Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Строение цитоскелета клеток нефрона позвоночных животных и человека

2 ц ФЕВ В97

На правах рукописи УДК 591.461.3:577.112.083:576.311.348.37/7

ЗАЙЦЕВ ВАЛЕРИЙ БОРИСОВИЧ

СТРОЕНИЕ ЦИТОСКЕЛЕТА КЛЕТОК НЕФРОНА ПОЗВОНОЧНЫХ ЖИВОТНЫХ И ЧЕЛОВЕКА

14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Москва -1997

Работа выполнена в Мурманском морском биологическом институте Кольского научного центра РАН

Научный консультант - академик РАН Ю.В.Наточин

Официальные оппоненты: - заслуженный деятель науки РФ,

академик РАМН В.В.Серов

- заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Н.А.Юрина

- доктор медицинских наук, профессор В.В.Банин

Ведущая органицация - НИИ морфологии человека РАМН

Защита состоится "_"_1997 г. в часов н

заседании диссертационного совета Д 084.14.04 при Российски государственном медицинском университете по адресу: 117869, Москва, ух Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ.

Автореферат разослан" 1997

г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор А.Н.Тихомиро]

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Важнейшим направлением в развитии биологии петки на современном этапе является исследование цитоскелета - комплекса ниверсальных, динамичных и гетерогенных филаментных систем эукариотических гсеток с локализацией их в цитоплазме (микротрубочки, промежуточные филаменты микрофиламенты), внутренней ядерной (ламин) и плазматической (сеть 1ектриноподобного белка) мембранах.

Цитоскелет активно участвует в процессах развития, поддержания и зменения формы клеток, морфогенезе, митозе, цитокинезе, эндо- и экзоцитозе, окализации и закреплении ядра с обеспечением ядерно-плазмалеммальных связей, бразовании специализированных клеточных структур (ресничек, микроворсинок и ежклеточных контактов), осуществлении механической интеграции и транспорта нутриклегочных компонентов, генерации и стабилизации клеточной полярности.

Исследования структуры цитоскелета эукариотических клеток наиболее нтенсивно проводятся в последние 15-20 лет. К настоящему времени в литературе редставлены как обзорные работы (Lazarides, 1982; Osborn et al., 1982; Банников, 984; Гельфанд, Розенблат, 1984; Fulton, 1984; Traub, 1985; Bershadsky, Vasiliev, 1987; рояновский, 1987; Small, 1988; Steinert, Roop, 1988; Поглазов, Бурнашева, 1989; jrschner, 1989; Drenckhahn, 1990; Georgatos, 1993), так и оригинальные сследования по структуре цитоскелета в клетках различных органов и тканей иологических объектов (Duden et al., 1990; Feltkamp et al., 1990; Fuhrmann et al., 990; Gottlieb et al., 1993; Bums, 1995) , включая клетки почек животных и человека >ров, Пауков, 1975; Бершадский и др. 1979; Andrews, 1981, 1988; Andrews, offey, 1983; Серов, 1984; Drenckhahn, Franke, 1988; Свиткина, 1989; Franke, »renckhahn, 1989; Нога et al., 1990; Daniels, 1993; Lafont et al., 1994). Вместе с тем, в итературе отсутствуют данные по широкому сравнительно-морфологическому яализу строения цитоскелета клеток нефрона позвоночных (Наточин, 1994).

Почки являются одним из наиболее полифункциональных органов (осмо-злюмо- и ионная регуляция, поддержание кислотно-основного равновесия, секреторные и инкреторные процессы), но вся их деятельность подчинена одной ели - стабилизации постоянства объема и состава жидкостей внутренней среды рганизма. Принимая во внимание важное значение цитоскелета для г'кариотических клеток, исследование структурных особенностей цитоскелетных 1ементов в клетках нефрона у представителей различных классов и экологических эупп позвоночных позволяет определить основные принципы становления и азвития цитоскелета исследуемых клеток, как в пределах отдельных классов эзвоночных , так и типа в целом. В то же время изучение цитоскелетных основ эстроения клеток нефрона способствует глубокому пониманию закономерностей ггуляторных механизмов почечной функции на ультраструктурном уровне. Данные роли цитоскелета в функционировании клеток нефрона особенно актуальны при зссмотрении принципов эволюции специализированных почечных клеток у эзвоночных.

Настоящая работа является составной частью планов НИР Мурманског морского биологического института КНЦ РАН, но выполнялась также в рамка Всесоюзного Координационного плана НИР по направлению "Физиологи висцеральных систем" (раздел 2.3.6.2. "Функциональная морфология и биохими почки") на 1986-1990 гг.; Всесоюзной Программы "Функциональная организаци системы регуляции водно-солевого гомеостаза", утвержденной Отделение; физиологии Академии наук на 1991-1995 гг.; Координационного тематическог плана Научного совета по геронтологии и гериатрии АМН СССР и проблемно комиссии "Биологические основы старения" Научного совета АН СССР и AMI СССР по физиологии человека на 1991-1995 гг.

Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в изучении сравнительном морфологическом анализе характерных особенностей строени цитоскелега клеток нефрона у различных позвоночных животных и человека. Цел исследования определила ряд конкретных задач:

- установить закономерности в строении цитоскелета гломерулярных клеток нефрона у представителей основных классов позвоночных животных и человека;

- изучить строение цитоскелета гломерулярных клеток нефрона в зависимости от возраста у отдельных видов животных и человека;

- определить и дать цитоскелетную характеристику основным специализированным образованиям клеток почечных канальцев позвоночных;

- выявить белковый состав цитоскелетных структур в клетках нефрона;

- на ультраструктурном уровне локализовать возможные энергетические источники функционирования цитоскелета клеток нефрона позвоночных.

Научная новизна. Проведенные исследования позволили впервые:

- показать, что в цитоскслсте подоцитов у представителей позвоночных от круглоротых до млекопитающих прослеживается тенденция к замещению системы промежуточных филаментов системой микротрубочек;

- установить, что в процессе индивидуального развития и старения в почках высших животных и человека происходят морфофизиологические изменения, вызывающие перестройку цитоскелета подоцитов, которая сопровождается интенсивным развитием системы промежуточных филаментов с одновременным уменьшением количества микротрубочек и микрофиламентов;

- показать, что функциональное состояние главного селективного барьера в процессах почечной ультрафильтрации, состоящего из комплекса фильтрационных щелей и щелевых диафрагм, определяется размерами и формой отростков подоцитов, изменяющихся под воздействием цитоскелета, представленных у низших позвоночных и рептилий промежуточными филаментами, а у птиц и млекопитающих микрофиламентами;

постулировать существование в почечных гломерулах позвоночных животных и человека двух популяций подоцитов, отличающихся по топографии и функциональному назначению;

установить, что подоциты низших позвоночных занимают промежуточное положение между истинными эпителиальными (по наличию десмосом) и эпителиоидными (по содержанию виментина) клетками; обнаружить, что плазмалемма подоцитов и их отростков представляет домен, где протекают процессы гликолитического фосфорилирования, в ходе которых генерируются молекулы АТФ, необходимые для энергетического обеспечения эффективного функционирования цитоскелета подоцитов; установить, что цитоскелет клеток гломерулярного эндотелия определяет морфологические параметры эндотелиальных фенестр, а цитоскелет мезангиальных клеток имеет развитую систему микротрубочек; показать, что действие цитоскелета клеток фильтрационного барьера дополняет основные физико-химические силы, управляющие переносом жидкости и растворенных веществ через гломерулярный фильтр; считать терминальную сеть клеток эпителия почечных канальцев аналогом цитоскелета, сформированного цитокератиновыми промежуточными филаментами и микрофиламентами межклеточных контактов, корешками стержневых актиновых пучков микроворсинок, а в ресничных клетках -корешками базального аппарата ресничек.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований первые охарактеризовали эволюцию цитоскелета клеток нефрона у позвоночных, [олучениые данные могут явиться основой для проведения дальнейших исследований области сравнительной морфологии цитоскелета в различных эукариотических четках. Результаты работы можно использовать в учебном процессе на кафедрах иологии и гистологии медицинских вузов и в других институтах биологического рофиля. Установленные возрастные изменения цитоскелета подоцитов человека тедует учитывать при дифференциальной диагностике заболеваний почек, езультаты работы используются в исследовательской работе ряда учреждений: Ькевской государственной медицинской академии, Самарского государственного едицинского университета, С.-Петербургского университета, НИИ питания РАМН, [нститута биологии Карельского научного центра РАН и др.

Апробация работы. Основные положения диссертации докладывались и бсуждались на рабочем совещании "Теоретические и математические аспекты орфогенеза", Суздаль, 1983; IV Всесоюзном совещании "Немышечные формы одвижности", Чернигов, 1984; I Всесоюзной конференции по проблемам эволюции, 1осхва, 1985; VII Всесоюзной конференции по физиологии почек и водно-солевого эмена, Чернигов, 1985; Всесоюзном симпозиуме "Современные методы электронной икроскопии в биологии и медицине" Звенигород, 1986; V Всесоюзном совещании по гмышечным формам подвижности, Чернигов, 1988; IV Всесоюзной конференции по иологии клетки, Москва, 1987; IV Всесоюзной конфереции по раннему онтогенезу

рыб, Мурманск, 1988; III Всесоюзном совещании по лососевидным рыбам, Тольятти 1988; II Всесоюзной конференции "Экология, биологическая продуктивность i проблемы марикультуры Баренцева моря", Мурманск, 1988; XIII Всесоюзно] конференции по электронной микроскопии, Звенигород, 1988; Международно! симпозиуме "Эволюционная биология. Теория и практика", Пльзень, Чехословакия Международном конгрессе по биологии клетки, Монреаль, Канада, 1988; ) Юбилейном конгрессе по анатомии, гистологии и эмбриологии, Стара Загора Болгария, 1989; IX Международной конференции по эволюционной биологии, Прага Чехословакия, 1989; VIII Всесоюзной конференции по физиологии почек и водно солевого обмена, Харьков, 1989; Всесоюзной конференции по физиологии морски организмов, Мурманск, 1989; X Всесоюзном совещании по эволюционно: физиологии памяти акад. Л.А.Орбели, Ленинград, 1990; I Мировом конгрессе го клеточной и молекулярной биологии, Париж, Франция, 1991; XIV Конференция го электронной микроскопии, Черноголовка, 1992,; IX Международном конгерессе п< гистохимиии и цитохимии, Маастрихт, Нидерланды, 1992; V Международно! конгрессе по клеточной биологии, Мадрид, Испания, 1992; X Европейском конгресс по электронной микроскопии, Гранада, Испания, 1992; XIII Международно! конгрессе по электронной микроскопии, Париж, Франция, 1994; Симпозиум "Физиология почек и водно-солевого обмена", посвященного 100-летш А.Г.Гинецинского, Новосибирск, 1995; Международной конференции "Современно состояние и перспективы исследований Баренцева, Карского морей и мор Лаптевых", Мурманск, 1995; 1(Х1) Международном совещании и школе п эволюционной физиологии, С.-Петербург, 1996; XI европейском конгрессе п электронной микроскопии, Дублин, Ирландия, 1996; XVI Российской конференции п электронной микроскопии, Черноголовка, 1996..

Публикации. По теме диссертации опубликовано 49 научных работ, в toi числе 20 в центральных и зарубежных журналах, 25 в трудах различных конгрессов конференций.

Объем и структура работы. Диссертацию составляют два тома. Первый то; включает 232 страницы машинописного текста и состоит из введения, 6 mai заключения, выводов, списка основных публикаций по теме диссертации и указател литературы, включающего 121 отечественных н 737 зарубежных авторов, трет источников представлено за последние десять лет. Второй том включает условны обозначения, 7 схем и 116 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Цитоскелет клеток и его организация в системе нефрона позвоночных.

Цнтоскелет эукариотических клеток составляют три главных компонента михротрубочки (диаметром 24-25 нм), промежуточные филаменты (диаметром 8-1 нм) и микрофиламенты (диаметром 6-7 нм). Эти структуры объединены в клетке трехмерную организацию посредством сети недавно открытых новых типо цитоскелетных элементов - ультратонких (диаметром 2-5 нм) филаментов (Tzukitî

983; Roberts, 1987). Однако нельзя исключить, что этот новый тип филаментов вляется аналогом микротрабекул, отмечаемых ранее в литературе (Wolosewick, orter, 1976), и вопрос о реальном существовании которых остается спорным Wolosewick, Porter, 1979).

Микротрубочки впервые описал в 1963 году Слаутгербак (Slautterback, 1963) в итоплазме клеток гидры. Они имеют вид полых цилиндров диаметром 25 нм со генкой толщиной около 5 нм и сердцевиной около 15 нм в поперечнике. Они бразованы белком тубулином, имеющим несколько форм (альфа, бэта, дельта и 1силон) (Mac Rae, 1992; Burns, 1995). Субъединицы тубулина формируют стенку икротрубочек и состоят из параллельных рядов протофиламентов (Kamimura, landelkow, 1992). При сканирующей туннельной микроскопии в стенке икротрубочек выявляются длинные ряды субъединиц с периодичностью 3.8-4.0 нм ри расстоянии между рядами, равном 4.0-4.8 нм, а периодичность на уровне знтура протофиламентов составляет 7.8-8.0 нм (HamerofT et. al., 1990; Maaloum et .,1994). Сборка цитоплазматических микротрубочек в клетке начинается в гнтриолярном аппарате, локализованном обычно в области перикариона ¡оробьев, Надеждина, 1987). Показано, что одним из факторов, контролирующих >орку микротрубочек в клетке, является их связывание с ассоциированными инорными белками (MAPI, МАР2, МАРЗ и МАР4), которые стимулируют элимеризацию основного белка тубулина, что обеспечивает построение орфологически нормальных микротрубочек (Гельфанд, 1989; Seeback et al., 1989; imble et al., 1991). При математическом моделировании установлено, что ггенсивность внутриклеточных электрических полей достаточна, чтобы вызвать эямую полимеризацию тубулина в микротрубочки, определяющие направленность шжения клеточных органелл (Kaimanovich et al., 1989). Микротрубочки знаружены практически во всех эукариотических клетках (Porter, 1966, Margulis, »75; Dustin, 1978; Weber, Osborn, 1979; Bershadsky, Vasiliev, 1987; Necas, 1990).

Микрофиламенты (=актиновые филаменты) - второй тип цитоплазматических абрилл - впервые были обнаружены в немышечных клетках в 50-х годах (Loewy, •52). Основным структурным белком микрофиламентов является глобулярный лок актин (G - актин с молекулярным весом 46 кДа), имеющий участки связывания g2+ и АТФ (Hepler, Palevitz, 1974; Bukley, 1975). При полимеризации G-актина ¡разуются микрофиламенты (F-актин) толщиной 5-6 нм (Korn et al., 1987). (Шествует около десятка актин-связывающих белков (альфа-актинин, вилин, шбрин, актиногелин, профилины, фрагмин и др.), которые управляют >ганизацией и функциями основного белка микрофиламентов - актина (Weber, 82;Пинаев, 1983; Fulton, 1984; Otto, 1994). Микрофиламенты также являются ;иверсальным компонентом цитоскелета эукариотических клетках (Поглазов, 1965, 67, 1981; Fulton,1984; Поглазов, Бурнашева, 1989; Turner, Tartakoff, 1990).

При декорировании микрофиламентов тяжелым меромиозином (составная сть большой молекулы миозина) образуются характерные стреловидные руктуры (arrow-head), по которым можно определить полярность гкрофиламентов. На "оперенном" конце филамента элонгация идет быстро, а юстренный" конец растет медленнее. Оперенный конец актиновых филаментов

может быть блокирован так называемыми "котирующими" белкам1 (Верховский,1987), а также цитохалазинами В и Д, которые, соединяясь с растущш концом фнламентов , препятствуют их дальнейшему удлинению (Goldman, 1972 Brown, Spudicb, 1979; Mac Lean-Fletcher, Pollard, 1980); при этом тормозятс различные морфогенетические процессы и движение клеток (Crawford et al., 1972 Свиткина, 1989).

Третий тип цитоскелетных фнламентов эукариотических клеток (толщиной 8 10 нм) занимает промежуточное положение между микротрубочками с болыши диаметром (25 нм) и меньшим диаметром микрофиламентов (6-7 нм), который i получил соответствующее название: промежуточные филаменты (Ishikawa et al. 1968). При сканирующей туннельной микроскопии промежуточные филаменть представляют собой параллельные нити диаметром 10 нм, состоящие из изогнуты: цепей тетрамерных субъединиц (6-12 нм) (Hameroffet al., 1990).

В отличие от микротрубочек и микрофиламентов, которые поляризованы i имеют "плюс" и "минус" концы, полимеризация промежуточных филаменто) происходит за счет антипараллельного бокового связывания двух димеров, поэтом; промежуточные филаменты не поляризованы (Remacle, 1991; Singh et al.,1994) Характерными для промежуточных фнламентов являются их резистентность i воздействию различных детергентов и антимитотических препаратов (в отличие о-от микротрубочек), а также их инертность к цитохалазинам и тяжелом; меромиозину (в отличие от микрофиламентов) (Brown et al., 1976; Osborn, Webet 1977; Трояновский, 1987; Klymkovsky,1990). В отличие от микротрубочек i микрофиламентов промежуточные филаменты располагают только единичными ассоциированными с ними белками: бета-интернексином (Celis et al., 1987) i полипептидом с мол.массой 240 хД (Brown, Binder, 1990). В противоположное тубулину и актину, высококонсервативным белкам микротрубочек i микрофиламентов, белки промежуточных фнламентов различаются между собо: аминокислотной последовательностью (Bilej, Siraa, 1989; Fuchs, Weber, 1994).

