Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Восстановление костных дефектов с помощью трансплантации культуральных штаммов костномозговых фибробластов в условиях эксперимента

АКАДЕЛШЯ Л\ЕДИЦННСКИХ НАУК СССР

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИИ ИНСТИТУТ МОРФОЛОГИИ ЧЕЛОВЕКА

На правах рукописи УДК 616.003.93

САРГСЯН лнлидл лгвлновнл

ВОССТАНОВЛЕНИЕ КОСТНЫХ ДЕФЕКТОВ С ПОМОЩЬЮ ТРАНСПЛЛТАЦИИ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ШТАММОВ КОСТНОМОЗГОВЫХ ФИБРОБЛАСТОВ В УСЛОВИЯХ ЭКСПЕРИМЕНТА

14.00.23—гистология, цитология, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Л\ О С К В А - 1 9 9 0

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте травматологии и ортопедии имени проф- X. А. Петрос-яна А13 Армянской ССР.

Научные руководители:

доктор биологических паук А. Я. Фриденштенн доктор медицинских наук А. В. Азнаурян

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук А. Г. Бабаева доктор медицинских наук 10. И. Елецкий

Ведущая организация—Ордена Дружбы Народов Университет дружбы народов им. П. Л у.*.....

Д 001.04.01 при НИИ морфологии человека АМН СССР по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ морфологии человека АМН СССР.

Защита диссертации состоится

в — часов па заседании

часов па заседании специализированного совета

Автореферат разослан «

— 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

И. Н. ЕМЕЛЬЯНЕНКО

I.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Несмотря на то, что костная ткань облагает высокой восстановительной способностью, проблема стимуляции ее регенерации продолжает оставаться актуальной по двум фичинам. Во-первых, хорошая восстановительная способность ха-¡актерна хотя и для большинства, но, й сожалению, не для всех состей. Кости черепа или накладные кости у млекопитающих, в :ом числе у человека, у взрослых особей не регенерируют и пос-[еоперационный или посттравматический дефект зарастает соедини-:ельно-тканным рубцом, который ни в коей мере не может обеспе-[ить надежную защиту головного мозга (А.И.Матвеева,1962; Г.А. 1лизаров с сотр.,1984; В.И.Канторова с соавт. ,1971; В.А.Картами с соавт.,1979; Л.В.Полежаев.1982;то1& ¿.1960). Во-вто-)ых, в условиях клиники довольно часто встречаются .случаи,ког— И хорошо регенерирукщие трубчатые кости вдруг перестают регенерировать, что грозит возникновением ложных суставов и отсут-!твию должного лечебного эффекта.

Все это является причиной постоянных поисков методов, которые позволили бы обеспечить реализацию регенерационных потенций кости. В этой связи привлекают внимание-детерминированные ютеогенные клетки-предшественники костного мозга.

Костная ткань организуется остеогенными клетками-предаест-¡енниками разной степени зрелости с различными пролиферативными ютенциями.Среди них особое место занимают наиболее ранние ос-■еогенные клетки-предшественники, стволовые остеогенные клетки, > частности, находящиеся в костном мозге (А.Я.Фриденштейн с :оавт.,1970;1974;1986; Ра.{ hi.Fl.et 1982). Разработанные ютоды их культивирования и обратной пересадки в организм

обеспечивают образование ими новой костной ткани на месте пересадки (А.Я.Фриденштейн,с соавт. ,1973,1980; 80.1/г£1986). На основании этих исследований возникла мысль об использовании стволовых остеогенных клеток, размноженных в культурах для лечения костных дефектов в клинике.

Актуальность нааих исследований вытекает из такой возможности и вопрос о том, могут ли стволовые остеогенные клетки, выращенные в культурах, при обратной трансплатации обеспечить восстановления дефектов скелета, проходит ли новообразованная кость правильный гистогенез и встраивается ли в скелетный орган.

В свете приведенных положений, разрабатываемая нами проблема является актуальной, представляет не только теоретическое, но и практическое значение, что и определяет тему данного экспериментального исследования.

