Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Влияние ультрафиолетового и лазерного излучений на структуру и функции мембран форменных элементов крови

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОМ ФЕДЕРАЦИИ ПО ВЫСШЕЛ1У ОБРАЗОВАНИЮ МОРДОВСКИМ ОРДЕНА ДРУЖБЫ НАРОДОВ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИЛ\ЕНИ Н. П. ОГАРЕВА

На правах рукописи УДК 611—018.5:615.831.4Л6

МЕЛЬНИКОВА НАТАЛЬЯ АЛЕКСЕЕВНА

ВЛИЯНИЕ УЛЬТРАФИОЛЕТОВОГО И ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЙ НА СТРУКТУРУ И ФУНКЦИИ МЕМБРАН ФОРМЕННЫХ ЭЛЕМЕНТОВ КРОВИ

М.ио.1-';} — ШСМКШН», имюлонш, змириологин

АВТОРЕФЕРДТ диссертации ¡¡а соискание.ученой степени кандидата биологических наук

С Л!'Л ¡1С К ¡П'М

Работа выполнена в лаборатории электронной микроскопии кафедры гистологии, цитологии, эмбриологии и кафедре биохимии Мордовского ордена Дружбы народов государственного университета имени Н.П.Огарева

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Р. Е. Киселева

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Л. П. Тельцов, кандидат биологических наук, доцент О. С. Шубина

Ведущая организация — Институт лазерной медицины Мннздравмедпрома России

Защита состоится * »_-_1994

в_ часов на заседании диссертационного совета К 063.72.08

довском ордена Дружбы народов государственном ни Н. П. Огарева (430000 г. Саранск, ул. Большевистская^ 68)

при Мор-университете име-

Авторсферат разослан <

1994

Ученый секретарь диссертационного совета

П. П. Кругляков

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы

Исследование адаптационного синдрома клеточной системы, его причин, симптомов, молекулярных механизмов-относится к фундаментальным проблемам цитологии.

Велико значение этой проблемы для медицины, ветеринарии, сельского хозяйства: на основании работ Д. И. Насонова, 1940 — 1951, В. Я. Александрова, 1956 — 1975, В. В. Лепешкгг-на, 1945, Л. В. Гейльбруипа, 1957, Э. С. Бауэра, 1965, А. Д. Брауна, 1962— 1987 и др. стало очевидно, что для правильного диагноза, контроля за эффективностью л.ечення и для профилактики заболеваний людей, животных и растений необходимо проведение исследований на клеточном и молекулярном уровнях. В этом направлении достигнуты крупные успехи (Браун, 1986, ВоПэ, 1986, Саркисов, 1987, Нефедов; 1991, Швалев, 1979 — 1994, Ярыгин, 1988, Боголепов, 1978 — 1994, Бородин, 1982 — 1993, Сапин, 1978 — 1994).

Особое внимание вопросу о взаимоотношении структуры и функции биологических объектов, как в условиях нормы, так и патологии уделяют А. И. Струков, О,.К- Хмельницкий (1983). До настоящего времени некоторые аспекты этой проблемы служат предметом дискуссии и нередко трактуются с различных точек зрения. В отличие от функциональных изменений, являющихся строго специфичными, субстанциональные изменения адаптационного синдрома не специфичны: они наблюдаются у любых клеток при действии разнообразных неблагоприятных факторов (Браун, 1987). На фоне однотипных реакций удается выявить черты частные, специфичные.

Так, ультразвук, магнитное поле, электромагнитные колебания различной длины волны, к которым относятся ультрафиолетовое и лазерное излучения, вызывают качественно идентичную адаптационно-компенсаторную реакцию организма, интенсивность которой зависит от дозы воздействующего фактора.. Для каждого физического фактора существует своя оптимальная терапевтическая доза, она зависит от особенностей взаимодействия данного фактора с биотканями. Эта проблема в настоящее время интенсивно исследуется. Механизмы ультрафиолетовой и

лазерной фотоактивацпи крови окончательно еще не установлены. Сложность ее требует объединения усилий специалистов разных областей знаний. Между тем для изучения адаптационного синдрома, как считает А. Г. Браун (1987), очень важно, наряду с исследованием его специфических черт, исследовать общие признаки реакции.

Депатурационпая теория, созданная Д. И. Насоновым и В. Я- Александровым, опирается на многочисленные экспериментальные данные и теоретические представления о том, что в основе реакций живой протоплазмы на неблагоприятные воздействия лежит единый молекулярный механизм. По своему характеру и по характеру физико-химических последствий эти молекулярные нарушения очень близки к обнаруживаемым при денатурации дативных белков in vitro.

Трудами JT. X'. Эйдуса, К- Боулера, М. А. Панова, В. А. Монастырского и др. в развитии неспецифического адаптационного синдрома клеточной системы выдвинуты новые концепции, в частности положение о роли альтерации мембран в развитии клеточного повреждения. Вопрос относительно того, являются ли изменения, происходящие в биомембранах (микровязкость, фосфолппидный состав, белок-липидные взаимоотношения), первичными пли выполняют тригерную функцию в инициации не-спсцнфпческого адаптационного синдрома, А. Г. Браун считает открытым. Однако накопленные за последние годы многочисленные данные по строению п функции биологических мембран (Болдырев, 1990, Бурлакова, 1992, Овчинников, 1992 ) дают основание предполагать о их роли, как ключевого звена в пусковых механизмах при воздействии различных факторов. Поэтому свое исследование мы посвятили изучению роли бпомембран в развитии песпецифического адаптационного синдрома. При его моделировании использованы широко применяемые в клинике облучения крови ультрафиолетовый свет и пизкозпсргстпческий гелии-неоновый лазер.

