Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Возможности сохранения репродуктивной функции у женщин, больных раком молочной железы

На правах рукописи

ШАРИПОВА Надежда Юрьевна

ВОЗМОЖНОСТИ СОХРАНЕНИЯ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ У ЖЕНЩИН, БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

14.01.01 - Акушерство и гинекология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2012

Работа выполнена в 1-ом гинекологическом отделении (отделение сохранения и восстановления репродуктивной функции) ФГБУ «Научный центр акушерства гинекологии и перинатологии имени В.И. Кулакова» Минздравсоцраэвития России.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Назаренко Татьяна Алексеевна

Пароконная Анастасия Анатольевна

Официальные оппоненты:

Ашрафян Левон Андреевич - член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор, руководитель отделения гинекологии ФГБУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздравсоцраэвития России

Калугина Алла Станиславовна - доктор медицинских наук, ассистент кафедры репродуктивного здоровья женщины ГБОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова»

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Защита диссертации состоится «15» января 2013 г. в 13.00 на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.125.01 при ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Академика Опарина,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан «15» декабря 2012 г.

Д. 4.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Калинина Елена Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Ежегодно в мире регистрируется 12,7 млн. больных злокачественными новообразованиями и 7,6 млн. умерших от них. Рак молочной железы (РМЖ) в структуре заболеваемости женского населения занимает первое место и составляет 20,1%. В 2009 году зарегистрированы 54 315 новых больных раком молочной железы, при этом, среди всех женщин моложе 45 лет, впервые заболевших злокачественным новообразованием, РМЖ выявлен у 23% (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2009). Следовательно, почти одна треть больных РМЖ находится в репродуктивном возрасте.

Успехи современной онкологии позволили достичь значительных результатов в лечении РМЖ. Комплексный подход, включающий в себя хирургические методы лечения, системную терапию (химиотерапию), лучевую терапию, гормональное лечение привели к увеличению уровня выживаемости. Более 80% больных с I стадией после лечения РМЖ живут 10 лет. При II и III стадиях РМЖ 5-летняя выживаемость составляет 50-60% и 30-40% соответственно (У.И. Чен, Э. Уордли, 2009). В связи с этим, растет количество пациенток репродуктивного возраста, перенесших онкологическое заболевание, которые хотят продолжить полноценную жизнь.

Вместе с тем, полихимиотерапия, используемая при лечении РМЖ, обладает гонадотоксичным эффектом и, зачастую, приводит к снижению, либо к полной потери фертильности. Степень повреждения функции яичников может варьировать от транзиторной аменореи до развития преждевременной менопаузы и зависит от возраста женщины, вида и дозы используемого препарата, а также исходного состояния репродуктивной системы. Частота развития бесплодия, при этом, может колебаться по разным данным от 21 до 71% (Oktay К., 2006; Petrek J.A., 2006; Axelrod D., 2008). Проводимая в ряде случаев гормональная терапия РМЖ, длительность которой составляет не менее 5 лет, приводит к увеличению возраста женщины и, следовательно, дополнительному риску потери фертильности. Безусловно, возникающее в результате лечения бесплодие и длительность необходимого лечения онкологического заболевания существенно снижают

качество жизни больных и уровень социальной адаптации пациенток, планирующих впоследствии иметь детей.

Поиск наиболее оптимальных, эффективных и безопасных методов сохранения репродуктивной функции у онкологических больных остается на сегодняшний день актуальным и не вполне решенным вопросом. Применение методов вспомогательной репродукции (криоконсервации эмбрионов, ооцитов, ткани яичника), безусловно, позволяет сохранять генетический материал у данной группы пациенток, однако метод его забора не всегда является простой задачей. В частности, неоднозначным остается вопрос проведения стимуляции суперовуляции у больных с гормонально зависимым раком молочной железы, которая может приводить к выраженному повышению уровней половых стероидов в крови и потенциальному риску рецидива заболевания. В связи с этим, актуальным остается изучение и поиск схем стимуляции суперовуляции у больных РМЖ, обеспечивающих получение достаточного количества генетического материала с учетом течения и прогноза заболевания. На сегодняшний день не существует четких рекомендаций по отбору пациенток для проведения программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) с последующей криоконсервацией полученного материала, не ясны сроки ее проведения, не отработаны этапы взаимодействия между врачами различных специальностей, не оценено влияние проводимых мероприятий на течение и прогноз основного заболевания. Все вышеперечисленное определяет актуальность представляемой исследовательской работы.

Целью исследования явилась разработка схем стимуляции функции яичников у больных РМЖ с целью сохранения генетического материала для отсроченной реализации репродуктивной функции с учетом клинических особенностей, течения и прогноза основного заболевания.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить клинико-лабораторные особенности больных РМЖ репродуктивного возраста с учетом онкологического статуса, гинекологического и репродуктивного анамнезов.

2. Оценить уровень информированности пациентов о влиянии проводимого лечения на состояние их репродуктивной системы и возможности сохранения репродуктивного материала.

3. Изучить состояние овариального резерва у пациенток до лечения, и через 6, 12,18 и 24 месяца после комбинированного или комплексного лечения РМЖ для определения влияния различных видов лечения на состояние репродуктивной системы.

4. Разработать критерии отбора больных РМЖ репродуктивного возраста для сохранения генетического материала на основании клинических, морфологических особенностей заболевания, его течения и прогноза.

5. Изучить возможность применения различных протоколов стимуляции функции яичников у больных РМЖ и сравнить их эффективность.

6. Оценить число и качество полученных ооцитов и эмбрионов и их способность к криоконсервации.

7. Разработать алгоритм использования методов вспомогательной репродукции для сохранения генетического материала больных РМЖ с целью отсроченной реализации репродуктивной функции.

