Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Выбор оптимальных методов культивирования и трансплантации мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток человека в условиях эксперимента

На правах рукописи

ПУЛИН АНДРЕЙ АЛЕКСЕЕВИЧ

ВЫБОР ОПТИМАЛЬНЫХ МЕТОДОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И ТРАНСПЛАНТАЦИИ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТА

14.00.16 - патологическая физиология 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□03451716

Москва - 2008

003451716

Работа выполнена в:

• лаборатории клеточной биологии и патологии развития ГУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН (Москва);

• Center for Gene Therapy Tulane University Health Sciences Center, New Orleans, LA, USA.

Научные руководители:

Член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор B.C. Репин

Кандидат биологических наук И.Н. Сабурина

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Доктор медицинских наук, профессор

H.A. Онищенко Г.А. Дроздова

Ведущее учреждение - Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова

Защита диссертации состоится « 2 »

2008 г. в

часов

на заседании диссертационного совета Д 001. 003. 01 ГУ Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН (125315, Москва, Балтийская ул., дом 8).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан

« »

2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук

JI.H. Скуратовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди негемопоэтических клеток, используемых для клеточной терапии, наибольшее применение находят мультипотентные мезенхимальные стромапьные клетки, выделенные из костного мозга, или ММСК [M. Dominici, 2006]. В связи с развитием клеточных технологий начато применение ММСК в клинических целях [Е.М. Horwitz et al., 2002; O.N. Кос et al., 2002; H.A. Онищенко с соавт., 2004; О. Ringden et al., 2006]. Однако до настоящего времени многие вопросы, касающиеся получения, культивирования, фенотипирования, распределения и кинетики клеток in vivo, остаются нерешенными. Не разработан универсальный и воспроизводимый протокол культивирования и фенотипирования клеток, и не определены единые критерии оценки качества культуры клеток для трансплантации. В научной литературе отсутствуют указания на различия в поведении ММСК in vivo после инфузии их интактным животным и животным с моделями острого и хронического патологического процесса. Одним из основных остается вопрос: при каких патологических процессах применение ММСК оправданно и эффективно?

На данный момент разработано несколько методов культивирования ММСК. По одному из них - культивирование ММСК в высокой плотности (впММСК) считают оптимальным и выгодным способом подготовки клеток к трансплантации. Согласно другому - конфлюэнтные культуры частично коммитированы к дифференцировке или даже старению, поэтому впММСК теряют некоторые свойства, присущие ММСК, выращенным в низкой плотности (нпММСК).

Общепринятым считается метод выделения ММСК из костного мозга путем их агдезии к поверхности лабораторного пластика [А.Я. Фриденштейн с соавт., 1970; M. Owen et al., 1988; M.F. Pittenger et al., 1999]. Клетки были охарактеризованы главным образом по их способности образовывать колонии в культуре и дифференцироваться в адипоциты, остеобласты и хондроциты. В дальнейшем с целью получения более стандартизованных и точных процедур изоляции и идентификации ММСК стали применять антитела к поверхностным белкам клеток. Первыми были открыты моноклональные антитела (IgM) к белку STRO-1, который экспрессировался конфлюэнтными культурами человеческих ММСК [P.J. Simmons et al., 1991]. Затем была выявлена дополнительная серия антител к ММСК, причем для фенотипирования ММСК стали использовать антитела, первоначально полученные для других типов клеток [F. Anjos-Afonso et al., 2007; V.L. Battula et al., 2007; H.J. Buhring et al., 2007; C. Martinez et al., 2007]. Однако ни одно из этих антител не позволяет выделить культуру клеток, наиболее насыщенную ранними предшественниками и обладающую максимальным терапевтическим эффектом.

В последние годы появились сообщения о том, что нпММСК содержат суб-популяцию быстро само-реплицирующихся клеток [T. Mets et al., 1981; С.М. DiGirolamo et al., 1999; D.C. Colter et al., 2001], проявляющих характерные паттерны экспрессии генов, отличные от паттернов клеток конфлюэнтных культур [С.A. Gregory et al., 2005], имеют гораздо больший потенциал к образованию моноклональных культур [D.C. Colter et al., 2001; J.R. Smith et al., 2004] и характеризуются лучшей эффективностью при трансплантации [R.H. Lee et al., 2006].

Преимущество использования культур нпММСК для клеточной терапии требует дальнейшего изучения. Важное значение имеет и определение (выбор) наибол фективных

путей доставки ММСК в органы/ткани-мишени. Имеются сообщения об успешнои приживлении клеток при внутривенном или локальном введении в ишемизированные облученные или другим образом поврежденные органы/ткани [J.S. Wang et al., 2001; А.А. Mang et al., 2003; L.A. Ortiz et al., 2003; M. Bensidhoum et al., 2004]. В то же время практически н изучена способность ММСК к миграции из системного кровотока через неповрежденный неактивированный эндотелий, то есть в условиях, приближенных к тем, которые наблюдаюто при большинстве заболеваний, потенциально пригодных для клеточной терапии.

Во всех публикациях, посвященных применению ММСК в клеточной терапии количественную оценку приживления клеток в тканях и органах осуществляют преимущественно в отдаленные сроки, не раньше чем через несколько суток поел трансплантации [S. Francois et al., 2006; Т.Е. Meyerrose et al., 2007]. Имеются лишь единичны сообщения о качественной оценке распределения меченых клеток в ранние сроки поел введения [S. Schrepfer et al., 2007]. Количественная оценка распределения клеток не проводится.

Целью настоящего исследования являлась разработка оптимального и воспроизводимог протокола получения клеточного трансплантата на основе ММСК костного мозга человека критериев экспресс-оценки качества трансплантата, опредение возможности и эффективност его использования в эксперименте у животных в норме и при различных патологически состояниях.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить культуру ММСК с высоким содержанием стволовых/прогениторных клеток.

2. Разработать критерии экспресс-оценки культуры ММСК для трансплантации.

3. Подобрать условия культивирования ММСК, при которых минимизируется риск агрегащн клеток в суспензии in vitro и образования тромбоэмболов при трансплантации in vivo.

4. Изучить распределение клеток полученных культур по органам и их кинетику поел введения в организм мыши в норме и при патологии.

5. Изучить терапевтическую активность полученных ММСК у мышей на модел стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета.

Научная новизна. Работа является первым экспериментальным исследованием, котором при сравнении существующих протоколов культивирования ММСК выбран оптимальный, направленный на получение максимально возможного количества клеток и одного биоптата костного мозга человека с сохранением качества культуры.

В ходе исследования впервые идентифицированы антитела к поверхностным клеточным маркерам, позволяющим охарактеризовать ранние клетки-предшественники в культурах ММС человека. Показана возможность быстрой оценки культур на наличие ранних клеток предшественников путем обнаружения маркерных поверхностных эпитопов PODXL интегрина-аб, интегрина-а4, HGFR методом проточной цитометрии ММСК после снятия их пластика трипсином/ЭДТА. Определены качественные и количественные характеристики культуры ММСК на этапах подготовки клеток к трансплантации.

Впервые изучена кинетика и распределение нпММСК в ранние сроки после системног введения мышам - циркуляция в крови и распределение по органам и тканям. Впервы

проводится количественная оценка распределение нпММСК по органам в зависимости от метода введения.

В ходе работы предложены экспериментальные модели острого и хронического заболеваний для оценки распределения и кинетики после трансплантации отобранной культуры нпММСК. На модели стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета у мышей впервые изучен терапевтический эффект введения нпММСК: показано восстановление структуры островкового аппарата поджелудочной железы и активация ее эндокринной функции, а также репарация структуры гломерулярного аппарата почек.

Теоретическая и практическая значимость. Разработан метод, позволяющий получить трансплантат на основе ММСК человека с максимальным числом клеток из единственного образца костного мозга. Этот метод позволяет сохранить максимальное количество клеток-предшественников в культуре и одновременно минимизировать риск агрегации ММСК и образования тромбоэмболов в сосудах микроциркуляторного русла после трансплантации. Предложен эффективный подход к оценке качества ММСК, подготовленных для трансплантации, методом проточной цитофлюориметрии. Выявлен кластер поверхностных маркеров ранних клеток-предшественников. При сопоставлении внутривенного и внутриартериального способов введения определен оптимальный метод доставки клеток в пораженный орган/ткань. Показана структурная и функциональная репарация пораженных островков Лангерганса в ткани поджелудочной железы у мышей со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом после внутриартериальной трансплантации культуры нпММСК человека. Установлено, что секреторной активностью обладали и некоторые из мигрировавших в поджелудочную железу нпММСК человека, причем при двойном иммуноцитохимическом окрашивании показана экспрессия этими клетками мышиного инсулина.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Культуры ММСК могут быть быстро оценены на наличие ранних клеток-предшественников, клоногенность и способность к дифференцировке, риск агрегации их в суспензии и образования летальных тромбоэмболов методом проточной цитометрии по уровню экспрессии спектра поверхностных маркеров. Наиболее информативными являются РСЮХЬ, интегрин-аб, интегрин-а4, НСГК.

2. Особенности кинетики и распределения нпММСК по органам и тканям в ранние сроки после трансплантации зависят как от способа системного введения, так и от наличия и характера патологического процесса.