Нель исследования. Целью исследования явилось выяснение возможности восстановления плохо регенерирующих костных дефектов свода черепа за счет трансплатации аутологичнцх костномозговых фибробластов, выращенных в культурах.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить восстановительный процесс в области дефекта теменной кости кролика без дополнительных воздействий.

2. Изучить остеоиндуктишые возможности аллогенного губчатого костного матрикса при замещении им дефекта теменной кости.

3. Изучить влияние имплантации инактивированного костного матрикса на регенерацию дефекта теменной кости.

4. Получить пассажные культуры'диплоидных штаммов костномозговых фибробластов. ■

5. Провести параллельно трансплантацию аутогенных и алло-генных шташов костномозговых фибробластов в дефекты, теменных костей в сочетании с активным и инактивированным губчатым костным матриксш и оценить процессы восстановления скелетного дефекта в таких условиях.

6. Разработать рекомендации для возмояного применения штаммов аутологичных костномозговых фибробластов для восстановления костных дефектов скелета в клинике.

Научная новизна. Данная работа является первым экспериментальным исследованием, в котором проанализирован эффект трансплантации культуральных штаммов аутологичных костномозговых фибробластов на место дефекта скелета. Наши экспериментальные исследования показали, что костная ткань, образующаяся этими пересаженными клетками, встраивается в костный орган и • подвергается полноцзнному ремоделированию, что приводит к восстановлению целостности органа. В работе впервые комплексно исследованы последовательйые стадии регенерации костной ткани за счет пересадки костномозговых фибробластов и получены результаты, которые убездают, что остеогенез обеспечивается за счет костеобразозательной активности клеток-потомков самих остео-генных клеток.

Научно-практическая значимость. Анализ полученных экспериментальных результатов позволили разработать и внедрить в клиническую практику способ стимуляции регенерации дефекта костнсй ткани путем трансплантации аутологичных костномозговых либробластов, использовав их высокие остеогенные потенции,спо-

t

собность к костеобразованию и интенсивному размножению (наращиванию клеточной массы) в услошях культивирования.

Наши исследования являются одним из первых экспериментальных обоснований в разработке этого нового метода и могут способствовать его совершенствованию и широкому применению в клинике.

Апробация работы. Об. осношых положениях работы доложено на: республиканской научной конференции молодых ученых травматологов-ортопедов Армении совместно с рационализаторами и изобретателями, посвященной 60-летию установления Советской власти в Армении (Ереван.1980); 1У зональной кеквузовской научной конференции по регенерации органов и тканей животных и ее стимуляции (Ереван,1986); заседании о&цэства травматологов-ортопедов Армении (ЕреванД987); научной конференции по экспериментальному и клиническому применению костного матрик-са (Киев,. 1988).

Материалы диссертации опубликованы в 8 работах, получено авторское свидетельство й I400I6 от 8 февраля 1988г.оформлена методическая рекомендация.

Объем и структура райотк. Диссертации изложена на страницах машинбписного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, изложения собственных результатов, их обсувдеккя,. выводов и списка литературы. Литературный указатель включает в себя 235 источника, из "коих' 162 -отечественных, 73 - иностран- ■ ных.

Работа проиллюстрирована 30 микрофотографиями, 9 рентгенограммами, 6 диаграммами, 6 таблицами. '

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. Материалы и методы исследования

1.1. Постановка эксперимента.

Исследования проведены на 165 здоровых взрослых кроликах обоего пола калифорнийской и новозеландской породы весом 2-3зсг. Под нембуталовым наркозом производилй разрез кожи черепа длиной 3 см над теменной костью. Послойно рассекали фасцию, мышцы, надкостницу, которые отводили в стороны и обнажали теменную кость. Электротрепаном вырезали круглое отверстие диаметром 12-13 мм, при этом твердая мозговая оболочка не повреждалась. Было проведено 6 серий экспериментов:

- в I серии экспериментов костный дефект ничем не заполнялся (контрольная группа);

- во 2 серии экспериментов костный дефект заполнялся аллоген-ннм губчатым костным матрпксси (АГШ);

- в 3 серии экспериментов костный дефект заполнялся АГШ с аутогенными фибробластами;

- в 4 серии экспериментов костный дефект заполнялся инактиви-рованным АГШ;

- в 5 серш: экспериментов костный дефект заполнялся инактиви-рованннм АГШ с аутогенными фибробластами;

- в 6 серии экспериментов костный дефект заполнялся инактиви-рованным АГШ с аллогекными фибробластами.

