Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Морфологические изменения опухолевых клеток в условиях IN VITRO и IN VIVO под влиянием вакцинных штаммов вирусов

На правах рукописи

/^v.Y/;

Рогозин Евгений Александрович

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ

ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК В УСЛОВИЯХ IN VITRO И IN VIVO

ПОД ВЛИЯНИЕМ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ ВИРУСОВ

14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

14.00.14 - онкология

Томск 1999

Работа выполнена на кафедре биологии Сибирского медицинского университета и в Научно-исследовательском институте онкологии ТНЦ СО РАМН, г. Томск

Научные руководители: д.б.н., профессор Н.Н. Ильинских

к.б.н. Л.Н. Уразова

Официальные оппоненты : д.м.н., профессор И.В. Сухододо

д.м.н. Е.Ц. Чойнзоиов

Ведущая организация

Кемеровская государственная медицинская академия

Защита состоится " ^" 1999г

в_часов на заседании диссертационного совета К 084.28.01

при

Сибирском медицинском университете МЗ РФ по адресу 634050, г. Томск, Московский тракт 2.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского медицинского университета (634050, г. Томск, пр. Ленина 107).

Автореферат разослан " ^ ' 1999г.

Учений секретарь диссертационного совета к.м.н., доцент

/> ГЗ ~ Л V, б7

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АРЭ - асцитный рак Эрлиха

БЦЖ - противотуберкулезная вакцина

(Bacille de Calmette et de Guerin - BCG)

ВЭЛ - венесуэльский энцефаломиелит лошадей

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИИМ - индекс ингибирования процесса метастазирования

ИЛ-2 - интерлейкин-2

и-РНК - информационная РЖ

РНК - рибонуклеиновая кислота

СРЭ - солидный рак Эрлиха

'Г-клетки - тимусзависимые лимфоциты

ТНЦ СО РАМН - томский научный центрн сибирского отделения российской академии медицинских наук 1ДПЭ- цитопатический эффект ЦФ - циклофосфамид

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Лечение опухолей представляет собой сложную, а при злокачественных формах, не всегда разрешимую задачу. Главную роль среди противоопухолевых воздействий общего типа играет химиотерапия, которая предусматривает преимущественно прямое цитотоксическое влияние на опухолевые клетки. Идея применения цнтостатиков, обладающих избирательной токсичностью, может успешно реализовываться при наличии качественных различий в биологии опухолевой и нормальной клетки. Такие различия существуют, но современная химиотерапия использует скорее количественный, чем качественный их характер. Этот вид противоопухолевой терапии стал неотъемлемой частью комплекса лечебных мероприятий, применяемых для воздействия па злокачественные новообразования. Около 40 противоопухолевых препаратов прочно вошли в клиническую практику. Известно, что в настоящее время химиотерапия онкологических больных используется, как самостоятельный метод лечения, лишь при определенных формах быстрорастущих новообразований (лейкозах, лимфоме Беркитта, лимфо- и ретикулосаркоме, трофобластической болезни, семиноме й др.) (Акимов А.А., Филов В.А., 1994). Среди опу-

холевых заболеваний существуют такие, которые либо полностью излечиваются химиотерапевтическими методами (хорионэпителиома матки, злокачественная лимфома Беркитта), либо подвергаются глубокому угнетению с длительным исчезновением клинических симптомов (семи-нома яичка, раки кожи, яичников, миеломная болезнь, лимфогрануло-матоз, опухоль Вилмса) (Софьина З.П., 1976). При этом остается очень большой спектр опухолей, не чувствительных или малочувствительных к существующим противоопухолевым препаратам. В эту группу, к сожалению, входят многие наиболее часто встречающиеся формы опухолей (рак легкого, желудочно-кишечного тракта, матки и ряда других локализаций). Важным моментом является то, что избирательность противоопухолевого действия существующих препаратов низка. Поэтому даже в тех случаях, когда наблюдается ясно выраженный терапевтический эффект, он обычно сопровождается тяжелыми побочными явлениями, не дающими довести лечение до конца (Софьина З.П., 1976).

Такое положение дел ставит перед исследователями, занимающимися отбором и изучением новых противоопухолевых препаратов, непростую задачу изыскания веществ для лечения заданных форм опухолей человека, причем эти препараты должны обладать высокой избирательностью действия, т. е. не поражать нормальных органов, либо вызывать в них минимальные изменения, не препятствующие проведению терапии основного заболевания. На решение этого вопроса направлены усилия биохимиков и химиков-синтетиков, осуществляющих синтез новых соединений. Ту же проблему, с других позиций, пытаются решить химиотерапевты-экспериментаторы, пересматривающие методы отбора противоопухолевых препаратов и пытающиеся создать модели, более адекватные опухолям человека (Софьина З.П., 1976). В последние годы в клинической онкологии все чаще апробируются лекарственные препараты, терапевтический эффект которых связан с непрямым цито-токсическим действием на опухолевые клетки (Clebowski R.T. et all, 1990; Ching L-H., et all, 1991; Taylor Ch.W. et all, 1992; Scher H.I., 1993). Предпочтение отдается методам, позволяющим, в отличие от традиционных, воздействовать на регуляторные системы организма, способные инициировать противоопухолевый эффект (Blay J.Y. et all, 1992; Lu С., Kerbel R.S., 1993; Boon Т. et all, 1994; Tartour E. et all, 1995). Неоднократно предпринимались попытки использовать различные инфекционные агенты, в частности вирусы, для подавления роста клеток экспериментальных опухолей или перевиваемых культур, полученных из опухоле-

вых клеток (Hersey P. et all, 1987; Gasti G, et all, 1992; Whitman E.D. et all, 1994). Отбор и изучение различных штаммов онкотропных вирусов -первый этап для дальнейшего становления перспективных методов лечения рака (генотерапии и противоопухолевой вакцинации).