Объектом исследования были выбраны тромбоциты (кровяные пластинки), большую часть цитоплазмы которых составляют мембранные структуры и лейкоциты, в которых значительная часть клетки занята ядерными структурами. И те и другие клетки являются полифупкциональньши системами.

Вышеизложенное послужило основанием для проведения комплекса модельных экспериментов по исследованию адаптационного синдрома с учетом проявления специфических его черт, а та кже общих песпецифических признаков реакции, так как наличие объединяющих признаков дает повод для выделения самой проблемы адаптации клетки, позволяет судить об адаптационном синдроме как особом типическом состоянии клеточной системы.

1.2. Цель и задачи исследования

Основной целью настоящего исследования явилось выяснение структурно-функциональных изменений, происходящих в клетках крови, а также изучение возможных адаптивных реакций их биомембран при облучении различными дозами ультрафиолетового света и низкоэнергетического Телий-пеопового лазера.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Изучить возможные изменения в ультраструктуре тромбоцитов и лейкоцитов в зависимости от дозьг ультрафиолетового и низкоиптенсивного гелий-иеопового лазерного излучений.

2. Исследовать общее функциональное состояние мембран тромбоцитов п лейкоцитов при облучении ультрафиолетовым светом и гелий-неоновым лазером в -зависимости от дозы воздействия.

3. Определить наличие возможного адаптационного ответа тромбоцитарных и лейкоцитарных мембран в пострадиационный период па структурно-функциональном уровне.

4. Дать сравнительную характеристику действия различных доз ультрафиолетового и гелий-иеопового лазерного -излучений в формировании иеспецифического адаптационного синдрома клеточных систем.

Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры по теме «Электромагнитные волны и регулятор-иые механизмы, ответственные за адаптацноипо-трофнчсскне функции клеток» № 53/27 — 89 в рамках общесоюзной программы «Человек и свет»^*/"ГР 01£ /0СС£|*/С.

1.3. Научная новизна

В результате выполнения работы получены следующие новые результаты.

— В результате■сравнительного анализа получены данные по ультраструктуре тромбоцитов человека и быка и биохимическому составу их мембран.

— Проведен сравнительный анализ действия ультрафиолетового и гелий-неонового лазерного излучений па ультраструктуру тромбоцитов я лейкоцитов.

— Качественно новый подход, использование флуоресцентных зондов позволили охарактеризовать структурно-функциональное состояние мембран тромбоцитов и лейкоцитов в норме и их адаптационные возможности в ответ па светостимуляциго.

— Показан двухфазный характер действия ультрафиолетового и градуальный гелий-неонового излучения па клетки крови.

1.4. Основные положения, выносимые на защиту

1. Ультрафиолетовый свет вызывает дозозавнеимые изменения ультраструктуры тромбоцитов и лейкоцитов. Функциональная активация тромбоцитов и лейкоцитов под действием ультрафиолетового света происходит при непосредственном участии плазматической мембраны этих клеток.

2. Структурные изменения- на плазматической мембране тромбоцитов и лейкоцитов при УФ-стимуляцин предшествуют изменению ультраструктуры клеток и опосредуют их.

3. Разные дозы ультрафиолетового излучения вызывают разнонаправленные адаптивные реакции клеток и их мембран в период последействия..

4. Излучение гелий-неонового лазера практически не приводит к заметным изменениям ультраструктуры тромбоцитов н лейкоцитов крови.

5. Облучение гелий-неоновым лазером, модифицируя структуру плазматической мембраны^ ее микровязкость, способствует повышению функциональной активности нейтрофилышх лейкоцитов, снижает агрегационную активность тромбоцитов.

1.5. Научно-практическая значимость работы

Полученные данные по сравнительному анализу ультраструктуры тромбоцитов человека и быка и липидного состава их мембран позволят применить новые методические подходы к проведению модельных экспериментов па животных.

Полученные данные расширяют -представление о механизмах воздействия гелий-неонового лазерного и ультрафиолетового излучений на клетки крови.

Показанный двухфазный характер действия ультрафиолетового облучения на ультраструктуру тромбоцитов и лейкоцитов и морфофункциональное состояние их мембран позволит дифференцированно подходить к выбору оптимальных доз облучения крови и ее компонентов в клинике.

Полученные данные могут попользоваться в учебном процессе по курсам цитологии, молекулярной биологии клетки.

1.6. Реализация результатов исследований

По теме диссертации опубликовано в журналах, сборниках научных трудов, отчетах по заказ-наряду № 53/9—92, материалах конференций 8 научных работ,

1.7. Апробация работы

Материалы диссертации докладывались на: Всесоюзном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз». Москва, 1992; VI симпозиуме по биохимии липидоп. С.-Петербург, 1994; Всероссийской научно-производственной конференции «Гигиена, ветсанитарпя и экология животноводства»., Чебоксары, 1994; ежегодных научно-практических конференциях Мордовского государственного университета имени Н. П. Огарева «Огарев-ские чтения». Саранск, 1991 — 1993.