После завершения операции мышцы, фасцию и кожу послойно зашивали шелком.

1.2. Приготовление деминерализованного костного матрикса. Эпифизы аллогенной большеберцовой кости очищали от мягких

тканей, надкостницы, удаляли эпифизарный хрящ, содержимое кост-

t

номозговой полости промывали сильной струей воды для освобождения от костного мозга. Затем проводила деминерализацию эпифизов в О.бн растворе соляной кислоты в течение 7-10 суток при температуре 0+-4°С. Полученные деминерализованные губчатые трансплантаты величиной 3-4 ил расфасовывали в пеницилликовые флаконы и для стерилизации в течение 20 суток помещали в 0,5^ раствор формалина. Перед имплантацией: в- область дефекта приготовленный таким образом костный ыатрккс многократно отмывали средой в течение суток.

1.3. Приготовление ^активированного АГМЛ.

Полученный АГКГЛ подвергали дальнейшей обработке с целью

инактивации его индукционкюс способностей {1/г /1. Я. 1965). В течение 2 суток юс обрабатывали'2% аОН. Затем дополнительно обрабатывали 0,6н раствором соляной кислоты в течение 2 суток. 3-4 суток промывэл;г проточкой водой, подвергатл 7-ми кратному замораживанию, оттаиванию (-78°С) и облучешпо в дозе 30000 д.

1.4. Культивирование костномозговых йибробластов.

Для получения костномозговых фибробластсв прозсдили эксплантацию клеточных суспензий аутологичного к ;-.ллогешю1,о костного мозга. Костный мозг получали из подвздошной кости, который извлекали путем разреза мягких тканей со сторонц спины. В стерильных условиях тазовую кость очищали от мягких ткане":, костномозговую полость вскрывали продольным разрезом на 2 части и содержимое медулярной полости выскеб.сгьасс в культураль-ную среду 199. Для получения суспензии шстяомозговых клеток костный мозг шесте с губчатой костью многократно пропускали

через 4-х слойный капроновый фильтр. Клетки осаздали центрифугированием при 1000 об в течение 10 мин. и клетки использовали по методу, служащему для получения штаммов костномозговых фиб-робластсв (А.Я.Фриденштекн с соавт., 1970,1973,1980).

Костномозговые клетки засевали во флаконы Ру (объем 250

о

мл, площадь дна 66 см ) с плотностью чзксплактированных меток

7

2x10 на флакон. Культивирование проводили на синтетических средах (199, Игла, Дюльбеко) с добавлением 20$ инактивирован-ной сыворотки, продували Ъ% С0£ и помещали в термостат при температуре 37°С. На 8-10 сутки культивирования во флаконах Ру образовывались дискретные колонии-клоны фдбробластов с эфективностыо колонкеобразованпя порядка 0,5*10^ эксплантиро-ванных костномозговых меток. На 12-14 сутки в результате быстрого размножения последних, колонии сливались,, образуя монослой фибробластов. После клетки последовательно пассировали несколько раз во флаконы Ру вдвое большей площадью. При пассировании костномозговых фибробластов обрабатывали 0,25$ раствором триспгна. Затем триспин сливали и флаконы инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 8-10 мшу т. тосле чего матрасы заливали по 10 мл свежей средой 199. Отде-хившиеся от стекла колонии дезагрировали до отдельных фибро-5ластов путем повторного пропускания через пастеровую пипетку. Действие трипсина, приостанавливает с добавлением аллогенной :ыворотки, и клетки осаздали центрифугированием 10 'минут при :000 об. Затем клетки ресуспендировали в культуральной'среде i использовали для дальнейшего пассирования, т.е. переносили слетки в новые флаконы Ру со свежей средой ж сывороткой. Такш )бразом, прово,дили ряд последовательных пассажей с целью уве-ичения численности фибробластов. Количество фибробластов до-

водили до концентрации 3,2«106 - 8»106 и нужный объем этой взвеси соответственно помещали в костный матрикс. Благодаря своей эластичности, пористости губчатый костный матрикс хорошо впитывал в себя и удерживал фибробласты. Заготовленным такил образом комбинированным имплантатом заполняли область дефекта теменной кости.