На основании биохимических и иммунологических данных и типа ткан] (Steinert, Roop, 1988; Georgatos, 1993) промежуточные филаменты подразделяются н пять больших классов: 1) кислые кератины, мол.массой 40-60 kDa, во все: эпителиях; 2) нейтральные кератины, мол.масса 50-70 kDa, во всех эпителиях; 3 виментин, мол.масса 53 kDa, в мезенхнмных клетках; десмин, мол.масса 52 kDa, миогенных клетках; глиальные фибриллы с кислыми белками, мол.масса 51 kDa, глиальных клетках; 4) нейрофиламенты, четыре белка с мол.массой 57-150 kDa, позвоночных и два белка с мол.массой 60-200 kDa у беспозвоночных; 5) ламинь: мол.масса 60-70 kDa, в адерных оболочках всех зукариот.

2+

В регуляции функций цитоскелета клеток большую роль играют Ca кальмодулнн - известные медиаторы внутриклеточных процессов в различны органах и тканях (Bartelt et al., 1982; Matsudaira, Burgess, 1982; Mooseker, 198f S'.einert, Roop, 1988). Однако конкретные механизмы их воздействия на цитоскелст особенно последнего, до сих пор твердо не установлены. В настоящее время иде интенсивный поиск кальмодулин-связывающих белков, участвующих метаболических процессах, подсчет взаимодействий между кальмодулином

елками-мишенями с целью определения и анализа специфических ингибиторов для итоскелетных кальмодулин-связывающих белков. Наиболее изучен в этом тношении фодрин, важный цитоскелетный белок эпителиальных клеток (Nelson, eshnock, 1987; Haiech, Asselin, 1988). С усовершенствованием метода ммуномечения стало возможным избирательное определение каждой системы итоскелета (микротрубочек, микро- и промежуточных филаментов) клеток на тьтраструктурном уровне (Svitkina et al., 1984; Свиткина, Васильев, 1986; Bershadsky : al., 1987; Lachapelle, Aldrich, 1988; Langanger, Le Mey, 1989; Свиткина, 1989; lalecki, 1990).

На светооптическом уровне впервые наблюдал и описал фибриллярные -руктуры в матриксе мезангиальных клеток почечных клубочков млекопитающих Циммерман (Zimmermann, 1933). В 1969 году Берник (Bernic, 1969) опубликовала аультаты исследования по прямому наблюдению сокращения изолированных эчечных гломерул человека в культуре ткани с помощью скоростной икрокинематографической съемки в фазовоконтрастном микроскопе. При имунофлуоресцентных исследованиях почек человека с использованием кроличьей ггисыворотки к человеческому маточному актомиозину (F - AVAM) обнаружено, го мезангиальные клетки содержат актомиозин, тогда как сократительных белков в гдотелии гломерулярных капилляров не бьшо выявлено (Becker, 1972).

В 1975 году Аццини и сотрудники (Accini et al., 1975) при электронной лмуногистохимии почечной ткани мышей с применением сыворотки, содержащей :адкомышечные антитела и использованием в качестве коньюгата ферритина жазали, что сократительные белки располагаются в цитоплазме подоцитов и яангиоцитов и ассоциируются с микрофиламентами, а в эндотелиальных клетках юдукты реакции не были обнаружены. С другой стороны при электронной шуногистохимии на почках крыс с применением кроличьей сыворотки к актину, желому меромиозину и миозину, окрашивания мезангиальных клеток не 1блюдалось (Trenchev et al., 1976), а установлено, что высокие концентрации актина жализованы в цитоплазме ножевых отростков подоцитов, а тяжелый меромиозин средоточен в узкой полоске основания отростков.

Цитоплазматические филаменты показаны в основании клеток юксимальных и дистальных канальцев почек человека (Tisher et al., 1966) и крыс iewstead, 1971). На основании полученных данных авторы предполагают ществование в клетках почечной паренхимы сократительного аппарата, который зируется на толстых и тонких филаментах и, по-видимому, имеет большое ачение в регуляции процессов мочеобразования. При использовании ингибиторов геротрубочек (винкристин) и микрофиламентов (цитохалазин В) установлено, что и структуры играют синергическую роль в регуляции объема клеток олированных проксимальных канальцев почек кролика при помещении их в потоническую среду (Linshaw et al., 1992). На почечных канальцах крыс показано, о вазопрессин способствует слиянию везикул, содержащих воду с канальцами на икальной поверхности клеток, вызывая деполимеризацию актинового цитоскелета ays, 1993). В целом сведения в литературе о цитоскелетных структурах в клетках фрона позвоночных животных и человека весьма противоречивы и не полны.

2. Материал и методы исследования.

Работа выполнена на представителях основных классов позвоночны: животных, включающих 16 отрядов и 36 видов. В том числе: круглоротые - миног; Lampetra fluviatilis; хшастиножаберные - морская лисица Raja clavata, морской ко' Dasyatidae pastinactr, хрящевые ганоиды - русский осетр Acipenser guldenstadti проходные костистые рыбы - лосось Salmo solar, морские костистые рыбы - мойв; MaUotus villosus, летучая рыба Exocoelus volitans, атлантическая треска Gadus morhut morhua, пикша Melanogrammus aeglefinus, сайда Pollachius virens, мозамбнкска тиляпия Tilapia mossambica, керчак Myoxocephalus scorpius, пинагор Cyclopteru lumpus, морская камбала Pleuronectes platessa, камбала-ерш Hippoglossoide platessoides; амфибии - тритон обыкновенный Triturus vulgaris, тритон испански! Triturus boscai, лягушка травяная Rana temporaria-, рептилии - болотная черепаха Ету, orbicularis, степная черепаха Testudo horsfieldi, сцинковый геккон Teratoscincus scincus степная агама Agama sanguinolenta, ушастая круглоголовка Phrynocephalus mystaceus длинноногий сцинк Eumeces schneideri, разноцветная ящурка Eremias arguta, средня) ящерица Lacerta trilineata, песчаный удавчик Eryx miliaris, водяной уж Natrb tesselata, стрела-змея Psammophis lineata; птицы - морянка Clangula hyemalis серебристая чайка Larus argentatus, голубь Columba livia; млекопитающие - собак; Canis familiaris, суслик Citellus undulaius, ондатра Ondatra zibethicvs, крыса Rattu. norvegicus. Почки крыс исследовались в 3-х возрастных группах: 6-7 недель, 4-: месяцев и 1.5-1.8 года.

Для исследования почки человека использовались кусочки почечной ткани взятые в момент операции из интактной зоны почек у больных с опухолью Вилмса j нефробластомой (ВОНЦ РАМН, Москва). Больные были распределены по тре» группам в зависимости от возраста: 1) от 1 года до 7 лет; 2) от 35 до 50 лет; 3) от 5 до 74 лет. По данным ряда авторов (Kuhn, Reale, 1975; Schneeberger et al., 1975 Franke et al., 1978a; Holthofer et al., 1983; Jones et al., 1989), клетки разных органов i тканей, расположенные на значительном удалении от пораженного опухоль» участка, не вовлекаются в патологический процесс, и их цитоскелет может быт! принят за норму. По каждому виду животных и в рамках возрастных групп человек; и крыс исследовалось не менее пяти экземпляров почечных проб.

Световая микроскопия. Кусочки почечной ткани фиксировали в жидкостя: Буэна и Карнуа, проводили по батарее спиртов возрастающей крепости и заливали i парафин; срезы толщиной 5-6 мкм окрашивали гематоксилином-эозином.

Световая гистохимия. Часть фиксированной ткани на срезах обрабатывал; Шиффа-иодной кислотой (PAS - реакция) для выявления мукополисахаридов. Н криостатных срезах толщиной 10-15 мкм выявляли окислительно-восстановительны ферменты цикла Кребса (сукцинатдегидрогеназу), терминального окисления (НАД диафоразу, цитохромоксидазу) и гликолиза (лактатдегидрогеназу). Для обнаружена дегидрогеназ использовали соответствующие субстраты, а в качестве акцептор; электронов нитросиний тетразолий (Pearse,1962). Для определена

[итохромоксидазы в качестве субстрата использовали ДАБ (3.3-;иаминбензидинтетрагидрохлорид) по методу Зелигман и др. (Seligman et al., 1968).

Иммунофлюоресцентная микроскопия. Кусочки свежей ткани из хвостового 1тдела рыб и корковой зоны крыс заключали в 7%-ный раствор желатина на абуференном фосфатном физиологическом растворе (ЗФР) с последующим ¡ыстрым замораживанием при погружении в жидкий азот. Приготовленные риотомные срезы толщиной 5 мкм после размораживания и 5-минутной фиксации в %-ном растворе формалина на ЗФР отмывали не менее 2 ч ЗФР и последовательно нкубировали со специфическими антителами. В качестве последних использовали ледующие моноклональные антитела к белкам промежуточных филаментов: ;итокератинам человека - HI(№8), Н3(№19) и Н4(кератины всех эпителиальных каней); цитокератинам крысы - С12 (мол. масса 49 кДа), Е2 (мол. масса 55 кДа) и ЕЗ мол. масса 40 кДа). Применяли также моноклональные антитела к виментину еловека и крысы (клоны 30 и PN 1102 Amershara) и комбинированные антитела, знающие как кератины, так и виментин крысы (клон AI). В некоторых случаях рименялась двойная окраска на актин и виментин. Указанные моноклональные нтитела получены из коллекционного фонда лаборатории механизмов анцерогенеза НИИ канцерогенеза (заведующий - профессор Ю.М.Васильев) ВОНЦ АМН (Москва). Исследования проводились под руководством профессора '.А.Банникова. Подробная характеристика используемых моноклональных антител редставлена в работах Трояновского и соавторов (1984, 1985, 1986, 1987). 1оликлональная сыворотка к виментину была любезно предоставлена I.И.Родионовым (Межфакультетская проблемная научно-исследовательская аборатория молекулярной биологии и биоорганической химии Московского ниверситета). Последняя была получена иммунизацией кроликов препаратом иментина из хрусталиков глаза свиней по методике Гейслера и Вебера (Geisler, Veber, 1981). Детальное описание приготовления антисыворотки против виментина зложено в работе Gyoeva et al., (1987). В качестве проявляющих антител спользовали меченные флюоресцеинизотиоционатом антитела против ммуноглобулинов мыши фирмы Miles (Англия).

Электронная микроскопия. Кусочки почечной ткани у различных животных >иксировали в 2.5-3%-ном глютаральдегиде на фосфатном буфере (1.5 ч) с оследующей дофиксацией в забуференной 1% 0s04 (1 ч). Осмомоляльность шксирующих смесей достигалась добавлением сахарозы, избирательно, в ависимости от вида исследуемых животных. Дегидратация материала роизводилась в спиртах, в некоторых случаях применялась окись пропилена, с оследующей заливкой в Аралдит или Эпон-812. Полутонкие и ультратонкие срезы зготовляли на ультратомах Reichert или LKB-I1I и окрашивали толуидиновым иним и цитратом свинца соответственно. Основные исследования выполнены на пектронном микроскопе JEM-100В, а частично на Н-300 и УЭМВ-100В.

Электронная гистохимия. Для выявления лактат- и сукцинатдегидрогеназ риотомные срезы (толщиной 30-50 мкм) почечной ткани атлантической трески и обаки инкубировали в среде по Керпель-Фронису, Хайошу (Kerpel-Fronius, Hajos, 968). Среда содержала соответствующие субстраты с использованием в качестве

акцептора электронов феррицианида меди. В контрольных опытах срез выдерживали в среде без субстрата, с добавлением малоната и с прединкубационны нагреванием почечной ткани при 83 С" в течение 5 мин. После инкубации срез фиксировали в четырехокиси осмия по Миллонигу (Millonig, 1961) в течение 1 час Дегидратацию материала производили в спиртах с последующей заливкой в аралди Материал в процессе проводки и на сетках не контрастировали.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3. Строение цитоскелета клеток висцерального и париетального эпителиев

почечных гломерул

Цитоскелет подоцитов. Подоцигы (= клетки висцерального эпителия капсул Шумлянского-Боумена, боуменовой капсулы или гломерулярный эпителий) уникальная популяция клеток, типичная исключительно для почечных фильтруюцц структур . Эти клетки являются продолжением париетальных клеток боуменовс капсулы на сосудистом полюсе почечной гломерулы. Согласно утверждению Пи: (Pease, 1955), углубление наших знаний по электронной микроскопии пот происходило последовательно в течение трех исторических периодов. Если первь период включал отработку адекватной фиксации и техники ультратомии, то вторе исторический период был ознаменован раскрытием тонкого строения имен! висцеральных эпителиальных клеток почечных гломерул и особенностч расположения их отростков на базальной мембране капилляров (Hall, 1954). Впервь клетки висцерального эпителия при световой микроскопии обнаружены Герлахс (Gerlach, 1848), который, используя инъекционный метод контрастных вещест показал, что капилляры отделены от мочевого пространства гломерул слоем тоню с расщелинами клеток. Подоциты, спрутообразные клетки (Sakai et al., 1988), coctoj из центрального клеточного тела с отходящими от него отростками, на которых oí возвышаются подобно "телу медузы" (Rhodin, 1958) над наружной поверхность капиллярных петель почечных гломерул. Многочисленные ножевые отростс эпителиальных клеток и послужили основанием для их наиболее удачного названия подоциты (от греч. "подос" - нога) (Hall, 1954). Следовательно, подоциты i прилегают непосредственно к гломерулярной базальной мембране, как это обьга наблюдается во всех известных эпителиях органов и тканей, а приподняты над hi множественными подоцитарными отростками, формирующими так называем! субподоцитарное пространство. Ножевые отростки своими основания), ("подошвами прикрепления" по Policard et al., 1955) погружены в толщу наружно] разреженного слоя (lamina rara externa). Плазмалемма основания ножевых отросла прикрепляется к плотному слою (lamina densa) базальной мембраны капиллярш стенки гломерул тончайшими (2.5-3 нм) филаментами обозначаемыми как "лучев! фнламенты ножевых отростков" (по Yamada, 1955). Подобные филаменты таю отождествляют с IV типом коллагеновых волокон и предполагают их связь с тонкс сетью нитчатых структур субплазмалеммальной цитоплазмы ножевых отросто подоцитов (Inoue, 1995). Смежные ножевые отростки разделены пространством в 2

Ю им, которые обозначаются фильтрационными щелями и перекрыты «ембраноподобнымн структурами толщиной 3-6 нм - фильтрационными щелевыми диафрагмами (= щелевыми мембранами) (Уатаёа, 1955).

В мезонефрических почках у круглоротых (минога) и морских костистых рыб морской камбалы, камбалы-ерша, атлантической и кильдинской трески, пикши, айды, мойвы, керчака и летучей рыбы - цитоскелет подоцитов имеет в общих юртах близкое строение. Он представлен в основном мощно развитой системой [ромежуточных филаментов. Последние, толщиной в 8-10 нм, образуют плотные [учки, состоящие из десятков отдельных единиц. На поперечном и тангенциальном ечениях в филаментах наблюдается светлый матрикс . В области перикариона пучки >иламентов концентрически окружают ядро и плотно примыкают к наружной дерной мембране . Иногда наблюдается локальный контакт ядра подоцнта с пучком >иламентов, который затем, после и-образного изгиба, вновь контактирует с ядром, о уже с соседним участком наружной ядерной мембраны. Вероятно, через подобные окальные контакты осуществляется избирательная филаментная связь одних дерных пор клеток с другими. Отчетливо прослеживаются зоны перехода пучков >иламентов из тела подоцитов в их отростки, что свидетельствует о непрерывной диной филаментной системе, соединяющей плазматическую мембрану и клеточное дро . В трабекулярных и особенно в ножевых отростках филаменты заполняют очти всю их цитоплазму, тем самым определяя уникальную конфигурацию и азмеры всех типов подоцитарных отростков. По ходу пучков филаментов тмечаются их тесные топографические взаимосвязи с плазмалеммой , итохондриями , цистернами эндоплазматической сети и комплексом Гольджи , изосомами и с так называемыми тубуло-ретикулярными структурами (в подоцитах глантической трески). Смежные подоциты соединены между собой, помимо (елевых диафрагм в ножевых отростках, межклеточными комплексами или же золированными плотными контактами и типичными десмосомами , а также их эмбинациями. В некоторых случаях наблюдается связь филаментного компонента гсмосом - пучков промежуточных филаментов - с ядром.

В цитоплазме у пластиножаберных (морская лисица и морской кот), хрящевых шоидов (русский осетр) и особенно у пресноводных костистых рыб (тиляпия), в гличие от предыдущих видов рыб, система промежуточных филаментов редставлена менее плотными пучками и, кроме того, в цитоплазме клеток и их гростков отмечается (хотя и слабо выраженная) сеть микрофиламентов и щничные микротрубочки.