На сегодняшшш день достаточно перспективной в онкологии считается биологическая-терапия рака - иммунотерапевтический подход с использованием естественных полимерных молекул (антител, факторов роста, вирусов и т.д.) - в частности генотерапия и противоопухолевая вакцинация (Nishi Y. et all, 1987; Tanner J., 1991; Nohria A., 1994; De Vita V., 1995; Schmidt-Wolf G.D. et all, 1995; Имянитов E.H.. 1996; Ура-зова Jl.H., с соавт., 1998). В этом направлении наиболее значимой является проблема онколитического действия экзогенных вирусов в частности их вакцинных штаммов, которые анатогеины для организма человека. Их действие на опухолевые клетки складывается, как из непосредственного онколиза, так и из модификации антигенных свойств этих клеток. Применение в клинике рака патогенных для человека вирусов невозможно, поэтому использование для этих целей стандартных вирусных вакцин упраздняет вопрос о патогенности и привлекает возможностью, в случае положительного эффекта, иметь готовый официальный препарат для клиштческого использования.

В настоящее время осталось очень мало вирусов, ошсотропные свойства которых не были бы изучены. По мнению А.Я. Муцевиеце (1972) вместо того, чтобы испытывать все новые и новые онкотропиые вирусы целесообразней заниматься изучением вопросов связанных с различной чувствительностью разных опухолей к вирусам, путями регуляции ее в желаемом направлении. Последний вопрос представляется особенно важным для решения проблем виротерапии, ибо только тогда она станет на практическую почву, когда "случайность" тропизма вирусов к определенным опухолям станет закономерностью (Муцепиеце А.Я., 1972).

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Изучить способность вакцинных штаммов вирусов венесуэльского энцефаломиелита, паротита, гриппа вызывать цитопатичаокий эффект в опухолевых клетках человека и животных, тормозить рост солидной опухоли и влиять на процесс метастази-рования и продолжительность жизни мышей-опухоленосителей.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Оценить качественные показатели митотического режима клеток асцитного рака Эрлиха при воздействии на них вируса венесуэльского энцефаломиелита в системе in vitro.

2. Оценить количество цитологических изменений и митотиче-ской активности в опухолевых клетках животных и человека при воздействии на них вакцинных штаммов вирусов венесуэльского энцефаломиелита, гриппа, паротита в системе in vitro.

3. Исследовать жизнеспособность опухолеых клеток животных и человека при воздействии на них вакцинных штаммов вирусов венесуэльского энцефаломиелита, гриппа, паротита в системе in vitro.

4. Изучить динамику цитологических изменений и митотической активности в опухолевых клетках асцитной и солидной аденокарцино-мы Эрлиха при воздействии вакцинных штаммов вирусов венесуэльского энцефаломиелита, гриппа, паротита в системе in vivo.

5. Исследовать продолжительность жизни животных-опухоленосителей на модели асцитной и солидной аденокарцином Эрлиха при введении им вакцинных штаммов вирусов (венесуэльского энцефаломиелита, гриппа, паротита).

6. Оценить степень торможения роста меланомы В-16 при воздействии вакцинных штаммов вирусов венесуэльского энцефаломиелита, гриппа, паротита и метастазирования при воздействии вируса венесуэльского энцефаломиелита.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Впервые проведено изучение жизнеспособности, митотической активности и цитологических нарушений, происходящих в клетках экспериментальных опухолевых линий животных и человека под действием вакцинных штаммов РНК-содержащих вирусов венесуэльского эн-цефаломииелита, паротита, гриппа в системе in vitro с одновременным исследованием цитопатических изменений в опухолевых клетках асцитного и солидного варианта аденокарциномы Эрлиха в динамике в системе in vivo и продолжительностью жизни животаых-опухоленосителей, зараженных этими штаммами.

ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Вакцинные штаммы вирусов венесуэльского энцефаломиелита и паротита обладают отчетливо выраженным цитотоксическим и цито-

деструктивным действием в отношении опухолевых клеток животных и человека.

2. Действие изучаемых вакцинных штаммов вирусов на опухолевые клетки в системах in vitro и in vivo не имеют коррелятивной зависимости между собой.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Полученные данные: 1) предоставляют новую информацию относительно спектра вирусных вакцин, применяемых в терапии злокачественных опухолей; 2) расширяют круг представлений о механизмах лежащих в основе противоопухолевого действия, что позволит оцепить возможности применения вирусных препаратов в онкологической практике; 3) могут найти применение в создании новых лекарственных форм на основе живых вакцин вирусов ВЭЛ, паротита, гриппа.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Основные положения работы доложены и обсуждены на конференциях: 14th Asia Pacific Cancer Conference, 4th Hong Kong International Cancer Congress,. 16-19 November 1997, Hong Kong; юбилейной конференции "Медико-биологические аспекты нейрогуморальной регуляции", посвященной 35-летию ЦНИИ СГМУ Томск 1997; Eighth international congress on anti-cancer treatment. 1998, France; конференции "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины", Москва, 1998; юбилейной конференции научно-исследовательского института онкологии ТНЦ СО РАМН "Проблемы современной онкологии"., 29-30 июня Томск, 1999 г. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Диссертация изложена на 105 страницах и состоит из введения, 3 глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 18 таблицами, 29 рисунками (5 микрофотографий, 13 гистограмм, 11 графиков). Библиографический указатель включает 110 источников (48 на русском и 62 на иностранных языках). Все материалы, представленные в диссертации, обработаны и проанализированы лично автором.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводились- на 2-месячных мышах обоего пола линий BALB/c, С57В1/6 и беспородных массой 20-22 г разведения пи-