1.5. Метода исследования.

В качестве основного был использован гистологический метод. Материалы для гистологического анализа брал:: на 7-14, 21, 30, 60, 90 и 180-е сутки. Изъятые после забоя тканевые блоки •фиксировали в 10% растворе формалина или Карнуа, подвергали деминерализации в Ъ% растворе азотной кислоты, после чего следовала обычная гистологическая проводка и заливка в парафин. Серийные срезы готовились таким образом, чтобы срез проходил через неповрежденную костную ткакь и область дефекта. Парафиновые срезы толщиной 7-10 мк окрашивали гематоксилин-эозином и по ван Гизону. Кроме того, по срокам проводили рентгенологическое исследование и количественное определение зольных остатков в тканях регенерата. В сериях эксперимента, в которых определяли сухой вес и зольнке остатки, регенераты забирали с захватом зоны лота реципиента (0,1 мм). Выкроенные регенераты взвешивали на аналогических весах и помещали в термостат ка 24 часа при температуре 57 дот удаления влаги. Определяли сухой вес трансплантата, после чего образцы подвергали озолепшо в муфельной печи при 800° в течение 1-2 часа и определяли вес зольных остатков. Дополнительно у ряда животных исследовали некоторые биохимические показатели сыворотки крови (опаловые кислоты, щелочная фосфатаза, кальций, неорганический фосфор.

магний).'Цифровые данные обрабатывались-методом вариационной статистики по Стьвденту-Фишеру с определением доверительных границ при уровне значимости 0,01.

2. Результаты исследования и их обсуждение '

Результаты проведенного исследования показали, что куль-туральные штаммы костномозговых фибробластов являются остео-генными и при пересадке их в область дефекта теменной кости эти клеточные штаммы образуют костную ткань, которая подвергается затем ремоделированию и хорошо встраивается в структуре костного органа, при этом восстанавливается его кортикальный слой и костномозговая полость.

Трепанация черепа без замещения де(Тюкта (контрольная группа)

Дефект теменной кости имел круглую форму диаметром 12-13 мм и не закрывался костной тканью полностью. Новообразование костной ткани осуществляется, однако от краев дефекта, но происходит медленно и в течение 6 месяцев радиус сохранившегося костного дефекта у ряда животных составляет примерно половину радиуса исходного дефекта, а у большинства контрольных животных степень регенерации кости в области дефекта бще менее выражена. Имея такой контроль, представлялось возможным оценить вклад трансплантируемых фибробластов в заживление костного дефекта и модель дефекта теменных костей взрослых кроликов оказалась удовлетворительной дая того, чтобы оценить влияние трансплантации костномозговых фибробластов на восстановление костного дефекта.

*

Регенерация теменной кости при имплантации в область дефекта ATM

Пересаженный АГКМ в область дефекта теменной кости подвергается постепенной резорбции. АГЖ состоит в основном из. коллагена и из глюкозамдаогллканов, длительно сохраняется в организме после имплантации и может стимулировать костеобразо-вание. благодаря наличию в деминиролизованнои костном матриксе нескольких индукторов ocTeoTene3alf7u.i^.uium.a.iein N. /9£S; Ulli ft i9Ь9.) Ha 7-14 сутки после имплантации микроскопическое исследование выявило четкую границу мезду имплантатом и костным локем. В области ложа небольшие очаги сзетего остеогекеза. На 21-30-е сутки процесс остеогенеза становится активнее в области лоаа. В центральных участках - мелкие очага свежего остеогенеза. На SO-90-e сутки центральная часть дефекта заполнена соединительной тканью и белками костного матрикса. На 180-е сутки костная ткань в состоянии незавершенной перестройки. Костный мозг образуется ограниченными очагами. На рентгенограммах на 180-е сутки определяли дефект костной ткани, имеющий нечеткие края. Признаки регенерации слабо выражены.