3. Системное введение нпММСК человека мышам со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом стимулирует репарацию пораженных островков Лангерганса в ткани поджелудочной железы преимущественно за счет паракринных эффектов, при этом частично восстанавливается нормальная структура островков Лангерганса, снижается уровень глюкозы, повышается уровень инсулина крови этих животных. После трансплантации нпММСК человека у животных с сахарным диабетом также наблюдается восстановление структуры и функции гломерул почек.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на: 7th Annual Rachmic Levine Diabetes and Obesity Symposium, Advances in Diabetes Research: From Cell Biology to Cel Therapy (2006r, Long Beach, CA, USA); 18th Annual Research Days of Tulane University Healtl Sciences Center (2007r, New Orleans, LA, USA); American Society of Gene Therapy's 10th Annua Meeting (2007r, Seattle, WA, USA); Adult Mesenchymal Stem Cells in Regenerative Medicine (2007i Cleveland, OH, USA); V конференция молодых ученых России с международным участиен (2008г, Москва).

Внедрение полученных результатов. Результаты диссертационного исследовани используются для выделения, культивирования и подготовки клеток к трансплантации лаборатории клеточной биологии и патологии развития ГУ НИИОПП РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 2 центральной печати. Еще две работы готовятся к публикации.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 156 страницах машинописног текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования трех глав изложения собственных результатов, их обсуждения, выводов, приложения и списке литературы. Литературный указатель включает 174 источника. Работа иллюстрирована 33 рисунками, 45 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. Работа проводилась на самцах иммунодефицитных мышей линии NOD/sric/ (NOD.CB17-/VMriCK'/J; The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) в возрасте 7-недель (таблица 1). Мыши содержались в стерильных условиях. Работа с животными проводилась согласно протоколам, одобренным Institutional Animal Care and Utilizatio Committees of Tulane University Health Sciences Center. Всего использовано 405 мышей.

Таблица 1. Общая структура исследования.

Эксперимент Кол-во мышей

Построение калибровочных кривых 48

Подбор дозы для введения 53

Циркуляция нпММСК в крови при системном введении 24

Распределение нпММСК по органам при системном введении 18

Распределение опухолевых клеток по органам и циркуляция в крови при системном введении 12

Распределение мононуклеаров по органам и циркуляция в крови при системном введении 12

Кинетика нпММСК в легких у здоровых животных после внутривенного введения 48

Распределение нпММСК, прошедших предварительную обработку, по органам при системном введении 33

Распределение нпММСК по органам у животных с моделью острого заболевания 52

Распределение нпММСК по органам у животных с моделью хронического заболевания 52

Распределение по группам в эксперименте по внутриартериальному введению клеток животным с сахарным диабетом «Сахарный диабет» 15

«Сахарный диабет + нпММСК» 29

«Сахарный диабет + фибробласты» 5

Контрольная группа 4

Изоляция и культивирование ММСК человека. Мононуклеарную фракцию клеток изолировали из костного мозга здоровых доноров градиентным центрифугированием с фиколлом. Затем клетки высевали с высокой плотностью в питательной среде (а-МЕМ (GIBCO/BRL; Carlsbad, CA), 17 % FBS, 2-4 мМоль/л L-глютамина (GIBCO/BRL), ЮОЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина). Через 24 ч прикрепившуюся культуру отмывали, после чего инкубировали в течение 4-8 сут. Смену среды проводили каждые 3 сут. При достижении первичными культурами 70% конфлюэнтности клетки отмывали, снимали с пластика смесью трипсин/ЭДТА (0,25% трипсин/1мМ ЭДТА; GIBCO/BRL), ресуспендировали в питательной среде для инактивации трипсина и высевали с плотностью 100 клеток/см2 в клеточные фабрики (площадь поверхности - 6320 см2; Cell Factory™; Nunc). Клетки инкубировали в течение 6-10 сут до достижения ими 70% конфлюэнтности.

Клетки рака молочной железы человека линии MDA-MB 231 после разморозки культивировали в течение двух пассажей в питательной среде (DMEM с повышенным содержанием глюкозы (GIBCO/BRL), 10% FBS (Atlanta Biologicals), ЮОЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина (GIBCO/BRL)).

Выделение клеток мононуклеарной фракции крови человека и крысы производили из свежих образцов периферической крови при помощи градиентного центрифугирования с фиколлом, затем отмывали фосфатным буфером и готовили к трансплантации.

Инфузия клеток животным. Клетки при 50, 70 и 90% конфлюэнтности снимали с пластика трипсином/ЭДТА, отмывали и ресуспендировали в концентрации 1-3* 106 клеток в 150 мкл. Мышей наркотизировали смесью кетамин/ксилазин, после чего вводили суспензию клеток либо трансторакально в полость левого желудочка, либо в хвостовую вену инсулиновым шприцем с диаметром иглы 29g. Некоторые животные за 1 мин до введения ММСК получали инъекцию 1 мг/кг вазодилататора - нитропруссида натрия (Fluka Chemica, Buchs, Switzerland).

Исследование мРНК при помощи microarray. ММСК высевали с плотностью 100 клеток/см2 и инкубировали 5, 10 или 15 сут. Для выделения РНК использовали коммерческий набор (High Pure RNA Isolation Kit; Roche Diagnostics Corporation; Indianapolis, IN). Синтезировали двойную цепочку кДНК (Superscript Choice System; GIBCO/BRL), затем очищали при помощи Phase Lock геля и смеси фенола, хлороформа, изоамилового спирта и преципитировапи в этаноле. кДНК транскрибировали в кРНК, меченую биотином (BioArray HighYield RNA Transcription Labeling Kit; Enzo Life Sciences; Farmingdale, NY). Биотинилированную кРНК очищали (RNAeasy Mini Kit; Qiagen; Valencia, CA), фрагментировали и гибридизировали на чипах для микроэррэй (HG-U133A; Affymetrix; Santa Clara, CA). Отдельные чипы были проинкубированы со стрептавидином-фикоэритрином (Invitrogen; Carlsbad, California), затем полученный сигнал амплифицировали биотинилированным анти-стрептовидином (Vector Laboratories; Burlingame, CA) с последующим вторичным окрашиванием стрептавидином/фикоэритрином. Чипы были просканированы для оценки сигнала (GeneArray Scanner; Hewlett Packard; Palo Alto, CA), данные анализировали используя программы Microarray Suite 5.0 (MASS 5.0; Affymetrix) и dChip 1.3+ [Schadt E.E. et al., 2001].

Для ПЦР с обратной транскрипцией при помощи коммерческого набора (RNeas) RNA Isolation Kit; Qiagen, Valencia, USA) из клеток/тканей выделяли РНК. Затем синтезировали кДНК при помощи обратной транскриптазы (M-MLV RT Kit; Invitrogen, Carlsbad, USA). После инактивации обратной транскриптазы проводили амплификацию кДНК в 30 циклах ПЦР по ЗОс при 94°С, 30с при 60°С и 30с при 72°С, используя рекомбинантную Таг полимераз) (Recombinant Taq DNA polymerase; Invitrogen, Carlsbad, USA). Затем образцы разделяли на 2°А агарозном геле и визуализировали при помощи этидия бромида.

Вестерн-блоттинг. Исследование проводилось по протоколу, описанному DuBois R.N. et al., 1996. При этом использовались первичные антитела к PODXL (1: 1000; R&D systems), аб-интегрину (1: 250; MP4F10; R&D systems), а4-интегрину (1:200; 44Н6; Abeam), c-Met (1: 250; clone 95309; R&D systems, Minneapolis, MN), CXCR4 (1:1000; Chemicon; Temecula, California) и CX3CR1 (1:1000; Abeam; Cambridge, MA), a также видоспецифичные вторичные антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена (Amersham Biosciences UK Limited; Little Chalfont. Buckinghamshire, England).

Илшуноцитохимия. Культуры фиксировали в 4% растворе параформальдегида, затем блокировали 5% бычьим альбумином (Sigma). Стекла инкубировали с антителами к PODXL (1: 1000; R&D systems), аб-интегрину (1: 250; MP4F10; R&D systems), а4-интегрину (1:200; 44Н6; Abeam), HGFR (1: 250; clone 95309; R&D systems), CXCR4 (1:1000 ; Chemicon) и CX3CR1 (1:1000; Abeam), a затем с несущими флюоресцентную метку видоспецифичными вторичными антителами (1:1000, Alexa-594 or Alexa-488; Invitrogen).

Проточную цитометрию проводили на цитометре FACScalibur (BD Biosciences) с программным обеспечением CellQuest. Прибор стандартизовали при помощи микрогранул (7, 10, 15 и 20 микрон Dynosphere Uniform Microspheres; Bangs Laboratories Inc.; Fisher scientific). Для исследования ММСК инкубировали в фосфатном буфере, содержащем 1% бычьег альбумина и первичные антитела, а затем, при необходимости, с вторичными антителами.

Исследование клоногенности клеток. ММСК высевали с плотностью 1 клетка/см2. Через 2 недели клетки отмывали и инкубировали в 1% растворе кристаллвиолета в метаноле. После этого чашки промывали водой и подсчитывали колонии с диаметром более 1 мм.

Адипогенная и остеогенная дифференцировка. ММСК высевали с плотностью 30000 клеток/см2. Клетки инкубировали в течение 10 сут в среде для адипогенной дифференцировки, затем фиксировали 10% формалином и окрашивали раствором Oil Red О, связавшийся краситель экстрагировали изопропиловым спиртом. Клетки инкубировали в течение 21 сут в среде для остеогенной дифференцировки, затем фиксировали раствором формалина и окрашивали раствором Alizarin Red S, связавшийся краситель экстрагировали 10% раствором уксусной кислоты. Экстракт остужали на льду и центрифугировали. Около 0,5 мл супернатанта переносили в пробирку с 10% раствором гидроксида аммония. Абсорбцию полученных растворов измеряли на сканирующем спектрофотометре (Fluostar Optima; BMG Labtechnologies) с длиной волны 485 нм.