1.8. Структура диссертаций

Диссертация состоит из введения; обзора литературы; раздела по материалам и методам исследования; результатов собственных исследований и их обсуждения (4 главы); заключения; выводов и библиографического указателя'.- Работа иллюстрирована 25 микрофотографиями, 25 фотографиями, 4 рисунками и 20 таблицами. Библнографическиий указатель состоит из 218 источников (в том числе 33 иностранных).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследований служила кровь доноров, полученная с республиканской станции переливания крови и лаборатории гемотрансфузии на базе 4 городской больницы (г. Саранск) и кровь практически здоровых предубойных быков с мясокомбината «Саранский». Тромбоконцентрат получали из цитратной крови (5 % цитрат натрия) методом градиентного центрифугирования (Меньшиков, 1987). Количество тромбоцитов подсчитывали унифицированным методом в камере Горяева, суспсппю разводили средой 199 до концентрации 1x10 клеток/л.

Лейкоциты выделяли методом Р. А. Поспеловой (1973), подсчитывали в камере Горяева л рссуепеиднровали в среде ,199 до концентрации 1 х 10 клеток/л.

Облучение проводили in vitro двумя источниками ультрафиолетовой лампой ДРБ-15 мощностью 15 Вт с длиной волны' излучения 254 им, применяемой в клинике в аппарате для экстракорпорального ультрафиолетового облучения крови «Изольда' 100» в дозах 156, 780, 1560, 3120Дж/см2 и гелий-неоновым лазером ЛГ-78 мощностью 0,02 мВт с длиной волны излучения 362,8 им (клиническая модификация — аппарат «Узор»), в дозах 1,2; 6,0; 7,8; 15,6; 31,2 Дж/см2.

Для световой микроскопии» делали мазки тромбо- и лейко-массы н окрашивали по Романовскому-Гимза. Фагоцитарную активность псйтрофилои определяли с тест-культурой стафнло-

кокка по общепринятой методике. Жизнеспособность определяли по окраске с трипановым синим и фл\оресценции красителя ДСМ.

Для электронно-микроскопических исследований материал фиксировали в 3 % глутаровом альдегиде на 0,2 M фосфатном буфере в течение 20 часов. После дофиксацнн в 1 % осьмневой кислоте (1 час) и обезвоживания в спиртах и ацетоне проводили заливку в эпои-аралдиг по общепринятым методикам. Поиск клеток (нейтрофилов и тромбоцитов) проводили на полутопких срезах, окрашенных метиленовым синим. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме Ultrakut и контрастировали ура-пилацетатом. Полученный материал просматривали в электронные микроскопы ЭМФ-100И и ЭМ-125.

Флуоресцентные методы исследования.

■ Трансмембранный потенциал, .ми крав я з кость я л;ишд-белко-вые взаимодействия в мембранах .исследовались при помощи флуоресцентных красителей — 4-(п-диметиламиностирил) -1-метилпиридиний п-толуолсульфон.ата (ДСМ), пирена, 1-фени-ламиио-8-сульфонафталина (АНС) по методикам, разработанным в Институте физико-химической медицины РАН под руководством Г.- Е. Добрецова.

Количественно флуоресценцию красителей регистрировали! на спектрофлуориметре «Signe-4», анализ спектра и обработка результатов осуществлялись с помощью ЭВМ.

Лшшды мембрал выделяли методом Блая-Даера (KefnL\ 1972). Количественное определение проводили: общих липи-дов — фосфорновайилшговым методом; холестерина — методом Зл'аткиса-Зака с хлорлым железом; фосфолниидо-в — по методу Васьковского. Метиловые эфмры жирных кислот разгоняли на газожидкостном хроматографе Хром-3700 (Чехословакия) с использованием стеклянных наполнительных колонок размером 3 мм х 3 м. В качестве носителя использовали хромо-сорбхроматон N-cynep, в качестве жидкой фазы OW-lOl (5%).

Результаты ¡исследований статистически обрабатывалась та ЭВМ-386, достоверность ' рассчитывалась с «использованием t-критерия Стыодента.

3. СОБСТВЕННЫЕ ДАННЫЕ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Влияние ультрафиолетового излучения на морфофункциональное состояние тромбоцитов

Использование электромагнитных волн нашло достаточно широкое применение ib медицинской и исследовательской практике. Хороший клинический эффект при заболеваниях различ-

пои этиологии оказывает применение облучения крови ультрафиолетовым «ветои (длина волны шзлучелпя .254 mi) (Самойлова, Дуткевнч ¡и др., 1986, Пикали, 1993).

Исследователи отмечают такие эффекты данного вида п.ч.чу-чсн-ия на организм, как .снижение исходного уровня нсрокси-дацип (Ганелина, 1986, Гафарова, 1989, Бякнн, Киселева, 1990); повышению иммунного ¡статуса организма (Дуткевич m др., 198i>, Ярема и др., 1988, Киселева, Кузьмичева, 1993), улучшение реологических овой с ив кров« (Юрлов и др., 1990, Бякни и др., 1993).