Научная новизна

Впервые в отечественной медицинской практике проведено исследование, оценивающее возможность получения и криоконсервации генетического материала для отсроченного деторождения у больных РМЖ. Совместно с онкологами сформированы критерии отбора пациентов для применения методов вспомогательной репродукции, включающие в себя оценку онкологического статуса, прогноза выживаемости, состояние репродуктивной функции, возможности получения и криоконсервации ооцитов и эмбрионов. Разработана тактика этапного ведения пациенток онкологами и акушерами-гинекологами. Изучены методы управления менструальным циклом для обеспечения эффективности и безопасности лечения. Впервые продемонстрировано, что оптимальным является протокол с использованием ингибиторов ароматазы, дающий возможность криоконсервировать достаточное число эмбрионов, снизить риск развития гиперстимуляции яичников и контролировать уровень эстрогенов.

Оценена потребность использования ВРТ у больных РМЖ, а также уровень их информированности о влиянии терапии РМЖ на функцию яичников и возможности для сохранения этой функции.

Практическая значимость В результате проведенного исследования выработан алгоритм ведения больных РМЖ репродуктивного возраста, желающих сохранить свой генетический материал, включающий в себя этап отбора больных в онкологическом учреждении на основании клинических, патоморфологических и иммуногистохимических особенностей заболевания, и этап ведения пациенток акушерами-гинекологами, заключающаяся в оценке состояния овариального резерва, выборе протокола и проведении стимуляции яичников, забора ооцитов их оплодотворение, культивировании и криоконсервации эмбрионов. Разработанная методика дает реальный шанс больным РМЖ в будущем иметь собственного ребенка, что, несомненно, улучшает качество жизни и уровень социальной адаптации пациентов.

Положения, выносимые на защиту

1. Большинство женщин (80%) репродуктивного возраста, больных раком молочной железы, с благоприятным прогнозом выживаемости, имеют потребность в сохранении генетического материала для отсроченного деторождения, однако лишь 30% из них информированы о степени гонадотоксичности проводимой терапии и возможностях вспомогательной репродукции для сохранения репродуктивной функции.

2. Больным раком молочной железы, желающим иметь детей в будущем, целесообразно проведение криоконсервации генетического материала после оценки онкологического статуса, прогноза течения заболевания и состояния репродуктивной системы до начала полихимиотерапии.

3. Управление менструальным циклом и использование индукторов овуляции осуществляется исходя из состояния овариального резерва пациенток и рецепторного статуса опухоли. Наиболее эффективно использование ингибиторов ароматазы у женщин молодого возраста с сохраненными параметрами овариального резерва.

4. Сохранность функции яичников после проведенного лечения определяется исходным состоянием овариального резерва и степенью гонадотоксичности проводимой терапии.

Личный вклад автора Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах исследования, анализе и обобщении полученных результатов. Автором лично проводился отбор, обследование и лечение пациенток, статистическая обработка и научное обоснование результатов.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.01.01 - акушерство и гинекология. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пункту 5 паспорта акушерства и гинекологии.

Внедрение результатов в практику Результаты исследования внедрены в практическую работу 1-го гинекологического отделения (отделение сохранения и восстановления репродуктивной функции) ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцраэвития России.

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 3 в ведущих рецензируемых научных журналах определенных ВАК.

Апробация работы

Основные положения диссертации и результаты работы доложены на XI Всероссийском научном форуме «Мать и Дитя» (Москва, 2010), XXI ежегодной международной конференции Российской ассоциации репродукции человека (Санкт-Петербург, 2011), Первой Российской конференции «Рак и репродукция» (Москва, 2012).

Работа обсуждена на конференции сотрудников 1-го гинекологического отделения ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцраэвития России (09.04.2012) и заседании апробационной комиссии ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцраэвития РФ (16.04.2012, протокол №8).

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 143 страницах, содержит 13 рисунков и 20 таблиц. Список литературы содержит 157 работ, в том числе 151 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования Для достижения цели исследования и решения поставленных задач работу выполняли проспективно в три этапа.

На первом этапе проводили определение информированности и потребности больных РМЖ в сохранении репродуктивной функции путем анонимного анкетирования на базе ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН». Было опрошено 60 женщин репродуктивного возраста больных РМЖ.

На втором этапе обследовано 60 пациенток, желающих сохранить репродуктивную функцию: проведена оценка онкологического статуса, определение прогноза течения заболевания и отбор больных для использования методов вспомогательной репродукции. Все пациентки были направлены в ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России, где проведена оценка состояния репродуктивной системы и овариального резерва. Для проведения программы ЭКО с целью сохранения генетического материала было отобрано 22 пациентки (36,7%) репродуктивного возраста. У оставшихся пациенток методы ВРТ не использовались в связи с различными причинами, включая медицинские, организационные и социальные.

Критериями включения пациенток в исследование явились: Рак молочной железы II - I1IA (T1N1M0, T2N0M0, T2N1M0) стадий, возраст < 40 лет, наличие информированного согласия пациентки.

Первичное клиническое обследование и лечение основного заболевания выполнялось в ФБГУ «РОНЦ им.Н.Н. Блохина» РАМН. Стадию РМЖ определяли онкологи по Международной классификации TNM (6 издание) с дальнейшей группировкой по стадиям. Оценку степени злокачественности опухоли производили

в

путем определения митотической активности, а также путем определения протеина Ю 67. Определение рецепторов стероидных гормонов в опухоли производили путем иммуногистохимического исследования на основании балльной оценки процента окрашенных ядер и интенсивности окраски. Определение экспрессии рецепторов эпидермального фактора роста НЕЯ2/пеи производили также путем иммуногистохимического исследования опухоли. В ряде случаев проводили Р-н-реакцию с целью подтверждения амплификации гена егЬВ-2. Части больных (55%) производили исследование на наличие мутаций генов ВЯСА 1/2.

Методы исследования, выполняемые в ФГУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» включали в себя: сбор анамнеза, осмотр, и инструментальное обследование (ультразвуковое исследование органов малого таза), а также лабораторную диагностику (определение гормонального статуса).