томника научно-исследовательской лаборатории экспериментальных биомоделей ТНЦ СО РАМН и вивария СГМУ. В работе использовано 390 мышей (Таб.1). Эксперименты осуществлялись в осенне-зимний период. До начала исследований животные в течении 10-14 суток выдерживали в стандартных условиях вивария, умервщляли методом цер-викальной дислокации.

Таблица 1

Распределение животных по сериям экспериментов

Цель использования Линия Количество

Пассирование АРЭ и эксперименты in vitro BALB/c Беспородные 35

Исследование продолжительности жизни мышей-огг/холеносителей Беспородные 80

Исследование цитологических показателей АРЭ и СРЭ в динамике Беспородные 240

Исследование торможения меланомы В-16 и процесса метастазирования С57В1/6 35

Всего 390

Были использованы следующие вакцинные штаммы вирусов: ВЭЛ (получен в Томском НИИ вакцин и сывороток); паротита (акционерное общество "Д. Мазай и К0", г. Москва); гриппа (предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов Свердловского НИИ вирусных инфекций, г. Екатеринбург).

Для определения числа клеток в суспензии и их жизнеспособности использовали 1% раствор трипанового синего на изотоническом физиологическом растворе. Подсчет клеток производился в камере Го-ряева.

Мазки готовили по стандартной методике, затем фиксировались 10 минут в 96% этиловом спирте и окрашивались по методу Нохта-Максимова. Использовали следующие цитологические методы: исследование митотической активности, которое заключалось в подсчете на 1000 клеток количества делящихся; исследование патологий ядра в интерфазе - подсчет на 1000 клеток количества многоядерных и микрояд-расодержащих; исследование вакуолизированности - подсчет на 100 клеток количества вакуодизированных; исследование патологий митоза, которое заключалось в подсчете на 1000 митозов количества и разно-

видностей патологических митозов по классификации Блюмкина В.Н. (Блюмкин В.Н., Жданов В.М., 1973).

Таблица 2

Характеристика опухолевых линий и штаммов

Природа опухоли Условия поддержания Назначение

1. Меланома В-16 (пигментный штамм) Поддерживается in vivo на мышах линии C57BL/6, перевивается в/м на 10-13 сутки роста в количестве 1х10б клеток Модель для определения степени торможения опухолевого роста.

2. Адсно-карцинома Эрлиха (ас-цитпая и солидная). Поддерживается in vivo на мышах всех линий, перевивается в/б, в/м и п/к на 6-7 сутки роста в количестве 5x10° клеток. Модель для определения продолжительности жизни животных-опухолено-сителей и изменения цитологических нарушений в клетках in vitro и in vivo.

3. К-562 КЛСТКИ эрит-ромиелолей-коза человека. Поддерживаются in vitro при 37°С в среде RPMT - 1640 с добавлеш1ем 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков, рассеивается в конценрации 250-300 тыс/мл. Модель для изучения цитологических нарушений, происходящих в опухолевых клетках in vitro под влиянием вирусных вакиин.

4. РЗШ.-1 клетки из лимфозлов больных лимфомой Беркпта. Поддерживаются in vitro при 37°С в среде RPMI - 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков, рассеивается в концентращш 250-300 тыс/мл. Модель для изучения пито-геиетических нарушений, происходящих в опухолевых клетках in vitro под влиянием вирусных вакцин.

5 Нер-2 клетки рака гортани человека Поддерживаются in vitro при 37°С в среде ИГЛА с добавлением 10% бычьей сыворотки и антибиотиков, рассеивается в концентрации 1x107мл. Образуют монослой, который снимается и превращается в суспензию смесью 2,5% раствора трипсина и 0,02% раствора версена в соотношении 1/20. Модель для изучения цитологических нарушений, происходящих в опухолевых клетках в системе in vitro под влиянием вирусных вакцин.

Метастазирование в легкие учитывалось на 23-25 сутки после перевивки опухолей. В зависимости от количества метастатических узлов в легочной ткани определяли степень поражения легких.

Динамику роста опухоли оценивали раз в 2-3 суток по изменению объема, для чего штангельциркулем измеряли длину (а), ширину (в), высоту (с) солидной опухоли и вычисляли по формуле Шрека: Уср=л/6 « (а х в х с).

' Процент увеличения продолжительности жизни животных вычисляется по формуле: СПЖо - СПЖк/ СПЖк х 100, где СПЖо - средняя продолжительность жизни в опытной группе, СПЖк - средняя продолжительность жизни в контрольной группе.