В цитоплазме подоцитов мезонефрических почек у представителей амфибий -эыкновенного и испанского тритонов и травяной лягушки - приблизительно в 1вных соотношениях наблюдаются как микротрубочки, так и пучки эомежуточных филаментов. За исключением перинуклеарной области, где эеобладают промежуточные филаменты, а микротрубочки единичны , на ггальном клеточном пространстве наблюдается четко выраженная полярность в ¡определении элементов цитоскелета. В апикальных отделах клетки располагаются икротрубочки, а базальные отделы, включая ножевые отростки, заполнены /чками промежуточных филаментов. Микротрубочки и филаменты ориентированы

преимущественно параллельно длинной оси клеток и их отростков. Хорошо прослеживаются их контакты с ядром, плазмалеммой и митохондриями. В цитоплазме клеток, прежде всего в их отростках, определяется разреженная сеть микрофиламентов.

Электронно-микроскопические исследования метанефрических почек рептилий выполнены на 11 видах животных, представляющих различные экологические группы. Эти обстоятельства, по-видимому, определяют и высокую степень мозаичности в наблюдаемой нами структуре цитоскелета подоцитов рептилий. Пучковый тип промежуточных филаментов отчетливо представлен в подоцитах ушастой круглоголовки, сцинкового геккона и водяного ужа. Пучки филаментов прилегают и даже "сплавляются" с наружной ядерной мембраной. Причем подобная взаимосвязь отмечается на всех уровнях ультратонких срезов ядер подоцитов, вплоть до их фрагментов. Сходный тип связи пучков филаментов наблюдается с плазмалеммой , митохондриями и цистернами комплекса Гольджи . В тоже время у степной черепахи , агамы и песчаного удавчика пучки промежуточных филаментов сравнительно немногочисленны, рыхлые, и связь их с ядром и органеллами клетки менее выраженная, хотя с секреторными гранулами они имеют достаточно тесные контакты. Полярности (апикально-базальной) во внутриклеточном распределении элементов цитоскелета подоцитов, в отличие от амфибий, у рептилий не наблюдается. Микротрубочки рассеяны по всей цитоплазме, контактируя с ядром , митохондриями и секреторными гранулами , а также многократно взаимно пересекаясь с промежуточными филаментами и сетью микрофиламентов. Межклеточные соединительные комплексы имеют обычное строение.

Основное вещество цитоплазмы подоцитов у птиц (голубя, серебристой чайм и утки-морянки) формируется сетью микрофиламентов диаметром 6-7 нм, особеннс интенсивно выраженной в ножевых отростках. Микротрубочки располагаются I перинуклеарной области и трабекулярных отростках. Иногда обнаруживаете! раздвоение одного из концов микротрубочек с образованием характерной У образной формы, тогда как их противоположный конец обычно закреплен н; плазмалемме . Микротрубочки примыкают к митохондриям и имею-множественные точечные метки их взаимных пересечений с микрофиламентами I промежуточными филаментами. Последние не собраны в пучки, а рассеяны по все! цитоплазме подоцитов. В матриксе подоцитов серебристой чайки обнаружен! поперечно исчерченные пучки микрофиламентов длиной 1.5-2 мкм . Структурно ош представлены актиноподобными филаментами, сформированными в пучк! толщиной 50-40 нм, с периодичностью исчерченности в 60-80 нм. При этом 1 совокупности создается структура, напоминающая корешки, которые обычн< крепятся к базальным тельцам ресничек. Подобные филаментные структур! постоянно наблюдаются в зоне комплекса Гольджи и тесно связаны с его элементам:

У млекопитающих (суслика, ондатры, крысы и собаки) цитоскелет подоцито образован множественными микротрубочками, расположенными преимущественно направлении длинной оси клеток и их больших отростков . Микротрубочки нередк

организованы в пучки , которые пронизывают цитоплазму трабекулярных отростков и прикрепляюся к подоцитолемме .Изолированные микротрубочки, напротив, пересекают отростки перпендикулярно длинной оси клеток . Многие микротрубочки имеют Y-образные концевые разветвления, в которых нередко заключены митохондрии. Некоторые микротрубочки перекрещиваясь между собой создают очертания песочных часов. Промежуточные филаменты в теле подоцитов и грабекулах обычно следуют по ходу микротрубочек или же располагаются отдельно параллельными ровными рядами с интервалом в 100-200 нм. Многочисленные микрофиламенты, пересекая под прямым углом микротрубочки и промежуточные филаменты, в результате формируют крупноячеистый филаментный матрикс тела подоцитов и их больших отростков. В ножевых отростках микрофиламенты эбразуют войлокообразную густую сеть с электроноплотным ободком в их эсновании.

Цитоскелет подоцитов у человека исследовался в различных возрастных группах: 1) от 1 года до 7 лет; 2) от 30 до 50 лет; 3) от 51 до 74 лет. В почках детей здним из основных компонентов цитоскелета подоцитов является система микрофиламентов . Последние (толщиной 6-7 нм), контактируя и пересекаясь с »шкротрубочками и промежуточными филаментами образуют плотную широко разветвленную сеть, пронизывающую всю цитоплазму клеток и их отростков. В юнах пересечения отдельных микрофиламентов нередко локализованы рибосомы. 1редполагают, что подобные рибосомы являются информационными РНК, соторые, осуществляя связь между ядром и цитоскелетом, контролируют щигательные реакции клеток, реализуемые через посредство опорно-двигательного шпарата (Караганов и др., 1981,1983). Сеть цитоскелетных структур имеет тесные ■опографические взаимосвязи с ядром и органеллами подоцитов - митохондриями , 1ндоплазматической сетью , комплексом Гольджи , а также с плазматической мембраной . Показано, что микрофиламенты совместно с микротрубочками 'частвуют в переносе информации между плазматической мембраной и внутренними труктурами клеток (Burridge et al., 1987). Микротрубочки и сопутствующие им фомежуточные филаменты располагаются в основном вдоль продольной оси тела юдоцитов и их трабекулярных отростков. Четко прослеживаются места заякоривания" микротрубочек с плазмалеммой подоцитов и множественные узлы их 1заимных пересечений и контактов по типу "конец в бок" с микрофиламентами . Имеются сообщения о том, что микротрубочки не только определяют еометрические характеристики клетки, но и способны путем своего удлиннения или корочения участвовать в двигательных реакциях клеток (Simon, Salmon, 1990). В юдоцитах хорошо представлены центриоли (=базальные тельца), локализованные :ак в области перикариона , так и на периферии клетки под плазмалеммой . )бнаруживаются также пучки микрофиламентов с поперечной исчерченностью, нелогичные наблюдаемым в подоцитах у птиц , но более значительных по длине и с 'аздвоением на одном из концов . Иногда удается наблюдать их в непосредственной ¡лизости с базальными тельцами . В почках человека в возрасте от 34 до 50 лет >тмечается две популяции подоцитов. различающихся по структуре цитоскелета. 1ервый тип цитоскелета в основном тождествен по строению с описанным выше.

имеющим хорошо выраженную сетчатую структуру матрикса подоцитов и и? отростков . Второй тип цитоскелета характеризуется тенденцией к замещении сетчатой структуры микрофиламентов на пучковую и увеличению в них числе промежуточных филаментов . В почках человека от 51 до 74 лет доминирующи!.» становятся подоциты со структурой второго типа . Отчетливо прослеживаются зонь перехода пучков промежуточных филаментов из тела подоцитов, где онг локализованы перинуклеарно, в трабекулярные и ножевые отростки, а также и? множественные соединения с плазматической мембраной клетки . Микротрубочки v центроли единичны.

Цнтоскелет клеток париетального зтггелия. Клетки париетального эпителш (=клетки париетального листка боуменовой капсулы или капсулярного эпителия сквамозного типа выстилают полость капсулы Шумянского-Боумена t располагаются на базальной мембране, которая снаружи прилегает i интерстициальной ткани . Базальная мембрана включает три слоя: одт центральный электроноплотный и два, наружный и внутренний, узки; электронопрозрачных. Прослеживается плавный переход базальной мембрань боуменовой капсулы в базальную мембрану шейки нефрона. Ядра клеток эпители: крупные, в области перикариона располагаются единичные мелкие митохондрии цистерны эндоплазматической сети и комплекса Гольджи. По всей цитоплазм-рассеяны немногочисленные рибосомы, полисомы и везикулярные пузырьки Соседние клетки эпителия капсулы скреплены межклеточными соединительным! комплексами или отдельными десмосомами . На апикальной поверхности клето! наблюдаются единичные короткие микроворсинки .

У морских костистых рыб в цитоплазме париетальных клеток наблюдаютс компактные пучки промежуточных филаментов, которые плотно охватывают ядра а затем распространяются по всей цитоплазме клеток . Отмечаются их контакта кроме наружной ядерной мембраны, с плазмалеммой, митохондриями эндоплазматической сетью и цистернами комплекса Гольджи . У рептилий эпителиальных клетках боуменовой капсулы крупные пучки промежуточны филаментов также имеют тесные взаимосвязи с ядром, митохондриям! эндоплазматической сетью и комплексом Гольджи. Промежуточные филаменп околоядерной цитоплазмы нередко пересекаются с десмосомальным тонофиламентами. У птиц в клетках капсулярного эпителия почек промежуточны филаментов, собранных в пучки, не наблюдается, а преобладающим цитоскелетными структурами становятся микрофиламенты и микротрубочки Следовательно, в цитоскелете клеток париетального эпителия прослеживаете тенденция, наблюдаемая нами в филогенезе позвоночных при исследовани цитоскелетных элементов подоцитов, то есть постепенное замещем промежуточных филаментов на микротрубочки и микрофиламенты.

Аспекты энергетического обеспечения цитоскелета клеток подоцито! Установлено, что функционирование цитоскелета эукариотических клеток i многом зависит от интенсивности в них энергетического обмена (Арронет, 197 1977; Evans, 1989; Hollenbeck et а!., 1989; Hexley, 1990), и при его нарушениях, частности, истощении пула АТФ, наблюдается разрушение цитоскелетных структ)

Bershadsky et al., 1980; Гельфанд, Бершадский, 1982; Bershadsky, Gelfand, 1983; üershadsky, Vasiliev, 1987). Предполагается также регулирующая роль АТФ в образовании микрофиламентов (Гельфанд, Бершадский, 1982; Bershadsky, Gelfand, 1983; Кот, 1987). В отличие от эпителиальных клеток почечных канальцев, где шеется множество митохондрий, генерирующих богатые энергией молекулы АТФ, слетки гломерул (эндотелиальные, мезангиальные, париетальные и подоциты) относительно бедны митохондриями, поэтому образование в них АТФ в основном осуществляется посредством гликолиза. Согласно данным световой гистохимии, «тивность в почечных клубочках одного из основных и высокоспецифичньгх ферментов гликолиза лактатдегидрогеназы (ЛДГ: КФ 1.1.1.27) колеблется в широких феделах от следовой и слабо выраженной (Наточин, 1963; Серов, Уфимцева, 1967; Быкова и др., 1969) до умеренной и интенсивной (Райхлин, 1967; Wejener, 1968). В то ке время активность в клубочках сукцинатдегидрогеназы, ключевого фермента щкла Кребса, протекающего исключительно в митохондриях, указанными шторами единодушно отрицается. Анализ данных литературы позволяет федположить, что на общем низком фоне ферментативной активности тканевого метаболизма, характерном для почечного клубочка (Серов, 1968), в последнем феобладают процессы гликолиза.

Нами изучены структурно-топологические особенности активности ЛДГ в ючечных гломерулах млекопитающих (взрослых собак) (Рыжаков, Зайцев, 1976). 1ри электронной гистохимии конечный продукт реакции - ферроцианид меди ->пределялся в виде высококонтрастных гранул размером 10-14 нм, резко сличающихся по электронооптической плотности от ультраструктурных компонентов клеток клубочка. Гранулы отчетливо интегрированы в подоцитолемму южевых и трабекулярных отростков , а также тела самих подоцитов . Выявляемые ранулы располагаются в плазматической мембране на границе с так называемым фимембранным слоем - гликокаликсом (Rambourg, Le Blond, 1967; Комиссарчик, Тевин, 1974; Latta et al., 1975). Продукт реакции в ножевых отростках распределен геравномерно - основная масса гранул локализована со стороны погружения >тростков в базальную мембрану на уровне ее разреженного слоя ( lamina rara xterna) . В зонах с наибольшей интенсивностью реакции гранулы плотно прилегают (руг к другу или же располагаются с едва уловимыми промежутками; на участках с (еньшей активностью расстояние между гранулами 20 нм и более. В отдельных лубочковых капиллярах ножевые отростки обильно усеянные гранулами хелата, [ередуются с отростками, имеющими редко расположенные гранулы , что указывает ia их определенную функциональную гетерогенность и коррелирует с данными льтраструктурного анализа цитоскелета подоцитов позвоночных (Зайцев, "амбарян, 1985, 1986). В контрольных срезах ферментативная реакция не [аблюдалась.

В некоторых работах (Лушников, 1979; Браун, Моженок, 1987) показано, что ; нативной клетке энзимы гликолиза организованы в компактные мультиэнзимные грегаты, упорядоченно расположенные на мембранах. Подобная организация определяет важнейшие регуляторные характеристики гликолитического юсфорилирования. Полученные нами данные подтверждают принцип структурной

интеграции гликолитических ферментов на мембранах, способствуют конкретизации представлений о локализации этих ферментов и показывают возможные пути энергообеспечения функции цитоскелета клеток гломерулярного фильтра позвоночных животных.

Доминирующие цитоплазматические филаменты, выявляемые нами в подоцитах почек круглоротых, пластиножаберных, хрящевых ганоидов, морских и пресноводных костистых рыб по своим размерам (диаметр 8-10 нм), внутриклеточной локализации (преимущественно околоядерной) и типу организации (пучковому) позволяют отнести их к системе промежуточных филаментов.

В подоцитах круглоротых и рыб система промежуточных филаментов тесно связана с плазматической мембраной и поэтому способна изменять размеры и форму оснований ножевых отростков и тем самым влиять на состояние фильтрационных щелей с их диафрагмами и соответственно, на гидродинамическую проводимость капиллярной стенки и интенсивность фильтрационных процессов. В подоцитах морских костистых рыб (атлантической трески) также обнаружена взаимосвязь пучков промежуточных филаментов н тубуло-ретикулярных структур (ТРС). Впервые подобные структуры под названием "волнистые микротрубочки" были описаны при электронной микроскопии световоспринимающих клеток кольчатых червей (Bassot, 1966) и железистых клеток дендритного органа морских сомиков (Van Lennep, Lanzing, 1967). Установлено, что ТРС имеют белковую природу и состоят из кислых белков, однако конкретных данных о их значении и функции в клетках нет (ShafT et al., 1972). При иммунофлюоресцентной микроскопии определена виментиновая природа промежуточных филаментов (Зайцев, 1989). Следовательно, нами впервые установлено, что цитоскелет подоцитов и клеток париетального эпителия нефрона круглоротых и рыб образован преимущественно мощно развитой системой промежуточных филаментов виментинового типа, пучки которых взаимно связывают ядро с плазмалеммой и основными органеллами клеток (Зайцев, 1983; Зайцев, Гамбарян, 1985а, б; 1986; Зайцев, 1986; Zaitsev, 1988; Zaitsev et al., 1988; Зайцев, 1989; Zaitsev, 1989; 1991; 1992a, b, c, d). В подоцитах пучки промежуточных филаментов проходят последовательно от ядра, которое они окружают плотным кольцом, в трабекулярные и ножевые отростки и, по-видимому, не столько повторяют, сколько активно предопределяют уникальную многоотросчатую форму подоцитов. В цитоплазме подоцитов пластиножаберных, хрящевых ганоидов и пресноводных костистых рыб наблюдаются не только пучки промежуточны* филаментов, но также и слабо выраженная сеть микрофиламентов и единичны« микротрубочки, что обусловлено экологическими факторами, влияющими не интенсивность фильтрационных процессов. У амфибий цитоскелет подоцитог представлен как микротрубочками, так и промежуточными филаментами с и? полярным расположением, а сократительный компонент цитоскелета - сетьк микрофиламентов. В подоцитах и париетальных клетках почечных гломерул j различных видов и экологических групп рептилий нами также впервые выявлен; классическая триада элементов цитоскелета: микротрубочки, микро- > промежуточные филаменты (Зайцев, Гамбарян, 1985; 1986).

Клетки почечных гломерул птиц, по нашим данным, в целом имеют высокий уровень цитоскелетной организации (Зайцев, 1995). При гель-электрофорезе плазмалеммальной фракции ножевых отростков подоцитов из почек цыпленка были выявлены винкулин и талин - два белка, необходимые для фиксации нитей актина к липидному бислою мембраны и к рецепторам фибронектина и ламина (Drenckhahn, Franke, 1988), что согласуется с нашими данными об интенсивном развитии в последних системы актиновых микрофиламентов.

Структура цитоскелета подоцитов и париетальных клеток почечных гломерул млекопитающих диаметрально противоположна наблюдаемой у круглоротых и морских костистых рыб, так как в их цитоплазме вместо пучков промежуточных филаментов доминирующими становятся множественные микротрубочки и сеть микрофиламентов, разреженная в теле клетки и плотная в ножевых отростках.