При анализе анамнеза жизни пациенток обращали внимание на возраст менархе, характер менструаций, перенесенные гинекологические заболевания, оперативные вмешательства, количество беременностей и их исходы. Собирали данные в отношении семейного положения женщины, желания иметь детей в будущем, желания мужа/партнера проходить программу сохранения генетического материала. Уделяли внимание семейному анамнезу с целью уточнения наследственной предрасположенности к РМЖ, в ряде случаев проводили генетическое консультирование в ФБГУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина» РАМН.

Всем пациенткам производили ультразвуковое исследование (УЗИ) органов малого таза в раннюю фолликулярную фазу с определением размеров яичников и числа антральных фолликулов в них, что позволяло дать предварительную оценку овариальному резерву яичников до начала ХТ, а также определить схему стимуляции яичников в программах ВРТ. В процессе стимуляции суперовуляции проводилась ультразвуковая динамическая оценка роста и созревания фолликулов в яичниках, а также оценка толщины эндометрия.

Кроме того, УЗИ органов малого таза проводили через 6 и 12, 18 и 24 месяца после завершения адъювантного лечения РМЖ на 2-3 день менструального цикла (в любой день в случае аменореи) с целью оценки овариального резерва.

Методом иммуно-ферментного анализа исследовали концентрации гонадотропинов в сыворотке крови (ФСГ, ЛГ), эстрадиола (Е2) на 2-3 день менструального цикла с помощью наборов тест-систем фирмы «Monobind» и «BDS» (США), концентрация антимюллерового гормона (АМГ) на 2-3 день менструального цикла с помощью коммерческого набора фирмы DSL (США). За нормативные показатели принимали результаты, полученные в научно -диагностической лаборатории ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И.Кулакова» Минздравсоцразвития России (руководитель - к.м.н. Т.Ю. Иванец).

У пациенток в программе ЭКО проводили исследование уровней ФСГ, ЛГ, Е2, Р каждые 2-3 дня с момента начала стимуляции суперовуляции, а также в день введения овуляторной дозы ХГЧ и проведения трансвагинальной пункции яичников. Контрольное исследование уровней указанных гормонов в сыворотке крови проводили через 5 дней после проведения трансвагинальной пункции яичников (ТВП). Исследование гормональных маркеров овариального резерва осуществляли также через 6,12,18 и 24 месяца после завершения адъювантного лечения РМЖ.

На третьем этапе работы у 22 пациенток, больных РМЖ, провели программу ЭКО с последующей криоконсервацией полученных эмбрионов. В зависимости от метода управления менструальным циклом пациентки были распределены в 4 группы.

Группа I - 5 пациенток, у которых использовали протокол с антагонистами ГнРГ (антГнРГ).

Группа II - 5 пациенток, у которых использовали протокол с агонистами ГнРГ (аГнРГ).

Группа III - 7 пациенток, у которых использовали модифицированный протокол, включающий ингибиторы ароматазы (ИА), аналоги ГнРГ и гонадотропины.

Группа IV - 6 пациенток, у которых забор ооцитов осуществляли в «модифицированном» естественном цикле.

В протоколе с антГнРГ введение гонадотропинов начинали с 2-5 дня менструального цикла в дозе 75-225 международных единиц (ME) в сутки. При

достижении лидирующим фолликулом диаметра не менее 14-15 мм, с целью подавления преждевременного пика ЛГ вводили антГнРГ в дозе 0,25 мг/сутки в течение 2-4 дней до достижения критериев, необходимых для введения овуляторной дозы ХГЧ (диаметр лидирующего фолликула не менее 18 мм).

В протоколе с аГнРГ на 2-5 день менструального цикла вводили депо-форму аГнРГ 3,6 мг, либо использовали ежедневную форму введения препарата по 0,050,1 мг для однократных подкожных инъекций. Введение гонадотропинов начинали с 3-7 дня менструального цикла в дозе 150 МЕ в сутки до достижения критериев, необходимых для введения овуляторной дозы ХГЧ.

Протокол с использованием ИА начинали с 2-5 дня менструального цикла с одновременного введения гонадотропинов в дозе 150 МЕ в сутки и анастразола в дозе 2 мг в сутки или летрозола в дозе 2,5 мг. При повышении уровня эстрадиола более чем на 20 % в день доза И А увеличивалась на 1-2 мг, максимальная доза составляла 6 мг в сутки. Введение ИА продолжали до дня введения триггера овуляция и возобновляли в день трансвагинальной пункции яичников. ИА использовали как в протоколе с антагонистами, так и в протоколе с агонистами ГнРГ, введение которого начинали со 2-3 дня менструального цикла. Стимуляцию проводили до достижения критериев, необходимых для введения овуляторной дозы ХГЧ.

«Модифицированный» естественный цикл. В данном протоколе проводили ультразвуковой мониторинг растущего доминантного фолликула, и при достижении им диаметра не менее 14-15 мм, с целью подавления преждевременного пика ЛГ вводили антГнРГ в дозе 0,25 мг в сутки в течение 2-4 дней до достижения критериев, необходимых для введения овуляторной дозы ХГЧ.

Длительность стимуляции суперовуляции, кратность и дозу вводимых препаратов определяли на основании данных гормонального и УЗ -мониторинга до дня введения «овуляторной» дозы одного из препаратов ХГ, назначение которой производили при достижении лидирующим фолликулом по данным УЗИ диаметра не менее 18 мм. «Овуляторную» дозу препаратов ХГЧ, составляющую 5-10 тысяч МЕ, определяли индивидуально, в зависимости от

количества растущих фолликулов. В ряде случаев в качестве триггера овуляции использовали аГнРГ в дозе 0,2 мг.

Трансвагинальную пункцию яичников производили через 35-36 часов после введения овуляторной дозы ХГЧ в условиях малой операционной под кратковременным внутривенным наркозом и ультразвуковым контролем. Полученные ооциты оплодотворяли методом инсеминации in vitro или ИКСИ при необходимости.

Оценку зрелости полученных ооцитов и морфологии преимплантационных эмбрионов человека производили по общепринятым критериям. Криоконсервацию эмбрионов производили на 3-е или 5-е сутки культивирования методом витрификации (30%) или медленного замораживания (70%) по стандартным протоколам.