В ^настоящее .время' ультрафиолетовое (излучение рассматривается как 'Инструмент соответствующего управления рядом клеточных функций. Многие авторы, в том числе К. А,Самойлова 1986 — 1988, Д. И. Рощупим!, 1989, Р. И. Киселева, 1989, В. А. Трофимов, 1S92, описывая клеточные эффекты ультрафиолетового облучения крови, делали предположение о первичной роли плазматической мембраны в формировании отюета клеток на .воздействие "излучений, однако до сих пор это предположение остается во многом чисто теоретическим, а исследования морфофункциональных изменений мембран под действием электромагнитных излучений единичны.

Как показывают данные наших исследований, при облучении ультрафиолетовым светом в разных дозах цитологические эффекты несколько различены, отличаются и адаптационные реакции тромбоцитов в «твет ата воздействия.

Электронно-микроскопические исследования показали, что при облучении тромбоцитов ультрафиолетовым светом в дозах. начиная от 780 Д'ж/cvr в клетках 'Обнаруживаются и с возрастанием дозы до 3120 Дж/см2 увеличиваются изменения ультраструктурной организации! тромбоцитов: появление многочисленных шеевдоподий; ныход гранул из цитоплазмы «о внеклеточную «среду; и при больших дозах. — значительная дефор*. мация клеток, нарушение грануломера п целостности плазматической .мембраны.

Первоначальные (изменения структуры тромбоцитов под действием ультрафиолетового излучения по своим признакам соответствуют обратимой стадии агрегации тромбоцитов, описанных в работах Cw\. Сщб'ирцева (1982), G. С. White (1983), В. А. Трофимов, 1994). Доза 3120 Дж/см2 (вызывает ультраструктурные изменения, характерные для стадии разрушения тромбоцитов. (Углов, 1979, Zer.che, 1983, Киселева, Сосунов, Кругляков, 1S90). Нарушение целостности плазматической .мембраны тромбоцитов приводит к выходу во внешнюю среду содержимого клетки, в том числе биогенных аминов и тромбоци-тарных факторов спертыиапня крови (Вашкпнс.чь и др., 1982, Альба, Ковтаенкова, 1993), что может привести к донолнитель-

ной активации агрегации тромбоцитов. Усиление процессов дезорганизации плазматической мембраны и гибели части тромбоцитов при ультрафиолетовом облучении в больших дозах — 1560 — 3120 Дж/см2 мы видим также на препаратах по увеличению поглощения клетками красителя — трипанового синего.

Та>К'ИМ образом, -изменение ультраструктуры тромбоцитов под действием ультрафиолетового излучения ¡в дозах 780 и 1560 Дж/с,м! вызывает дозозавдспмсе увеличение их функциональной активности. В литературе существуют данные о усилении при ультрафиолетовом облучении кро>'вй процессов агрегации тромбоцитов (Рпск, е1 а1., 1983, Мурииа, 1984, Трофимов, 1993). Однозначно положительным этот эффект ультрафиолетового облучения назвать нельзя, так как при таких заболеваниях, как атеросклероз, иШемическая болезнь 'сердца, инфаркт миокарда, тро>мбозы, некоторые гипертонические состояния активность тромбоцитов уже выше нормы (Горбатенко-ва, Азизо.ва, 1984, Давиденко, Шафран, 1989, Вагпа^ е!:. а1., 1989, \Vinocour, 1989) и применение ультрафиолета в данных дозах может неблагоприятно сказаться -на реологическом состоянии крови.

Как подчеркивают Д. С. Саркисов, 1984, Л. С. Овчинникова, 1993, функциональная активация клеток является производной от взаимодействия мембрамных структур клетки между собой 'И окружающей средой.

Б-иО'мембраны представляют собой ¡системы с (выраженным проявлением кооператиеностн и ир-оланпировамности действия, что обеспечивает согласованное поведение их кодш-онентов через генерализованные перестройки п-ри достижении пороговой интенсивности стимул а.

Интересно, что структурные перестройки плазмат-яче-смих мембран мы наблюдали уже. при применении -начальных доз ультрафиолетовой -стимуляции, когда ультраструктурные изменения на уровне целой клетки отсутствуют или не поддаются выявлению при помощи электродной микроскопии.

Тонкие изменения в строении и функционировании мембран . при облучении ультрафиолетовым светом иоследовалы -налш с помощью применения биохимических .методов и флуоресцентных красителей.

Изменения липидиог-о состава фотомодифицированиых .мембран тромбоцитов, зарегистрированные нами п эксперименте: снижение уровня общих липидов, фосфолппидов. и повышение доли холестерина, 'Вероятно, могут быть опосредованы пере-

стройками гидрочасти молекул лнпидов, которая отличается высокой лабильностью -и ¡наиболее чутко реагирует на внешнее воздействие. Накоплено большое число данных, подтверждающих участие жирных кислот в формировании гидрофобной зоны мембраны, за счет чего в значительной степени определяется фазовое состоящие мембранных структур .и, следовательно, многие функциональные характеристики ион-траиспортирую-щих систем (Бодырев, 1993, Асташкин, Ходоров, 1994, Резин, 1994). Кроме того, способность жирных кислот к окислению может явиться причиной деструктивных изменений и возникновения многих нарушений на уровне ферментативных систем (Болдырев, 1990, Денисенко, 1991, Климов, 1992, Кузнецов, 1994).

Выбирая параметры, характеризующие морфофункциональ-ное состояния плазматической мембраны —• мнкровязкость ее лнпидного бнслоя, лппшд-белко'вые комплексы, а также суммарный трансмемб'раниый потенциал плазматической мембраны н внутренней мембраны митохондрий, мы стремились наиболее полно охарактеризовать взаимоотношение ее структуры и функции.