При исследовании подоцитов человека нами установлены две популяции клеток с различным типом структуры цитоскелета (Зайцев и др., 1989). Первый тип характеризуется разветвленной, высокой плотности сетью микрофиламентов, развитой системой микротрубочек и относительно малочисленными промежуточными филаментами. Подоциты с указанной организацией цитоскелета, по-видимому, активно функционируют лишь в первой половине человеческой жизни, гак как в почках изученной группы человека от 34 до 50 лет чаще наблюдаются подоциты с цитоскелетом второго типа. Этот тип цитоскелета отличается множественными пучками промежуточных филаментов, уменьшением числа микрофиламентов и единичными микротрубочками. В почках человека в возрасте ;тарше 65 лет второй тип цитоскелета подоцитов, с преобладанием пучков промежуточных филаментов, становится обычным. Следовательно, выявляется противоположная тенденция, которая наблюдается в филогенезе позвоночных, а шенно постепенное замещение мощно развитой пучковой системы промежуточных филаментов в цитоскелете подоцитов у низших позвоночных системами микрофиламентов и микротрубочек в почках млекопитающих. Эти результаты юдтверждаются и данными литературы. Так, в подоцитах почек человека (De vlartino et al., 1973) наряду с тонкими филаментами (=микрофиламентами) шределялись разрозненные филаменты с диаметром около 12 нм (=промежуточные |>иламенты 1-го типа подоцитов человека по Зайцеву и др., 1989) или же аналогичные [шламенты , но собранные в плотные пучки (=промежуточные филаменты 11-го типа юдоцитов человека по Зайцеву и др., 1989). Исследование на почках крысы и [еловека разных возрастных групп позволяет считать, что в процессе шдивидуального развития и старения в почках высших животных и человека, ¡ероятно, происходят физиологические изменения, обусловливающие юрфологическую перестройку цитоскелета подоцитов, которая сопровождается штенсивным развитием системы промежуточных филаментов с одновременным ■меньшением количества микротрубочек и микрофиламентов.

Следует особо отметить, что подоциты имеют не только уникальную шогоотросчатую форму, но и необычную природу. Углубленные иследования (итоскелетных структур с использованием иммунофлюоресцентной и электронной шкроскопии позволили разграничить истинные эпителии от эпителиоидных

(=эпителиоподобных). Первые характеризуются типичными десмосомами цитокератиновыми филаментами, а эпителиоидные не содержат этих структур, hi богаты виментиновыми филаментами (клетки хрусталика, герминативный эпители! яичников, эндотелий) (Franke et al., 1979; Ramaekers et al., 1983; Virtanen et al., 1981) Эти клетки с экспрессией промежуточных филаментов исключитеяьн< виментинового типа являются редким "выпадением" из общеприняты: классификаций промежуточных филаментов, согласно которым эпителиальны клетки обычно содержат только цитокератиновые филаменты (Lazarides, 1982 Steinert, Roop, 1988), поэтому их предлагается отнести к разряду эпителиоидны: клеток (Ramaekers et al., 1980). Предпринимаются попытки причислить к последнш и подоциты (Bachmann et al., 1983), что не лишено оснований, но в этом вопрос требуется осторожный подход. По всем критериям к эпителиоидным клеткам можн< отнести лишь подоциты высших позвоночных животных, которые имеют атипичны десмосомы (Vasmant et al., 1984) и экспрессируют виментин (Bachmann et al., 1982 Zaitsev, 1992a, b, с). Результаты наших исследований показали, что низши позвоночные обладают подоцитами с типичными десмосомами , но одновременн имеют и выраженную экспрессию виментиновых промежуточных филаментов, чтс возможно, "маскирует" и не позволяет "улавливать" экспрессию минорны десмосомальных цитокератиновых филаментов. Следовательно, подоциты низши позвоночных занимают промежуточное положение между истинным эпителиальными (по наличию типичных десмосом) и эпителиоидными (п содержанию виментина) типами клеток, тогда как подоциты высших позвоночны можно с определенной долей уверенности отнести к эпителиоидным клеткам.

Главной функцией цитоскелета гломерулярных клеток нефрона позвоночны животных и человека является их активное участие в процессах почечно фильтрации. Впервые концепция фильтрации (=ультрафильтрации) плазмы кров через капиллярную стенку почечных гломерул с последующим включение механизма канальцевой селективной реабсорбции, как основополагающего этап образования мочи, выдвинута Людвигом в 1843 году (Ludwig, 1843) в противове секреторной теории, рассматривающей почки наподобие экзокринных желе: продуцирующих мочу главным образом путем канальцевой секреции (Bowman, 184: Heidenhain, 1886). Согласно теории Старлинга (Starling, 1899), определяющим переносе жидкости и растворенных веществ через капиллярную стенку являете результат дисбаланса между гидростатическим давлением циркулирующей крови капиллярах и коллоидно-осмотическим давлением белков плазмы крови.

Гломерулярную капиллярную стенку структурно составляют тр фильтрационных компонента: 1)эндотелий; 2)базальная мембрана; 3)подоциты фильтрационными щелями и щелевыми диафрагмами. Фенестрированны эндотелий, имея высокую порозность, хотя и не обладает значительной барьернс функцией, детерминирует общую поверхность, доступную для фильтращ (Parquhar, 1975), благодаря развитому цитоскелету, регулирующему размеры количество функционирующих фенестр (Zaitsev, 1994; Зайцев, 1996). Особое место стенке гломерулярных капилляров занимают подоциты с их многочисленнык отростками. На перпендикулярных срезах базапьной мембраны гломер;

1иафрагмы фильтрационных щелей имеют вид тонких линий с центральной плотной гонкой, но на тангенциальных срезах в этой же зоне обнаруживается структура )ысокого порядка. Точка на щелевой диафрагме оказывается центральной полоской, шеющей регулярные поперечные соединения-связки с плазмалеммой смежных южевых отростков. В результате чередующиеся поперечные связки с двух сторон от митральной полоски в совокупности создают структуру, напоминающую застежку-молнию (Rodewald, Karnovsky, 1974).

В классическом исследовании Фарквар и др. (Farquhar et а!., 1961) ломерулярной проницаемости в почках крыс при внутривенной инъекции юшадиного селезеночного ферритина с мол. массой 480000 и эффективным шффузионным радиусом 6.1 нм основная аккумуляция маркера отмечалась между ндотелием и базальной мембраной, а также в разреженном внутреннем слое юследней - факт, указывающий, что базальная мембрана гломерул является главным [шльтрационным барьером. Опыты же с ферментативными метками (пероксидаза ;рена, миелопероксидаза, каталаза и др.), при которых продукты реакции :онцентрировались в основном на диафрагмах фильтрационных щелей ножевых »тростков подоцитов (Graham, Karnovsky, 1966), свидетельствуют, что последние >бладают выраженной барьерной функцией и задерживают те макромолекулы, оторые не отфильтровываются базальной мембраной. Следовательно, Фильтрационные щели подоцитов с их диафрагмами, имеющие сложную льтраструктуру, действуют как главный барьер, ограничивая продвижение ебольших белковых молекул, миновавших префильтр - базальную мембрану, тем амым детерминируя общую гидродинамическую проводимость капиллярной стенки ломерул.

Результаты наших исследований впервые показали, что в ножевых отростках одоцитов позвоночных доминируют различные цитоскелетные элементы в ависимости от их филогенетического положения и функциональной нагрузки, бусловленной эколого-физиологическими факторами. У круглоротых и морских ыб в ножевых отростках, как и в общей архитектуре цитоскелета их подоцитов, реобладают виментиновые промежуточные филаменты, которые считаются, в тличие от сократительных микрофиламентов, чисто "скелетным" элементом клеток. >днако сравнительно недавно (Kasten et ab, 1989) при изучении функции ромежуточных филаментов на субклонах глиальных клеток линии С6 установлено, то виментиновые промежуточные филаменты участвуют в движении клеток, начит, обнаруженные нами виментиновые промежуточные филаменты в подоцитах изших позвоночных также обладают, хотя и в меньшей степени, чем икрофиламенты, сократительными потенциями, но , вероятно, вполне остаточными для обеспечения контролирующей и регулирующей функции одоцитов при низком уровне гломерулярной фильтрации, присущем круглоротым и орским костистым рыбам. У пластиножаберных, пресноводных и проходных эстистых рыб в ножевых отростках подоцитов, наряду с пучками промежуточных иламентов, появляются микрофиламенты, что связано с интенсификацией юмерулярнон фильтрации и. соответственно, необходимостью более лабильных энформационных изменений ножевых отростков и фильтрационных щелей.

Подобная тенденция усиливается у амфибий и рептилий, а у птиц, млекопитающих и человека в цитоплазме ножевых отростков обнаруживаются главным образом микрофиламенты.

Конформационные изменения ножевых отростков возможны только при очень тесных взаимодействиях цитоскелетных структур с плазмалеммой подоцитов. При помощи видеоусиливающей контрастной микроскопии с использованием частиц коллоидного золота, покрытых поли-альфа-лизином в качестве метки, показано, что в плазматической мембране существует два типа структурных комплексов: свободно плавающие и связанные с кортикальными цитоскелетными структурами (De Brabander et al.,1990). Для виментиновых промежуточных филаментов характерно связывание виментина с плазматической мембраной клеток путем некооперативного взаимодействия своим головным аминоконцевым участком (Georgatos, Blobel, 1987), тогда как микрофиламенты прикрепляются к плазмалемме исключительно посредством белка винкулина (Burridge, Faith, 1986), который одним концом непосредственно взаимодействует с актиновыми филаментами, а другим с белком талином. Последний содержит сайты, с одной стороны, для связи с винкулином, а с другой с интегрином - гликопротеиновым комплексом плазмалеммы (Muguruma et al., 1990). Зоны "стыковки" интегрированных белков и микрофиламентов с плазмалеммой, по-видимому, соответствуют электроноплотным ободкам в основании ножевых отростков (Зайцев, Гамбарян, 1985, 1986; Andrews, 1988).

Гликокаликс подоцитов и их отростков, будучи отрицательно заряженным, играет роль ограничителя для фильтруемых макромолекул с одноименным зарядом . В свою очередь, подоцитолемма в соответствии с нашими данными представляет домен, где протекают процессы гликолитического фосфорилирования, в ходе которых генерируются молекулы АТФ, необходимые для энергетического обеспечения эффективного функционирования цитоскелета подоцитов. Поэтому повышение порозности капиллярной стенки гломерул может быть связано не только с потерей гликокаликсом отрицательного заряда и последующим свободным прохождением в мочевое пространство боуменовой капсулы нейтральных молекул, но и с более глубокими изменениями в плазмалемме подоцитов, блокирующих процессы гликолиза и соответственно препятствующих адекватному энергоснабжению цитоскелетных структур подоцитарных ножевых отростков с дальнейшими, как следствие, нарушениями функции фильтрационных щелей и их диафрагм.

С учетом морфофизиологических особенностей гломерулярной фильтрации по-видимому, в почках позвоночных животных и человека имеются две разновидности подоцитов, отличающихся по топографии и функциональном} предназначению. В подоцитах, расположенных в начале клубочковых капилляров где эффективное фильтрационное давление максимальное (около 15 мм рт. ст.) i образование фильтрата не затруднено, основная функциональная нагрузк; приходится в них на комплекс фильтрационных щелей с диафрагмами выполняющий контролирующую роль. Поэтому в таких подоцитах всегда очеш четко обнаруживаются щелевые диафрагмы, указывающие на локализацию i принадлежность их к афферентному отделу гломерулярных капилляров. Ближе i

эфферентному концу гломерулярных капилляров, по мере снижения эффективного фильтрационного давления, для его компенсации функция локализованных здесь подоцитов направлена на поддержание процессов образования ультрафильтрата, что обеспечивается пульсирующими сокращениями тела клетки и ее больших отростков, создавая разрежение в боуменовой капсуле и тем самым усиливая гидродинамическую проводимость капиллярной стенки. Вероятно, этим и объясняется необходимость существования субподоцитарного пространства, способствующего свободному сокращению подоцитов, так как при обычном строении эпителиальных клеток, плотно прилегающих к базальной мембране, каждое их сокращение (синхронно) приводило бы к констрикции просвета клубочковых капилляров. Такие подоциты обычно характеризуются сильно развитым цитоскелетом в теле клеток и трабекулах, а щелевая диафрагма чаще всего не обнаруживается. Они обладают также хорошо выраженными лучевыми филаментами оснований ножевых отростков, которые служат своеобразными ультраструктурными (диаметр 2.5-3 нм) связками, соединенными проксимальными концами с подоцитолеммой отростков, а дистальными с фибриллярной сетью плотного слоя (lamina densa) базальной мембраны. Подобные филаментные связки не препятствуют свободному сокращению подоцитов и при этом амортизируют и удерживают их от разрыва с базальной мембраной на уровне оснований ножевых отростков. Следовательно, подоциты гломерулярного фильтра почек позвоночных в морфофункциональном отношении несут двойную неоднородную нагрузку.

Факт активного участия цитоскелетных структур клеток капиллярной стенки почечных гломерул позвоночных в процессах ультрафильтрации в настоящее время вряд ли может серьезно оспорен. Поэтому основные физико-механические силы Старлинга (Starling, 1899), управляющие переносом жидкость и растворенных веществ через капиллярную стенку (гидростатическое и коллоидно-осмотическое цавление), целесообразно дополнить биологическим компонентом, представленным активно действующим цитоскелетом клеток гломерулярного фильтра почек.

4. Строение цитоскелета клеток эндотелия и мезангиума почечных гломерул.

Цитоскелет эндотелиальных клеток.Исследование эндотелия гломерул в электронном микроскопе, так же, как и подоцитов, явилось вторым историческим териодом в изучении структуры почки (Pease, 1955а). В клетках гломерулярного ¡ндотелия нефрона морских костистых рыб пучки промежуточных филаментов расположены циркумнуклеарно, плотно прилегают к ядерной оболочке, вплоть до юлного слияния с последней, а затем распространяются по всей цитоплазме. У млекопитающих (Zaitsev, 1994; Зайцев, 1996) в области перикариона располагаются ликротрубочки, собранные в пучки, которые, переходя в цитоплазму «перфорированных отростков, заякориваются в них на плазмалемме . В филегающих к перикариону участках цитоплазмы клеток микротрубочки образуют групноячеистую сеть с другими цитоскелетными структурами . Наблюдаются тесные шутриклеточные взаимосвязи микротрубочек с митохондриями, ядерной мембраной, комплексом Гольджи, плазмалеммой. В неперфорированных

маргинальных отростках эндотелия пучки микротрубочек близко примыкают к плазмалемме, плотным межклеточным контактам , элементам комплекса Гольджи, митохондриям и цистернам эндоплазматической сети. Отдельные микротрубочки раздваиваются на одном из свободных концов, образуя характерную Y - форму . Немногочисленные промежуточные филаменты обычно повторяют ход мнкротрубочек. Микрофиламенты образуют войлокообразную сеть, сосредоточенную в базальных отделах клеток. В фенестрированных участках цитоплазмы эндотелиоцитов микротрубочки обнаруживаются как изолированные , так и собранные в пучки . При этом микротрубочки располагаются в узких пространствах цитоплазмы между фенестрами и нередко наболюдаются их тесные контакты с плазмалеммой . В иммуноморфологических исследованиях с использованием непрямой иммунофлюоресцентной реакции на актин наблюдается яркое свечение почечных клубочков (Zaitsev, 1992; 1994; Зайцев-, 1996). Гетерогенное окрашивание клубочков обнаруживалось при реакции на виментин, широкораспространенного белка промежуточных филаментов (Zaitsev, 1992).

В реакции на актинсвязывающие белки в эндотелии почечных гломерул цыпленка установлен (Hanke, Drenckhahn, 1989) белок талин, посредством которого, как предполагается, актомиозиновый комплекс эндотелия соединяется с рецепторами фибронектина и ламина базальной мембраны гломерул. Наблюдаемое нами относительно доминирующее положение микротрубочек в цитоскелете исследуемых клеток у млекопитающих согласуется с данными Васмант и др. (Vasmant et al., 1984), изучавших ультраструктуру цитоскелета подоцитов и эндотелиальных клеток в почках человека и крыс. Показано, что во всех эндотелиальных клетках имеется анизотропность в организации цитоскелета (Миронов, Миронов, 1985), при которой пучки микрофиламентов располагаются преимущественно в продольном направлении, что является отражением ориентирующего влияния потока крови.

Микротрубочки, как известно, обеспечивают необходимые перемещения органелл клеток посредством так называемых "белков - моторов" (динеин, кинезин, динамин и др.), одним концом-головкой соединяющихся с микротрубочками, а другим - с органеллами (Kuznetsov, Gelfand, 1986; Stebbings, 1990; Kamimura, Mandelkow, 1992; Mitchison, 1992). Использование микротрубочек в качестве "рельсового" механизма для транспортировки органелл является энергозависимым процессом (Scholey, 1990) и, следовательно, наблюдаемые нами в эндотелиальных клетках тесные топологические взаимосвязи микротрубочек с митохондриями предполагают утилизацию при этом энергии АТФ, продуцируемой последними.