Статистическая обработка данных выполнена на индивидуальном компьютере с помощью электронных таблиц «Microsoft Excel» и пакета программ «Statistica for Windows» версии 6.1 (StatSoft Inc., США). В работе были применены следующие методы обработки данных: критерий х2 для таблиц сопряженности признаков 2*2 и 2*4 (для сравнения частот встречаемости признаков в анализируемых группах), в том числе с использованием поправки Бонферрони (для большей достоверности при повторном анализе части уже проанализированных данных). Сравнительный анализ переменных проводили с помощью непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни для несвязанных совокупностей (т.к. провести проверку на нормальность не представлялось из-за малого объема выборок; выбор данного критерия обусловлен его наибольшей мощностью для рассматриваемых групп); сравнительный анализ связанных переменных проводили с помощью критерия Вилкоксона связанных пар (Т-критерий Вилкоксона); критерий знаков. Для выявления существования прямой и обратной связи между признаками использовали ранговый корреляционный анализ Спирмена. Статистически значимыми считали различия при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

С целью оценки информированности женщин репродуктивного возраста, больных раком молочной железы, о влиянии проводимого лечения на состояние репродуктивной системы, а также о существующих методах сохранения фертильности было проведено анонимное анкетирование 60 больных, находящихся на лечении в ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохина» РАМН на этапе подготовки к оперативному лечению, либо сразу после его проведения. Средний возраст респондентов составил 33,25±4,7 лет. 65% опрошенных состояли в официальном браке; дети были лишь у 40 % пациенток, при этом у 62,5% из них - один ребенок, и у 37,5 % - двое детей. Стоит отметить, что 48 женщин (80 %) изъявили желание иметь детей в будущем. Всем пациенткам планировалось проведение полихимиотерапии, а 70% - в сочетании с гормональным лечением, однако лишь 30% опрошенным было хорошо известно о влиянии системного лечения РМЖ на репродуктивную функцию, в то время как большинству пациенток (65 %) имеющейся информации показалось не достаточно, и 5 % ответили, что им вообще ничего об этом не известно.

Что касается информированности пациенток о методах сохранения репродуктивной функции, то 60 % из них не знают ни про один из таковых, 20% -знают о возможности проведения криоконсервации ооцитов и/или эмбрионов перед химиотерапией, такая же часть женщин - об использовании препаратов агонистов ГнРГ для «защиты» яичников во время гонадотоксичного лечения. При этом более половины опрошенных (60%) не имеют представления о программе ЭКО, 20% обладают небольшим количеством информации, и столько же сочли свои знания достаточными. Большинство женщин (85%), опрошенных нами, изъявило желание провести терапию, направленную на сохранение репродуктивной функции, в дополнение к основному лечению. Таким образом, выявлена высокая заинтересованность молодых женщин в сохранении репродуктивной функции перед гонадотоксичным лечением и последующем деторождении. Однако, на данный момент, лишь одна треть пациенток обладала достаточным количеством знаний в отношении влияния проводимого лечения онкологического заболевания на функцию яичников и возможностях сохранения фертильности.

Группу пациенток, больных раком молочной железы, направленных для обследования, составили 60 человек. Средний возраст пациенток составил 32 ±4,4 года. При анализе структуры гинекологических заболеваний не было выявлено каких-либо особенностей. Стоит отметить, что 23,3% пациенток страдали бесплодием. Лишь 15 женщин из 60 имели одного ребенка.

При оценке овариального резерва было выявлено, что 60% пациенток имели нормальные показатели, оценивающие функциональное состояние репродуктивной системы, у 7% показатели овариального резерва оказались сниженными, и у 33% соответствовали таковым при поликистозных яичниках.

При анализе онкологического статуса пациенток было выявлено, что у 20 пациенток была I стадия рака молочной железы, у 20 - IIA стадия, у 9- IIB стадия, у 5 пациенток - IIIA, IIIB и ШС стадии были выявлены у 6 пациенток. По данным гистологического исследования у 50 (83,3%) пациенток выявлен инфильтративный протоковый рак, инфильтративный дольковый рак - в 2 случаях (3,3%), как и слизистый рак (3,3%), а также встречались редкие гистологические типы РМЖ. У подавляющего большинства больных - 71,7% - выявлены опухоли II степени злокачественности, у 20% - III степени, и у 8% - I степени злокачественности. Оценка пролиферативной активности опухоли (показатели Ki67) была проведена у 24 (40 %) больных, при этом у 3 (12,5%) из них отмечена низкая пролиферативная активность опухоли, в остальных случаях (87,5%) - высокая.

По результатам иммуногистохимического исследования у 76,7 % (п=46) пациенток определялись «рецептороположительные» опухоли, при этом у большинства из них (84,8%) - по обоим видам рецепторов.

С целью выявления наследственной этиологии заболевания у 33 пациенток (при наличии семейного анамнеза РМЖ, а также у всех женщин, кому планировалось сохранение генетического материала) проводили молекулярно-генетическое исследование с использованием метода Real-time ПЦР. Наличие мутаций генов BRCA1/2 обнаружено у 6 женщин (18,1%), при этом во всех случаях отмечалась мутация гена BRCA1.

Всем пациенткам выполнено хирургическое вмешательство (рис. 1).

3,3%

48,3%

48,3%

■ радикальнаярезекция

молочной железы □ двусторонняя мастэктомия

Рисунок 1. Объем выполненного хирургического лечения

Химиотерапию провели 54 пациенткам (90%): 45-ти - в адъювантном режиме, 4-м - в неоадъювантном, у 9,3% (п=5) больных использовали оба вида лечения. Количество курсов неоадъвантной полихимиотерапии составило от 2 до 6 (в среднем 3±1,4). Количество курсов адъювантной полихимиотерапии составило в среднем 4,6± 2,4.