При статистической обработке результатов для каждой выборки вычисляли среднее значение величины и среднее квадратнческое отклонение средней величины. Проверка гипотезы о равенстве средних проводилась с использованием t-критерия Стыодента. Кроме того, для отдельных выборок с этой целью использовали непараметричесюш критерий Вилкоксона-Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ НИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Полиморфизм опухолевых клеток - одна из их характерных черт, однако, степень полиморфизма в одной и той же, и в разных опухолях колеблется в очень широких пределах, касается при этом, как формы, так и размеров клеток. Последнее так же относится к перевиваемым опухолевым штаммам. Принято считать, что чем более резко выражен клеточный полиморфизм, тем злокачественней опухоль и хуже прогноз. Однако полного соответствия между этими признаками нет и, нередко, как раз наиболее злокачественные новообразования отличаются моно-морфностью (Караевский H.A. с соавт., 1993). В морфологический характеристике опухолевых клеток большую роль играют исследования митотического режима. Под термином 'Чштотический режим" имеют в виду совокупность параметров, связанных с количественной и качественной оценкой процесса деления клеток. Сюда включается митотиче-ская активность культуры (число митозов на 1000 клеток), фазовый индекс (отношение числа про- и метафаз к числу ана- и телофаз митоза), процент про-, мета-, ана- и телофаз среди митотических фигур, число и качественная характеристика хромосомных аберраций, данные об от-

носительной длительности периодов клеточного цикла и т. д. (Блюмкин В.Н., Жданов В.М., 1973). Определены основные направления возможного использования исследования митотического релшма в опухолях (Казанцева И.А., 1981). Среди них - оценка степени терапевтического повреждения опухоли. Главной особенностью митотического режима клеток злокачественных опухолей является резкий рост числа патологических митозов и разнообразие их видов. Страдает преимущественно метафаза, высок процент К-метафлз со слипанием или рассеиванием гиперспирализованных хромосом, отставания хромосом и фрагментов в метафазе. Часто встречаются трехгрупповые метафазы, метафазы с рассеиванием и массовой фрагментацией хромосом, ассиметричные многополюсные и моноцентрические митозы (Караевский H.A. с соавт., 1993).

По результатам собственных исследований изменений показателей митотического режима APD при заражении вирусом ВЭЛ в системе in vitro можно сделать вывод, что свойственная альфавирусам задержка митотически делящихся клеток в телофазе и их гибель при переходе в очередную интерфазу проявляется в виде увеличения процентного содержания телофаз и нормальных телофаз после 48-и часов культивирования клеток с вирусом ВЭЛ при значительном падении показателя их жизнеспособности. Для инфекции вирусом венесуэльского энцефаломиелита лошадей и другими вирусами это явление обнаруживалось ранее (Мосолов А.Н. с соавт., 1971).

Увеличение процентного содержания клеток с микроядрами можно объяснить выявленной выраженной активностью вируса ВЭЛ в анафазе, где хромосомы или их фрагменты утрачивают связь с нитями ахроматинового аппарата. Возможно предположить, что вирус ВЭЛ действует приимущественно на митотический аппарат клеток АРЭ и это проявляется в увеличении процента патологических митозов за счет патологических аиафаз и телофаз.

Результаты исследования цитопатического действиея вирусов ВЭЛ, паротита, гриппа в отношении АРЭ в системе in vitro позволяют утверждать, что в разной степени обладают вакцины ВЭЛ, паротита. Наиболее выраженный цитопатический эффект возникает при действии вируса ВЭЛ, о чем свидетельствует снижение жизнеспособности клеток АРЭ (рис. 3), а также увеличение содержания в культуре микроядросо-держащих клеток, снижение митотической активности и увеличение процентного содержания многоядерных клеток (симпластов) котрое,

как известно, в ряде случаев является ранним симптомом вирусного поражения келеток и появляется в первые часы после их заражения (Быковский А.Ф. с соавт., 1975).

Менее выраженный чем при заражении вирусом ВЭЛ цитопатиче-ски и цитостатический эффекты обнаруживались при действии паро-титной вакцины. Показатели гриппозной вакцины позволяют говорить об отсутствии ЦПЭ в отношении клеток АРЭ в данном эксперименте.

Результаты исследований действия вирусов ВЭЛ, паротита и гриппа, проведенного на клеточных линиях опухолей человека позволяют утверждать, что изучаемые вакцинные штаммы оказывают цито-деструктивное действие на клетки Нер-2 в системе in vitro, при этом максимальный эффект наблюдался под действием вируса паротита. Несколько менее выраженное цитопатическое действие вызывал вирус ВЭЛ. Вирус гриппа на клетки линии Нер-2 воздействовал цитостатиче-ски.

Более или менее выраженным цитопатическим действием в отношении клеток эритромиелолейкоза человека (линия К-562) в условиях in vitro обладают все исследуемые вирусные штаммы, при этом проявление этого действия носит неодинаковый характер. При культивировании клеток К-562 с вакцинными штаммами вирусов гриппа и паротита не было выявлено выраженнего снижения жизнеспособности, как это было, например, в случае с клетками АРЭ при воздействии вируса ВЭЛ. На клетки К-562 вирус ВЭЛ не оказывал цитолитического действия. При относительно равном цитолитическом действии вирусы паротита и гриппа оказывали заметно различающееся по величине цитостатиче-ское действие на клетки эритромиелолейкоза человека. Вирус ВЭЛ вызывал более значительную вакуольную деградацию клеток К-562, чем другие вирусные штаммы. Вирус паротита в большей мере, чем другие исследуемые вирусы, увеличивал процент многоядерных и микроядра-содержащих клеток в культуре К-562, как и в случае с клетками опухоли гортани человека (Нер-2). Известно, что все исследуемые вирусные штаммы активно размножаются в цитоплазме клеток в вакуолях или ЭПР. Степень вакуольной деградации вследствии активности вирусов в вакуолях и ЭПР, скорей всего, определяется интенсивностью размно-жегаш вируса. В первые часы инфекции формирование наружной оболочки вирионов ВЭЛ происходит за счет мембран клеточной оболочки, а на более поздних этапах - преимущественно за счет мембран цито-плазматических вакуолей и эндонлазматической сети (Чернявский