Преобладающая "масса" микротрубочек в цитоплазме исследованных нами эндотелиоцитов, по-видимому, "маскирует" в почках млекопитающих остальные менее развитые элементы цитоскелета. Этот феномен ни в коей мере не обусловлен техническими погрешностями (некачественной фиксацией и заливкой, низким разрешением электронного микроскопа и др.), а отражает реальную структуру цитоскелета клеток. Убедительным подтверждением этого являются электронограммы, на которых хорошо видна густая сеть микро- и промежуточны? филаментов в цитоплазме подоцитов, а в смежных эндотелиальных и мезангиальньи клетках они едва заметны. Причина крайне слабой выраженности промежуточны?

филаментов, отмеченной нами в цитоскелете эндотелия гломерул почек молодых крыс и человека, вероятно, может быть связана с возрастным фактором. Действительно, как было показано в предыдущей главе, при электронной и иммунофлюоресцентной микроскопии установлено, что мощно развитая система микротрубочек в подоцитах млекопитающих с увеличением возраста постепенно замещается системой промежуточных филаментов. Эту возрастную зависимость, по-видимому, с определенной долей осторожности можно экстраполировать и на цитоскелет других гломерулярных клеток. Эндотелий почечных гломерул позвоночных относится к фенестрированному типу (Pease, 1955; Шахламов, 1971: Караганов и др., 1981; Миронов, Миронов, 1983; Алимов и др., 1986), и в эндотелиальных порах, имеющих размеры от 50 до 100 нм, задерживаются только крупные белковые молекулы и форменные элементы крови. В то же время эндотелий может осуществлять эффективную "клапаннук>"функцию (Caulfield, Farquhar, 1974) благодаря высокой организации цитоскелета (Zaitsev, 1994; Зайцев, 1996), который способен изменять количество и морфологические параметры функционирующих фенестр, тем самым регулируя оптимальный доступ циркулирующей крови к фильтрующей поверхности капилляров для последующей более избирательной ультрафильтрации и образования первичной мочи. Ранее показанная нами (Zaitsev et al., 1988; Зайцев и др., 1989) морфофункциональная пластичность эндотелия в почечных гломерулах у человека также обусловлена адаптивными реакциями его цитоскелетных элементов, главными из которых являются системы микротрубочек и микрофиламентов.

Цитоскелет мезангиальных клеток. Впервые на светооптическом уровне мезангиум в почках у лабораторных животных наблюдал Циммерман (Zimmermann. 1933). Мезангиальные клетки, локализованные в аксиальной области почечных -ломерул, погружены в матрикс, вместе с которым в совокупности и образуют мезангиум. Материал матрикса мезангиума подобен (но не идентичен) "ломерулярной базальной мембране, он сформирован более грубыми фибриллами и меньшей электронной плотности. Мезангиальные клетки имеют неправильную ¡юрму с длинными цитоплазматическими отростками, отходящими от тела клетки. В плотной цитоплазме наблюдается хорошо развитая эндоплазматическая сеть, сомплекс Гольджи и густые пучки периферических микрофиламентов, имеющих -очки прикрепления в определенных участках плазмалеммы.

Наиболее сильно развит мезангиум у птиц. Он занимает обширную зону в яежкапиллярном пространстве почечных гломерул. У млекопитающих ломерулярный мезангиум выражен умеренно, в цитоплазме отмечаются [ромежуточные филаменты. В области перикариона наблюдаются центриоли с входящими от них микротрубочками, которые в цитоплазме собраны в пучки или <е располагаются изолированно. Микрофиламенты рассеяны по всей цитоплазме 1езангиальных клеток. При иммунофлюоресцентной микроскопии с использованием элуоресцеин-меченной антисыворотки к маточному актомиозину наблюдалось пецифическое окрашивание в мезангиальной области почечных гломерул человека Becker, 1972). Однако при иммуноэлектронной микроскопии с пероксидазной

меткой антител к актину и миозину экспрессии сократительных белков в мезангиуме почек крыс не отмечалось (Trenchev et al., 1976).

На фоне многочисленных данных о структуре цитоскелета мезангиальных клеток, где особое значение придается актино-миозиновым филаментам, нами впервые показана определяющая роль системы микротрубочек в организации цитоскелета мезангиальных клеток почек у высших позвоночных. В цитоплазме последних нами установлены центриоли, индуцирующие полимеризацию цитоплазматических микротрубочек в эукариотических клетках, а по завершении сборки определяющие их стабильность (Гельфанд и др. 1984; Воробьев, Надеждина, 1987; Гельфанд, 1989).

Следовательно, для архитектоники цитоскелета эндотелиальных и мезангиальных клеток почечных гломерул позвоночных характерна мозаичность расположения цитоскелетных элементов, среди которых доминирующими у низших позвоночных животных являются промежуточные филаменты, а у млекопитающих микротрубочки. В области перикариона клеток и прилегающих к нему участков цитоплазмы микротрубочки образуют диффузную крупнопетлистую сеть. В маргинальных отростках эндотелия микротрубочки представлены пучковым типом строения, а в перфорированной части цитоплазмы отдельные микротрубочки располагаются в узких пространствах между фенестрами. Микрофиламенты при электронной микроскопии четко не выявляются, но легко обнаруживаются при непрямой иммунофлуоресцентной реакции на актин. Синхронное действие всех цитоскелетных структур в эндотелиальных клетках предопределяет количество и морфологические параметры функционирующих фенестр и тем самым обуславливает и поддерживает необходимый уровень начальной фильтрации в почечных гломерулах у позвоночных.

5. Строение цитоскелета клеток канальцевой системы нефрона.

Первые электронно-микроскопические исследования канальцевой системы нефрона были предприняты в 50-х годах и явились третьим историческим периодом (Pease, 1955) в изучении почки с улучшенной фиксацией ткани и относительно высоким разрешением электронного микроскопа. Следовательно, почка стала одним из первых биологических объектов, на котором апробировались и усовершенствовались методические подходы в электронной микроскопии.

По аналогии с тремя указанными выше историческими периодами в изучена ультраструктуры почек (Pease, 1955) поиск сократительных структур в клетка> почечных канальцев нефрона следует считать четвертым, наиболее запутанным i противоречивым историческим периодом в исследовании почки.

Открывается он, как обычно, символической работой основоположник, электронной микроскопии биологических объектов Пиза (Pease, 1968) о миоидны) структурах в почке у крыс. Автор, применив метод инертной дегидратации ш нефиксированной почечной ткани, обнаружил систему толстых филаментов i основании клеток проксимальных канальцев и редкие единичные филаменты i дистальных канальцах, считая их миозиновыми и ассоциированными

тропомиозином Б. Размер филаментов колебался от 17 нм до 30 нм в диаметре. При этом автор сожалеет, что примененный метод обработки ткани не позволяет выявить одновременно с миозиновыми и актиновые филаменты, так как в процессе препаровки последние сильно деполимеризуются. Эта работа Пиза (Pease, 1968), как всегда безукоризненная в техническом исполнении, тем не менее вызывает некоторые вопросы по ее результатам. Метод инертной дегидратации, качественно превосходящий, по мнению автора, традиционные химические фиксации ткани, тем не менее почему-то "щадит" только грубые филаментные структуры и разрушает тонкие актиновые филаменты, которые хорошо сохраняются при рутинной обработке почечной ткани для электронной микроскопии. Автор пытается ответить на этот вопрос, но очень неуверенно, возникает ощущение, что и для него это является загадкой. Показанные в работе филаменты с очень нестабильными размерами вряд ли можно считать типичными для филаментов одной популяции миозиновых структур. В работе не раскрыта связь миозиновых филаментов с митохондриями, обычно локализованными в базальных компартментах клеток канальцев. Митохондрии в клетках проксимальных канальцев являются основными продуцентами макроэргов АТФ, необходимых для активного транспорта реабсорбируемых субстанций, поэтому "замещение" их миозиновыми филаментами едва ли может быть полезным для функционирования проксимальных канальцев. Работа Пиза (Pease, 1968), безусловно, имеет непреходящее фундаментальное значение для настоящих и будущих исследований цитоскелетных структур в почке позвоночных. Эта работа мэтра электронной микроскопии биологических объектов -наиболее цитируемая в литературе, но, к сожалению, только цитируемая, так как результаты ее до сих пор не повторены, хотя к настоящему времени метод инертной дегидратации в электронной микроскопии уже стал рутинным.

Позднее на светооптическом уровне в почках крыс и человека в норме и патологии при обработке почечных срезов таниновой и фосфомолибденовой кислот с леванол-прочным цианином 5 RN, описаны миоидные фибриллы в канальцевых и гломерулярных клетках (Harper et al., 1970). Миоидные фибриллы в эпителиальных клетках канальцев были едва различимыми, но становились хорошо заметными при патологических состояниях. Попытки авторов сопоставить обнаруженные ими структуры с миофнламентной системой, наблюдаемой при электронно-микроскопическом исследовании Пизом (Pease,1968) выглядят, на наш взгляд, малосостоятельными. Авторы приводят оригинальную схему базальных отделов клеток эпителия почечных канальцев с локализацией миоидных фибрилл, которая якобы согласуется с данными Пиза (Pease, 1968). В действительности показанная схема противоречит общепринятым представлениям о базальной мембране почечных канальцев как образовании с относительно ровной поверхностью и с внутренней -цитоплазматической, и с наружной - интерстициальнон сторон. На представленной же схеме базальная мембрана канальцев удивительно близко напоминает пластину "гофрированного шифера", в желобках которого располагаются пучки миоидных фибрилл, обнаруженных авторами. В основу подобного "шнферного" паттерна базальной мембраны канальцев положены результаты всего двух электронно-микроскопических исследований, выполненных на почках крыс (Waygh et al., 1967) и

мышей (Leak, 1968), в которых наблюдались регулярные гребни или кристы на внутренней поверхности базальной мембраны. На фоне многих десятков репрезентативных электронно-микроскопических исследований почек данные о "шиферном" паттерне базальной мембраны почечных канальцев представляются казуистическими. Отсюда и результаты исследования по "желобковому" расположению миоидных фибрилл в базальной мембране эпителиальных клеток канальцев нефрона, весьма сомнительны.

Многие факты по морфологии сократительных структур в эпителии почечных канальцев были поколеблены или опровергнуты при изучении почек методами световой и электронной иммуногистохимии. В 1972 году Беккер (Becker, 1972) провел иммуногистохимическое исследование почек человека с использованием кроличьей сыворотки к человеческому маточному актомиозину, конъюгированной с флюоресцином (F-AVAM). При иммунофлюоресцентной микроскопии после обработки F-AVAM замороженных срезов нормальных почек человека установлено, что почечные канальцы не окрашиваются F-AVAM, факт, доказывающий отсутствие в эпителиальных клетках канальцев актомиозина. При электронной иммуногистохимии с меткой антител пероксидазой хрена антисыворотка к актину окрашивала основания клеток проксимальных канальцев почки крысы, реакция на миозин была очень слабой или вообще не отмечалась, а тяжелый меромиозин не выявлялся совсем (Trenchev et al., 1976).

Тщательный анализ данных специальной литературы более чем за 100 лет позволяет прийти к заключению, что цитоскелет эпителиальных клеток почечных канальцев позвоночных животных и человека, в отличие от целостной, относительно самостоятельной организации цитоскелета в клетках гломерул, не имеет подобного строения, а цитоскелетные элементы входят составной частью в специализированные клеточные образования: реснички, микроворсинки и межклеточные соединения. В свою очередь, отдельные компоненты этих трех образований формируют в цитоплазме клеток канальцев, преимущественно в субапикальной зоне, терминальную сеть, основу которой составляют филаментные структуры. Отличительные особенности в организации цитоплазмы клеток гломерул и канальцев, влияющие на архитектонику их цитоскелета, заключаются в том, что форму канальцевых клеток определяют и поддерживают (одна из основных функций цитоскелета!) в их основании - развитый базальный лабиринт, сформированный складками плазматической мембраны, в апикальных отделах - терминальная сеть, а в латеральных отделах - межклеточные соединительные комплексы. Следовательно, морфофункциональная "ниша" цитоскелета, в общепринятом понимании этого термина (Lazarides, 1982), в клетках почечных канальцев занята, однако в составе специализированных образований цитоскелетные элементы участвуют во всех ключевых внутриклеточных процессах канальцев: продвижении и реабсорбции фильтрата, стабилизации и интеграции канальцевой системы, формировании шунтированных парацеллюлярных каналов и др.

Наиболее убедительным аргументом, подтверждающим наши представления о цитоскелете клеток почечных канальцев можно считать результаты изучения ультраструктуры нефрона пресноводной черепахи Mayremys caspica (Meseguer et al..

1987). В клетках проксимальных канальцев почки у этого вида черепах отсутствует базапьный лабиринт, а взамен его наблюдаются множественные пучки филаментов, простирающихся от основания клеток к ядру: при этом по характеру аггрегации они близки к промежуточным филаментам.

Реснички являются специализированными структурами апикальной поверхности клеток, хорошо развитые в шеечном сегменте нефрона, характерном для низших позвоночных. В шеечном сегменте множественные пучки ресничек заполняют узкий просвет, в проксимальных канальцах их значительно меньше, а в остальных клетках почечных сегментов они единичны. В среднем реснички имеют 515 мкм в длину и около 0.2 мкм в диаметре. Реснички развиваются из базальных телец, аналогов центриолей (Wolfe, 1972; Dustin, 1984), которые располагаются обычно в ряд под апикальной плазмалеммой. Центриоли (=базальные тельца) -короткие цилиндрические структуры диаметром 120-150 нм и длиной от 300 до 2000 нм. Стенка каждой из них состоит из девяти пучков микротрубочек, расположенных параллельно друг другу, по три микротрубочки в каждом пучке, называемом триплетом. Девять триплетов, составляющих базальное тельце, удерживаются в определенном положении фибриллами, тем самым формируя стенку цилиндра. Из дистального конца базальных телец образуется стержень (=аксонема), состоящий из микротрубочек, окруженный плазматической мембраной, с постоянным диаметром около 200 нм. Назальные тельца и, соответственно, сами реснички закрепляются в цитоплазме корешками или кинетодесмальнымн фибриллами (диаметр 6 нм). Кроме того, сбоку к базальному тельцу прикрепляется исчерченная структура - базальная ножка, к которой нередко бывают прикреплены микротрубочки и филаменты цитоплазмы. У наружного конца базальные тельца закрыты аморфной терминальной пластинкой толщиной около 30 нм, которая отделяет их от основания собственно реснички. Микротрубочки базального тельца и ресничек различаются в-количественно-топографическом отношении. В процессе ресничкогенеза две внутренние трубочки - дублеты каждого триплета базального тельца за счет полимеризации дистальных концов увеличиваются в длину и вместе с окутывающей их плазмалеммой выходят в просвет канальцев, формируя основу аксонемы. При этом третья трубочка из триплета не полимеризуется и остается в зоне базального тельца (Kalnins, Porter, 1969). В результате на поперечном сечении в базальных тельцах наблюдается девять триплетов, а в аксонеме девять дуплетов микротрубочек. Кроме того, в центре аксонемы образуются две одиночные микротрубочки , заключенные в оболочку, так называемая центральная пара или синглеты, формирующие структуру по типу 9 х 2 + 2, а в базальном тельце они отсутствуют, поэтому структура здесь по типу 9x3 + 0. Дублеты и синглеты реснички "сшиты" спиралевидными структурами радиальных связей (=споками) в единую структуру (Warner, 1972; Sleigh, 1974; Fawcett, 1986). Синглеты связаны с плазмалеммой на апикальном конце через систему горизонтальных дисков, так называемый "колпачок", имеющий боковые выросты, контактирующие непосредственно с мембраной. Область верхушки ресничек считается интегральной частью ее цитоскелета, где перекрещиваются множественные микротрубочки. Механизм движения ресничек заключается в скольжении дублетов микротрубочек в ресничке

относительно друг друга, при этом большую роль играют динеин-тубулиновые мостики, оказывающих действие по принципу положительной обратной связи (Lindeman, 1994). In vivo динеиновые ручки одного дублета, соприкасаясь с соседним дублетом, инициируют энергию, необходимую для приведения механизма скольжения в действие (Walczak, Nelson, 1994). Показано, что АТФ служит источником энергии биения ресничек, причем в основе этого лежат биохимические процессы, сходные с теми, которые вызывают сокращение мышечного волокна, поэтому каждая ресничка должна обладать собственным механизмом, трансформирующим энергию АТФ в механическую работу (Серавин, 1985). Расположенные на люминальной поверхности шейки нефрона в один ряд реснички совершают движения по очереди, проталкивая гломерулярный фильтрат в одном направлении к начальному сегменту проксимальных канальцев. В осуществлении двигательной функции ресничек большую роль играют базальные тельца, которые обладают АТФазной активностью и содержат актиноподобные белки (Поглазов, Бурнашева, 1989). Предполагается, что они могут функционировать как органеллы, регулирующие инициацию и координацию цикла биения ресничек внутри каждой клетки (Naiton, Kaneko, 1972; Fawcett, 1986; Поглазов, Бурнашева, 1989). Ритмичные биения ресничек эпителия шеечного сегмента нефрона у рыб обеспечивают активное продвижение первичной мочи вдоль поверхности почечных канальцев. Клетки остальных сегментов нефрона у рыб и млекопитающих имеют единичные реснички, и функция их не ясна.