Из всех выбранных нами параметров текучесть мембраны наиболее адекватно отражает реактивные и адаптивные изменения, происходящие при воздействии внешних факторов па мембрану. Уникальность данного показателя заключается в том, что жидкостность мембраны является одновременно характеристикой как структурного (Pike et al., 1980), так и функционального (Балли и др., 1993) состояния мембраны. Показано, что изменение текучести мембран влияет на большое число явлений, связанных с клеточной поверхностью (Cyatrecass, 1976, Ткачук, 1983, Кульберг, 1993). Во многих исследованиях модификация текучести мембраны предшествует функциональной модификации клеток (Hersh, 1971, Конев, 1984 — 1994).

Для мембран форменных элементов крови с достаточной степенью достоверности установлена роль' микровязкости в регулировании работы таких важных а функциональном плане ферментов как Na-K-АТФэзы, аденилагциклазы, фоофолипаз А и С, ферментов дыхательной цепи митохондрий (Орлов и др., 1984, De Mendonca, 1984, Кузнецов и др., 1987, Ммрахмедов и др., 1988).

Нами обнаружено. дозозависимое снижение текучести плазматических мембран тромбоцитов под действием ультрафиолетового облучения. Увеличение вязкости мембраны может быть объяснено принимая во внимание способность Уф-света индуцировать фотоокнсление мембранных липидюш (Рощупкин и др., 1973, 1988). Из литературы известно, что после индукции ПОЛ наблюдаются следующие изменения: изменяется степень

насыщенности мембранных днпидов, увеличивается относительная доля холестерина, вследствие чего его молекулы образуют плотно упакованные домены, гидрополярные продукты ПОЯ образуют в мембране перекпсные кластеры (Ваковская и др., 1985, Владимиров, Лрчаков, 1982). Все эти обстоятельства, по-видимому, и являются причиной уменьшения текучести мембранных ЛИПИД0В.

На-начальных этапах, при малых дозах облучения, повышение микровязкости мембран тромбоцитов, по-видимому, определяет 'их неспецифшчеокую активацию: данные работ Г. В. Аи-дрсенко, Л. А. Суворова, 1986, Е. А. Горбатенкова и др., 1984, Н. Skimada et al„ 1984, R. Y. Winocour et al„ 1989, показывают, что увеличение микровязкости мембран тромбоцитов 'способствует усилению их спонтанной агрегации и процессов агрегации под влиянием факторов активации тромбоцитов, в том числе адреналина, АДФ, коллагена и серотонина.

Повышение дозы облучения способствует образованию в плазматических мембранах липидных доменов 'с повышенной плотностью, т. е. происходит кристаллизация мембраны в одних уча'стках и разрыхление"« других, что приводит в конечном итоге к ее разрушению, наблюдаемому нами на электронограммах, п гибели части клеток, зафиксированной по поглощению три-папового 'синего.

Данные наблюдения подтверждаются наличием интеисивно-го тушения проникающими в мембрану молекулами воды флуоресцентного красителя АНС. В норме центр связывания этого зонда на мембране состоит нз положительно заряженного участка молекулы белка, окруженного гидрофобным карманом •iu апнулярпых лииидов (Галацин, 1974, Spikes, 1977). При ультрафшолето&ой стимуляции, активирующей первичные процессы перекидного окисления липидов (Владимиров, 1987) « вторичное окисление белков (Владимиров, Арчаков, 1972, Нау-iies, 1974), происходит нарушение гидрофобиости.кармана и тушение флуоресценции АНС, за фиксированное нами.

Поведение другого флуоресцентного проникающего зонда — ДОМ свидетельствует >не только о разрушении мембранных структур при облучении 'высокими дозами ультрафиолетового света, но и снижении энергетики всей клетки. В .нормально функционирующей клетке данный зонд аккумулируется прежде всего внутри митохондрий и на, плазматической мембране, при эГом спектр его флуоресценции лежит в зеленой и желтой области. Причиной аккумуляции данного катиона является потенциал на внутренней мембране митохондрий и плазматической мембране (Скулачев, 1972, 1987, Либерман, 1987). При снижении или отсутствии электрохимического потенциала

ил мембранах зонд .начинает накапливаться прежде всего в ядре и свечение в клетке смещается в кра'епую область спектра (Морозова и др., 1981, Добрецов, Косннков, 1992).

Зафиксированные памп изменения флуоресценции ДСМ в тромбоцитах при ультра фаю л етооой 'стимуляции носят двухфазный характер. Дозы в 158 и 780 Дж/см2 приводят к повышению флуоресценции ДСМ в зеленой области 'спектра по сравнению -с флуоресценцией в контрольных тромбоцитах, при этом величина рассчитанного памп гаалсмембранного потенциала повышается на 8 %, что говорит об увеличении эиергизован-пости клеток и усилении функциональной активности тромбоцитов. Но дальнейшее повышение дозировки ультрафиолетового света приводит к сдвигу в красную область и снижению трансмембранного потенциала тромбоцитов ниже исходного уровня па 30 %. '

Анализ состоячшя -структурной организации мембраны тромбоцитов о период пс'сле облучения ультрафиолетовым светом показал зависимость >от дозы. Облучение в дозах 156 л 780 Дж/см2 характеризовалось наличием волн адаптации, связанных с изменениями мпкровязксст,и да время последействия. Через три часа после облучения мнкровязкс'сть возвращалась близко к исходному значению, хотя д оставалась несколько ниже его уровня — 93,1 %' и 99,0 % от контроля соответственно.