Ю.Н., 1973). Этот факт способен объяснить увеличите процентного содержания вакуолизированных клеток эритромиелолейкоза человека и АРЭ при заражении вирусом венесуэльского энцефаломиелита по сравнению с нативными в которых, судя по результатам данный вирус размножается быстрей чем вирусы паротита и гриппа.

В клетках P3HR1 максимальный ЦПЭ проявлялся при воздействии вирусом паротита и, в меньшей степени, ВЭЛ. Значительная вакуольная деградация, в отличии от вируса гриппа, наблюдалась при заражении вирусами ВЭЛ и паротита. При этом следует заметить, что высвобождение на плазматической мембране,' как правило, происходит без заметного повреждения клетки-хозяина. Напротив, вирусы, созревающие на цитоплазматических мембранах, лизируют свои клетки. Исследуемые вирусы относятся к лип идсодержащим и входят в группы (тогавирусы, ортомиксовирусы, парамиксовирусы), которые созревают на плазматической мембране (Зенгбуш П., 1982). При цитопатогенном действии вирусов паротита, как и вирусов болезни Ньюкасла, Сендай, герпеса наблюдается пульверизация хромосом, в основе которой, видимо, лежит нарушение связи репликонов хромосом с ядерной оболочкой (Мосолов А.Н. с соавт., 1971). Активность этого вакцинного штамма отмечена также и в отношении клеточных линий опухолей человека Нер-2 и К-562. Как известно нитопатическое действие парамиксовиру-сов, к которым относится вирус паротита, довольно разнообразно (Фер-нер Ф. с соавт., 1977). Многие из них вызывают образование симпла-стов в ранней стадии инфекции. Весь цикл репликации данного вируса протекает в цитоплазме клетки, с чем, видимо, связан высокий процент вакуолизированных клеток в клетках АРЭ, Нер-2, К-562 и P3HR-1. Вирусные гликопротеины включаются в клеточную мембрану, замещая клеточные белки, что и вызывает слияние клеток, вследствие чего в зараженной клеточной культуре формируются многоядерные синцитии. В приведенных результатах это подтверждается относительно высоким показателем многоядерных клеток P3HR-1, К-562, Нер-2.

Вакцинные штаммы вирусов ВЭЛ и паротита были способны в разной степени вызывать отчетливый ЦПЭ во всех четырех исследуемых клеточных линиях in vitro, в то время как вирус гриппа обнаруживал такую способность только в трех из них.

Согласно результатам собственных исследований вирусные штаммы ВЭЛ, паротита, гриппа имели раличное влияние на жизнеспособность опухолей животных и человека (рис. 1, 2, 3).

48 часов

Рисунок 1. Поцентное содержание жизнеспособных клеток АРЭ, К-562, P3HR1 при заражении вакцинным штаммом вируса ВЭЛ в системе in vitro, *(Р<0,05).

%

P3HR1

r*V Ко"62

24 часа

48 часов

Рисунок 2. Поцентное содержание жизнеспособных клеток АРЭ, К-562, P3HR1 при заражении вакцинным штаммом вируса паротита в системе

in vitro, *(Р<0,05).

24 часа

48 часов

Рисунок 3. Поцентиое содержание жизнеспособных клеток АРЭ, К-562, P3HR1 при заражении вакцинным штаммом вируса гриппа в системе in

vitro, *(Р<0,05).

Экспериментально было показано, что вирус ВЭЛ способен подавлять жизнеспособность клеток АРЭ, но не оказывает влияния на жизнеспособность клеток К-562 и P3HR1 при этом вирус паротита стимулирует жизнеспособность клеток АРЭ, подавляет у клеток К-562, P3HR1. В данном случае происходит довольно четкое разделение способности вирусов воздействовать на клетки по признаку их происхождения от человека или животного. В то же время показано, что вирус гриппа стимулирует жизнеспособность клеток АРЭ, P3HR1, подавляя жизнеспособность клеток К-562.

Исследования в системе in vivo позволяют утверждать, что вирус гриппа обладает наименее выраженным цитодеструктивным эффектом из всех изучаемых вакцинных штаммов, на клетки аденокарциномы Эр-лиха. Из литературных источников известно (Муцениеце А.Я., 1972), что у данного вируса обнаружены выраженные онкотропные свойства, по отношению к клеткам асцитных и солидных опухолей. Однако, он-котропизм редко сопроваждается онколизом. В экспериментах на АРЭ, при заражении мышей-опухоленосителей вирусом гриппа, ни в одном из регистриуемых показателей не было обнаружено достоверного оли-

чия от контроля. В экспериментах с СРЭ было выявлено достоверное снижение митотической активности по сравнению с контролем только на 7-е сутки с момента заражения мышей опухолью. Таким образом, влияние гриппозной вакцины на опухолевые клетки АРЭ и СРЭ в системе in vivo было минимальным и цитопатический эффект полностью отсутствовал. В отличии от вируса гриппа, вирус ВЭЛ активно воздействовал на цитоморфологию клеток опухоли Эрлиха, как в асцитном, так и в солидном ее варианте.