Микроворсинки в клетках проксимальных канальцев нефрона позвоночных представлены в виде пальцевидных отростков апикальной плазмалеммы около 0.1 мкм в диаметре, выступающих в просвет канальца. В совокупности плотно упакованные микроворсинки образуют на свободной поверхности клетки щеточную каемку, заметную уже на светооптическом уровне, которая хорошо окрашивается реактивом Шиффа-иодной кислотой (PAS - реакция) и положительна на щелочную фосфотазу и Mg2+ АТФазу. Со стороны просвета канальцев щеточная каемка покрыта надмембранным слоем - гликокаликсом, состоящим из гликопротеидов, богатых сиаловой кислотой. Сердцевину микроворсинок составляет пучок актиновых филаментов, придающий микроворсинкам необходимую жесткость. При электронной микроскопии на поперечном сечении можно видеть 6-8 филаментов в каждой отдельной микроворсинке. Актиновые пучки формируются путем сшивания их между собой вдоль всей их длины цитоскелетными актинсвязывающими полипептидными белками виллином (мол. масса 95 кДа) и фимбрином (мол. масса 68 кДа) (Coudrier et al., 1988). Фимбрин - один из немногих цитоскелетных белков, который впервые был выделен из микроворсинок. В свою очередь, пучки микрофиламентов соединены с плазматической мембраной микроворсинок короткими, тонкими латеральными связками, образованными комплексом 110 kDa-полипептидом и кальмодулином (Bretscher et al., 1981; Matsudaira, Burgess, 1982; Mooseker et al., 1984; Coluccio, Bretscher, 1987). В наших иммунофлюоресцентных микроскопических исследованиях криостатных срезов почечной ткани морских костистых рыб с использованием фаллоидина, меченого родаминфлюоресцеином, четко прослеживается локализация актина в проекции щеточной каемки

проксимальных канальцев. Дистальный тонкий конец пучка актиновых филаментов кепирован и связан с плазматической мембраной. В качестве кепирующего фактора при этом рассматривается виллин. Проксимальный конец актиновых филаментов сердцевины микроворсинок, связанных в пучок спектриноподобным белком TW 260/240 ( Glenney, Glenney, 1984; Fulton,1984; Rodman, 1986), проникает в субапикальную цитоплазму и участвует в формировании терминальной сети (=цитоскелета) клеток почечных канальцев. Недавно в апикальной плазмалемме, формирующей микроворсинки почечных канальцев позвоночных, обнаружены амилорид-чувствительные натриевые каналы, ко-локализованные с цитоскелетными белками анкирином, фодрином и актином, из которых наиболее специфичным для этих каналов является анкирин (Smith et al., 1991).

Следовательно, щеточная каемка - уникальная органелла почечных канальцев, - имеет развитый цитоскелет. Белки цитоскелета представлены в двух доменах: архитектуре собственно микроворсинок (актин, анкирин, фимбрин, виллин, 110 кДа белок) и их проксимальных окончаниях с цитоскелетными компонентами терминальной сети цитоплазмы (актин, тропомиозин, цитокератин, миозин, альфа-актинин, винкулин, виллин, спиктриноподобный белок TW 260/240). В совокупности эти два домена цитоскелетных белков щеточной .каемки клеток почечных канальцев нефрона позвоночных составляют единый структурно-функциональный комплекс.

Межклеточные контакты. Связь клетки с клеткой и межклеточные взаимодействия в органах и тканях опосредуют и контролируют специальные соединительные образования, различные по морфологии и функциональной роли. У позвоночных известны четыре основных типа межклеточных контактов, различающихся по строению и функциям: плотный контакт (tight junction, zonula occludens), промежуточный контакт (intermediate junction, zonula adhaerens, puncta adhaerens, belt desmosome), десмосома (macula adhaerens) и щелевой контакт (gap junction, nexus) (Farquhar, Palade, 1963; Staehelin, 1974; Снигиревская, Комиссарчик, 1980).

Плотный контакт (=зона замыкания) в большинстве используемых методов фиксаций представляется пятислойной структурой, образованной путем слияния белковых слоев плазматических мембран соседних клеток. В плотном контакте сливаются только отдельные белковые частицы (=гребни) контактирующих мембран, формируя тяжи, плотно сцепленные наподобие застежки-молнии, перекрывающие на своем протяжении все межклеточное пространство. Поэтому, чем больше слившихся гребней в контакте, тем, естественно, длиннее подобные застежки-молнии и тем надежнее обеспечиваются его непроницаемость (Staehelin, Hull, 1978). В области плотных контактов определяются актинсвязывающие белки адьфа-актинин и винкулин, которые могут быть маркерами для определения этих типов межклеточных соединений (Geiger et al., 1981). Плотные контакты характерны для различных эпителиальных клеток, в том числе и для эпителия почечных канальцев позвоночных, где они располагаются сразу же под апнкальной плазмалеммон, углубляясь ниже на различные расстояния в виде сплошного пояска между боковыми поверхностями смежных клеток и изолируя межклеточное пространство от просвета канальцев.

Промежуточный контакт отражает в своем названии особенность локализации в составе межклеточного соединительного комплекса. В клетках почечных канальцев, как и в большинстве эпителиев, промежуточный контакт локализован тотчас под плотным контактом, окружая боковые поверхности соединяемых клеток сплошным поясом. Промежуточный контакт - семислойная структура, сформированная двумя соседними триплетами слоев плазматических мембран, которые не сливаются, сохраняя расстояние между собой около 20 нм, а очень прочно прилипают одна к другой благодаря межклеточному веществу и тонкофибриллярному материалу. Плазматические мембраны в области промежуточных контактов со стороны цитоплазмы покрыты электроноплотным материалом и соединены с микрофиламентами (диаметр 7 нм) терминальной сети субапикальной цитоплазмы клеток.

Десмосома (= пятно слипания), как и промежуточный контакт, относится к адгезивным контактам и представлена многослойной структурой в форме диска с диаметром, обычно не превышающим 0.4 мкм (Hull, Staehelin, 1979). В отличие от плотного и промежуточного контактов, структуры десмосомы не опоясывают клетку целиком, а прерываются, соединяя клетки наподобие "кнопок" (Комиссарчик, Миронов, 1990). Десмосомальные плазматические мембраны прямые и тонкие (толщиной около 6 нм) располагаются строго параллельно друг другу. Со стороны цитоплазмы они значительно утолщены за счет компактно" пристыкованных" к ним электроноплотных, толщиной около 14-20 нм, пластинок прикрепления. К последним латерально крепятся пучки петель тонофиламентов (=цитокератиновые промежуточные филаменты), диаметром 8-10 нм которые, закрепившись на пластинах и не нарушая целостности плазматических мембран, возвращаются назад в цитоплазму соответствующих клеток (Penn et al., 1987). Тонофиламенты -обязательный структурный компонент десмосом, поэтому в некоторых работах оперируют термином "десмосомо-тонофиламентный комплекс" (Franke, 1982; Ouyang, Sugrue, 1992). По средней линии десмосомальной межклеточной щели проходит центральная электроноплотная полоса шириной около 5-9 нм, состоящая из мелких гранул и тонких филаментов, прикрепленных к обеим десмосомальным пластинам и тем самым соединяющих их вместе через межклеточную щель. В различных типах эпителиев десмосомы способствуют межклеточной адгезии и обеспечивают их резистентность к механическим нагрузкам (растяжению, давлению и др.).

Десмосомы редко наблюдаются в проксимальных канальцах нефрона млекопитающих, они более типичны для почечных канальцев амфибий и определенных видов рыб, таких, как камбаловые. У морских костистых рыб десмосомы располагаются в эпителии почечных канальцев, обычно, как и во всех эпителиях, несколько ниже промежуточных контактов, тем самым завершая формирование в апикальных отделах клеток межклеточных соединительных комплексов. Следовательно, межклеточный соединительный комплекс включает в себя, последовательно, начиная от апикальной части к базальной , три вида контактов: плотный, промежуточный и десмосомальный.

У морской камбалы (Pleuronecies platessä), атлантической трески (Gadus morhua morhua), сайды (Pollachius virens) и семги (Salmo salar) в эпителии почечных канальцев ниже соединительного комплекса отдельные десмосомы уже автономно соединяют на всем протяжении боковые поверхности смежных клеток до базальной мембраны, располагаясь одна над другой. Особо следует отметить, что у близкородственного вида морской камбалы - морского языка (Parophrys vetulus) - в эпителии проксимальных канальцев нефрона, дополнительно к соединительному комплексу латеральные плазмалеммы соседних клеток соединены не десмосомами, а плотными контактами (Bulger, Trump, 1968), что обусловлено, по-видимому, не видовой специфичностью, а средой обитания этих рыб.

Щелевой контакт (=нексус) формируется между плазматическими мембранами смежных клеток с очень узким межклеточным пространством около 2 нм. С помощью специальных методов электронной микроскопии (электроноплотные метки гидроксид-лантана, рутений красный и др., замораживание-скалывание-травление, негативное контрастирование) выявлено глобулярное строение мембран щелевого контакта (Staehelin, 1974; Orci et al., 1982). Показано, что каждая глобула (=коннексон) состоит из шести субъединиц, располагающихся вокруг гидрофильного канала, проходящего на уровне середины межклеточной щели и непосредственно соединяющего цитоплазму двух соседних клеток (Zampighi, Simon, 1985). Открытие каналов моделируется совокупностью коннексонов, участвующих в образовании межклеточных контактов (Bruzzone et al., 1994). Данные о возможном участии цитоскелетных структур в формировании щелевых контактов чрезвычайно скудны и неоднозначны. В нефроне у представителей морских и проходных костистых рыб -морской камбалы Pleuronecies platessa (Olsen, 1970; Ottosen, 1978; Зайцев, 1983), морского языка Parophrys vetulus (Bulger, Trump, 1968), колюшек Gasterosteos aculeatus (Wendelaar, 1973) и Spinachia spinachia (Hentschel, 1977), мойвы Mallotus villosus (Зайцев, 1983), атлантического лосося Salmo salar (Зайцев, 1988; Zaitsev, 1989), также, как и у представителей рептилий - крокодила Crocodylus acutus (Davis, Schmidt-Nielsen, 1967) и пресноводных черепах Pseudemys scripta elegans и Mauremys caspica (Meseguer et al., 1987) щелевых контактов в эпителии почечных канальцев не обнаружено.

Терминальная сеть эпителиальных клеток почечных канальцев состоит из трех филаментных доменов, два из которых ассоциированы с межклеточным соединительным комплексом, а третий составляют базальные и корешковые окончания стержневых пучков микроворсинок (микрофиламенты) и ресничек (микротрубочки). Промежуточные цитокератиновые филаменты, связанные с десмосомами, формируют толстый плотный диск филаментов, ориентированный перпендикулярно актиновым пучкам микроворсинок. При непрямом иммунофлюоресцентном окрашивании криостатных срезов почек взрослой крысы моноклональными антителами к цитокератинам (белкам промежуточных филаментов) в цитоплазме эпителиальных клеток проксимальных канальцев, их апикальных и интермедиарных отделах, наблюдается яркое свечение. Выше десмосом промежуточный контакт ассоциируется с циркулярным кольцом актиновых филаментов, который заключает также в себе миозин (Rodman et al.,

1986; Burgess et al., 1987 ) и тропомиозин - актинстабилизирующий белок (Drenckhahn, Groschel-Stewart, 1980). Пучки актиновых филаментов плотно ассоциированы с мембраной промежуточных контактов, возможно, через комплекс, включающий альфа-актинин и винкулин.

Третий филаментный домен терминальной сети составляют корешки актиновых пучков сердцевины микроворсинок и базального аппарата ресничек. Два актинсвязывающих белка определяются в корешковых пучках микроворсинок -виллин и тропомиозин (Bretcher, Weber, 1978; Mooseker, 1985; Burgess et al., 1987). Корешки заключены в плотную сеть тонких филаментов, которые преимущественно поперечно соединяют соседние корешки. Некоторые их них принадлежат к распространенному классу актинсвязывающих спектриноподобных белков, родственных эритроцитарному спектрину (Glenney, Glenney, 1984). Спектриноподобный белок TW 260/240 при наличии аналогичной альфа-субъединицы, отличается от собственно спектрина бэта-субъединицей с мол. массой 260 кДа. Альфа-бэта-димеры этого белка формируют тонкие (диаметром около 5 нм) нити, связывающие корешки соседних актиновых пучков между собой и с плазматической мембраной клеток (Rodman et al.,1986).

Терминальная сеть субапикальной цитоплазмы клеток закрепляет филаментные актиновые пучки микроворсинок и базальный аппарат ресничек и тем самым стабилизирует их положение на апикальной поверхности клеток канальцев. Следует также отметить, что различные сегменты почечных канальцев имеют гетерогенные паттерны цитокератиновых филаментов, включающие разнообразные наборы прекератинов, как эпидермально-связанных полипептидов, так и полипептиды, которые главным образом тесно связаны с цитокератинами простых эпителиев печени и кишечника. Высокое развитие десмосом и связанные с ними цитокератиновые филаменты способствуют интеграции эпителиальных клеток. В этом плане апикальные отделы канальцевого эпителия нефрона соответствуют по функциональному предназначению "субапикальному скелетному диску", описанному в клетках кишечника (Franke et al., 1979). В этих клетках апикальный цитоскелетный комплекс функционирует как стабилизатор поверхностной части эпителиальных слоев, тогда как в средне-латеральных и базальных участках достаточную стабилизацию осуществляют клеточные интердигитации. В сущности терминальная сеть клеток почечных канальцев функционально, как и цитоскелет во всех эукариотических клетках, является механическим интегратором, но с характерными особенностями, так как объединяет в основном базальные филаменты компонентов ресничек и микроворсинок, а также латеральные актиновые и циркулярные десмосомальные цитокератиновые филаменты межклеточных соединительных комплексов.

6. Иммуноморфология цитоскелета клеток нефрона.

Следуя предложенной Пизом (Pease, 1955) периодичности в изучении структуры почки, исследование иммуноморфологии цитоскелета на световом и электронно-микроскопическом уровне можно с полным основанием считать пятым

(и, наверное, не последним!) историческим периодом на пути познания тонкого строения почек позвоночных. Все исследования в этом периоде выполнены на срезах почечной ткани или почечных клеток культуры ткани (эпителиальные клетки почек человека, крысы, детеныша хомяка ВНК, линии Мздин-Дарби почек быка MDBK и собаки МДСК) млекопитающих, за исключением наших работ (Зайцев, 1989; 1991; 1996; Zaitsev, 1992а, Ь, с, d; 1994; 1996), в которых впервые представлены данные по иммуногистохимии цитоскелетных белков почек низших позвоночных.

Иммуноморфологические исследования проведены на почках морских костистых рыб (морская камбала, камбала-ерш, пикша, атлантическая треска и сайда) и почках крыс различного возраста (6-7 недель, 4-5 месяцев, и 1.5 года). Исследования выполнялись на криостатных срезах с использованием непрямой иммунофлуоресцентной микроскопии.

Антитела к цитокератинам клонов HI, НЗ, Н4, Е2 и ЕЗ одинаково не окрашивают почечную ткань как морских рыб, так и крыс. Отрицательная реакция в аналогичных условиях получена также при использовании моноклональных антител к виментину человека (клон 30) и комбинированных антител к виментину и кератину (клон AI).

Поликлональная антисыворотка к виментину ярко окрашивает почечные гломерулы морской камабаы, камбалы-ерша и пикши, точно также, как и моноклональные антитела к виментину клона PN 1102 Amersham окрашивают гломерулы почек атлантической трески и сайды, но с более утонченным флуоресцирующим рисунком внутренней структуры гломерулярных капилляров. Виментин-позитивные участки почечных гломерул имеют четкую локализацию в области наружной поверхности капиллярных петель, обращенной в просвет боуменовой капсулы. Клетки париетального эпителия, выстилающие боуменову капсулу, показывают следовую или негативную реакцию к виментину. При обработке срезов почек крыс антивиментиновой поликлональной сывороткой и моноклональными антителами к виментину PN 1102 Amersham интенсивность окраски гломерул коррелирует с возрастом экспериментальных животных. Наиболее сильная реакция на виментин отмечается в почках старых крыс, менее сильная у взрослых и слабая у молодых. Обратная возрастная зависимость прослеживается при выявлении в почках актина. Интенсивная окраска при обработке срезов почки меченным фаллоидином наблюдается в почечных гломерулах у молодых и менее выраженная у старых крыс.

В эпителии почечных канальцев морских костистых рыб, так же, как и у крыс, отмечается негативная реакция на виментин, за исключением локальных точечных ярких свечений в межклеточных пространствах проксимальных канальцев нефрона. соответствующих расположению недифференцированных, так называемых "блуждающих клеток" ("wandering cells") (Bulger, Trump, 1968). Перитубулярная промежуточная (= интерстициальная) ткань, экспрессирующая виментин, особенно у морских рыб, при иммунофлюоресцентной реакции представляется в виде узких светящихся ободков, плотно окружающих почечные канальцы.