Данные гистологических исследований подтверждаются количественным анализом. При количественной оценке регенерата наблюдали увеличение его веса в сроки на 21-60-е сутки (48,5-53,5), на 90-180-е сутки сухой вес максимально прии-сайк к контрольным данным (69,2-70,3 против контроля 70.7). При сжигании регенерата зола на 100 мг сухого веса в указанные сроки также соответственно нарастает, однако, достигая не 1ЕС-е сутки 40.8+1,5 статистически достоверно отстает от такого показа- ■ теля в контрольной груше (54.&ь2,3) /табл.1/.

Таблица I

Данные количественного анализа при имплантации в область дефекта теменной кости (Р<0,01)

Сроки ис- ' Костный матрикс Костный матрикс в сочетании с

следования - костномозговыми Фибробластами

(сутки) - Сухой вес % Зола мгДООмг Сухой вес % 3ола мг/100мг

14 36,1 0,7 ' II.8+ 0,5 37,3 + 0,8 19,8 ± 1.1

32,0 * 0,2 8,9 * 14,7 32,6 + 42,0 13,4 + 26,2

21 48,5 + 0,2 25,9 ± 0,7 48.6 + 0,6 31,5 ± 0,4

47,3 т 49,8 22,8 * 31,0 45,0 * 52,1 29,2 + 38,8

30 44,1 + 1.4 31,2 ± 1.2 53,5 + 3,5 37,8 + 2,0

36,9 - 51,3 24,2 -г 38.2 33.0 л. 73,5 23,1 + 46,5

60 '53,5 £ а 34.8 + 1,5 54,7 + 3/0 , 37,2 + 2,2

37,2 69,8 26,0 * 43,6 37,2 * 12.2 24,2 + 49,8

90 69,2 •1- 1,5 40,0 - Т,4 69,8 + 1.6 46,5 + 1.5

61Д + 78,7 32,8 + 47,2 60,5 + 79,1 37,7 + 55,3.

180 70,3 + 0,9 41,8 + 1,5 69,4 + 0,9 47,2 + 6,5

65,0 л- 75,6 34,5 + 49,1 65,8 л. 73,0 21,0 + 73,4

контроль 70,7 + 1,4 54,9 + 2,3 70,6 + 1.4 54,9 + 2,3

62,5 X 78,9 41,5 * 68,3 62,5 -1- 78,9 41,5 + 68,3

Количественная оценка регенерата в динамике позволяет-сделать вывод, что в формалинизированном костном матриксе сохранены остеоиндуктивные свойства, но они не проявляются в полной мере, из-за способности формальдегида при взаимодействии с белками связывать их в крупные нерастворимые комплексы. .Резорбция их, в сравнении с нативными тканями, значитель-"" но слабее, чем и объясняется уменьшение антигенной активности. Это обстоятельство, очевидно, затрудняет контакт соединительнотканных клеток с индуктором, чем можно объяснить не только замедленный и'слабый остеогенез, но и пролонгацию его во времени (А.А.Ханин и др., 1978).

Регенерация теменной кости при имплантации АГКМ

с аутогенными костномозговыми йибробластами

" В этой серии экспериментов было установлено полноценное восстановление дефекта с заполнением его костной тканью и последующей перестройкой вновь образованной кости в пластинчатую кость, заменившую аллотрансплантат.

На 7-14-е сутки гистологическое наблюдение показало, что в пространстве между балками костного матрикса расположены активно растущие фибробласты. По краю имплантата, а также в области ложа наблюдали участки остеогенеза. Характерным на 21-30-е сутки постиплантационного периода является нарастаиие процесса остеогенеза как в области ложа, так и в центральных участках дефекта, появление среди ретикулярной ткани вновь образованных костномозговых островков с гемопоэтическими элементами. На 60-90-е сутки в области ложа происходит образование пластинчатой кости с вполне сформированными гаверсовыми каналами. В центральных участках регенерата процесс остеоге-

[еза нарастает. К концу эксперимента дефект замещен новообра-юванной костной тканью, в пространстве медцу балками-которой юрошо развитый костный мозг. Остатки имплантированного мат-1икса почти отсутствуют.