Исследование цитопатологии интерфазного ядра показали, что вакцинный штамм вируса ВЭЛ, как и вируса паротита, увеличивает процентное содержание многоядерных клеток среди клеток АРЭ и мик-роядросодержащих клеток в. СРЭ. Особенно следует отметить влияние этих вирусов на митотическую активность опухолевых клеток. Вирус ВЭЛ достоверно снижал ее по сравнению с контролем во всех исследуемых точках (7, 9, 11 сутки для АРЭ и 7, 14, 21 сутки для СРЭ). Вирус паротита достоверно снижал данный показатель по сравнению с контролем в опухоли мышей с СРЭ и тольно на 7-е сутки в опухоли мышей с АРЭ. Полученные данные не позволяют говорить о цитопатическом эффекте вызываемом исследуемыми вакцинными штаммами в клетках опухоли Эрлиха в системе in vivo, но подавление митотической активности вирусами паротита и, в большей степени ВЭЛ, говорят об о цито-статическом эффекте. Вполне возможно, что вирус ВЭЛ способен более чем вирус паротита или гриппа размножаться в клетках опухоли Эрлиха в системе in vivo или имеет большую тропность к данной опухоли. При исследовании в системе in vitro вирусы ВЭЛ и паротита так же, как и в системе in vivo снижали митотическую активность клеток опухоли Эрлиха, а вирус ВЭЛ подавлял жизнеспособность ее клеток увеличивал содержание многоядерных и микроядросодержащих клеток, что может объяснить его воздействие на клетки рака Эрлиха при заражении мышей-опухоленосителей. При этом, однако, нельзя упускать из вида и опосредованные через иммунную систему эффекты воздействия на опухолевые клетей, т. к. не исключено, что вирус способен активировать киллерную активность иммуноцитов (Илиинских H.H. с соавт. 1984).

Исследуя ЦПЭ в опухолях животных и человека, а также оценивая одинаковые цитологические показатели, мы рассматриваем различные механизмы его осуществления в экспериментах in vitro и in vivo. При наличии высокой тропности вируса к определенной опухоли, механиз-

мы возникновения ЦПЭ в системах in vitro и in vivo могут быть, адекватными, т. е. происходит прямое цитопатическое действие вируса на клетку. При применении в терапии опухолей вирусов, не обладающих онкотропными свойствами, противоопухолевые эффекты в опытах in vitro и in vivo определяются разными механизмами. В экспериментах in vivo ЦПЭ может возникать за счет иммунной системы и/или других систем гомеостаза организма. Дефектный синтез вируса в опухолевых ¡слетках, как в отношении формирования полной вирусной частицы, так и антигенных компонентов и оболочки вируса не является препятствием для гибели клеток. Онколитическим может быть определенный этап взаимодействия вируса и опухолевой клетки (Муцениеце АЛ., 1972).

Основным критерием противоопухолевого эффекта препаратов в Национальном институте рака в США считается увеличение продолжительности жизни леченых животных по сравнению с контрольными. Учитывается также процент излеченых животных (Софъина З.П. с со-авт., 1980). В Онкологическом научном центре АМН противоопухолевая активность оценивается по продолжительности жизни и проценту излеченных животных, а также по торможению роста солидных опухолей в различные сроки наблюдения (Софьина З.П., 1976, 1977). В Институте химической физики АН СССР для оценки противоопухолевого эффекта широко применяются кинетические показатели роста опухолей (Эмануэль Н.М., 1977).

При постановке эксперимента предполагалось выявить эффект увеличения жизни животных-опухоленосителей при терапии аденокар-циномы Эрлиха вирусом ВЭЛ. Аттенуированный штамм 2621 вируса ВЭЛ, который был использован в опытах, апатогенеп для белых мышей весом 9-10 г и выше при подкожном введении и имеет сниженуго внутри церебральную активность равную 5,0 - 5,5 lg ЛД50/мл. Индекс резистентности для белых мышей при иммунизации 104 ТЦД50 штамм 2621 составляет 7,5 lg и выше. (Марченко Н.М., 1975; Ефимова Э.И., 1972). Было показано, что этот штамм обладает активностью против некоторых перевиваемых опухолей мышей - саркомы-37, саркомы-180, асцит-ной опухоли NK/Ly. Однократное введение вируса через сутки после перевивки, опухолей вызывает 50-80%-е торможение их роста в разные сроки наблюдения (Уразова Л.Н., 1986). Явление торможения роста опухоли, без размножения в ней вируса, неоднократно наблюдалось при применении вирусов эпидемического паро.тита. Так, при введении вируса эпидемического паротита в асцитную карциному Эрлиха, было об-

наружено временное тормозящее действие на рост опухоли, хотя вирус в ней не размножался (Муцениеце А.Я., 1972).

Недостоверное увеличение продолжительности жизни животных-опухоленосителей при введении им п/к исследуемых вирусных препаратов, возможно, связано со схемой введения, дозой или способом введения препарата. Общим правилом при исследовании противоопухолевых свойств препаратов является следующее: чем меньше интервал между имплантацией опухоли и введешгем препарата, тем больше надежд на онколиз. Вирусные вакцины не являются исключением из этого правила.