Трансфекцию клеток малыми интерферирующими РНК к PODXL производили, используя коммерческий набор (Lipofectamine™ RNAiMAX reagent; Invitrogen). Для

приготовления трансфецирующего реагента малые интерферирующие РНК (20 цМ Stealth™ Select 3 RNAi PODXL Set; HSS108202; HSS108203; HSS108204; Invitrogen) разводили с реагентом Lipofectamine™ в среде Opti-MEM I с пониженным содержанием сыворотки (Invitrogen) RNAiMAX. ММСК высевали с плотностью 100 клеток/см2, на 5 сут инкубации питательную среду меняли на смесь для трансфекции. Через 5 ч смесь меняли на питательную среду без антибиотиков. На 7 сут культивирования клетки снимали с пластика трипсином/ЭДТА и высевали с плотностью 1000 клеток/см2, после чего инкубировали еще 24 ч.

Исследование агрегационпой способности клеток. Проводили спектрофотометрию суспензий ММСК (Fluostar Optima; BMG Labtechnologies) при длине волны 590 нм.

Модель стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета. Ежедневно с 1 по 4 сут эксперимента мыши получали иньекции 35мг/кг стрептозотоцина (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО), растворенного в цитратном буфере.

Модель химической деплеции макрофагов и токсического поражения селезенки. Животным вводили внутривенно 0,2 мл дихлорометилен-бифосфоната (CL 2MDP), инкапсулированного в липосомы (Encapsula NanoSciences LLC, Nashville, TN). Для контроля вводили липосомы, содержащие фосфатный буфер.

Определение уровня глюкозы и инсулина в крови. В течение 4 ч до. забора крови животные находились на голодной диете. Уровень глюкозы в образце капиллярной крови определяли при помощи глюкометра (Elite Diabetes Care System; Bayer, Germany). Количественное определение уровня инсулина в крови проводилось специфичным для инсулина мыши или специфичным для инсулина человека методом ELISA (Ultrasensitive Mouse Insulin ELISA и Insulin Ultrasensitive ELISA; Mercodia, Uppsala, Sweden).

Подготовка образцов тканей для гистологического, иммуногистохимического исследований и ПЦР в реальном времени. У животных под общей анестезией после перфузии фосфатно-солевого буфера производился забор органов. Красный костный мозг выделялся из бедренных и большеберцовых костей. Для анализа ДНК и РНК органы быстро замораживали до -80°С. Для гистологического исследования легкие фиксировались формалином, заливались парафином, затем производились срезы по 6 мкм. Поджелудочная железа фиксировалась формалином, затем раствором сахарозы, образец ткани заливался криопротектором (Tissue-Tek ОСТ Compound; Sakura Finetek, Torrance, CA) и подвергался быстрой заморозке в изопентане на сухом льду. Затем на криостате изготовлялись срезы по 5-8 мкм. Образцы почечной ткани фиксировались формалином в нейтральном буфере, затем раствором сахарозы, заливались парафином, затем производились срезы толщиной 8 мкм. Для иммуногистохимического исследования образцы почечной ткани и легких заливались криопротектором и подвергались быстрой заморозке в изопентане, на сухом льду, затем на криостате изготовляли срезы 5-10 мкм.

Выделение ДНК из тканей. В пробирки с образцами добавляли протеиназу К и экстракционный буфер (Tris Cl, ЭДТА, додецилсульфат натрия (SDS), РНКаза А). Пробирки инкубировали при 50°С, после чего содержимое гомогенизировали. Затем образцы тканей помещали в пробирку с Phase Lock гелем (Phase Lock Gel; Eppendorf/Brinkmann Instruments, Inc., Westbury, NY) с раствором фенола, хлороформа и изоамилового спирта (24:23:1, pH 6,7, Fisher

Scientific). Пробирки встряхивали, затем центрифугировали. К супернатанту добавляли ацета1 аммония и 96% этиловый спирт. Для лучшей преципитации ДНК образцы инкубировали при температуре 4°С. Затем пробирки центрифугировали, к осадку добавляли 1 мл 70% охлажденного этилового спирта, пробирки интенсивно встряхивали. Образцы ДНК вновь центрифугировали, осадок высушивали и ресуспендировали в стерильной воде.

Получение образцов крови и выделение ДНК. Животных наркотизировали смесью кетамин/ксилазин и забирали 50 мкл крови из сердца при помощи шприца с диаметром иглы 29g. Для предотвращения свертывания к образцу добавляли 2 мМ ЭДТА. Экстракцию ДНК проводили при помощи коммерческого набора DNeasy Kit (Qiagen, Hercules, CA).

Измерение количества ДНК. Для приготовления стандарных растворов использовали ДНК, выделенную из тканей телячьих тимусов (Sigma, St. Louis, МО). В пробирку с ДНК добавляли ДНКазу I и буфер для расщепления ДНК (Х10). Пробирки инкубировали 1 ч при температуре 37°С, после этого в пробирки с образцами ДНК добавляли дифениламиновый реагент (дифениламин, кристаллическая уксусная кислота, серная кислота). Затем пробирки помещали в кипящую воду на 21 мин. Оптическую плотность образцов измеряли на спектрофотометре при длине волны 595 нм. По значению оптической плотности определяли содержание ДНК в образцах.

ПЦР в реальном времени проводили на автоматизированном приборе (Model 7700; Applied Biosystems, Foster City, USA). Каждая реакция включала в себя универсальный мастер микс для ПЦР (Universal PCR Master Mix, Applied Biosystems, Foster City,USA), прямой и обратный праймеры, флюоресцентную метку ТагМан (TagMan) и таргетную ДНК. После активации ферментов урацил-Ы-гликозилазы и АмплиТаг Голд (AmpliTag Gold) реакции инкубировали 40 циклов, состоящих из 15с при 95°С и 1 мин при 60°С. Использовали дизайн праймеров, специфичных к Alu последовательности, и флюоресцентной метки, разработанный McBride С. et al. Амплификацию всех образцов проводили в одинаковых условиях дважды или трижды, в результатах представлены средние значения. В качестве гена нормализации использовали ген сывороточного альбумина мыши [Lee R.H. et al., 2006].

Калибровочные кривые. Серийные разведения известного количества ММСК человека добавлялись к образцам мышиных тканей. После этого выделяли ДНК, измеряли концентрацию и проводили ПЦР в реальном времени. По значениям пороговых циклов строился график функции и рассчитывалось уравнение для определения количества клеток в органах/тканях.

Гистологическое и иммуногистохимическое исследования. Для гистологического исследования срезы легких и поджелудочной железы окрашивали гематоксилин-эозином (Н&Е, Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI, USA), срезы почек окрашивали реакцией ШИК (PAS, Richard-Allan Scientific). Для иммуногистохимического исследования криосрезы высушивались, отмывались, затем нейтрализовалась эндогенная пероксидаза. Слайды отмывали, блокировали раствором сыворотки в детергенте (Triton х-100) и инкубировали с первичными антителами: к человеческому р2-микроглобулину (1:200; Roche, Switzerland), антигенам ядер человеческих клеток (1:200; clone 235-1; Chemicon, Temecula, CA, USA), человеческому инсулину (1:40; clone E2E3C2; Calbiochem, San Diego, CA, USA), мышиному инсулину (1:50; clone 182410; R&D

Systems, Minneapolis, MN, USA), мышиному/человеческому PDX-1 (1:50; clone 267712; R&D Systems), мышиному/человеческому PODXL (1:100; clone 222328; R&D Systems), мышиным макрофагам/моноцитам (1:25; clone MOMA-2; Chemicon), мышиному/человеческому фибронектину (1:80; Chemicon), мышиному/человеческому CD31 (1:500; clone MEC 13.3; BD Biosciences, San Jose, CA, USA). После этого слайды отмывались и инкубировались с видоспецифическими вторичными антителами (1:1000; Alexa-594 or Alexa-488; Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Слайды для контроля окрашивали только вторичными антителами. Препараты исследовали при помощи флюоресцентной микроскопии (Eclipse Е800; Nikon, Melville, NY). Подсчет пикселей производился при помощи программы ImageJ (NIH Image).

Статистический анализ результатов исследования проводили с помощью пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 и SPSS 11.5. Для расчета минимально необходимого количества животных в группах использовали программу Power and precision (Biostat Inc., Englewood, NJ, USA). С использованием критериев Шапиро-Вилка и %2 Пирсона были проверены гипотезы о нормальности распределений исследуемых показателей. При сравнении параметров, имевших нормальное распределение, использовали t-тест для независимых выборок в предположении неравных дисперсий. При сравнении параметров, имевших ненормальное распределение, использовали критерий Манна-Уитни или критерий Крускалла-Уоллиса. Критический уровень значимости для всех статистических критериев принимали равным 0,05. Все показатели и значения представлены как средние и указано стандартное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сопоставление культур ММСК, выращенных при высокой и низкой плотности

Предварительно изучили отличия в культурах ММСК in vitro, взятых от одного донора, выращенных в низкой плотности - нпММСК (5 сут после пассажа, 3400-6200 клеток/см2) и в высокой плотности - впММСК (9 сут после пассажа, 23000-57000 клеток/см2). Начальная плотность посева была одинаковой - 100 клеток/см2. Клетки были исследованы на клоногенность и жизнеспособность. Показано, что нпММСК имели большую способность к образованию колоний (рис. 1А и 1Б, цветная вставка 1), чем впММСК. Также жизнеспособность нпММСК была выше (рис. 1Б, цветная вставка 1). В дополнение к этому культуры ММСК были исследованы на дифференцировочный потенциал. Исследование показало, что более эффективно дифференцировались в адипоциты и минерализующие клетки нпММСК, по сравнению с культурами впММСК (рис. 1В и 1Г, цветная вставка 1).

