварительного суждения о значимости роли эозинофилов в генезе эозинофилии (Гублер Е.В., 1978). С помощью этого метода составлены таблицы диагностических коэффициентов для каждого изученного признака (таблица 6).

С помощью методов описательной статистики были установлены достоверные различия многих эозинофильных показателей у больных с амброзийным пол-линозом и токсокарозом, т.е. при эозинофилиях различного генеза. Для сравнения частоты признака и диагностической значимости изучаемых показателей эозинофилов в группах больных амброзийным поллинозом и токсокарозом была проведена статистическая обработка данных и рассчитан соответствующий коэффициент Ку-бальта. Данные иллюстрированы в таблице 6.

Сравнивая полученные результаты, представленные в таблице 6, установлено, что для развития аллергического ответа характерно наличие у эозинофилов следующих признаков: уменьшение среднего диаметра клетки менее 13,94мкм - 6,21; увеличение ядерно-цитоплазматического отношения более 0,47 у.е. - 5,58; повышение фактора формы клетки более 24,86 у.е. - 5,34; уменьшение средней площади клетки менее 161,641 мкм2 - 4,74; снижение средней площади ядра менее 45,87мкм2

- 4,72; увеличение относительного количества эозинофилов более 5% - 4,4; снижение эозинофильного индекса менее 0,8 у.е. - 4,15; увеличение абсолютного количества эозинофилов более 400 клеток на мкл - 3,56; снижение среднего цитохимического коэффициента катионных белков менее 2,6 у.е. - 3,4; повышение индекса ал-лергизации более 2,0 у.е. - 3,14; увеличение удельной плотности красного спектра более 0,34 - 2,95; увеличение среднего цитохимического коэффициента более 2,8 у.е. - 2,85; увеличение высоты профиля мембраны клетки более 400 нм - 2,16. При токсокарозе эозинофилы характеризовались следующими признаками - повышение общего количества лейкоцитов в периферической крови более 10*109/л - -2,07; увеличение удельной оптической плотности по синей компоненте более 0,35 - -2,49.

Таблица 6

Сравнительная частота (Р) и диагностическая значимость (коэффициент Кубальта) показателей эозинофилов в группах больных _амброзийным поллинозом и токсокарозом_

№ п\п Показатель Обследуемые группы Отношение правдоподобия Р1/р2 Прогностический коэффициент Кубальта, 101о§(Р1\Р2)

Аллергия (Р0 (п=73) Токсокароз (Р2)(п=47)

1. Диаметр клетки <13,94мкм 0,949 0,227 4,18 6,21

2. ЯЦО>Ю,47, уе. 0,821 0,227 3,617 5,58

3. ФФ>24,86, у.е. 0,154 0,045 3,422 534

4. Площадь клетки <161,61 мкм2 0,949 0,318 2,984 4,74

5. Площадь ядра <45,87мкм2 0,539 0,182 2,962 4,72

6. Эозинофилы>5% 0,974 0,353 2,759 4,4

7. ЭИ<0,8у.е. 0,923 0,353 2,6 4,15

8. Абсолютное количество Эо>400кл/мкм 1 0,441 2,268 3,56

9. СЦКкб<2,6 у.е. 1 0,455 2,19 3,4

10. ИА>2,0 у.е. 0,667 0,324 2,059 3,14

11. УОПкр>0,34, у.е. 0,539 0,273 1,974 235

12. СЦКп>2,8 у.е. 0,667 0,346 1,93 2.85

13. Высота>400* 10"9м 0,938 0,571 1,643 2,16

14. Лейкоциты>10*109/л 0,128 0,206 0,621 -2,07

15. УОПсин>0,35 у.е. 0,154 0,273 0,564 -2,49

При этом использование прогностических коэффициентов дают возможность

уточнять патогенетический механизм эозинофилий и соответственно выбирать тактику ведения больного и терапию. Результат проведенных исследований позволяют выявить возможную сенсибилизацию к другим аллергенам у заболевшего токсокарозом и наличие глистной инвазии у страдающего амброзийным поллинозом или бронхиальной астмой, вследствие сочетания механизмов развития эозинофилии у конкретного больного

18

ВЫВОДЫ

1. У больных с амброзийным поллинозом и токсокарозом, независимо от возраста отмечаются однотипные изменения активности эозинофилопоэза, выражающиеся увеличением относительного, абсолютного количества эозинофилов и индекса аллергизации, при этом в детском возрасте преобладает инфекционный механизм эозинофилии, что подтверждается достоверным снижением эозинофильного индекса.