Известно, что изменяя интервал между введениями одной и той же разовой дозы препарата можно получить различный терапевтический эффект, вплоть до полного излечения. Такие результаты были получены при введении ЦФ (суммарная доза 500 мг/кг) (Агееико А.И. с соавт., 1982). У людей опухоль клинически определяется лишь тогда, когда образовалось не менее 109 опухолевых клеток (Зенгбуш П., 1982). В настоящем исследовании в опытах с АРЭ in vivo мышам вводилось по 5x10° опухолевых клеток, а введение вакцин (начало лечения) производилось на 6-е сутки развития опухолевого процесса, что, как можно предположить, соответствует неизлечимой его стадии.

Исследование антиметастатической активности вируса ВЭЛ позволяет утверждать, что его воздействие на опухолевые клетки не ограничивается прямым цитопатическим действием, которое было выявлено в экпериментах in vitro, а может быть и вовсе не связано сшш. Более активно, чем первичную опухоль вирус ВЭЛ ингибировал развитие метастазов. На 23-25 сутки после имплантации опухоли индекс ингибиро-вания метастазированпя меланомы В-16 был равен - 56%. Аттенуиро-ванный штамм вируса ВЭЛ наиболее активен в отношении небольших опухолевых образований - метастазов. По мере увеличения последних вирусная активность постепенно снижается. Более значимое торможение роста опухоли в течении 20-23 дней после имплантации, не соотносится с вирусным циклом в организме животного-опухоленосителя. Ранее было установлено, что вирусомия определяется в течение недели после инъекции вируса (Уразова Л.Н., Громова А.Ю., 1997), однако антиметастатическая активность вируса наблюдается и в более поздние сроки опухолевого процесса. Это может свидетельствовать о косвенном воздействии на опухолевый рост через модуляцию противоопухолевого иммунитета. Метастазирование опухоли - один из ключевых признаков

ее злокачественности. Именно раннее метастазирование ограничивает эффективность всех известных способов терапии (Кавецкий П.Е., 1977; Пинчук В.Г., 1979; Нооб Е., 1978; НаШ., 1981).

Установлено, что все эффективные в клинике препараты проявляют противоопухолевую активность на экспериментальных перевиваемых опухолях животных. Необходимо в то же время учитывать, что экспериментальные опухоли отличаются друг от друга различной чувствительностью к препаратам. Существуют опухоли, которые в связи с особенностями своего строения или биохимизма проявляют особенно высокую чувствительность к определенному типу соединений. Таковы, например, саркомы 298, 45, Иошида, а также карциносаркома Уокера 256, легко поддающиеся влиянию веществ с алкилирутощим механизмом действия (Софыша З.П., 1976). По поводу антигенной природы противоопухолевого действия вирусных препаратов следует отметить, что исследуемые вирусы в липидной мембране содержат углеводы, которые они приобретают во время инфекционного периода, поскольку только в это время в вирусную мембрану встраиваются радиоактивно меченные моносахариды (Зенгбуш П., 1982). Природа углеводов вируса гриппа, например, зависит в основном от типа клетки-хозяина. Различные штаммы вирусов содержат одинаковые углеводы, если они размножались в одном и том же хозяине (Зенгбуш П., 1982). Особенность взаимодействия с клетками различных линий в какой-то степени должна зависеть от свойств, которые липидсодержащие вирусы (например ВЭЛ, паротита, гриппа) приобретают с захватом клеточных углеводов и липидов. Известно, что в тех случаях, когда вирусы культивируются в клетках различных хозяев, в липидном составе их мембран обнаруживаются разлитая (Зенгбуш П., 1982). Белковый компонент оболочки вирусов содержит вирусиецифические белки. В отличии от липидной и углеводной составляющей, белки по-видимому, определяют индивидуальность во взаимодействии с клетками различных опухолевых линий (например АРЭ, К-562, Нер-2, РЗРЯ1). По данным Зенгбуш П. (1982) вопрос о том, встраиваются ли белки клеток-хозяев в мембрану вирусов, не имеет однозначного ответа.

• Следует сделать вывод, что с учетом всех полученных данных,' вирус ВЭЛ представляет наибольший интерес для дальнейших исследований с целью создания противоопухолевого вирусного лекарственного препарата. В отношении вируса ВЭЛ в проведённых ране.е исследованиях было показано, что он тропен не только к клеткам аденокарцино-

мы Эрлиха, но и некоторых опухолей экспериментальных животных: саркоме - 37 (S-37), саркоме - 180 (S-180), меланоме В - 16, карциноме Льюиса, асцитной опухоли NK/Ly (Уразова Л.Н., 1986; Уразова Л.Н. с соавт., 1998; Urazova L, Gromova А., 1996). В несколько меньшей степени это относится и к вирусу паротита. Вирус гриппа, по совокупности полученных данных, менее остальных исследованных вакцин представляет интерес для дальнейшего исследования, однако это не исключает открытия его эффективных, в противораковой терапии качеств, при воздействии на другие опухоли, особенно в клинической, с применением других доз и схем введения. Геном вируса гриппа разделен на 8 молекул РНК, которые способны образовывать любые комбинации в отличии от других РНК-содержащих вирусов (например ВЭЛ, паротита). Такое перераспределение удавалось получить в эксперименте при помощи двойного инфицирования клеток двумя видами вируса гриппа (PR8 и РК) и в других экспериментах (Зенгбуш П., 1982). Использованная в экспериментах вирусная вакцина содержит вирусы гриппа типа А, В и следовательно способна к созданию большого количества комбинаций вирусных частиц с полным и неполным геномом. Это возможно обьясняет разброс в показателях при воздействии гриппа на исследуемые клеточные линини.