Чтобы установить зависимость выживаемости реципиента после трансплантации от характеристик культуры, которые в свою очередь зависят от времени культивирования и степени конфлюэнтности, ММСК человека вводили в хвостовые вены мышам (рис. 2А, цветная вставка 1). Отмечена 100% выживаемость животных (п=10) при введении 2*106 клеток культур нпММСК, но 70% реципиентов погибло после введения такого же числа впММСК (п=13). Макроскопически легкие погибших мышей после введения 2*106 впММСК были бледнее, чем легкие контрольных животных (рис. 2Б, цветная вставка 1). Гистоморфологическое

исследование показало, что сосуды легких у животных, погибших сразу после инъекции впММСК, были заполнены ядросодержащими клетками, блокирующими кровоток (рис. 2В, цветная вставка 1).

Для выяснения причин различий в поведении клеток сравнили экспрессию генов поверхностных белков культуры ММСК человека. Сравнение проводили на первом пассаже с начальной плотностью посева 100 клеток/см2 на 5, 10 и 15 сут культивирования (рис. 3). После проведенного анализа для дальнейшего исследования из совокупности поверхностных белков были отобраны шесть. PODXL (белок, подобный подокальцину) и интегрин-аб, для которых отмечено наибольшее понижение экспрессии при увеличении срока культивирования. Интегрин-а4, т.к. установлена его тесная взаимосвязь с интегрином-аб в процессах направленной миграции, роллинга и адгезии клеток. HGFR (мембранный рецептор к фактору роста гепатоцитов), а также CXCR4 (рецептор к SDF-1) и CX3CR1 (рецептор к фракталкину), в связи с их участием в процессах миграции клеток; кроме того для двух последних доказана экспрессируемость в культурах ММСК только клетками-предшественниками. Выбор маркеров также определялся наличием коммерческих антител к ним.

60

и: I

а

° I ï § « h о р

И ¡2

sl

30 25 20 15 10 5 0

-PODXL

-аб-integrin

HAS1

ATP1B1

•--ж--- TJP2

....... CSPG4

STEAP1

— —.. TM4SF1

SEMA4D

------- CD44

C-Met

» : : : : : : :П;ГртЙТГтт»|

10

15

5 10 15 5

Время культивирования (сутки)

Рис. 3. Экспрессия транскриптов ММСК на 5, 10 и 15 сут культивирования.

При помощи ПДР с обратной транскрипцией (рис. 4А), вестерн блоттинга (рис. 4Б), иммуноцитохимического исследования (рис. 5А, цветная вставка 2) показаны особенности экспрессии шести отобранных белков. Уровни экспрессии всех шести белков оставались высокими в культурах нпММСК и уменьшались в культурах впММСК. Также при пассировании культуры впММСК все шесть белков восстановили уровни экспрессии в культуре клеток с низкой плотностью к 5 сут третьего пассажа. При двойном иммуноцитохимическом окрашивании (рис. 5Б, цветная вставка 2) культуры нпММСК установлено, что РСЮХЬ в основном локализовался в отдельных участках мембраны клеток вместе с белками интегрин-аб, интегрин-а4, НСРЯ, CXCR4 и СХЗСЯ1.

Чтобы исключить влияние трипсинизации на экспрессию 6 белков при помощи РАСЭ в культурах нпММСК определяли количество клеток, экспрессировавших изучаемые белки, после снятия их с пластика раствором ЭДТА или трипсином/ЭДТА. Все белки, кроме СХСР4 и CXЗCR1, были обнаружены на поверхности клеток, снятых ЭДТА и трипсином/ЭДТА (рис. 6). Поэтому в дальнейшем CXCR4 и CXЗCR1 были исключены из дальнейших экспериментов.

А1шпп К к: $ 011 0

Рис. I. Клоногенность, жизнеспособность и дифференцировочный потенциал культур нпММСК и впММСК }п \nlro: А — общий вид чашек с колониями, окрашенными кристаллвгюлетом, Б - клоногенность и жизнеспособность клеток, снятых с пластика на разные сроки культивирования, В - спектрометрическая оценка экстрагированных красителей, Г-микрофотографии дифференцированных ММСК.

Б

Контрольный про па рот Легкие поело внутри вонн ого

введения н' ММСК

Рис. 2. Клинический и патоморфологический эффект введения одинаковых доз нпММСК и впММСК: А - выживаемость реципиента; Б - макропрепарат: В - гистоморфологическое исследование легких.

I I

нпММСК впММСК нпММСК влММСК

t - ' 1 W, -\ Л ' i : 1 с ' \ 1 0?

1 •

| •i , 1 \ HCf ЙГ ftftfXi

¿rjf y '(i'-л - r \ ¡ ГКСЙ j /1 1Г У t.

г и

Рис. 5. Исследование культур ММСК (гшмуноцитохимия}; А - экспрессия белков на 2 и 3 пассажах; Б — двойное окрашивание нпММСК антителами к РОВХЪ (красный) и к иптегрину-а4. интегричу- аб, №Ш, СХСЯ4, СХЗСЯ1 (зеленый).

\ Л 'irninir'M iKH «/СТОН TUNEL ^ ! ¿ í1 !.• ^ » 4 % * f 1 | > 4

Г \ 4 r г \ Г * к \ .*Л \ *

i

Амиг«ч I -I.I ил»'» 1

чрооявчве 41« ir.»rpt Г

МдарОфпгИ | |

Y' s

) I

Рис. 14. Кинетика нпММСК в легких здоровых мышей: А — TUNEL исследование, Б -i окрашивание антителами к макрофагам.

15 мим 1 Сут 2 сут

4 сут

Цветная вставка 3

1 в» в*

1 0.30 и»

а*

Поджелудочная железа

1 сут

Селезенка

т сут 2 сут

С»рдч*

15 *Нт* иуг йеуг

_Л>гии<__

Рис, 16. Распределение нпММСК по органам после внутривенного введения мышам с токсическим поражением селезенки и детецырованными макрофагами, где «С12МВР» -группа мышей, получивших перед введением нпММСК инкапсулированный в липосомы раствор дихлорометилен-бифосфоната; «буфер» — группа мышей, получивших перед введением нпММСК инкапсулированный в липосомы физиологический раствор; «контроль» - группа интактиых мышей, которым вводили только суспензию нпММСК.

1 сут

2 сут

4 сут

15 мин 1 сут 2 Сут 4 сут Свлез+Нка_

4 сут

Рис. 17. Распределение нпММСК после внутривенного введения мышам со стрептозотоцин-иидуцированным сахарным диабетом, где «СД.» — группа мышей с индуцированным сахарным диабетом; «контроль» - группа здоровых мышей.

Рис. 19. Гистоморфологическое и иммуногистохимическое исследования оргапов-мишепей мышей со стрептозотоцин-тдуцирсванным сахарным диабетом (32 сут эксперимента, увеличение Х400): А - поджелудочная железа, окраска гематоксилин-эозином, антителами к мышиному инсулину и красителем 0АР1, Б — почка, окраска ШИК-реащией, антителами к макрофагам, красителем ВАР1.

мышиный инсулин ышкныи инсупин 1 - ■ Г- •/ишин ми инсулин \ V*

р2Г1 и А1 н 1 пооупин Р ч

: . '1-И МЫШ^ЫП ИНСУЛИН - ( * » .Я рзн^фшобуяйй мышиным инсулин * $ 1 - - А ■ч 1- Мышинми инсулин ^ Т

Рис. 20.

Иммуи огистохимическое исследование ткани

поджелудочной железы б группе мышей

«СД+нпММСК» (32 сут эксперимента, увеличение Х400): окраска антителами к мышиному инсулину, ¡32-микроглобупину, красителем ВАР! (треугольными

стрелками указаны

человеческие клетки,

экспрессырующие мышиный инсулин).

Пассаж 2 Пассаж 3

«иск 1 PODXI Б <fi5k[>-*- Пассаж 2 Пассаж 3 Hfï an un MMCX PODXL

1 Интегрин-сб M Интегрин-аб

1 Интегрн - -u-1 l&flkD-f — »

I HGFH нот

■ СХСЯ4 4 xltD—» — -- CXCFW

[СХЗСЯ! MkD-». — — СХЭСН1

1 GAPDH 3B"kD 7+ GAPDH

15

Рис. 4. Экспрессия отобранных белков а культурах нпММСК и епММСК на 2 и 3 пассажах: А - ПЦР с обратной транскрипцией, Б - вестерн блоттинг.

Интвгрии

POOXL-ФИТЦ ИитегрнН'Об'ФИТЦ фикьзрипри»

-j ' ta ,'M.IK

ЭДТА m? E - f - чдо*

w ■ f _ 1 217%

- -

"j 70.8% sm

Трипсин|ЭДТА - s iW- *

If. • i-am

cxacRi-Фити

PH-îv

Рис. 6. Проточная цитофлуориметрия культур нпММСК. полученных от одного донора.

Для изучения возможных различий клеток, изолированных из аепиратов от разных доноров, ММСК от пяти доноров при первом пассаже были посеяны с плотностью 100 клеток/см? и на 5-9 сут пассажа исследованы на предмет наличия РООХЬ, интегрина-а4, интегрина-аб и НОРР

При помощи ГАС8 вь1явили прогрессирую щбе снижение позитивного окрашивания клеток антителами при прогрессирующем росте культур (рис. 7). Причем -экспрессия снижалась незначительно на 5, 6, 7 сут (культуры нпММСК) и резко падала на 8, 9 сут (культуры впММСК). Нормализация средних значений пиковой флюоресценции по величинам на 5 сут показала, что наибольшие изменения произошли в экспрессии РООХЬ и интегрина-аб, экспрессия I К1К(< изменилась и меньшей степени, а изменения в экспрессии интегрина-а4 были ¡наименьшими.