Данные количественного анализа по этой серии экспериглен-■а со всей объективностью свидетельствуют о высоких остеоген-[ых*способностях костномозговых фибробластов в сочетании с ПИ. Начиная с 14-х суток исследований наблюдали постепенное [арастание сухого веса во все последующие сроки. К 90-160-м ¡уткам сухой вес почти соответствовал контрольному (69,0 про-■ив 70,7$). Зола на 100 № сухого веса более четко дифферен-сируот происходящий остеогензз в наблюдземые сроки. С 21-х ¡уток отмечали увеличение золы, сухого веса и в отличие от данных предыдущих экспериментов, где дефект имплантировали ¿ГКМ, в этой серии к 180-м суткам зола и сухой всс максималь-ю приближены к контрольным данным (47.2+6,5 против 54,9^2,3).

Биохимические исследована углеводосодержащих белков и плюрального компонента костной ткани, а также данные рентге-юлогического исследования позволили шлностко проследить эффективность трансплантации костномозговых фибробластов и по-сученные- результаты также свидетельствовали об :и остеогенных ¡войствах.

Таким образом, когда нужно получить благоприятный клини-[еский эффект при трансплантации костномозговых фибробластов ) дефектах скелета, использование демх-кералгсзозсгнпого АПС/1 в ¡иде каркаса представляется вполне целесообразным и индуци->уёмый остеогеноз за счет исходных неостеогенных меток, на-:одящихся в зоне дефекта (т.е.индукционный остеогенез) может

интенсировать процесс костной регенерации.

Регенерация теменной кости при имплантации в область костного дефекта инактивированного АГКМ

В данной серии экспериментов дефект теменной кости имплантировали инактивированный АГКМ. Подсадка в область дефекта инактивированного матрикса без аутологических костномозго-,вых фибробластов приводил к резорбции имплантата без регенерации дефекта. При этом большая часть дефекта заполнилась рубцовой соединительной тканью, в которой длительно сохранялись остатки имплантировайного матрикса. Рентгенологическая картина аналогична с контрольной группой. Через I месяц определяли дефект округлой формы, с четкими контурами. Аналогичная картина через 2 месяца, незначительные следы остеогенеза по краям'костного дефекта. Это свидетельствует, что костеоб-разугацие клетки, которые обеспечивают регенерацию при подсадке костномозговых фибробластов в сочетании с инактивированным матриксом не возникают в результате индукции пересаженным матриксом. т.е. регенерация осуществляется пересаженными клетками.

Регенерация теменной кости птот трансплантации в область костного де(Текта аутологичных костномозговых Фибробластов с инактивированным АРМ

Дня цели данного'исследования индукционные свойства деминерализованного костного матрикса могли создать затруднение при оценке роли трансплантируемых костномозговых фибробластов в регенерации костного дефекта. Это затруднение было преодо- . лено путем инактивации костного матрикса, т.е. устранения индукционной активности. Оказалось, что для полной инактивации

юстного матрикса необходима комбинированная обработка, кото- ' 1ая:и применялась в данной-работе, а именно обработка форма-згаом, слабым раствором щелочи, многократное замораживание : 'оттаивание и ионизирующее облучение.

Таким образом, в этой серии эксперт,юнтов для закрытия ефекта теменной кости использовали костномозговые фиброблас-ы с инактивированныч АГКД.