В то же (время 'высокие дозы способствовали значительному увеличению амплитуды колебания данного пара.метра в мембранах тромбоцитов, при этом через три часа последействия возвращения к норме не происходило.

Таким образом, исходя из теории неспецнфической адаптации клеток к е-нешинм воздействиям (Браун и др, 1987), по 'Которой в начальный период действия неблагоприятного фактора изменения метаболизма клеток вссьма сходны с изменениями при физиологическом возбуждении, а в дальнейшем при продолжающемся действии неблагоприятного фактора изменения обмена направлены в наивыгоднейшую для данной ситуации сторону и 'сопровождаются нарушением сопряженности -дыхания и фо'сфорнлирован'ия, выходом вещссгв из клетки, увеличением содержания свободных ¡радикалов, мы можем говорить о способности тромбоцитов адаптироваться к ультрафиолетовому свету в дозах 156 и 780 Дж/см2 и перенапрял<еиии и неспособности адаптироваться к облучению в дозе 3120 Дж/см2.

3.2. Влияние ультрафиолетового излучения на морфофункциональное состояние лейкоцитов •

Электронно-микроскопические исследования нейтрофилов, облученных разными дозами ультрафиолетового света, показали, что начальная доза — 156 Дж/см2 не вызывает изменений в ультраструктуре клеток, повышение ее до 780 Дж/см2 приводит к изменению ультраструктурной организации — появлению мелких вакуолей, цитоплазматических выростов, что свидетельствует о повышении их функциональной активности • (Струко-в, 1983). При больших дозах 1560, 3120 Дж/см2 на-' блюдается: сильная вакуолизация цитоплазмы; ¡выброс гранул из клетки; наличие аутолизосом; частичное нарушение целостности плазматических 'И митохо ндриалыных мембран. Подобные -картины ранее были описаны В. Е. Пигаревским, 1978 при изу-- чеиии процессов деструкции нейтрофшлов.

Полученные нами данные по влиянию ультрафиолетового излучения на фагоцитарную активность «ейтрофилов в значительной степени коррелируют с данными электронной микроскопии. Действительно, при облучении небольшими дозами ультрафиолета фагоцитарная активность нейтрофилов повышаемся на 10,1 а начиная с дозы 1560 Дж/см2 снижается и при облучении >в дозе 3120 Дж/см2 становится значительно меньше исходного уровня — на 26,4 %. Примечательно, что данные дозы 1ВЛНЯЮТ не только -на специфический функциональный ответ клеток, по .и на уровень жизнеспособности лейкоцитов в суспензии. Количество живых клеток при облучении в дозах 1560. и 3120 Дж/см2 снижалось по сравнению с контролем на 5,6 и 13,2 % соответственно.

Структурно-функциональным изменениям нейтрофилов продшествдаалн молекулярные перестройки их '.мембран, которые заключались ,в следующем. Дозы облучения в 156 и 780 Дж/см2 незначительно влияли «а липидный состав: снижение доли общих ли ни до в.— на 5% и 10 %; фсефолипидов — на 3 %; увеличение уровня холестерина — на 7 % и 14 %; повышение микровязкости липидного бислоя ' мембран лейкоцитов — на 3 % и 8 % -соответственно, что стимулировало их функциональную активность, выражающуюся повышением на 10 % уровня фагоцитоза и на 6 % — суммарного трансмембранного потенциала.

Увеличение доз до 1560 Дж/см2 и в большей степени до 3120 Дж/см2 приводит к нарушению структурного состояния плазматической мембраны: снижению количества фосфолипидов на 48 %; ненасыщенных жирных кислот на 52 %; увеличению доли холестерина на 20,8 %; повышению микровязкости на 22%,

нарушению липид-белкопых взаимодействий и повышению гидратации мембран л цитоплазмы, о чем свидетельствует тушение флуоресцентного красителя АНС — па 19 %; уменьшению суммарного траисмембрапного потенциала на 26 %. Именно, с обводнением клетки (повышением количества свободной полы в ее структурах) В. В. Лепешкмн связывает процесс вакуолизации-цитоплазмы при альтерации клеток.