Исследование ММСК, трансдуциронаниых тремя различными малыми интерферирующими РНК ^¡ККЛ) к РОПХЦ (рис, 8Л и 8Б) показало снижение уровня транскрипции РООХЬ на 60-80%. В культурах транедуцированных ММСК, инкубированных в ростовой срсде в течение двух суток, наблюдали тенденцию к формированию регионов с высокой плотностью клеток и тесными межклеточными контактами по сравнений с контрольными культурами (рис. 8В). После того, как клетки были сняты с пластика при помощи ггрипсина/ЭДТА и пересеяны, транедуцированные ММСК сегрегировали на две больший субпопуляцин: разрозненные, веретенообразные клетки с малым количеством межклеточных

Рис. 7. Исследование фенотипа ММСК

полученных от разны: доноров (проточна1

цитафяуаркметрия): Л ■ изменение экспрессш. э питонов ММСК

посеянных с начальной плотностью I 00 клеток/см2, но 5-9 су>1 культивирования; Б, В - данные рис. 5/ представлены в виде средних значены пи косой флуоресценции и % нозитивт окрашенных клеток; Г - нормализации, средних значении пиково:

флюоресценции по величине.

Реэп тэйм ПЦР с обратной гранскрилтазой

£ а- о

ïl ш аа

Û

□□о

0 Проточная цитофлоу метрия

Ё I

1 6 -¿г

£ 5 тт

Ж

О о

Транефекция ММСК интерферирующими РНК

"SI L^ï+Г;}::. '

Сегрегация транедуцирооанных ММСК на популяции

снятие с пластика трипсином/ЭДТА и посев с той же плотностью

Î: 1

с d "Л

* Qdj

ё? I о.г a cl

о г о

Пееп» nxtâii

И ммуно цитохимическое исследование

О

д

Контроль 0 PODXL РНК-иитерф. ; PODXL РНК-инторф. (arpcrai)

РОПХЦ POOXL PODXI,

| !Mt

Рис. 8. Агрегация ММСК вызванная РНК

интерференцией к PODXL А - исследование м-PHh, нормальных i

трансфецированных MMCI (реал-тайм ПЦР с обратной транскрипцией) Ь -экспрессия PODX ММСК, инкубированных i 20 нМ малы,

интерферируюи ¡их РНI (проточная

цитофлуорил ;етрия ) ; В определение количества м РНК PODXL (реал-таг^ ПЦР с обратноi транскрипцией). Г микрофотографг п/ трансфецированннои культуры; Д

иммуноцитохимическое исследование.

контактов и клетки, формировавшие большие агрегаты (рис. 8Г). Разрозненные веретеновидные клетки, в отличие от агрегированных клеток, экспрессировали молекулы PODXL (рис. 8В и 8Д). Уровень экспрессии остальных белков при этом снижался 1езначительно.

Таким образом, методом сравнительного выращивания показано, что только нпММСК жспрессируют белки PODXL, интегрин-а4, интегрин-аб и HGFR; обладают меньшей пособностью к агрегации и образованию тромбоэмболов после трансплантации мышам, становлено, что высокий уровень экспрессии указанных белков нпММСК отражает богащенность культуры клоногенными клетками-предшественниками с высоким ифферепцировочным потенциалом и служит новым универсальным критерием экспресс-оценки качества культуры. Кроме этого нами разработана методика быстрой оценки культуры ММСК на наличие экспрессии данных белков методом проточной цитометрии, и подобран писок коммерчески доступных антител, пригодных для этого. Также была установлена птимальная плотность посева (100 клеток/см2) и сроки для культивирования нпММСК (не "олее 7 суток), позволяющие получить в кратчайшее время максимальное число клеток с аданными свойствами для трансплантации. Указанные параметры применялись в дальнейших зкспериментах настоящего исследования.

2. Сопоставление распределения клеток по органам in vivo

Исходя из анализа научной литературы, в экспериментах на животных чаще используют внутривенное введение (наиболее часто используется хвостовая вена) и внутриартериальное например, трансторакально в полость левого желудочка или любым другим методом, минуя малый круг кровообращения). В нашем исследовании были сравнены оба способа введения. При этом проводили количественную оценку распределения клеток по органам и тканям мыши после системного введения.

В предварительных экспериментах при неизменном объеме суспензии и использовании нпММСК, культивированных в течение 7 сут, была подобрана оптимальная доза для рансплантации (рис. 9). Внутривенное введение 3 миллионов нпММСК оказалось нерациональным, поскольку приводило к образованию летальных тромбоэмболов в микроциркуляторном русле легких непосредственно после введения, что обусловило менынение показателя выживаемости до 20%. Интересно отметить, что при внутриартериальном введении высоких доз нпММСК (более 3 миллионов) мы не наблюдали 1аких осложнений, что, возможно, объясняется различной кинетикой клеток. Введение 2 миллионов клеток независимо от способа введения было достаточно безопасным. Эта дозировка была выбрана для дальнейшего использования. От введения 1 миллиона нпММСК, несмотря на еще большую безопасность, решено воздержаться в связи с невозможностью корректной оценки результатов.

150 микролитров суспензии нпММСК, содержащей 2 млн клеток, вводили мышам внутривенно (в хвостовую вену) или внутриартериально (трансторакально). В разные

временные точки забирали образец крови, выделяли из нее ДНК и при помощи ПЦР г реальном времени определяли количество циркулирующих нпММСК в крови (рис. 10). Чере 15 мин после введения в циркуляции оставалось менее 6% от исходного количества нпММС! как при в н у три а ртер и ал ь нОм, так и ири йнутривенном Введении. 13 дальнейших эксперимент;! все результаты также оценивали в этой временной точке. Для контроля аналогичным способами вводили и через 15 мин оценивали количество циркулирующих клеток линии МОЛ1 123 (рак молочной железы), клеток мононуклеарной фракции крови человека и крысы. Для все типов клеток получены сходные результаты (рис. ! I).

100

Е0 60 40 20 0

□

1«ллн 2 млн 3 млн

7 суток в культуре

Рис, 9. Выживаемост реципиента при внутривенно. введении нпММСК клеток а 150 мкл ^ёисимости от концентрат

50 60 70 Время (мин)

I °

ft ÛJ

О г

f 5

S к

С л

О I * X

V

О 3

10

5

6 4 2 0

1^5 Г04 0^9

10

20

30

0.98

60 70 Бремя (мин)

Рис. 10. Циркуляция нпММСК крови мыши после систем ног введения: А - внутриартерначыю введение, В - внутривенно введение.

. При сравнении распределения нпММСК по органам после внутривенного внутри артериального введения было установлено, что более 70% нпММСК через 15 мил поев? инъекции в хвостовую вену задерживаются в легочной ткани (рис. 12), В то же время поел инутриартериального введения нпММСК равномерно распределялись по всем органам и тканя! Аналогичные результаты получены при использовании клеток опухолевой ткани. Елетк мононуклеарной фракции крови человека и крысы после внутривенного введени задерживались в легочной ткани в меньшем количестве.

Внутривенное введение клеток значительно чаше используется в клинической практик поэтому мы изучили этот метод доставки клеток более детально.

10 а Й

о

□ нпММСК, г=10

О Опухолевые клетки. л=6

□ Мононуклеары человека, п=5 ■ Мононуклеары крысы, п=2

гЬ.

Внутривенное введение Бнутриартериальное введение

Рис. 11. Циркуляция клеток в крови мыши через 15 мин после системного введения.

К л X х

ЗнутрцИСММОО НПОЛО^ЛС

| I

п нпММСК, п=10 ^ Опухолевые клетки, п=4 с Мононуклеары человека, п=6 ■ Мононуклеэры крысы, п=4

Головной Сердцп Легкие Печень ПоАжелу'Селезенка Почки мозг дсчная

Костный мозг

60 60 40 30 20 ю о

Ш-й,

I

Внутриаргсриальнос □□одсние

° нпММСК, п=8 о Опухолевые клетки, л=6

£А

1

Ли

А

Головной Сордцо мозг

Легкие

Печень ПояжолУ Селезенка Почки Костный дочная „пзг

Рис. 12. Распределение нпММСК но органам через 15 мин после: А внутривенного, Б -знутриартериалыюго введения.

Средние значения для всех остальных органов

0.2 -> 0.01

80 100 Время, "асы;

Рис.

нпММСК здоровых после введения.

13. Кинетика в легких животных внутривенного

Кинетика клеток, осевших в капиллярах легких животных после внутривенноп введения, била прослежена в течение 4 сут (рис. 13). Отмечено, что число нпММСК в легочно: ткани прогрессивно уменьшалось и к концу 4 сут составляло не более 1% от общего количеств введенных клеток, возможно вследствие активации процессов апоптоза и фагоцитоза пр увеличении времени пребывания нпММСК в капиллярном русле легких (рис, 14, цветка, встапка 2). Также нами было отмечено, что предварительное введение системно! вазодилататорэ достоверно снижало количество осевших в легких кпММСК и увеличивал! фракцию циркулирующих в крови клеток. В отличие от этого ни блокирование интегркнов-а4 -аб, пи предварительное инкубирование клеток с мононуклеарами крови не приводит достоверному изменению фракции циркулирующих нпММСК и их органного распределен и (рис. 15).

6

Б

т нпММСК. п=14

ш В лзо дилятатор + нпММСК. л=13

£3 НпММСК + АТ к С£}49(. ПАЛ

И нпММСК + АТ к Соаэа, п=4

^ НПММСК+ мононуклвдры крысы П=€

- р<0.01

П.

ММСК + АТ ММСК + АТ к С0491 к Г

Рис. 15, Кинетик нпММСК. про шедши предварителы <уш обработку, через 15 ми ___I после введения; А

ММСК + Г.

«онокукл„системная циркуляция, Б крысы распределение по органам.

Л.