Можно предположить, что указанные свойства исследуемых вирусов способны проявляться и в отношении клеток других перевиваемых и спонтанных опухолей, вызывая при этом более выраженное цитопа-тическое и цитостатическое действие, прямо или опосредованно. Таким образом, полученные предварительные данные о цитолитической, ан-тиметастазирующей, цитостатической и цитодеструктивной активности исследуемых вирусных вакцин в отношении опухолевых клеток животных и человека требуют, на наш взгляд, дополнительных исследований.

ВЫВОДЫ

1. При введении вакцинного штамма вируса венесуэльского энцефаломиелита в культуры клеток аденокарциномы Эрлиха наблюдается достоверное уменьшение процентного содержания нормальных митозов за счет увеличения патологических, уменьшение процентного содержания нормальных анафаз с одновременным увеличением нормальных те-лофаз в митозах, увеличение процентного содержания телофаз (нормальных и патологических), увеличение процентного содержания патологий митоза (отставание одиночных хромосом в анафазе, хроматидные

мосты в анафазе, неравномерное расхождение хромомом в анафазе, трех-, четырех-, многополюсная анафаза, неравномерная телофаза, 3-х, 4-х и многополюсная телофаза, комбинированные формы патологических телофаз, формирование микроядер).

2. В системе in vitro вакцинные штаммы вирусов (венесуэльского энцефаломиелита, паротита, гриппа) в культурах перевиваемых опухолевых клеток (Нер-2, P3HR1, К-562, АРЭ) индуцируют появление многоядерных клеток, клеток с микроядрами и вакуолизированной цитоплазмой, при этом вирусы венесуэльского энцефаломиелита в АРЭ, Нер-2, К-562, P3HR1; паротита в АРЭ, Нер-2, P3HR1; гриппа в Нер-2, К-562 подавляют митотическую активность.

3. При введении вакцинных штаммов вирусов венесуэльского энцефаломиелита в в культуры клеток АРЭ; паротита в в культуры клеток К-562 и P3HR1 наблюдается достоверное снижение процентного содержания жизнеспособных клеток.

4. Эксперименты на мышах-опухоленосителях с асцитной и солидной аденокарцшгомой Эрлиха свидетельствуют, что вакцинные штаммы вирусов (венесуэльского энцефаломиелита, паротита, гриппа) индуцируют появление многоядерных клеток, клеток с микроядрами: и с вакуолизированной цитоплазмой, при этом вирусы ВЭЛ и паротита подавляют митотическую активность в этих опухолях in vivo.

5. Вакцинные штаммы вирусов (венесуэльского энцефаломиелита, паротита, гриппа) не изменяют продолжительность жизни мышей-опухоленосителей с асцитной и солидной аденокарцшгомой Эрлиха.

6. Вакцинные штаммы вирусов (венесуэльского энцефаломиелита, паротита, гриппа) тормозят рост первичного узла меланомы В-16, а вирус венесуэльского энцефаломиелита также способен достоверно инги-бировать процесс ее метастазирования.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Action Venezuela Encephalomyelitis of Horses Virus, Parotitis Virus, Influenza Virus on cells of Ehrlich's carcinoma in vitro and in vivo // Abstract of the 14th Asia Pacific Cancer Conference 4th Hong Kong International Cancer Congress, Hong Kong, 1997, - P. 57. (соавт. Urazova L.N., Ilyinskikh N.N.)

2. Влияние вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей на уровень щггогенетических нарушений в клетках аденокарциномы эрли-ха // Материалы юбилейной конференции "Медико-биологические аспекты нейро-гуморальной регуляции", посвященной 35-летию ЦНИЛ: Тезисы докладов. - Томск, 1997. - С.279-280. (соавт. Ильинских Н.Н.)

3. Патологические изменения ядер и митозов клеток аденокарциномы Эрлиха под действием вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) // Материалы конференции "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины": Тезисы докладов. - Москва, 1998. -С. 228. (соавт. Уразова Л.Н., Ильинских Н.Н.)

4. Influence of vaccine strain of Venezuelan encephalomielitis virus on cell of ascitic erlich carcinoma in vitro // Abstract of the Eighth international congress on anti-cancer treatment, France, 1998, P.108. (соавт. Urazova L.N., ilyinskikh N.N.)

5.Изменение жизнеспособности и цитогенстических иарамктров клеток асцитного рака Эрлиха под действием вакцинных штаммов РНК-вирусов с системе in vitro // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1999. - приложение 1. - С. 107-109. (соавт. Уразова Л.Н., Ильинских Н.Н.)

6. Влняние вакцинных штаммов вирусов венесуэльского энцефаломиелита, гриппа, паротита, осповакцины на уровень цитогенетиче-ских и нарушений жизнеспособность опухолевых клеток // Современные проблемы фундаментальной и клинической медицины. Томск, 1999. - С. 33-34.

7. Влияние вируса венесуэльского энцефаломиелита на жизнеспособность и уровень цитогенстических нарушений в клетках карциномы Эрлиха in vitro // Экспериментальная онкология. - 1999. - Т. 21. - № 1. -С. 70-72. (соавт. Уразова Л.Н., Ильинских Н.Н.)