Большинству женщин (п=38, 63,3%) проводили гормональное лечение, включающее проведение фармакологической кастрации путем ежемесячного введения депо-формы аГнРГ, а также использования антиэстрогенного препарата (тамоксифен 20 мг/сут). При этом всего 7 пациенток получали тамоксифен без выключения функции яичников, остальные 31 - оба вида лечения. Длительность введения аГнРГ составила 2,7±1,1 год. Тамоксифен в среднем применяли 4,7±0,9 года. Общая продолжительность гормональной терапии составила от 2 до 5 лет.

После первичного консультирования для проведения программы ЭКО с последующей криоконсервацией эмбрионов было отобрано 22 пациентки из 60

Был проведен анализ причин отказа пациенток от первоначального намерения проходить программу, направленную на получение и сохранение генетического материала. Эти причины были достаточно разнообразными и носили как объективный на данный момент характер - это отсутствие условий по дням менструального цикла и недостаточное время для проведения этой процедуры, так и различные субъективные факторы (рис.2).

(36,7%).

И отсутствие достаточного количества времени

■ использование спермы донора

О невысокая эффективность метода

П использование суррогатной матери

Рисунок 2. Причины отказа от проведения программы ЭКО

Средний возраст пациенток (п=22), получавших лечение в программе ЭКО, составил 31,4±4,2 года. Все женщины имели супруга или постоянного партнера, за исключением одной.

Проведенный анализ репродуктивной функции пациенток показал, что средний возраст менархе соответствовал норме и составил 13,3±1,2 года; у большинства женщин отмечался регулярный менструальный цикл, у 1 пациентки - олигоменорея. Бесплодием страдали 5 (22,7%) женщин данной группы, при этом у 3 пациенток причина не была установлена, в 2 случаях оно было обусловлено трубно-перитонеальным и мужским факторами. Длительность бесплодия составила в среднем 3,2±3,9 года. Беременности были у 12 (54,6%) пациенток, но лишь у 2 из них были дети.

При проведении ультразвукового исследования параметров овариального резерва не было выявлено значительных отклонений от нормы. Объем яичников колебался от 5,3 см3 до 15,0 см3 (в среднем составил 8,9 см3), количество антральных фолликулов от 2 до 16 в каждом яичнике.

Исследование гормональных маркеров овариального резерва показало, что у 55% женщин (п=12) он соответствовал возрастной норме, у трети (п=7) - отмечались признаки поликистозных яичников, и у 13,6% (п=4) - отмечена тенденция к снижению овариального резерва. Средний уровень ФСГ в исследуемой группе составил 8,4±2,5 МЕ/л, ЛГ - 6,4±3,1 МЕ/л, АМГ- 3,4±1,2 нг/мл.

Обобщение результатов проведенного онкологического и гинекологического обследования пациенток позволило придти к заключению о возможности

сохранения генетического материала для отсроченной реализации репродуктивной функции. Аргументами явились: благоприятный онкологической статус и прогноз выживаемости, репродуктивный возраст пациенток и их желание сохранить репродуктивную функцию, а также высокий риск потери функции яичников после завершения лечения онкологического заболевания.

Основным задачей, стоящей перед нами, был поиск эффективных и безопасных схем стимуляции суперовуляции, учитывая известный факт негативного влияния высоких уровней эстрогенов и их метаболитов на прогрессирование РМЖ.

Нами было выбрано 4 метода управления менструальным циклом: «модифицированный» естественный цикл, протокол с антГнРГ, короткий протокол с а ГнРГ и модифицированный протокол с аналогами ГнРГ и ИА.

Очевидно, что забор ооцита в «естественном» цикле является наиболее безопасным методом, поскольку повышение уровней половых стероидов происходит в пределах физиологической нормы. Однако эффективность данного протокола невысока - криоконсервировать эмбрион удалось лишь в 83,3% случаев.

В то время как использование протокола с антГнРГ, как в сочетании с ИА, так и без, позволило криоконсервировать эмбрионы у всех пациенток (6,6±5,2 и 4,2±3,6 в каждой группе соответственно). Протокол с аГнРГ, по нашему мнению, должен был обеспечить минимальное использование ГТ и фолликулярный рост за счет «flare-up» эффекта, а также обеспечить длительную десенситизацию после ТВП яичников, что важно для тех пациенток, у которых предполагалось использование аГнРГ для «защиты» яичников. Однако он не оправдал наших ожиданий, эффективность его была невысокой - криконсервировать эмбрионы удалось лишь в 60% случаев (у 3 женщин из 5), у одной пациентки ооциты не были получены. Анализ фолликулогенеза при различных протоколах стимуляции показал, что количество растущих фолликулов у пациенток в протоколе с антГнРГ как с добавлением ИА, так и без, составляло 13,4±8,5 и 13,0±9,0 соответственно, в то время как в протоколе с аГнРГ данный показатель был несколько ниже - 7,8±4,1, данные различия, тем не менее, оказались статистически не значимыми. Такая же тенденция была выявлена при оценке количества, степени зрелости ооцитов и частоты оплодотворения. При использовании модифицированного протокола,

включающего И А, было получено 12,1 ±7,3 ооцитов, при использовании двух других протоколов показатели были несколько ниже - 7,4±5,9 и 5,0±4,5. Количество зрелых ооцитов было максимальным в протоколе с антГнРГ и ИА - 10,3±5,2, в протоколе с антГнРГ - 6,4±5,4, в протоколе с аГнРГ - 4,4±3,8. Таким образом, было выявлено, что используемые методы управления менструальным циклом, были сравнимы по основным параметрам фолликуло-, оо- и эмбриогенеза; протокол с аГнРГ, тем не менее, обладал наименьшей эффективностью (табл. 1).