□ НПММСК, п-1 о

С] В а золил ататор + нпММСК. Пс12

□ нпММСК + АТ к С04а|. а нпммек + ат к сс4Э1(,

П НПММСК+ мононуклеары крысы, п = £ pi0.U1

Г ОЛООНОЙг

Сердце Легки« ПвченьПоджилу-с^пвздн. Печки костный мозг дочная ка мозг

железа

Известно, что распределение клеток после введения интактным животным отличается о их распределения после введения животным е минимальными повреждениями тканей. Пр анализе литературы нами не было найдено данных, показывающих отличия в распределении поведении клеток после введения животным е различными видами патологического процесс; острым и хроническим. В си язи е этим сравнили распределение нпММСК по органам и тканяг после внутривенного введения животным с моделями острого (деплеция макрофагов токсическое поражение селезенки) и хронического заболеваний (стрептозотоцш индуцированный сахарный диабет) (рис. 16, 17, цветная пставка 3), Установлено, что пр остром процессе через 1 сут после введения нпММСК наблюдается увеличение количеств клеток у животных экспериментальной группы в тканях селезенки, почек, костном мозг головном мозге, сердце, печени. При дальнейшем наблюдении различия исчезали, Пр Хроническом течении заболевания нет различий в распределении нпММСК по органам контрольных животных и у животных с патологией, хотя в литературе отмечен терапевтически эффект после внутривенного введения клеток животным с индуцированным сахарным диабсто

Таким образом, было изучено распределение клеток в ранние сроки (от 5 мин до 4 сут) юсле внутривенного и внутриартериального введения в организме здоровых мышей. При ¡ыборе дозы для введения (2 миллиона нпММСК, ресуспендированных в 150 микролитрах уферного раствора) мы исходили из условий уменьшения риска образования летальных ромбоэмболов в сосудах микроциркуляторного русла легких. Также при такой дозировке шсло клеток в органах и тканях после распределения было заведомо выше порога (увствителыюсти метода количественной оценки. Установлено, что независимо от способа •истемного введения и типа клеток через 5 мин после инфузии количество клеток, 1иркулирующих в крови не превышает 9% от исходного. После внутриартериального введения шММСК распределяются по органам и тканям практически равномерно. При внутривенном ведении наибольшая часть нпММСК (более 70% от исходного) задерживается в легких, а атем число их прогрессивно уменьшается и к концу 4 сут составляет не более 1% от исходного, уменьшении количества нпММСК в легких играют роль процессы апоптоза и фагоцитоза, становлено, что блокирование при помощи антител основных молекул адгезии или •мешивание нпММСК с мононуклеарной фракцией клеток не приводит к изменению схемы аспределения клеток. В отличие от этого предварительное введение системного азодилататора приводит с достоверному снижению количества задержавшихся в легких. шММСК и увеличению фракции циркулирующих в крови клеток. При внутривенном введении шММСК животным с патологическим процессом установлено, что при наличии модели строго заболевания в течение первых суток клетки, задержавшиеся в легких, ерераспределяются: количество нпММСК человека увеличивается в поврежденных органах и канях. При внутривенном введении нпММСК животным с моделью хронического заболевания азличий в распределении не выявлено.

3. Терапевтический эффект при внутриартериальном введении нпММСК мышам с юделью стрептозотоцин-индуцнрованного сахарного диабета

Учитывая отсутствие различий в распределении нпММСК после внутривенного введения ежду контрольной и экспериментальной группами при моделировании хронического аболевания, был проведен эксперимент с внутриартериальным введением нпММСК.

Животных разделили на следующие группы: мыши с индуцированным сахарным иабетом, получившие инъекцию нпММСК - «СД+нпММСК», мыши с индуцированным 'ахарным диабетом, получившие инъекцию фибробластов - «СД+фибробласты», мыши с тдуцированным сахарным диабетом, не получившие клеток - «СД» и группа здоровых

ивотных. Животным экспериментальной группы вводили суспензию 2,5*106 нпММСК на 10 и 7 сут после первой инъекции стрептозотоцина. Эффект введения клеток оценивали по вменению уровня глюкозы сыворотки крови (измерялся еженедельно), уровня инсулина ыворотки крови (измерялся на 32 сут эксперимента методом ELISA). Известно, что при ахарном диабете первыми повреждаются поджелудочная железа и почки, поэтому при оценке ерапевтического эффекта клеток оценивали также гистологию этих органов (животных

умервщвляли на 32 сут эксперимента и производили забор тканей ;и иммуногистохимического исследования).

Уровень глюкозы крови у животных группы «СД+нпММСК» по сравнению с группе «СД» достоверно уменьшился после второй инъекции клеток, а в группе «СД+фибробласть остался на прежнем уровне. Уровень инсулина сыворотки крови у животных, получивин инъекции нпММСК был выше, чем у животных группы «СД» (рис. 18), но ниже, чем в груш здоровых животных.

При иммуногистохимическом исследовании на 32 сут эксперимента установлено (ри 19А, цветная вставка 4), что в тканях поджелудочных желез животных группы «С наблюдалась атрофия паренхимы. Размеры и количество островков были уменьшены, клетки них не дифференцировались на подтипы, некоторые островки гиалинизированы. Час-островков находилась в состоянии гипертрофии. Наблюдался перидуктальны перилобулярный склероз. По ходу протоков определялась лимфогистиоцитарная инфильтраци В группе «СД+нпММСК» также наблюдалось уменьшение количества и размеров островко но в отличие от группы «СД» сохранные островки находились в состоянии гипертрофии, в ш определялись полиморфные клетки (что отражало, по-видимому, начало дифференцировки 1 подтипы). При иммуногистохимическом исследовании тканей поджелудочной железы мышей группе «СД+нпММСК» по-сравнению с группой «СД» большее количество островков большая их площадь окрашивались антителами против мышиного инсулина. Также в груш «СД+нпММСК» обнаружено достоверно большее количество островков Лангерганса на од( срез, чем в группе «СД».

С Д. п*2

СД + фибробласты, п«5

В

I 21

1 1.5.

| 1' Г"

| 0.5- п

сд п=5

10 17

Время (сутки)

СД * нпММСК п=9

Здоровью МЫШИ

п=3

10 17 24

Время (сутки)

Рис. 18. Уровень глюкозы и инсулина сыворотке крови мыши: А - уровень глюкоз в группах СД+нпММСК и СД; Б - урова глюкозы в группах СД+ фибробласты, СД; -уровень инсулина в крови животных на ' сут эксперимента.

Сравнительно небольшое количество нпММСК человека в островках поджелудочнь желез животных группы «СД+нпММСК» экспрессировали мышиный инсулин, что выявле)

ри двойном окрашивании антителами к человеческим клеткам (Р2-микроглобулипу [еловека) и мышиному инсулину (рис. 20, цветная вставка 4).

При гистологическом исследовании тканей почек на 32 сут эксперимента (рис. 19Б, шетная вставка 4) у животных группы «СД» обнаружены клубочки разного размера, часть лубочков была гиалинизирована и склерозирована, единичные клубочки гипертрофированы, пределялось расширение мезангиального матрикса, пролиферация мезангиальных клеток, шальные мембраны капилляров утолщены. Наблюдалось расширение и полнокровие сосудов сех калибров, определялись небольшие участки периваскулярных кровоизлияний и имфогистиоцитарная инфильтрация с примесью макрофагов. Некоторые канальцы были асширены, в просвете их определялись гомогенные эозинофильные массы (гиалиново-апельная дистрофия). В тканях почек животных группы «СД+нпММСК» по сравнению с руппой «СД» определялось уменьшение мезангиального матрикса и меньшая пролиферация юзангиальных клеток. Базальные мембраны капилляров утолщены меньше, чем у животных руппы «СД». Капиллярные петли клубочков расширены, полнокровны.

При иммуногистохимическом исследовании срезы тканей почек окрашивали антителами к 1ышиным макрофагам/моноцитам. У животных группы «СД» обнаружено достоверное величение количества макрофагов в гломерулах в сравнении с гломерулами почек мышей

руппы «СД+нпММСК», что подтверждено статистически.

***

Таким образом, экспериментальным путем был показан терапевтический эффект нпММСК ри внутриартериалыюм введении животным с моделью хронического заболевания - сахарного иабета, которое часто вызывает вопросы относительно целесообразности использования леток для лечения. Мы подтвердили тропность нпММСК к органам-мишеням, поражаемым ри сахарном диабете, в первую очередь поджелудочной железе и почкам.

ВЫВОДЫ

В культурах нпММСК костного мозга человека на ранних пассажах преобладают клетки-предшественники, экспрессирующие поверхностные маркеры РООХЦ интегрин-аб, интегрин-а4, НОГЛ, СХСК4 и СХЗСШ. Эти культуры по сравнению с культурами впММСК обладают большим клоногенным и дифференцировочным потенциалом, низкой способностью к агрегации в суспензии и к образованию летальных тромбоэмболов в микроциркуляторном русле легких после внутривенной трансплантации животным.

Экспресс-оценка качества снятой с пластика культуры ММСК, в том числе обогащенности ее клетками-предшественниками и степени риска тромбоэмболии после трансплантации, может быть проведена по уровню экспрессии поверхностных маркеров -РОЭХЬ, интегрина-аб, интегрина-а4 и НОБЯ, методом проточной цитофлюориметрии.

После системной инфузии (внутривенно или внутриартериально) нпММСК человека и использованных в качестве контроля опухолевых клеток, человеческих и крысиных периферических мононуклеаров крови мышам линии NODZ.sc/d количество этих клеток в циркуляторном русле через 15 мин не превышает 9% от исходного. Распределение нпММСК

по тканям и органам у здорового животного зависит от метода введения: п внутривенном способе в первые 15 мин 70-90% клеток задерживается в сосудах легких. К сут после трансплантации их количество в легких составляет менее 1%. П внутриартериальном введении распределение нпММСК по органам и тканям происход! равномерно, наибольшее количество обнаруживается в почках, легких, головном моз1 сердце.