Таким образом, ультрафиолетовое облучение вызывает в мембранах тромбоцитов и лейкоцитов однонаправленные реакции, выраженность которых в данных двух типах клеток различна и опосредуется прежде всего генетической детерминированностью и специализацией. Общее действие ультрафиолетового излучения и специфичность ответа клеток отражается: во-первых'— на перераспределении липидного компонента мембраны: снижение уровня фосфолипндов в тромбоцитах максимально на 54, а в лейкоцитах на 41 %, повышение доли холестерина в мембранах — в тромбоцитах на 50 %, а в лейкоцитах на 21 изменение коэффициента насыщенности жирных кислот в тромбоцитах и лейкоцитах на 110%; во-вторых, — на 'структурном состоянии мембран форменных элементов крови, выражающееся в однонаправленном их изменении, но различной степени сложности. Так микровязкость плазматических мембран тромбоцитов повысилась на 30 %, а лейкоцитов — на 22 %. Это же относится и к гидратации липид-белковых комплексов мембран, регистрируемых на основании снижения флуоресценции АНС — у тромбоцитов на 24 %, а у лейкоцитов — на 19 %. Все мембранные эффекты у тромбоцитов выражены более ярко по сравнению с лейкоцитами. Структурные перестройки мембран: кластеризация и обводнение, перераспределение их липид-пото компонента при ультрафиолетовом облучении клеток, приводят к значительным изменениям метаболизма, о чем свидетельствует снижение траисмембрапного потенциала у тромбоцитов.— на 32% и лейкоцитов — на 26%; в-третьих, глубина изменения физико-химических свойств мембраны коррелирует с морфологическими . перестройками в отдельных компартаментах клетки, осо&енно это касается плазматических н митохондриальных мембран, что приводит к нарушению ультраструктуры «леток: разрушению грануломера, наружной плазматической мембраны и набуханию тромбоцитов; сильной вакуолизации, деформации ядра и появлению аутофагосом лейкоцитов. Функционально регистрируется изменение адгезив-нсстн тромбоцитов а снижение процента фагоцитоза «ейтрофи-лов.

Таким образом, мембранные образования при ультрафиолетовом облучении клеток являются темп структурами, па уровне которых поддерживается функциональная целостность и актив-

ность клетки. При значительных структурных дефектах в лини/дном бнелое мембран происходят необратимые повреждения клетки п оли погибают, а 'незначительные нарушения в 'структуре биомембраны, в частности образование перекиспых кластеров при ультрафиолетом стимулированном псрек-ис-но.м окислении линндо'В, -играет важную функциональную роль в жнзпедс-ятельп-истн клеток (Владимиров, Рощупкпн, 1987).-Известно, что наибольшей метаболической активностью обладают минорные компоненты липидпон фазы биомембран — фосфопиозптпды и продукты их обмена — 1,2-днацнлглицерин и инозит 1, 4, 5-трифосфат, которые выступают в качестве вторичных мессенд-жеров, реализующих специфические пути клеточного управления (Трофимов, 1993). Важную роль в регуляции процессов, протекающих в клетках при ультрафиолетовом облучении, ¡играют -и такие биологически активные веще'ст-ва, как прост.а-гландины и тромбоксаны, синтезируемые из ар ахидоновой'кислоты, интенсивно высвобождающейся из фосфолипидов гари активации в фот-о-етимулированных мембранах фермента фосфо-липазы А2 (Трофимов, 1992).

3.3. Влияние гелий-неонового лазера 4

на морфофункционалыюе состояние тромбоцитов

Облучение крови визкоэлcijircTiiческим гел-нй-пеонавым лазером, дающим монохроматический, когерентный красный свет (длиной волны 632,8 им), находит все большее применение в практической -медицине (Von Koliuier, 1983, Klemkort, 1984, Locheng, 1987, Tan et al., 1987, Сычев и др., 1988, Ярема и Д'Р-> Буйлнн и др., 1989, Козлов и др., -1989).

Как показали данные наших исследовании, цитологические аффекты облучения ультрафиолетовым спетом и гелий-леоио-вым лазеро-м несколько различны, отличаются п адаптационные реакции клеток на эти воздействия.

Низкоинтепснвное лазерное излучение при дсйстппи па биоткани вызывает широкий спектр фотофн.шческих и фотохимических нз.менепий, результатом которых является интенсификация структурно-метаболических процессов, не связанных с нарушением целостности зон облучения (Ишбшин, 1984, Зубко-ва, Лапрун, 1984, Лешаков, 1987, Ohshiro, Calderhead, 1988). Свет гелий-неонового лазера обладает-значительно более низкой энергетической мощностью >н характеризуется .дозами на 2 — 3 порядка ниже, чем ультрафиолетовое излучение. По своим характеристикам он 'настолько близок к тепловому инфракрасному излучению, что многие авторы, 'в том числе Г. Р. Мос-tobhíikobíi 41 др., 1989, В. Л. Степанов и др., 1990, не отрицая

возможного вклада фотохимического механизма в терапевтические эффекты гелий-неоновой' стимуляции, предполагают, что определяющую роль в них играют аветоппдуцнруемые перестройки молекулярных т субмолскулярпых баюжидкокрпсглл-лпческих структур и иикродеформацпи мембраны [¡следствие ее оптической неоднородности.

В 'исследованиях на тромбоцитах нами отмечены как фотофизический, так и фотохимический эффекты гелий-неоновой стимуляции.

Электронно-микроскопические исследования свидетельствуют, что облучение красным светом гелий-неонового лазера в дозах, применяемых в клинической практике, не вызывает заметных структурных изменений в тромбоцитах. Однако различными авторами показано, что облучение гелий-неоновым лазером снижает агрегацнонную активность тромбоцитарных клеток (Бахтин н др., 1989, Кузнецов и др., 1989). Исходя из постулата

A. И. Струкова (1984) о том, что в живых системах изменения структуры опосредуют функциональные сдвиги, одним из вероятных субстратов, реагирующих на действия гелий-неонового излучения, могут служить клеточные мембраны, изменение тонкой структурной организации которых н приводит к наблюдаемым физиологическим эффектам (Зубкова, Лапруи, 1984, Де-вятков, 1987).