Таблица 1

Сравнительный анализ фолликуло-, оо- и эмбриогенеза у пациенток

Показатели Группа I (п=5) Группа II (п=5) Группа III (п=7) Группа IV (п-6)

Количество эмбрионов 3-х суток «хорошего качества» 4,8±4,3 1,8±2,1* 5,7±3.3* 0,8±0,4

Количество эмбрионов 5-х суток 4,0±3,9 2.0±2,3 7,2±5,4 0,8±0.5

Количество бластоцист 3,8±3,5 1,5±1,9 6,3±5,1 0,5±0,6

Количество криоконсер-вированных эмбрионов 4,2±3,6 1,8±2.1 6,6±5,2 0,8±0,4

Частота криоконсервации на 3 сутки, % 40 33,3 14,3 40

Частота криоконсервации на 5 сутки, % 60 66,7 85,7 60

Частота медленного замораживания, % 60 100 85,7 40

Частота витрификдции, % 40 0 14,3 60

* имеются достоверные различия между II и III группами (р<0,05)

Кроме того, не было выявлено достоверных различий в длительности стимуляции, суточной и суммарной дозе гонадотропинов, частоте использования ИКСИ и использования различных методов криоконсервации.

Сравнительный анализ уровня эстрадиола в сыворотке периферической крови у пациенток исследуемых групп не выявил статистически значимых различий.

Учитывая значительные различия параметров фолликулогенеза и количества полученных ооцитов внутри исследуемых групп, был проанализирован уровень эстрадиола у пациенток, при ТВП яичников которых было получено 5 и более ооцитов. При этом было выявлено, что при использовании протокола, включающего ИА, уровень эстрадиола в день введения триггера овуляции и в день проведения

ТВП достоверно ниже, чем при использовании других протоколов стимуляции (р<0,05).(табл. 2).

Таблица 2

Сравнение уровня эстрадиола в сыворотке крови пациенток, у которых ___было получено 5 ооцитов и более. __

Группа 3-5 день 6-9 день День введения День ТВП, 2-4 день

стимуляции, стимуляции, триггера, пмоль/л после

пмоль/л пмоль/л пмоль/л ТВП,

пмоль/л

I 1453,1± 5298.8± 7Э68,8± 4421,6± 3129,3±

(п=3) 799,5 4058,1 3738,8* •• 1983,4 1154,7

II 1263± 5450± 7168,7± 3962,7± 2872±

(п=3) 930,9 4176,8 3193,1* •• 2983,8 2004,2

III 1066,2± 3904,2± 3655,5 ± 3239,4± 13Э7,5±

<п=7) 1324,2 5674,5 3197,9 2291,2 1440,1

IV - - 883,6± - -

(п=6) 356,5

* имеются достоверные различия с III группой (р<0,05) ** имеются достоверные различия между с IV группой (р<0,05)

Полученные результаты позволили выделить протокол, включающий ИА и

гонадотропины как наиболее эффективный, поскольку при его применении было

получено достаточное количество ооцитов, сравнимое с другими протоколами,

уровень эстрадиола же, при этом был достоверно ниже.

Для оценки выраженности антиэстрогенного эффекта ИА мы сравнили уровень

эстрадиола в преовуляторный период индуцированного цикла у 7 пациенток с

бесплодием трубно-перитонеапьного генеза, проходящих лечение в программе ЭКО,

с пациентками группы исследования, у которых в протокол стимуляции были

включены И А. Группы были сопоставимы по возрасту, параметрам овариального

резерва и фолликулогенеза. Проведенный анализ показал, что ингибиторы

ароматазы обеспечивали снижение эстрадиола в сыворотке крови в 6 раз (р<0.05) по

сравнению со стандартным протоколом стимуляции. При этом, не было отмечено

нарушения фолликуло- и оогенеза, снижения качества и количества полученных

ооцитов и эмбрионов (табл. 3).

Кроме того, проведенное сравнение эффективности анастрозола и летрозола

показало тенденцию к более выраженному антиэстрогенному эффекту последнего,

однако недостаточное число наблюдений не позволило считать эту разницу

достоверной. Стоит отметить, что у пациенток, получавших анастрозол, доза

препарата 2 мг оказалась не эффективной, и во всех случаях требовалось увеличение

19

дозы до 4 мг, максимально до 6 мг (средняя суточная доза составила 4±2 мг, средняя суммарная доза - 28±4 мг). При этом доза летрозола 2,5 мг позволила снизить уровень эстрадиола до нормальных значений практически у всех пациенток.

Таблица 3

Параметры Протокол сИА Стандартный протокол

Средний возраст пациенток, лет 29±2,9 29,1±3,3

Баэальный уровень ФСГ, МЕ/л 5,8±1,9 4.5±2,7

АМГ, нг/мл 3,5±1.7 3.69±1.2

Уровень Е2 в день введения ХГЧ, пмоль/л 3655,5 ± 3197,9* 20735,1±22745,3*

Суммарная доза ГТ. МЕ 1158,7±251,6 2054±732,1

Количество фолликулов 13,4±8,5 15.4±11.7

Количество полученных ооцитов 12,1±7,Э 14.4±6,8

Количество ооцитов стадии 2РМ 8,3±5,4 9.1±7,5

Количество 6,6±5,2 7.2±6,1

криоконсервированных эмбрионов

* имеются достоверные различия между группами (р < 0.05)

Полученные нами результаты позволили создать алгоритм ведения пациенток репродуктивного возраста, больных раком молочной железы (см. приложение).

Была проведена сравнительная оценка состояния овариального резерва после гонадотоксичного лечения. У всех пациенток, вошедших в исследование, были оценены уровни АМГ, ФСГ, ЛГ в сыворотке крови, а также объем яичников и число антральных фолликулов в них до ХТ, через 6, 12 и 18-24 месяца после ее окончания. Большинство женщин после завершения цитостатической терапии получали гормональное лечение антиэстрогенными препаратами на фоне введения аГнРГ (длительность которого составляет до 5 лет), в связи с чем оценить овариальный резерв в этот период не представлялось возможным из-за выраженного подавления гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы. Учитывая данный факт, нами были отобраны 28 пациенток, которым гормональное лечение не проводилось или к моменту проведения оценки было завершено. Средний возраст в данной группе составил 30±3,4 года. Исходные параметры овариального резерва (до ХТ) были в пределах нормы: средний уровень АМГ составил 1,95±0,9 нг/мл, ФСГ - 6,4±2,1 МЕ/л, Л Г - 4,7±1,6 МЕ/л. Число антральных фолликулов составило в среднем 7,5±3,3, объем яичников - 8,1±2,7 см3.