4. Предварительное введение системного вазодилататора - нитропруссида натри приводит к достоверному увеличению количества циркулирующих нпММСК и уменьшени фракции клеток, задержавшихся в легких мышей, через 15 мин после внутривенн инъекции. После предварительной обработки нпММСК антителами к CD49f и CD49d и смешивании их с клетками мононуклеарной фракции крови не происходит достоверно увеличения циркулирующих клеток, и сохраняется тенденция к преимущественн миграции нпММСК в легкие.

5. В первые сутки после внутривенного введения нпММСК человека мышам с остры токсическим поражением селезенки вследствие лекарственной деплеции макрофаге количество нпММСК во всех органах, кроме легких, в десятки раз превышает их количест у здоровых животных, разница исчезает только к 4 сут. Количество нпММСК в легот мышей с вышеупомянутой моделью повреждения в течение всех 4 сут после инъекции i отличается от их количества у здоровых животных.

6. При внутривенном введении нпММСК человека мышам с моделью стрептозотоци индуцированного сахарного диабета (патологического процесса хронического течени распределение этих клеток по органам и тканям в первые 15 мин, на 1, 2,4 сут не отличает от распределения у здоровых животных, и не наблюдается достоверного изменения уров! глюкозы и инсулина крови.

7. При внутриартериальном введении нпММСК человека мышам с модель стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета эти клетки определяются поджелудочной железе и почках через 22 сут. Показано усиление репаративных процессов островках поджелудочной железы и в гломерулах почек - увеличение количества островко снижение количества макрофагов в почках по сравнению с контрольными животными с т же моделью сахарного диабета, но без введения нпММСК человека. В крови мышей сахарным диабетом, получивших инъекции нпММСК, наблюдалось повышение уров! инсулина и снижение уровня глюкозы.

Multipotent Mesenchymal Stromal Cells: defining optimal cultivation and transplantation conditions.

Andrey A. Pulin

In this dissertation thesis devoted to human bone marrow-derived multipotent mesenchym stromal cells (MSCs) we made an attempt to identify optimal and reproducible MSCs cultu conditions, criteria for their quality evaluation. A panel of antibodies to MSCs unique surface epitop is suggested for the rapid assay by flow cytometry. In addition, we tried to define potential and effica of MSCs transplantation in mice with different pathology. Herein it was shown that MSCs cultured low density were enriched in early progenitors and aggregated more slowly in suspension i

imparison to MSCs from completely confluent cultures. In addition, such low density cultures were ss prone to produce lethal pulmonary emboli after intravenous infusion into mice. Cultures of MSCs om early passages at low density showed high expression levels of PODXL, аб-integrin, a4-integrin, Met, CXCR4, and CX3CR1 as determined by several methods. The first four surface epitopes were lund to be useful for rapid assay by flow cytometry. After intravenous transplantation in normal mice -90% of MSCs were trapped in the lungs, while intraarterial infusion of cells resulted in equall istribution among different organs. Intravenous injection into mice with depleted macrophages and ixie spleen lesion led up to 70-fold increase of MSCs in target organ (spleen). There was no gnificant difference in cells distribution after intravenous injection in mice with STZ-induced iabetes Mellitus. Intraarterial transplantation of MSCs showed beneficial effect in mice with perimental Diabetes Mellitus: decrease of glucose and increase of insulin blood levels. Human ISCs were detected in pancreas and kidneys even after 22 days following transplantation. In MSCs-eated diabetic mice, there was an increase in number of pancreatic islets and (3-cells, producing ouse insulin. In kidneys of MSCs-treated diabetic mice, human cells were found in glomeruli where as found a decrease in mesangial thickening and a decrease in macrophage infiltration. Therefore, the •suits showed that MSCs may be beneficial for enhancing insulin secretion and perhaps improving the ■nal lesions that develop in patients with diabetes mellitus.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Lee R.H., Seo M.J., Reger R.L., Spees J.L., Pulin A.A., Olson S.D., Prockop D.J. Multipotent romal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli

diabetic NOD/scid mice. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2006,-V. 103.-№46,-P. 17438-43.

2. Lee R.H., Seo M.J., Reger R.L., Spees J.L., Pulin A.A., Olson S.D., Prockop D.J. Multipotent romal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli

diabetic NOD/scid mice. // Seventh Annual Rachmiel Levine Diabetes and Obesity Symposium, dvances in Diabetes Research: From Cell Biology to Cell Therapy - Long Beach, USA - November И, 2006.-P.90.

3. Lee R.H., Seo M.J., Pulin A.A. Tissue distribution of human multipotent stromal cells (hMSCs) Iter intravenous or intracardiac infusion into mice // 18th Annual Research Days of Tulane University ealth Sciences Center-New Orleans, USA - February 28 - March 1, 2007,- P.38.

4. Lee R.H., Seo M.J., Pulin A.A., Gregory C., Ylostalo J., Prockop D.J. Surface epitopes volved in cell motility and tumor progression are expressed in low density cultures but not in nfluent cultures of human multipotent stromal cells (HMSC) // Molecular Therapy, Abstracts from merican Society of Gene Therapy's 10th Annual Meeting.- Seattle, USA.- 30.05-3.06.2007,- P.S115.

5. Lee R.H., Seo M.J., Pulin A.A., Prockop D.J. Tissue distribution of human multipotent stromal -lis (hMSCs) after intravenous or intracardiac infusion into mice // Molecular Therapy, Abstracts om American Society of Gene Therapy's 10,h Annual Meeting - Seattle, USA - 30.05-3.06.2007,-.S396.

6. Lee R.H., Seo M.J., Pulin A.A., Prockop D.J. Antibodies that identify early progenitors in reparations of human multipotent stromal cells (MSCs) // Adult Mesenchymal Stem Cells in egenerative Medicine - Cleveland, USA - August 27 - 29, 2007.

7. Пулин A.A. Поверхностные эпитопы, идентифицирующие ранние прогениторные МСК еловека. // Вестник РАМН, приложение,- 2008 - №6 - Стр.352.

8. Пулин А.А. Стимуляция репарации клеток островков Лангерганса, их эндокринной ункции и клеток гломерулярного аппарата почек у мышей с индуцированным сахарным иабетом при трансплантации МСК человека. // Вестник РАМН, приложение - 2008 - №6.-тр.352-353.

9. Пулин А.А., Сабурина И.Н., Репин B.C. Поверхностные маркеры, характеризующие ультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) костного мозга человека. // леточная трансплантология и тканевая инженерия,- 2008 - Т.З.- №3.- Стр.25-30.

Заказ № 139/10/08 Подписано в печать 16.10.2008 Тираж 200 экз. Усл. п.л. 1.5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 , (У*); www. cfr. ru; e-mail: info@cfr. ru

Актуальность темы

Среди негемопоэтических клеток, используемых для клеточной терапии, наибольшее применение находят мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, выделенные из костного мозга, или ММСК [45]. В связи с развитием клеточных технологий начато применение ММСК в клинических целях [60, 77, 78, 90, 129, 132]. Однако до настоящего времени многие вопросы, касающиеся получения, культивирования, фенотипирования, распределения и кинетики клеток in vivo, остаются нерешенными. Не разработан универсальный и воспроизводимый протокол культивирования и фенотипирования клеток, не определены единые критерии оценки качества культуры клеток для трансплантации. В научной литературе отсутствуют указания на различия в поведении ММСК in vivo после инфузии их интактным животным и животным с моделями острого и хронического патологического процесса. Одним из основных остается вопрос: при каких патологических процессах применение ММСК оправданно и эффективно?

На данный момент разработано несколько методов культивирования ММСК. По одному из них — культивирование ММСК в высокой плотности (впММСК) считают оптимальным и выгодным способом подготовки клеток к трансплантации. Согласно другому — конфлюэнтные культуры частично коммитированы к дифференцировке или даже старению, поэтому впММСК теряют некоторые свойства, присущие ММСК, выращенным в низкой плотности (нпММСК).

Общепринятым считается метод выделения ММСК из костного мозга путем их агдезии к поверхности лабораторного пластика [52, 122, 127]. Клетки были охарактеризованы главным образом по их способности образовывать колонии в культуре и дифференцироваться в адипоциты, остеобласты и хондроциты. В дальнейшем с целью получения более стандартизованных и точных процедур изоляции и идентификации ММСК стали применять антитела к поверхностным белкам клеток. Первыми были открыты моноклональные антитела (IgM) к белку STRO-1, который экспрессировался конфлюэнтными культурами человеческих ММСК [143]. Антитела к STRO-1 и комбинация их с другими антителами в дальнейшем использовались для определения и выделения ММСК [39, 44, 57, 67, 68, 85, 151, 165]. Затем была выявлена дополнительная серия антител к ММСК [11, 18, 71, 174], причем для фенотипирования ММСК стали использовать антитела, первоначально полученные для других типов клеток [6, 12, 20, 109]. Однако ни одно из этих антител не позволяет выделить культуру клеток, наиболее насыщенную ранними предшественниками и обладающую максимальным терапевтическим эффектом.

В последние годы появились сообщения о том, что нпММСК содержат субпопуляцию быстро само-реплицирующихся клеток [35, 42], проявляющих характерные паттерны экспрессии генов, отличные от паттернов клеток конфлюэнтных культур [66], имеют гораздо больший потенциал к образованию моноклональных культур [35, 146] и характеризуются лучшей эффективностью при трансплантации [103].