Заполнение дефекта при пересадке костномозговых фибро-' ластов'.происходит гораздо полное, чем у контрольных животных к 6-му месяцу завершается. Параллельно с образованием гру-оволокнистой кости осуществляется ее ремоделирование, в ре-ультате которого происходит образование пластинчатой кости формирование костномозговой полости. К 3-6 месячному сроку остановленная новообразованная кость встраивается в струк-уру костного органа» непрерывность кортикальных слоев постанавливается, формируется костная полость и восстанавлива-гся ее сообщение с медулярной полостью в поврежденной части змеиной'кости. В целом, этим завершается полноценная регеие-щия костномозговой структуры в области дефекта. В ходе этих эоцессов пересаженных! деминерализованный костный матрикс под-зргается постепенной резорбции и его небольшие остатки могут 1ть определены вплоть до 6-го месяца..

Рогенерацяя теменной кости при трансплантации в область"костного дефекта аллогённых костномозговых (Т'ибробластов .с инактивировашшм АГШ

При пересадке аллогешмх фиброблаотов в области дефекта

¡теогенез осуществляется в течение первого месяца, и в ре-

'льтате образуется некоторое количество грубоволокнистой

костной ткани. Однако через <2 месяца эти костные структуры рассасываются и костный дефект остается незаполненным костью. Гистологически при этом на.йлвдаются характерные картины иммунологической резорбции при участии лимфоидных клеток. Такая последовательность событий свидетельствует о том,- что аллоген-.. ные фибробласты вызывают иммунологический; ответ на свои антиг генные гистосовместимости, в результате чего подвергаются иммунологическому отторжению.

Таким образом, при резорбции аллогенной костной•ткани образованной при'трансплантации аллогенных фибробластов, не происходит заполнения дефекта и индукции остеогенеза' за счет клеток реципиента. Все это дает достаточно оснований, чтобц исключить индукцию кости пересаженными фибробластами из.клето: ложа при аутотрансплантации костномозговых фибробластов в Область дефекта.

В целом проведенные исследования показали, Что дефекты теменных костей кроликов, которые не восстанавливаются при имплантации деминерализованного костного матрикса успешно вое станавливаются в результате трансплантаций аутологичных костномозговых фибробластов. При использовании аллогенных вместо аутойогичных фибробластов образование костной ткани в области дефекта в течение первого месяца осуществляется успешно, но затем новообразованная кость подвергается иммунологической резорбции, после чего процесс костеобразования не возобновляется. Это свидетельствует о том, что первичную костную ткань, за счет которой начинается восстановление дефекта, образуют сами, пересаженные аллогенные фибробласты и во-вторых, что заживление дефекта осуществляется не за счет индукции остеоге-

зеза из местных источников. Таким образом, костномозговые йибробласты не осуществляют индукцию костной ткани, также как эстеоинцуктивными свойствами не обладает и инактивированный костный матрикс.

Проведенные исследования-показали, что выращенные в культуре остеогенные клетки-предпественники костного мозга федставляют собой полноценный материал для регенерации кос-'ей скелета и, что костная ткань, которую они образуют успе(п-[о, встраивается в поврежденный костный орган, не формируя гзбыточных количеств кости и не нарушая структуру скелета.

Возможность восстановления обширных костных дефектов :утем трансплантации аутологичных костномозговых фиброблас-ов выращенных в культуре, была подвергнута клинической апро-1ации (Осепян И.А. и др., 1987). При этом были получены бла-оприятные результаты: с помощью таких пересадок удавалось останавливать обширные дефекты скелета конечностей у взрос-ых людей.

ВЫВОДЫ

1. Штаммы остеогенных костномозговых фибробластов, полу-енных путем культивирования клеток костного мозга из под-здошных костей взрослых кроликов обеспечивают полное восста-огленпе дефектов теменных костей при их аутологичной транс-яантации в инактивированном деминерализованном костном мат-пссе.

2. Пересадка инактивированного деминерализованного кост-эго матрикса в область костного дефекта не вызывает-образо-ание костной ткани, а при его пересадке со штаммами аллоген-пс костномозговых фибробластов вновь образованная костномоз-

говая ткань, образовавшаяся через 2-3 месяда, подвергается иммунологической резорбции и дефект костной ткани замещается рубцом.