Выявлено достоверное снижение уровня АМГ в сыворотке крови через 6 и 12 месяцев после проведения гонадотоксичного лечения, а также статистически значимое повышение уровня ФСГ через 6 месяцев после лечения (табл. 4).

Таблица 4

Динамика гормональных и ультразвуковых маркеров овариального

резерва у пациенток до и после ХТ (п=28).

Показатели До ХТ Через 6 месяцев после ХТ Через 12 месяцев после ХТ Через 18-24 месяцев после ХТ

АМГ, нг/мл 2,0±0,9 0,9±0,7» 0,7±0,6* 1,2±1,1

ФСГ, МЕ/л 6,4±2,1 12,6±3,7* 9,2±2,8 9,3±3,1

ЛГ, МЕ/л 4,7±1,б 9,9±2,1 6,5±1,7 7,1 ±2,6

Число антральных фолликулов 7,5±3,3 6,8±3,4 6,6±2,2 4,9±2,7

Объем яичников, см' 8,1 ±2,7 7,7±1,9 7,9±2,4 7,57 ±1,4

* имеются достоверные различия с исходными значениями (р<0,05)

Анализ изменения менструальной функции, гормональных и ультразвуковых маркеров овариального резерва показал, что более чем у половины больных гонадотоксичное лечение привело к снижению или утрате овариального резерва.

46,4%

И оваривльнмй резерв

сохранен Я утрата овариалмюш

резева □ снижение оварнлмюго резерва

Рисунок 13. Состояние овариального резерва после ХТ

Исследуя предпосылки для снижения овариального резерва после ХТ, нами

был произведен анализ корреляционных связей. Было установлено, что повышение

уровней ФСГ и Л Г через 12 и 24 месяца после ХТ, продемонстрировало

положительную зависимость от суммарной дозы циклофосфана (г=0,75, г=0,64), и

доксорубицина (г= 0,68), при этом не было выявлено зависимости ни от возраста, ни

от количества курсов ХТ, что, по- видимому, связано тем, что вошедшие в группу

исследования женщины были примерно одинакового возраста и количество курсов

ХТ также было приблизительно равным. Снижение уровня АМГ имело

21

положительную корреляционную связь с его исходным значением (г=0,51) и обратную зависимость от уровня ФСГ до ХТ (г=-0,82). Также, полученные результаты позволили сделать предположение, что степень снижения уровня АМГ может определяться суммарной дозой циклофосфана, с которой имеет значимую корреляционную связь исходный уровень ФСГ, хотя прямого статистически достоверного подтверждения этому не найдено.

Одним из важных аспектов работы явилась оценка возможного протективного действия аГнРГ на фолликулярный аппарат яичников во время проведения ХТ. Этот вопрос обсуждается в литературе и является дискутабельным. Нам удалось обследовать и оценить овариапьный резерв 28 пациенток после ХТ, при этом 18 женщин получали аГнРГ во время ХТ, а 10-ти аГнРГ не назначали. При сравнении гормональных и ультразвуковых маркеров овариапьного резерва не было выявлено достоверных различий между группами. Таким образом, применение аГнРГ во время ХТ, по-видимому, не оказало протекторного действия на состояние репродуктивной системы. Следует подчеркнуть, что полученные нами результаты ограничены небольшим количеством наблюдений и разнородностью исследуемых групп. Необходимо дальнейшее накопление данных для более детального и достоверного исследования и получения уточненных результатов.

Таким образом, результаты проведенного исследования позволили нам сформулировать принципиальные подходы к тактике ведения больных РМЖ. Стимуляцию яичников для забора и криоконсервации генетического материала следует проводить исходя из оценки состояния овариального резерва. Протоколы с антГнРГ являются предпочтительными у этого контингента больных, при этом молодым пациенткам с хорошими показателями овариального резерва, риском гиперстимуляции и гиперэстрогении целесообразно добавлять в схемы стимуляции ИА для снижения этого риска. Полученные нами данные подтверждаются и результатами зарубежных исследований.

выводы

1. Онкологический статус исследуемых больных характеризовался I-II стадией заболевания у большинства из них (82,33%), III стадию имели 16,7% женщин. Большая часть пациенток (83,3%) имела инфильтративно-протоковый рак, 76,7% - гормоноположительные опухоли. Наследственная форма рака подтверждена у 18,2% женщин.

2. Все пациентки находились в репродуктивном возрасте, средний возраст на момент заболевания составил 32±4,4 года. Показатели овариального резерва были нормальными в 60% случаев, в 33% соответствовали таковым при поликистозных яичниках и лишь 7% пациенток имели сниженные показатели овариального резерва, при этом лишь 15 женщин из 60 имели одного ребенка.

3. Из 80% женщин, больных раком молочной железы, которые хотели бы иметь детей в будущем, лишь 30% были достаточно информированы о влиянии системного лечения на состояние репродуктивной системы, а 60% не имели никаких сведений о возможности сохранения репродуктивного материала для отсроченного деторождения.

4. Методы вспомогательной репродукции для сохранения генетического материала могут быть использованы у молодых больных раком молочной железы, желающих иметь детей, при наличии сохранного овариального резерва и благоприятного онкологического прогноза. При этом оптимальным периодом является 2-3 недели от момента хирургического лечения до проведения гонадотоксичной терапии, что не влияет на эффективность лечения основного заболевания.

5. «Модифицированный естественный» протокол при своей безопасности следует считать малоэффективным для дальнейшей реализации репродуктивной функции, т.к. позволяет криоконсервировать в 83% случаев лишь один эмбрион для каждой женщины.

6. Протокол с добавлением ингибиторов ароматазы явился более эффективным по сравнению с применением только аналогов ГнРГ, так как обеспечивал возможность криоконсервации 6,6±5,2 эмбрионов против 4,2±3,6 с антагонистами ГнРГ и 1,8±2,1 с агонистами ГнРГ, причем 85,7% эмбрионов

криоконсервировано на стадии бластоцисты против 60% с антагонистами ГнРГ и 66,7% с агонистами ГнРГ.