2. Независимо от возраста у больных амброзийным поллинозом и токсокарозом по сравнению со здоровыми методом компьютерной цитоморфометрии эозинофилов выявлено снижение площади и диаметра клетки, при этом увеличивается ядер-но-цитоплазматическое соотношение, за счет уменьшения площади цитоплазмы и насыщенности ее гранул, что обусловливает механизмы повышения функциональной активности эозинофильных гранулоцитов в период клинического обострения заболевания, что наиболее выражено у больных токсокарозом.

3. Снижение интегральной оптической плотности подтверждает преобладание низкоплотностных эозинофилов с низким содержанием гранул в цитоплазме эози-нофила. Доминирование низкоплотностных эозинофилов характерно для больных токсокарозом, что доказывает повышенную функциональную активность эозинофилов.

4. Выраженное достоверное (р<0,001) повышение функциональной активности эозинофилов наблюдается у детей с эозинофилией как при амброзийном поллинозе, так и при токсокарозе. Однако, у больных токсокарозом отмечено наиболее выраженное снижение содержания пероксидазы в гранулах клетки, и следовательно повышенная фагоцитарная активность.

5. У больных амброзийным поллинозом с высокой активностью эозинофилопоэза, «эозинофилия>500 кл/мкл» встречается чаще, характеризуется достоверным снижением содержания катионных белков в цитоплазме, снижением площади клетки и цитоплазмы. У больных токсокарозом с«эозинофилией>500 кл/мкл» отмечается достоверное снижение пероксидазы в гранулах эозинофилов и увеличение высоты клетки.

6. Методом корреляционного анализа установлено, что между размерами клетки и ее клеточными ферментами имеется обратная линейная зависимость. Так при увеличении высоты клетки, содержание пероксидазы в гранулах снижается. При этом фагоцитарная активность клеток повышается.

7. При амброзийном поллинозе наиболее значимыми эозинофильными признаками являются: снижение диаметра клетки, увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения, снижение содержания пероксидазы в гранулах и катионных белков в цитоплазме эозинофилов, повышение индекса аллергизации, увеличение высоты клетки. При токсокарозе - увеличение удельной оптической плотность клетки по синей компоненте, общее количество лейкоцитов периферической крови.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Эльканова, А.Б. Изменения морфофункционального состояния эозинофилов при эозинофилиях различного генеза / М.И. Неткачева, А.Б. Эльканова // XI Международный конгресс «Здоровье и образование в XXI веке» «Научные и прикладные аспекты концепции здоровья и здорового образа жизни». - Москва, 2010 с.483-484.

2. Использование атомно-силовой микроскопии для изучения морфофункционального состояния эозинофилов у больных токсокарозом / Т. П. Бондарь, Н.М. Ишкова, Е.А. Мельченко, А.Б. Эльканова // Медицинский вестник Северного Кавказа №4 (20) Ставрополь, 2010, с.51-55

З.Эльканова, А.Б. Особенности морфофункционального состояния эозинофилов при эозинофилиях различного генеза / М.И. Неткачева, А.Б. Эльканова // Сборник трудов первой международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в медицине и физиологии» г. Санкт-Петербург, 2010 с.382-385

4. Неткачева М.И. . Функциональное состояние гранулоцитарных эозинофилов у больных с аллергическими заболеваниями / М. И. Неткачева, А.Б. Эльканова, // Сборник статей второй международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в медицине и физиологии» г. Санкт-Петербург, 2011 с.371-373

5. Бондарь, Т.П. Особенности компьютерной морфометрии эозинофилов при аллергических заболеваниях верхних дыхательных путей // Т.П. Бондарь, А.Б. Эльканова // Биоразнобразие, биоресурсы, новые материалы и здоровье население региона Материалы 56-ой научно-методической конференции «Университетская наука-региону». Ставрополь, Изд-во СГУ, 2011. с.33-35

6. Неткачева, М.И. Изменение морфофункционального состояния гранулоци-тарных эозинофилов при аллергических заболеваниях верхних дыхательных путей. / М.И. Неткачева, А.Б. Эльканова // Сборник тезисов XIX итоговая научная конференция студентов с международным участием Ставрополь, 2011г. С.185-186.