Из семи клонов моноклональных антител к цитокератинам, использованных нами, лишь антитела клона CI2, реагирующие с цитокератином крысы, имеющим

мол. массу 49 кДа, оказались эффективными при окраске как почек морских рыб, так и крыс. Подробное описание этих моноклональных антител (клон С12) представлено в ряде работ (Трояновский и др., 1984, 1985, 1986; Гелыитейн и др., 1985; Крутовских, Трояновский, 1985). Клетки почечных гломерул оказались кератин-негативными, за исключением отдельных окрашенных локусов в проекции париетального эпителия боуменовой капсулы и единичных клеток капиллярных петель гломерул. В клетках канальцевого эпителия наблюдается кератин-позитивная окраска главным образом в апикальных и интермедиарных отделах клеток, а неокрашенными остаются только полоски цитоплазмы над базальной мембраной. У крыс в клетках канальцев почек окрашенные кератин-позитивные участки цитоплазмы на поперечном сечении имеют вид 4-х лепестковых образований, а на продольном сечении выглядят как гофрированные трубки. Актин, выявляемый меченным фаллоидином, располагается в эпителии почечных канальцев тончайшим слоем и отдельными точечными кластерами на апикальной поверхности клеток.

Результаты проведенных иммуноморфологических исследований цитоскелетных почечных белков органично соотносятся с изученной нами архитектоникой цитоскелета клеток нефрона позвоночных. Обилие виментина в гломерулах почек рыб в основном определяется мощно развитой системой пучков промежуточных филаментов в цитоплазме их подоцитов (Зайцев, [983; 1984; 1989; Зайцев, Гамбарян, 1985; 1986; Zaitsev, 1992а, Ь, с). В почках млекопитающих реакция на виментин выражена слабее, так как в их подоцитах промежуточные филаменты не собраны в пучки, а рассеяны по всей цитоплазме. С возрастом в подоцитах почек млекопитающих промежуточные филаменты приобретают пучковый тип строения (Зайцев и др., 1989), и тогда окраска на виментин в их гломерулах по интенсивности приближается к гломерулам морских рыб, что особенно выражено у старых крыс. Окрашивание почечных гломерул на актин суммарно отражает его присутствие в цитоскелете подоцитов, эндотелиальных и мезангиальных клеток. Актин локализуется в эпителии щеточной каемки и межклеточных плотных контактах субапикальной области клеток. Обширные цитокератин-положительные участки в цитоплазме эпителиальных клеток почечных канальцев связаны с двумя доменами цитокератиновых промежуточных филаментов в почечных канальцах: терминальной сетью и десмосомами.

На основании факта ко-экспрессии подоцитами виментина и десмина, что характерно лишь для гладкомышечных клеток, а также утверждения об отсутствии в подоцитах десмосом, обычных маркеров всех типов эпителия (ВасИтапп е! а1., 1983), предлагается ревизовать понятие эпителиальных клеток применительно к подоцитам. Однако вряд ли подобные попытки можно рассматривать достаточно обоснованными, так как в действительности подоциты низших позвоночных обладают, возможно, немногочисленными, но хорошо развитыми десмосомами с типичным строением. В таком случае все же остается загадкой, почему подоциты не экспрессируют цитокератины, белки промежуточных филаментов, которые структурно входят обязательным компонентом в состав десмосом и являются надежными маркерами последних.

Следовательно, иммуноморфологические исследования почек позвоночных позволили не только обнаружить и определить ультраструктурную локализацию цитоскелетных белков в клетках нефрона, но и показать зависимость их характеристик от уровня фило- и онтогенеза позвоночных животных и человека. Актин, миозин, альфа-актинин, тяжелый меромиозин, винкулин, талин сосредоточены в ножевых отростках подоцитов, а в цитоплазме тела подоцитов и трабекулярных отростках локализованы преимущественно тубулин и виментин. Все указанные белки представлены в цитоплазме эндотелиальных и мезангиальных клеток, но в меньшей степени, а десмин, кроме того, обнаруживается и в мезангиуме. В клетках эпителия почечных канальцев актин и актин-связывающие белки, миозин, тубулин и цитокератины сконцентрированы в апикальных отделах (щеточная каемка, реснички, межклеточные соединительные комплексы и терминальная сеть), а цитокератины дополнительно локализованы в цитоплазме базо-латеральных отделов проксимальных канальцев и соответствуют расположению в них десмосом и полудесмосом. Вопрос о ко-экспрессии виментина и десмина в мезангиальных клетках нормальных почечных гломерул детерминирован видовой принадлежностью и пока остается открытым. Во всех остальных случаях ко-экспрессия белков промежуточных филаментов (виментин-десмнн, виментин-цитокератины и др.) возможна лишь в почечных клетках культуры ткани и патологически измененной почке.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Расплывчатое понятие фибриллярности цитоплазмы клеток, которое прогнозировалось многими исследователями, включая наблюдения Левенгука об эластических свойствах эритроцитов, лишь за последние 30 лет развилось в четкое представление о существовании в эукариотических клетках сложнейшей организации динамичных "самособирающихся" филаментных структур (микротрубочек, микро- и промежуточных филаментов) с выраженной внутриклеточной иерархией, специфическими индукторами, ингибиторами и стабилизаторами. К цитоскелету эукариотических клеток относятся также мембранный (сеть спектриноподобного белка) и ядерный скелет (ламин). Вследствие полярности мономеров и полимеризации "голова-хвост" тубулиновые микротрубочки и актиновые микрофиламенты поляризованы и имеют "плюс" и "минус" концы. Образование прмежуточных филаментов происходит за счет антипараллельного бокового связывания двух димеров, поэтому они не поляризованы. Промежуточные филаменты объединены в пять больших классов в зависимости от типа клеток. Специфические свойства микротрубочек и микрофиламентов определяются, главным образом, ассоциированными с тубулином и актином соответственно различных минорных белков, которые обеспечивают их связь с плазмалеммой и внутриклеточными мембранами, а также и зависящие от АТФ двигательные реакции (миозины, кинезин, динеин). Цитоскелет активно участвует во всех процессах жизнедеятельности немышечной клетки: развитии, поддержании и изменении формы, митозе, эндо- и экзоцитозе, цитокинезе, локализации и закреплении ядра с

обеспечением ядерно-плазмалеммальных связей, образовании специализированных клеточных структур (ресничек, микроворсинок, межклеточных контактов и терминальной сети), осуществлении механической интеграции и транспорте внутриклеточных компонентов, генерации и стабилизации клеточной полярности. Настоящее исследование является первой попыткой на основе собственных результатов и данных литературы раскрыть цитоскелетные основы фукционирования клеток нефрона позвоночных.

Впервые методами электронной и иммунофлюоресцентной мироскопии проведено исследование цитоскелета клеток нефрона у представителей основных классов позвоночных от круглоротых до человека. Показан различный уровень организации цитоскелета клеток с гетерогенным составом филаментных структур в зависимости от филогенетического положения объектов и функциональной почечной нагрузки, которая обусловлена эколого-физиологическими факторами. В почечных гломерулах позвоночных наиболее сильно развит цитоскелет в подоцитах, менее в клетках эндотелия, мезангиума и париетального эпителия. Установлено, что у круглоротых и морских костистых рыб в цитоскелете подоцитов доминируют пучки виментиновых промежуточных филаментов. Та же картина наблюдается в подоцитах пластиножаберных, проходных и пресноводных костистых рыб, но у последних отмечается, кроме того, слабо выраженная микрофиламентная система и единичные микротрубочки. Подоциты амфибий и рептилий в равных соотношениях содержат пучки промежуточных филаментов и микротрубочки с умеренно развитой сетью микрофиламентов. В цитоскелете подоцитов птиц и особенно млекопитающих преобладают микротрубочки, имеется плотная микрофиламентная сеть и единичные промежуточные филаменты. При непрямой иммунофлюоресцентной реакции на виментин, белок промежуточных филаментов, наблюдается яркое свечение в почечных клубочках рыб и менее выраженное в почках крыс. Обратное соотношение в интенсивности реакции наблюдалось при выявлении актина, когда почки крыс, особенно молодых, окрашивались хорошо, а в почечных клубочках рыб свечение было слабым. В то же время почечные клубочки старых крыс по характеру иммунофлюоресцентной реакции на виментин и актин приближаются к почкам рыб: яркое виментин-положительное свечение и слабое окрашивание на актин. Следовательно, в подоцитах у представителей позвоночных от круглоротых до млекопитающих прослеживается замена промежуточных филаментов микрогрубочками, а в онтогенезе млекопитающих наблюдается диаметрально противоположная тенденция. У человека установлены две популяции подоцитов с различным типом строения цитоскелета. Первый тип характеризуется разветвленной, высокой плотности сетью микрофиламентов, развитой системой микротрубочек и относительно малочисленными промежуточными филаментами. Подоциты с такой организацией цитоскелета активно функционируют в почках человека лишь в молодом возрасте, так как от 34 до 50 лет в почках человека наблюдаются подоциты преимущественно с цитоскелетом второго типа, для которого характерны множественные пучки промежуточных филаментов, немногочисленные микрофиламенты и единичные микротрубочки. В почках человека старше 65 лет второй тип цитоскелета подоцитов, с преобладанием пучков

промежуточных филаментов, становится обычным. Иными словами в ходе онтогенеза человека выявляется противоположная закономерность, чем та, которая наблюдается в филогенезе позвоночных - постепенное замещение мощно развитой системы промежуточных филаментов в цитоскелете подоцитов у низших позвоночных системами микротрубочек и микрофиламентов в почках млекопитающих. Итак, в процессе индивидуального развития и старения в почках высших животных и человека происходят морфофизиологические изменения, вызывающие перестройку цитоскелета подоцитов, которая сопровождается интенсивным развитием систем промежуточных филаментов с одновременным уменьшением количества микрогрубочек и микрофиламентов.

В стенке клубочковых капилляров главным барьером в процессах почечной ультрафильтрации являются фильтрационные щели и щелевые диафрагмы подоцитов, тогда как базальная мембрана представляет собой лишь грубый префильтр. Функциональное состояние главного фильтра всецело определяется размерами и формой ножевых отростков, которые могут изменяться под воздействием цитоскелетных структур. Конформационные изменения ножевых отростков возможны лишь при тесных взаимодействиях цитоскелетных элементов с плазмалеммой подоцитов. Белок промежуточных филаментов виментин связывается с плазматической мембраной напрямую своим головным амино-концевым участком. Актиновые микрофиламенты соединяются с подоцитолеммой опосредованно через белок винкулин, который имеет сайты с одной стороны для связи с актиновыми филаментами, а с другой с белком талином, способным "пристыковываться" к липидному бислою плазматической мембраны. С учетом морфофизиологических особенностей гломерулярной фильтрации в почках позвоночных животных и человека имеются две разновидности подоцитов, отличающихся по топографии и функциональному предназначению. Расположенные в начале клубочковых капилляров, где эффективное фильтрационное давление (ЭФД) максимальное и образование фильтрата не затруднено, подоциты с их комплексом фильтрационных щелей и диафрагм осуществляют "контрольно-ограничительную" роль. Такие подоциты всегда имеют выраженные щелевые диафрагмы, указывающие на локализацию и принадлежность их к афферентному отделу гломерулярных капилляров. Ближе к эфферентному концу капилляров, по мере снижения ЭФД, для его компенсации функция подоцитов сменяется на "насосную", которая обеспечивается хорошо развитым цитоскелетом в теле клеток и трабекулах, наличием субподоцитарного пространства и лучевых ультрафиламентов оснований ножевых отростков.

Подоциты как эпителиальные клетки имеют необычную природу. Они экспрессируют промежуточные филаменты только виментинового типа, что является редким исключением из общепринятых классификаций промежуточных филаментов, согласно которым эпителиальные клетки содержат лишь цитокератиновые филаменты, поэтому есть основания причислить подоциты к клеткам эпителиоидного типа. Однако по всем критериям к последним можно отнести, и, конечно, с определенной долей осторожности, только подоциты высших позвоночных, которые имеют атипичные десмосомы и экспрессируют виментин.

Подоциты же низших позвоночных, согласно нашим данным, занимают промежуточное положение между истинными эпителиальными (по наличию типичных десмосом) и эпителиоидными (по содержанию виментина) клетками.

Гликокаликс подоцитов и их отростков, будучи отрицательно заряженным, играет роль ограничителя для фильтруемых макромолекул с одноименным зарядом. А сама подоцитолемма в соответствии с результатами наших электронно-гистохимических исследований представляет домен, где протекают процессы гликолитического фосфорилирования в ходе которых генерируются молекулы АТФ, необходимые для энергетического обеспечения эффективного функционирования цитоскелета подоцитов. Поэтому повышение порозности капиллярной стенки гломерул может быть связано не только с потерей гликокаликсом отрицательного заряда, но и более глубокими изменениями в плазмалемме подоцитов, блокирующих процессы гликолиза и нарушающих адекватное энергоснабжение цитоскелетных структур, что негативно отражается на функциональном состоянии фильтрационных щелей и их диафрагм.

В эндотелиальных и мезангиальных клетках гломерул почек позвоночных установлена характерная мозаичность расположения цитоскелетных элементов, среди которых доминирующими являются микротрубочки. В области перикариона эндотелиоцитов и прилегающих к нему участков цитоплазмы микротрубочки образуют диффузную крупноячеистую сеть. В маргинальных отростках эндотелия микротрубочки собраны в пучки, а в перфорированной части цитоплазмы разрозненные микротрубочки располагаются в узких пространствах между фенестрами. Микрофиламенты на фоне хорошо развитой системы микротрубочек едва различимы, но легко обнаруживаются при непрямой иммунофлюоресцентной реакции на актин. Цитоскелет в эндотелии регулирует количество и морфологические параметры функционирующих фенестр и тем самым контролирует и поддерживает необходимый уровень начальной фильтрации в почечных гломерулах позвоночных. Содержание многочисленных белков микро- и промежуточных, филаментов (актина, альфа-актинина, виментина, винкулина, миозина, десмина и талина) и развитой системы микротрубочек в мезангиуме почечных гломерул обеспечивает ему функциональную мультипотентность, в том числе, способность к сокращению и выполнению роли "чистильщика" гломерулярной базальной мембраны от остатков фильтрата.

С учетом накопленных к настоящему времени фактов, предлагается основные физико-химические силы Старлинга (Starling, 1899), управляющие переносом жидкости и растворенных веществ через капиллярную стенку (гидростатическое и коллоидно-осмотическое давление), дополнить биологическим компонентом, представленным активно действующим цитоскелетом клеток фильтрационного барьера почечных гломерул позвоночных. В цитоскелете клеток париетального эпителия почечных гломерул в ходе филогенеза позвоночных, как и в подоцитах, наблюдается постепенное замещение пучков промежуточных филаментов на микротрубочки и микрофиламенты. Однако эти клетки, в отличие от подоцитов, которые содержат виментиновые промежуточные филаменты, экспрессируют

цитокератины, что, видимо, связано с определенной их дивергенцией в процессе дифференцировки.

В канальцевой системе нефрона позвоночных цитоскеяет участвует в образовании специализированных клеточных структур: ресничек, микроворсинок, межклеточных контактов и в формировании терминальной сети клеток. Ресничные клетки обычно сосредоточены в шеечном сегменте, характерном для нефрона низших позвоночных. Реснички имеют типичную сложную структуру из микротрубочек и комплекса специальных белков. Дуплеты аксонемы ресничек снабжены парой коротких наружной и внутренней ручек, обладающих АТФазной активностью (кзоинзимные белки динеина) и соединенных нексиновыми связками. Ритмичные биения ресничек эпителия шейки нефрона обеспечивают активное продвижение первичной мочи вдоль апикальной поверхности клеток почечных канальцев. Микроворсинки, формирующие уникальную органеллу почечных канальцев, - щеточную каемку, имеют развитый цитоскеяет. Сердцевину микроворсинок составляют актиновые филаменты, "сшитые" в пучки актинсвязывающими белками виллином и фимбрином. Пучки филаментов соединяются с плазмалеммой латеральными связками, образованными 110кДа -кальмодулиновым комплексом, который обладает АТФазной активностью. Дистальный конец микроворсинки кэпирован белком виллином и связан с плазмалеммой. Корешки пучков актиновых филаментов соединены в цитоплазме сетью спектринподобного белка. Цитоскелет микроворсинок щеточной каемки обеспечивает последней роль основного домена в проксимальных канальцах по реабсорбции гломерулярного фильтрата.

Цитоскелетные элементы участвуют в формировании трех типов межклеточных контактов в почечных канальцах позвоночных: плотных, промежуточных и десмосом. Плотные контакты располагаются непосредственно под апикальной плазмалеммой, изолируя межклеточные щели от просвета канальцев. В области плотных контактов выявляются актиновые филаменты и актинсвязывающие белки (альфа-актинин, винкулнн). Промежуточные контакты находятся ниже плотных соединений и связаны с микрофиламентами терминальной сети субапикальной цитоплазмы клеток. Десмосомы следуют за промежуточными контактами, завершая формирование межклеточного соединительного коплекса. Плазмалемма в области десмосом утолщена за счет примыкающих к ней электроноплотиых пластинок прикрепления, которые латерально соединяются с пучками цитокератиновых промежуточных филаментов, образуя десмосомо-тонофиламентный комплекс. Десмосомы более типичны для почек амфибий и морских костистых рыб (камбаловых), чем для клеток нефрона млекопитающих. Проницаемость межклеточных контактов канальцевого эпителия нефрона позвоночных определяется видовой принадлежностью, подвержена влиянию экологических факторов и обусловлена типом осморегуляции.