3. Сравнение результатов, полученных при пересадке аутологических и аллогенных штаммов костномозговых фибробластов,

а также инактивированного костного матрикса без клеток показывает:

а) что аллогенные костномозговые фибробласты и инактивированный матрикс не обладает остеоиндукционными свойствами;

б) что костная ткань образуется при трансплантации штаммов аутологичного костномозговых фибробластов за счет остеогенных свойств самих трансплантируемых клеток;

в) что после культивирования ¿а ^¿/го костномозговые фибробластй аутологичного костного мозга не теряют свои ос-теогенные свойства.•

4. Образованная-пересаженными аутологичными остеогенными фибробластами костная ткань рекоделируется и встраивается в поврежденную кость и при этом восстанавливается форма и структура поврежденной кости.

5. Полученные результаты могут слуЕить экспериментальным подкреплением успешных попыток использовать трансплантацию культивированных аутологичных костномозгоеых фибробластов для лечения обширных дефектов скелета в клинике.

Список работ, опубликованных по темз диссертации.

I. К вопросу о влиянии костного матрикса на остеогенные свойства стромальннх механоцитов. Вопр.регул, и транс.регенерации. Тез.докл. - Ереван, 1980; с.25.

2. Остеогенная активность костного матрикса; остеоиндуктив-кый и стимулирующий эффект. Вопр.регул, и трансп.регенерации. Тез.докл.- Ереван. 1980. с.28 (соавт.А.А.Ханин, З.И.Баюшева, С.К.Чопикяк).

3. Способ обратной трансплантации костного мозга или стро-мальных глехакоцитов, выращенных in. viito ка биологической губке в эксперименте. Рац.предложение К 52 от 21.7.83 (соавт. В.В.Козлова. И.А.Осепян, Р.К.Ча1игахян.A.M.Саркисян)-.

4. Замещение дефекта черепа половозрелых кроликов костномозговыми клетками и стромалыкми фибробластами, имплантируемых на синтетической основе. 17 зональная мезквузовская конй.по регенерации органов и тканей животных и ее стиму-" ляции. Тез.докл.- ЕреванД 988.С.60 (соанг.В.В.Козлова, Р.К.Чайлахян).

5. Стимуляция остеогенеза стромальгагмл механоцитами костного г/езга имплантируемые на губчатой основе костного матрикса в эксперименте. 17 зональная межвузовская кок^.по регенерации органов и тканей животных и ее стимуляции. Тез.докл. - Ереван, 1988, с. 65 (соавт. И.А.Осепян, В.В.Козлова, С.К.Чопикгпг).

G. Лабораторная оцз'нка регенерацпошого остеогенеза при имплантации костномозговых фибробластов в сочетании с алло-гёшим губчатым костным матриксв.ч в область дефекта черепа у кроликов. Ресд.науч.конф.молодых ученых травм.-орт.. поев.70-лет.Великой Отечественной войны.- Тез .докл.- Тбп-. лиси,1987, с.222-225 (соавт. А.В.Тевосякц).

?. Способ лечения дефектов костей. Авт.овид.^ I4006I6, 1988.

(соавт. И.А,Осепян. А.Я.Фрвденштейн, Р.К.Чайлахян, Э.С. Гарибян, В.В.Козлова, Ю.А.Герасимов).

8. К вопросу о регенерации суставного хряща в эксперименте. Во1д>.патофизиол.травм и дегенератишых заболеваний суставов. Сборник научных трудов. Саратов, 1988.с.93'(соанг. IJ. А. Осепян-, А.В.Хачатрян, Н.Н.Геворкян).

9. Пластика нерегенерирующих дефектов костей черепа имплантацией костномозговыми фибробластами в сочетании с губчатым костным матриксом в эксперименте. Нн.': клин, и.эксп. медицины АН Ары:ССР, 1989, т.29, 2, с.150 (соавт. И.А. Осепян, А.В.Тевосянц, Р.К. Чайлахян, Н.Н.Геворкян).

• 10. Замещение костных.дефектов костномозговыми фибробластами, инбибированными в губчатой костный матрикс.), Методические рекомендации. Ереван, 1990г. (соавт. И.А.Осепян, В.П. Айвазян, Т.В.Ханамирян, А.Н.Саркисян).