7. Бондарь, Т.П. Изучение денситометрических характеристик эозинофилов периферической крови при заболеваниях инфекционно-аллергической природы./ Т. П. Бондарь, Н.М. Ишкова, А.Б. Эльканова // Вестник Ставропольского государственного университета. Выпуск 74 (3), Ставрополь, 2011, с.5-14

8. Бондарь, Т.П. Результаты компьютерной цитоморфометрии эозинофилов у детей с амброзийным поллинозомУ Т. П. Бондарь, А.Б. Эльканова // Клиническая лабораторная диагностика №9, 2011, М.: Изд. Медицина, с.30.

9. Бондарь, Т.П. Состояние эозинофильного ответа при амброзийном полли-нозе у детей / Т.П. Бондарь, А. Б. Эльканова // VII съезд казахского физиологического общества с международным участием «Современная физиология: от клеточ-но-молекулярной до интегративной. Основа здоровья и долголетия», посвященного 100-летию академиков АН КАЗССР Н.У. Базановой и Ф.М. Мухамедгалиева. Алма-ты: Изд.: Казнау, 2011, с.26-27

10. Бондарь. Т.П. Использование сканирующей зондовой микроскопии эозинофилов в диагностике эозинофилии инфекционно-аллергического генеза / Т.П. Бондарь, А. Б. Эльканова, Е.А. Мельченко // Клиническая лабораторная диагностика №9,2012, М.: Изд. Медицина, с.30

11. Эльканова А.Б. Зависимость стереометрических характеристик эозинофилов от степени их цитотоксичности при эозинофилиях различного генеза / Т.П. Бондарь, ЕЛ Ракитина, А. Б. Эльканова // Электронный журнал «Современные проблемы науки и образования», 2012. www.science-education.ru. ISSN-1817-6321

12. Эльканова А.Б. Взаимосвязь между геометрическими и цитохимическими показателями эозинофилов у больных с амброзийным поллинозом / Т.П. Бондарь, А.Б. Эльканова, Н.М. Ишкова // Клиническая лабораторная диагностика № 9 2013, М.: Изд. Медицина, с. 36

13. Эльканова А.Б. Оценка значимости признаков структурных изменений эозинофилов при эозинофилиях различного генеза / А.Б. Эльканова // Биоразнобра-зие, биоресурсы, новые материалы и здоровье население Северо-Кавказского реги-

она. Материалы 1-ой научно-методической конференции «Университетская наука — региону». Ставрополь, Изд-во СКФУ, 2013. с.147-152

14. Патент №2464559 от 20.10.2012. «Способ оценки морфофункциональной активности эозинофилов при глистной инвазии» Т.П. Бондарь, Н.М. Ишкова, А. Б. Эльканова

16. Монография «Роль эозинофилов в развитии инфекционно-аллергического воспаления», г.Ставрополь, 2014,106с.

Список сокращений

ИА - индекс аллергизации ИЛ - интерлейкин

ИОП - интегральная оптическая плотность

КЦМЭо - компьютерная цитоморфометрия эозинофилов

СЗМ - сканирующая зондовая микроскопия

СЦКкб - средний цитохимический коэффициент катионных белков

СЦКп - средний цитохимический коэффициент пероксидазы

УОП - удельная оптическая плотность

ЭИ - эозинофильный индекс

ЯЦС - ядерно-цитоплазматическое соотношение

\УВС - лейкоциты

Информационно-технический отдел

ГБОУ ВПО СОГМА Минздрава России Подписано в печать 17.04.2014 г. Тираж 100 Формат издания 60 х 90 усл.печ.л. 1,0 Заказ № 7