Преимущество использования культур нпММСК для клеточной терапии требует дальнейшего изучения. Важное значение имеет и определение (выбор) наиболее эффективных путей доставки ММСК в органы/ткани-мишени. Имеются сообщения об успешном приживлении клеток при внутривенном или локальном введении в ишемизированные, облученные или другим образом поврежденные органы/ткани [13, 107, 118, 120, 166]. В то же время практически не изучена способность ММСК к миграции из системного кровотока через неповрежденный, неактивированный эндотелий, то есть в условиях, приближенных к тем, которые наблюдаются при большинстве заболеваний, потенциально пригодных для клеточной терапии.

Во всех публикациях, посвященных применению ММСК в клеточной терапии, количественную оценку приживления клеток в тканях и органах осуществляют преимущественно в отдаленные сроки, не раньше чем через несколько суток после трансплантации [50, 113]. Имеются лишь единичные сообщения о качественной оценке распределения меченых клеток в ранние сроки после введения [138]. Количественная оценка распределения клеток не проводится.

Все вышеизложенное указывает не только на актуальность теоретической разработки единых критериев и методов оценки пригодности культуры клеток для трансплантации и создания оптимального модифицированного и воспроизводимого протокола получения культуры ММСК для трансплантации, но и на необходимость изучения кинетики и распределения клеток такой культуры in vivo после введения в организме лабораторных животных, в том числе при наличии острого и хронического патологического процесса.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования являлась разработка оптимального и воспроизводимого протокола получения клеточного трансплантата на основе ММСК костного мозга человека, критериев экспресс-оценки качества трансплантата, определение возможности и эффективности его использования в эксперименте у животных в норме и при различных патологических состояниях.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить культуру ММСК с высоким содержанием стволовых/прогениторных клеток.

2. Разработать критерии экспресс-оценки культуры ММСК для трансплантации.

3. Подобрать условия культивирования ММСК, при которых минимизируется риск агрегации клеток в суспензии in vitro и образования тромбоэмболов при трансплантации in vivo.

4. Изучить распределение клеток полученных культур по органам и их кинетику после введения в организм мыши в норме и при патологии.

5. Изучить терапевтическую активность полученных ММСК у мышей на модели стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета.

Научная новизна

Работа является первым экспериментальным исследованием, в котором при сравнении существующих протоколов культивирования ММСК выбран оптимальный, направленный на получение максимально возможного количества клеток из одного биоптата костного мозга человека с сохранением качества культуры.

В ходе исследования впервые идентифицированы антитела к поверхностным клеточным маркерам, позволяющим охарактеризовать ранние клетки-предшественники в культурах ММСК человека. Показана возможность быстрой оценки культур на наличие ранних клеток-предшественников путем обнаружения маркерных поверхностных эпитопов РСЮХЬ, интегрина-аб, интегрина-а4, ЬЮРЯ методом проточной цитометрии ММСК после снятия их с пластика трипсином/ЭДТА. Определены качественные и количественные характеристики культуры ММСК на этапах подготовки клеток к трансплантации.

Впервые изучена кинетика и распределение нпММСК в ранние сроки после системного введения мышам — циркуляция в крови и распределение по органам и тканям. Впервые проводится количественная оценка распределениия нпММСК по органам в зависимости от метода введения.

В ходе работы предложены экспериментальные модели острого и хронического заболеваний для оценки распределения и кинетики после трансплантации отобранной культуры нпММСК. На модели стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета у мышей впервые изучен терапевтический эффект введения нпММСК: показано восстановление структуры островкового аппарата поджелудочной железы и активация ее эндокринной функции, а также репарация структуры гломерулярного аппарата почек.

Теоретическая и практическая значимость

Разработан метод, позволяющий получить трансплантат на основе ММСК человека с максимальным числом клеток из единственного образца костного мозга. Этот метод позволяет сохранить максимальное количество клеток-предшественников в культуре и одновременно минимизировать риск агрегации ММСК и образования тромбоэмболов в сосудах микроциркуляторного русла после трансплантации. Предложен эффективный подход к оценке качества ММСК, подготовленных для трансплантации, методом проточной цитофлуориметрии. Выявлен кластер поверхностных маркеров ранних клеток-предшественников. При сопоставлении внутривенного и внутриартериального способов введения определен оптимальный метод доставки клеток в пораженный орган/ткань. Показана структурная и функциональная репарация пораженных островков Лангерганса в ткани поджелудочной железы у мышей со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом после внутриартериальной трансплантации культуры нпММСК человека. Установлено, что секреторной активностью обладали и некоторые из мигрировавших в поджелудочную железу нпММСК человека, причем при двойном иммуноцитохимическом окрашивании показана экспрессия этими клетками мышиного инсулина.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Культуры ММСК могут быть быстро оценены на наличие ранних клеток-предшественников, клоногенность и способность к дифференцировке, риск агрегации их в суспензии и образования летальных тромбоэмболов методом проточной цитометрии по уровню экспрессии спектра поверхностных маркеров. Наиболее информативными являются РСЮХЬ, интегрин-аб, интегрин-а4, НОРЯ.

2. Особенности кинетики и распределения нпММСК по органам и тканям в ранние сроки после трансплантации зависят как от способа системного введения, так и от наличия и характера патологического процесса.

3. Системное введение нпММСК человека мышам со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом стимулирует репарацию пораженных островков Лангерганса в ткани поджелудочной железы преимущественно за счет паракринных эффектов, при этом частично восстанавливается нормальная структура островков Лангерганса, снижается уровень глюкозы, повышается уровень инсулина крови этих животных. После трансплантации нпММСК человека у животных с сахарным диабетом также наблюдается восстановление структуры и функции гломерул почек.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на:

• 7th Annual Rachmiel Levine Diabetes and Obesity Symposium, Advances in Diabetes Research: From Cell Biology to Cell Therapy (2006r, Long Beach, CA, USA);

• 18th Annual Research Days of Tulane University Health Sciences Center (2007r, New Orleans, LA, USA); th

• American Society of Gene Therapy's 10 Annual Meeting (2007r, Seattle, WA, USA);

• Adult Mesenchymal Stem Cells in Regenerative Medicine (2007r, Cleveland, OH, USA);

• V конференция молодых ученых России с международным участием (2008г, Москва).

Внедрение полученных результатов

Результаты диссертационного исследования используются для выделения, культивирования и подготовки клеток к трансплантации в лаборатории клеточной биологии и патологии развития ГУ НИИОПП РАМН.

ВЫВОДЫ

1. В культурах нпММСК костного мозга человека на ранних пассажах преобладают клетки-предшественники, экспрессирующие поверхностные маркеры: РСЮХЬ, интегрин-аб, интегрин-а4, НЮРЯ, СХСЯ4 и СХЗСШ. Эти культуры по сравнению с культурами впММСК обладают большим клоногенным и дифференцировочным потенциалом, низкой способностью к агрегации в суспензии и к образованию летальных тромбоэмболов в микроциркуляторном русле легких после внутривенной трансплантации животным.

2. Экспресс-оценка качества снятой с пластика культуры ММСК, в том числе обогащенности ее клетками-предшественниками и степени риска тромбоэмболии после трансплантации, может быть проведена по уровню экспрессии поверхностных маркеров: РСЮХЬ, интегрина-аб, интегрина-а4 и НвРЯ - методом проточной цитофлуориметрии.

3. После системной инфузии (внутривенно или внутриартериально) нпММСК человека и использованных в качестве контроля опухолевых клеток, человеческих и крысиных периферических мононуклеаров крови мышам линии ЖЮ/яс/й? количество этих клеток в циркуляторном русле через 15 мин не превышает 9% от исходного. Распределение нпММСК по тканям и органам у здорового животного зависит от метода введения: при внутривенном способе в первые 15 мин 70-90% клеток задерживается в сосудах легких. К 4 сут после трансплантации их количество в легких составляет менее 1%. При внутриартериальном введении распределение нпММСК по органам и тканям происходит равномерно, наибольшее количество обнаруживается в почках, легких, головном мозге, сердце.

4. Предварительное введение системного вазодилататора - нитропруссида натрия, приводит к достоверному увеличению количества циркулирующих нпММСК и уменьшению фракции клеток, задержавшихся в легких мышей, через 15 мин после внутривенной инъекции. После предварительной обработки нпММСК антителами к СБ49Г и СБ49с1 или смешивании их с клетками мононуклеарной фракции крови не происходит достоверного увеличения циркулирующих клеток, и сохраняется тенденция к преимущественной миграции нпММСК в легкие.

5. В первые сутки после внутривенного введения нпММСК человека мышам с острым токсическим поражением селезенки вследствие лекарственной деплеции макрофагов количество нпММСК во всех органах, кроме легких, в десятки раз превышает их количество у здоровых животных, разница исчезает только к 4 сут. Количество нпММСК в легких мышей с вышеупомянутой моделью повреждения в течение всех 4 сут после инъекции не отличается от их количества у здоровых животных.

6. При внутривенном введении нпММСК человека мышам с моделью стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета (патологического процесса хронического течения) распределение этих клеток по органам и тканям в первые 15 мин, на 1, 2, 4 сут не отличается от распределения у здоровых животных, и не наблюдается достоверного изменения уровня глюкозы и инсулина крови.

7. При внутриартериальном введении нпММСК человека мышам с моделью стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета эти клетки определяются в поджелудочной железе и почках через 22 сут. Показано усиление репаративных процессов в островках поджелудочной железы и в гломерулах почек — увеличение количества островков, снижение количества макрофагов в почках по сравнению с контрольными животными с той же моделью сахарного диабета, но без введения нпММСК человека. В крови мышей с сахарным диабетом, получивших инъекции нпММСК, наблюдалось повышение уровня инсулина и снижение уровня глюкозы.