Терминальная сеть, которую мы рассматриваем как аналог цитоскелета, в клетках канальцевого эпителия состоит из трех филаментных доменов, два из которых ассоциированы с межклеточным соединительным комплексом. Они включают в себя десмосомальные цитокератиновые филаменты и пучки актиновых

микрофиламентов, содержащих также миозин и гропомиозин, и прочно связанных с мембраной промежуточных контактов посредством комплекса интегрированных белков (альфа-актинин и винкулин). Третий домен терминальной сети составляют корешки стержевых актиновых пучков микроворсинок, включающих белки виллин и тропомиозин и объединенных вместе связками спектринподобного белка. В ресничных клетках этот домен представлен корешками базального аппарата ресничек. Все три домена формируют единый структурно-функциональный комплекс терминальной сети (= цитоскелет) клеток почечных канальцев позвоночных.

ВЫВОДЫ

1. Впервые методами электронной и иммунофлюоресцентной микроскопии проведено исследование цитоскелета клеток нефрона у представителей основных классов позвоночных животных и человека. В почечных гломерулах наиболее сильно развит цитоскелет в подоцигах, менее - в клетках эндотелия, мезангиума и париетального эпителия. Установлено, что у круглоротых и морских костистых рыб в цитоскелете подоцитов доминируют пучки виментиновых промежуточных филаментов. Та же картина наблюдается в подоцитах пластиножаберных, проходных и пресноводных костистых рыб, но у последних отмечаются дополнительно слабо выраженная микрофиламентная сеть и единичные микротрубочки. Подоциты амфибий и рептилий в равных соотношениях содержат пучки промежуточных филаментов и микротрубочки с умеренно развитой системой микрофиламентов. В цитоскелете подоцитов птиц и особенно млекопитающих преобладают микротрубочки, имеется плотная микрофиламентная сеть и единичные промежуточные филаменты. Следовательно, в цитоскелете подоцитов от круглоротых до млекопитающих прослеживается тенденция к замещению системы промежуточных филаментов микротрубочками.

2. В почках человека установлены две популяции подоцитов с различным типом строения цитоскелета. Первый тип цитоскелета подоцитов имеет разветвленную, высокой плотности сеть микрофиламентов, развитую систему микротрубочек и относительно малочисленные промежуточные филаменты. Такие подоциты характерны для почек человека молодого возраста, потому что в дальнейшем, к старости, они замещаются подоцитами со структурой цитоскелета второго типа, представленной множественными пучками промежуточных филаментов, немногочисленными микрофиламентами и единичными микротрубочками. Значит, в ходе онтогенеза человека выявляется противоположная закономерность, чем та, которая наблюдается в филогенезе позвоночных -постепенное замещение мощно развитой системы промежуточных филаментов в цитоскелете у низших позвоночных системами микротрубочек и микрофиламентов в почках млекопитающих. Следовательно, в процессе индивидуального развития и старения в почках высших животных и человека происходят морфофизиологические изменения, вызывающие перестройку цитоскелета подоцитов, которая сопровождается интенсивным развитием системы промежуточных филаментов с одновременным уменьшением количества микротрубочек и микрофиламентов.

3. В стенке клубочковых капилляров главным барьером в процессах почечной ультрафильтрации являются фильтрационные щели и щелевые диафрагмы подоцитов, функциональное состояние которых всецело определяется размерами и формой ножевых отростков, изменяющихся под воздействием цитоскелетных структур. Последние представлены в почках низших позвоночных и рептилий промежуточными филаментами, а у птиц и млекопитающих - микрофиламентами.

4. В связи с морфофизиологическими особенностями гломерулярной фильтрации в почках позвоночных животных и человека имеются две разновидности подоцитов, отличающихся по топографии и функциональному предназначению. Расположенные в начале клубочковых капилляров, где эффективное фильтрационное давление (ЭФД) максимальное и образование фильтрата не затруднено, подоциты с их комплексом фильтрационных щелей и диафрагм выполняют "контролирующую" роль. Такие подоциты всегда имеют очень четко выраженные щелевые диафрагмы, указывающие на локализацию и принадлежность их к афферентному отделу гломерулярных капилляров. Ближе к эфферентному концу капилляров, по мере снижения ЭФД, для его компенсации функция подоцитов сменяется на "насосную", которая обеспечивается развитым цитоскелетом в тете клеток и трабекулах, наличием субподоцитарного пространства и лучевых ультрафиламентов оснований ножевых отростков.

5. Подоциты экспрессируют промежуточные филаменты только виментинового типа, что является редким исключением из существующих классификаций промежуточных филаментов, согласно которым эпителиальные клетки должны содержать лишь цитокератиновые филаменты. На основании этого предпринимаются попытки причислить подоциты к клеткам эпителиоидного типа. Однако по всем критериям к эпителиоидным клеткам можно отнести, и, конечно, с определенной долей осторожности, только подоциты высших позвоночных, которые имеют атипичные десмосомы и экспрессируют виментин. Подоциты же низших позвоночных, согласно нашим данным, занимают промежуточное положение между эпителиальными (по наличию типичных десмосом) и эпителиоидными (по удержанию виментина) клетками.

6. Плазмалемма подоцитов и их отростков, в соответствии с результатами шектронно-гистохимических исследований, представляет домен, где протекают троцессы гликолитического фосфорилирования в ходе которых генерируются молекулы АТФ, необходимые для энергетического обеспечения эффективного функционирования цитоскелета подоцитов. Поэтому повышение порозности •ломерулярного фильтра может быть связано не только с потерей гликокаликсом зтрицательного заряда, но и с более глубокими изменениями в подоцитолемме, >локирующими процессы гликолиза и нарушающими адекватное энергоснабжение щтоскелета ножевых отростков подоцитов, что негативно влияет иа функциональное состояние фильтрационных щелей и их диафрагм.

7.Фенестрированный эндотелий почечных гломерул позвоночных имеет [ысокую порозность и не обладает значительной барьерной функцией, но (етерминирует общую поверхность капилляров, доступную для фильтрации, >лагодаря развитому цитоскелету, регулирующему размеры и количество

функционирующих эндотелиальных фенестр. Цитоскелет мезангиальных клеток почек высших позвоночных и человека, наряду с актино-миозиновыми структурами, по нашим данным включает и развитую систему микротрубочек.

8. С учетом накопленных к настоящему времени фактов, следует считать, что основные физико-химические силы, управляющие переносом жидкости и растворенных веществ через гломерулярный фильтр, действуют взаимно с цитоскелетом клеток, входящих в его состав.

9. В цитоскелете клеток париетального эпителия почечных гломерул в ходе филогенеза позвоночных, как и у подоцнтов, наблюдается постепенное замещение пучков промежуточных филаментов на микротрубочки и микрофиламенты. Однако эти клетки, в отличие от подоцитов, которые содержат виментиновые промежуточные филаменты, экспрессируют цитокератины, что, видимо, связано с определенной дивергенцией в процессе их дифференцировки.

10. В канальцевой системе нефрона позвоночных цитоскелет участвует в образовании специализированных клеточных структур: ресничек, микроворсинок, межклеточных контактов и в формировании терминальной сети клеток. Ресничные клетки обычно сосредоточены в шеечном сегменте, характерном для нефрона низших позвоночных. Реснички имеют типичную сложную структуру из микротрубочек и комплекса специальных белков. Ритмичные биения ресничек эпителия шейки нефрона обеспечивают активное продвижение первичной мочи вдоль апикальной поверхности клеток почечных канальцев.

11. Микроворсинки, формирующие уникальную органеллу почечных канальцев - щеточную каемку, имеют развитый цитоскелет. Сердцевину микроворсинок составляют актиновые филаменты, "сшитые"в пучки актинсвязывающими белками виллином и фимбрином. Пучки филаментов соединяются с плазмалеммой латеральными связками, образованными 110 кДа -кальмодулиновым комплексом, который обладает АТФазной активностью. Дистальный конец микроворсинки кепирован белком виллином и связан с плазмалеммой. Корешки пучков актиновых филаментов соединены в цитоплазме клеток сетью спектриноподобного белка. Цитоскелет микроворсинок щеточной каемки обеспечивает последней роль основного домена в клетках проксимальных канальцев по реабсорбции гломерулярного фильтрата,

12. Цитоскелетные элементы участвуют в формировании трех типов межклеточных контактов в почечных канальцах позвоночных: плотных, промежуточных и десмосом. Плотные контакты располагаются непосредственно под апикальной плазмалеммой, изолируя межклеточное пространство от просвета канальцев. В области плотных контактов выявляются актиновые филаменты и актинсвязывающие белки (альфа-актинин. винкулин). Промежуточные контакты находятся ниже плотных соединений и связаны с микрофиламентами терминальной сети субапикальной цитоплазмы клеток. Десмосомы следуют за промежуточными контактами, завершая формирование межклеточного соединительного комплекса. Плазмалемма в области десмосом утолщена за счет примыкающих к ней электроноплотных пластинок прикрепления, которые латерально соединяются с пучками промежуточных филаментов, образуя десмосомо-тонофиламентный

комплекс. Десмосомы более типичны для почек амфибий и морских костистых рыб (камбаловых), чем млекопитающих.

13. Терминальная сеть, которую мы рассматриваем как аналог цитоскелета, в клетках канальцевого эпителия состоит из трех филаментных доменов, два из которых ассоциированы с межклеточным соединительным комплексом. В них включаются десмосомальные цитокератиновые филаменты и пучки актиновых микрофиламентов, содержащих также миозин и тропомиозин, и прочно связанных с мембраной промежуточных контактов посредством интегрированных белков (альфа-актинин, винкулин). Третий домен терминальной сети составляют корешки стержневых актиновых пучков микроворсинок, включающих белки виллия и тропомиозин, и объединенных вместе связками спектринподобного белка. В ресничных клетках этот домен представлен корешками базального аппарата ресничек. Все три домена формируют единый структурно-функциональный комплекс терминальной сети (= цитоскелет) клеток почечных канальцев позвоночных.

14. Дифференцированные эпителиальные клетки почечных канальцев позвоночных экспрессируют исключительно цитокератиновые промежуточные филаменты, но при их пролиферации, индуцируемой нефротоксическими факторами или неопластической трансформацией возможна ко-экспрессия цитокератгаюв и виментина, что является очень важным и характерным признаком, который необходимо учитывать в диагностических целях.

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

А. Публикации в центральных и зарубежных журналах

1. Ультраструктурная особенность локализации лактатдегидрогеназы в клубочке почки // Цитология. 1976. Т. 1В, №11. С. 1319-1321. (в соавторстве с Д.И.Рыжаковым).

2. Локализация сукцинатдегидрогеназы в митохондриях почечных канальцев холоднокровных и теплокровных животных // Ж. эвол. биохим. и физиол. 1979. Т. 15, №6. С. 567-569.

3. Ультраструктурная организация мальпигиева тельца почек атлантической трески //Цитология. 1980. Т.22, №2 С. 149-153.

4. Микрофиламенты в подоцитах почек у морских рыб // Цитология. 1983а. Т.25, №3. С. 337-339.

5. Морфология клеток дистального сегмента нефрона мойвы МаПоШБ уШояиз // Ж. эвол. и физиол. 19836. Т. 19. №3. С. 310-312.

5. Структура и ультраструктура нефрона почек морской камбалы (Р1еигопес1е5 рЫеэБа Ь.) //В кн: Особенности биологии рыб северных морей. Л.: Наука, 1983в. С. 118-130. \ Ультраструктура сократительного аппарата подоцитов почек в филогенезе позвоночных // Бюл. экспер. биол. Мед. 1984а. Т.97.№6. С. 750-753.

8. Цитоскелет подоцитов в почках морских рыб // Цитология. 19846. Т.22, №9. С. 1068-1069.

9. Эволюционная морфология цитоскелета подоцитов почек у представителей основных классов позвоночных // ДАН СССР. 1985. Т.282, №4. С. 990-992. (в соавторстве с С.П.Гамбаряном).

10. Ультраструктура почечных клубочков летучей рыбы Exocoetus volitans H Цитология. 1986. Т.28, №2. С. 156-159.

11. Особенности строения цитоскелета подоцитов позвоночных II Цитология. 1986. Т. 28, №9. С. 926-931. (в соавторстве с С.П.Гамбаряном).

12. Структура почки у зародыша лосося Salmo salar И Ж. эвол. биохим. и физиол. 1988. Т.24,№1. С.34-39.

13. Kidney morphogenesis of the Atlantic salmon (Salmo salar L.) in mariculture // Plzen. Lek. Sborn. 1989b. Suppl. 59. P.183-187.

14. Иммуноморфологические исследования почечных гломерул позвоночных с использованием антител к белкам промежуточных филаментов // Цитология. 1989. Т.31, №4. С. 404-409.

15. Ультраструктурные проявления функциональной пластичности эндотелия почечных гломерул у позвоночных // Бюл. Экспер. биол. мед. 1989а. Т.107 №4. С. 493-197 (в соавторстве с Н.Т.Райхлиным и И.Н.Соколовой).

16. Электронно-микроскопические исследования цитоскелета подоцитов человека // Бюл. экспер. биол. мед. 19896. Т.107, №5. С. 633-637. (в соавторстве с .Т.Райхлиным и И.Н.Соколовой).

17. Иммуноморфология и ультраструктура цитоскелета подоцитов позвоночных в фило- и онтогенезе//Цитология. 1991. Т.33,№9. С.71.

18. Immunomorphologic study renal glomeruli in the vertebrates II The Histochemical Journal. 1992b. Vol.24. P.570.

19. Cytoskeleton of podocytes in vertebrate animals and human II J. Cellular and Molecular Biology (France). 1992d. Vol.38. P. 823-833.

20. Исследование цитоскелета эндотелия и мезангиума почечных гломерул крыс // Цитология. 1996. Т.38, №3. С. 305-310.

Б. Публикации в трудах конгрессов и конференций

21. Structure of the cytoskeleton of podocytes in the kydneys of teleost sea fishes // Proc. Fourth Intern. Congr. of Cell Bioligy. Canada, Monreal. 1988. P.147

22. The ultrastructural manifestation of the morphofunctional plasticity endothelium of kidneys glomerulus of vertebrates // Proc. Fourth. Intern. Congress of Cell Biology. Canada, Monreal. 1988. P.357 (with N.T.Raikhlin and I.N.Sokolova).

23. Особенности морфогенеза почки атлантического лосося Salmo salar L.// В кн.: Современное состояние исследований лососевидных рыб. Всес.совещание. Тезисы. Тольятти. 1988. С.112-113.

24. Ультраструктурные особенности эндотелия почечных гломерул атлантического лосося в пресноводном и морском пери-одах жизни II В кн.: Экология , биологическая продуктивность и проблемы марикультуры Баренцева моря. Всес.конф. Тезисы. Мурманск, ПИНРО. 1988. С. 226-228.

25. Гистофизиология предпочки атлантического лосося // IV Всес.конф. по раннему онтогенезу рыб. Тезисы. М®., 1988. С. 96-98.

26. Ультраструктурные и иммуноморфологические исследования цитоскелета подоцитов позвоночных // XI11 Всес.конф. по электронной микроскопии. Тезисы. М., 1988. С. 112.

27. Evolutionary morphology of podocytes cytoskeleton in vertebrates // The origin of life. The Sixth ISSOL Meeting and the Ninth Intern. Conference. Czechoslovak Academy of Sciences. Prague. 1989a. P. 230-231.

28. Ultrastructural and immunomorphological studies of renal glomerules in vertebrates // Tenth Jubilee Nat. Congr. Anat., Hystol., Embriol. Abstracts. Bulgaria, StaraZagora. 1989. P. 181.

29. Морфологические основы функционирования предпочки атлантического лосося // Всес.конф. по физиологии морских организмов. Тезисы. Апатиты. 1989. С. 43-44.

30. Сравнительные иммуноморфологические исследования цитоскелета клеток почечных гломерул позвоночных // VIII Всес. конф. по физиол.почки и водно-солевого обмена. Тезисы, Харьков. 1989. С. 73-74.

31. Особенности иммуноморфологии и ультраструктуры клеток почечных клубочков морских костистых рыб // В кн.: Экология, воспроизводство и охрана биоресурсов Северной Европы. III Всес.конф. Тезисы. Апатиты : КНЦ. 1990. С. 177-179.

32. Возрастные аспекты иммуноморфологии цитоскелета клеток почечных клубочков Л X Всес. совещ. по эвол.физиол. Тезисы. JI. :Наука.1990. С. 300.

33. Cytoskeleton of podocytes in vertebrates and man // Proc. 1st Wold Congress Cellular and Molecular Biology. France, Paris. 1991. P.201.

34. Intermediate filaments in podocytes cytoskeleton of the lower vertbrates // Proc. 5th Intern. Congr. on Cell Biology. Madrid, Spain. 1992a. P.77.

35. The electron microscopic investigation of podocytes in vertebrates // Electron Microscopy 92. Proc. X Europ. Congr. on Electron Microscopy. Granada, Spain. 1992c. Vol.3. P.785-786.

36. Cytoskeleton of endothelial and mesangial cells in renal glomeruli of mammalia// Proc. 13lh_ Intern. Congr. on Electron Microscopy. France, Paris. 1994. Vol.3A. P. 57-58.

57. The structure of the cytoskeleton in nephron cells from vertebrate animals and man // Electron Microscopy 96. Proc. XI European Congress of Electron Microscopy.Dublin, Ireland. 1996.