7. Применение ингибиторов ароматазы повышает безопасность лечения, не снижая его эффективности, уровень эстрадиола в процессе стимуляции оказался в 6 раз ниже по сравнению со стандартными протоколами лечения (3652 пмоль/л и 20735 пмоль/л соответственно).

8. Факторами, прогнозирующими сохранение овариального резерва после проведенной химиотерапии, являются исходное состояние овариального резерва и степень токсичности проводимой терапии, при этом не удалось выявить протективного действия агонистов ГнРГ на функцию яичников при проведении химиотерапии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Больным РМЖ репродуктивного возраста, имеющим благоприятный онкологический прогноз выживаемости и желающим иметь детей в будущем, необходимо предоставить полную информацию о влиянии химиотерапии на функцию яичников и о возможности потери репродуктивной функции после излечения.

2. Необходимо предоставить информацию о методах гормональной защиты яичников и возможности криоконсервации генетического материала для отсроченного деторождения. Следует информировать, что имплантация эмбриона и вынашивание беременности, возможно, будет осуществляться суррогатной матерью.

3. Забор генетического материала целесообразно проводить после хирургического лечения, подтверждения диагноза, уточнения основных характеристик опухоли и определения прогноза заболевания.

4. По согласованию с врачом онкологом проведение ПХТ может быть отложено на срок до 4-6 недель для проведения программы, направленной на получение ооцитов.

5. Консультация генетика с определением возможных мутаций генов ВЯСА 1/2 является обязательным мероприятием при решении вопроса о направлении

24

пациентки к специалистам репродуктивной медицины для сохранения генетического материала.

6. Перед началом лечения необходимо оценить состояние овариального резерва пациентки для определения протокола стимуляции и прогноза ответа яичников на введение индукторов.

7. Стимуляцию яичников целесообразно проводить со 2-го дня менструального цикла, используя протоколы лечения, основанные на параметрах овариального резерва и рецепторного статуса опухоли.

8. Забор, культивирование и криоконсервацию следует проводить общепринятыми способами. При отсутствии у пациентки мужа/полового партнера и нежелании использовать сперму донора, следует провести криоконсервацию ооцитов. Необходимо тщательно оформить все нормативные документы и специально разработанное информированное согласие.

9. После получения ооцитов целесообразно продолжить введение антагонистов ГнРГ и ингибиторов ароматазы, если они были включены в протокол лечения, в течение 4-6 дней для снижения уровней половых стероидов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Получение и сохранение генетического материала у больных раком молочной железы (первый опыт) /Т.А. Назаренко, H.A. Ревишвили, Н.С. Камалетдинов, Н.Ю. Шарипова, A.B. Андриуца, A.A. Пароконная, И.К. Воротников, Е.Б. Кампова-Полевая //Проблемы репродукции. 2010. №6. С. 69-74.

2. Возможности сохранения генетического материала у больных раком молочной железы / Т.А. Назаренко, H.A. Ревишвили, Н.С. Камалетдинов, Н.Ю. Шарипова, A.A. Пароконная, И.К. Воротников, Е.Б. Кампова-Полевая //Вестник РОНЦ им. H.H. Блохииа РАМН. 2011. Том 22, №1 (83). С. 60-65.

3. Применение ингибиторов ароматазы у больных раком молочной железы в программах вспомогательных репродуктивных технологий / Т.А. Назаренко,

A.A. Пароконная, Н.Ю. Шарипова //Проблемы репродукции. 2012. №2. С. 7276.

4. Fertility preservation in breast cancer patients of reproductive age. /Revishvili N., Durinyan E., Parokonnaya A., Sharipova N., Andriutsa A. II Journal of Reproductive Medicine and Endocrinology. 2010. Vol. 7. №4. P. 332.

5. Роль ингибиторов ароматазы в программах ВРТ у больных раком молочной железы /Т.А. Назаренко, A.A. Пароконная, Н.Ю. Шарипова //Материалы XXII Ежегодной международной конференции Российской ассоциации репродукции человека. Геленджик, 2012. С.63-64.

6. Возможности вспомогательных репродуктивных технологий для больных с онкологическими заболеваниями / Т.А. Назаренко, В.И. Краснопольский, Е.Г. Новикова, К.В. Краснопольская, О.В. Новикова, Н.Ю. Шарипова^ В.А. Антипов // Материалы Первой Российской конференции «Рак и репродукция», Москва, 2011, С. 4.

7. Сохранение генетического материала у больных раком молочной железы молодого возраста / Т.А. Назаренко, Н.Ю. Шарипова, A.A. Пароконная, М.И. Нечушкин, И.К. Воротников, Е.Б. Кампова-Полевая, H.A. Ревишвили // Материалы Первой Российской конференции «Рак и репродукция», Москва, 2011, С. 6.

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АМГ -антимюллеров гормон

AXT - адъювантная химиотерапия

ВРТ - вспомогательные репродуктивные технологии

ГнРГ - гонадотропин рилизинг гормон

Е2 - эстрадиол

ИА - ингибиторы ароматазы

ИКСИ - интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида

ЛГ - лютеинизирующий гормон

НХТ - неадъювантная химиотерапия

Р - прогестерон

РМЖ - рак молочной железы

УЗИ - ультразвуковое исследование

ФСГ - фолликулостимулирующий гормон

ХГЧ - хорионический гонадотропин человека

ХТ - химиотерапия

ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение

Приложение

Алгоритм ведения больных РМЖ репродуктивного возраста, желающих сохранить репродуктивную функцию

Отбор больных РМЖ репродуктивного возраста с / - Ш стадиями заболевания

Определение размеров опухоли, числа и локализачии метастазов, рецепторного статуса опухоли, гиперэкспрессии гена НЕЯ2/пеи, наличия мупип/ий генов ВЯСА 1/2

Подписано в печать: 14.12.2012 Объем: 1,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 694 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

- 2 6 19

2012341777

2012341777