Проведенные впервые исследования по изучению влияния гелий-неонового лазера на микровязкость плазматических мембран тромбоцитов показали изменение данного параметра в зависимости от дозы облучения. Начальные дозы характеризовались снижением микровязкости на 28 %, доза в 24,0 Дж/см2 приводила к восстановлению данного параметра до исходного значения.

В работах Nosal et. al„ 1982, Slurp Hitagiina el. al„ 1985,

B. И. Дудаева, 1987, В. P-: Пппелнс и др., 1987, М. Sahim et. al., 1988, В. Л.Трофимова, 1993, 1994, указывается па снижение агре-гацпоииой активности тромбоцитов в ответ па стимуляцию фак.-торами агрегации при повышении текучести их плазматической мембраны.

Анализ спектров пирена, полученных после облучения исследуемыми дозами, за исключением 24,0 Дж/см2, показал, что микровязкость плазматической мембраны тромбоцитов возвращалась к исходному состоянию уже через три часа последействия.

Снижение микровязкости клеточных мембран тромбоцитов можно объяснить за счет возникновения конформационных перестроек локальных участков мембраны (Крюк, Мостовппков и др., 1986, Болдырев, 1989, Петров, Воронков, 1989). Так, показано, что излучение лазеров красного спектра вызывает конфирмационные сдвиги в лпппдной фазе клеточных мембран, па-

правленные па изменение плотности упаковки лнппдов п бцелое (Максимов и др., 1982, Абдвахитова и др., 1982).

С другой стороны, па микровязкость биомембран влияет содержание холестерина в липидной фазе и -соотношение НЖК/ ННЖК в фосфолипидах. В работах М. И. Петуховой с соавт. (1991, а, б), выполненных на митохондриальных мембранах, отмечено, что облучение гелий-неоновым лазером в дозах от 1,2 до 7,2 Дж/ем- вызывает уменьшение пула свободного холестерина в мембранах митохондрий. Наши данные свидетельствуют об уменьшении доли холестерина в мембранах тромбоцитов на 17 %, возрастании в них уровня фосфолипидов на 17 % и снижении коэффициента насыщенности жирных кислот на .7 %.

Одним из механизмов, уменьшающих микровязкость мембран клеток крови, может быть снижение перекисного окисления липидов при гелий-неоновой стимуляции (Лапрун, 1990, Туртае-ба, Барнашова, 1993).

Облучение гелий-неоновым лазером благотворно сказалось на общем функциональном состоянии тромбоцитов. В экспериментах нами не отмечено снижения уровня жизнеспособных клеток при облучении in vitro. В то же время суммарный транс-йембраиный потенциал исследуемых клеток, рассчитанный по' ДСМ, достоверно повышался в .пределах физиологической нормы- (на 8,3%).

Таким образом, в отличие от ультрафиолетового облучения, установленные на.ми эффекты гелий-исоновой стимуляции характерны для «слабых» физиологических воздействий, не приводящих живые системы, будь то мембрана, клетка или организм в целом, к стрессовому состоянию, перенапряжению и в'конечном итоге развитию парабиоза по Н.' Е. Введенскому (Кондрашова и др., 1988) или второй и третьей фазы иеспецифнческого адаптационного синдрома по Л". Д. Брауну и Т. Н. Маженок (1987).

3.4. Влияние гелий-неонового лазера на морфофункциональное состояние лейкоцитов

Физиологический ответ на облучение -гелий-неоновым лазером ранее был зафиксирован во всех изучаемых группах форменных элементов крови (Гамалея и др., 1984, Иванов и др., 1989).

Проведенные нами эксперименты показали, что облучение лейкоцитов гелпй-нбоповым лазером в исследуемых" дозах не приводило к видимым изменениям в ультраструктурс лейкоцитов. Однако нами зарегистрировано дозозавпенмое увеличение уровня фагоцитирующих пейтрофилов — па 54 % -и индекса фагоцитоза — на 83 % при ннкубировашш с тест-культурой стафп-

1G

лококка после облучения суспензии лейкоцитов гелнй-неоиовым лазером. Т. В. Иваненко и др., 1990, изучали процессы фагоцитоза пейтрофнлов при облучении гелий-неоновым лазером в дозах до 10 Дж. и показали, что количество фагоцитирующих пейтрофнлов в облученной суспензии возрастает по сравнению с контролем.

В настоящее время все определеннее роль субстрата, запускающего биохимические реакции, определяющие в конечном итоге благотворный (или нет) итог фотовоздействия, приписывают мембранным образованиям клетки. Изменения клеточных мембран при облучении гелий-неоновым лазером были обнаружены в работах А. К. Абдвахитовой (1982). В серии опытов (Лапрун, 1990) выявлена связь между функциональной активностью лимфоцитов и изменением физико-химических свойств их мембран.

Повышение функциональной активности пейтрофнлов в ответ на облучение гелий-неоновым лазером, вероятнее всего, связано с развитием иеспецпфического адаптационного синдрома в первой его фазе и затрагивает прежде неего мембраны клеток. Об этом свидетельствуют полученные памп данные о наличии изменений в лппйдной фазе мембран лейкоцитов, в частности снижение доли холестерина в мембранах лейкоцитов на 15 %. Нами также зарегистрировано дозозависпмое изменение содержания насыщенных и ненасыщенных жирных кислот фосфолипидов. лейкоцитов, дозы в 1,2, 6,0, 12,0 Дж/см2 приводят к повышению уровня иепасыщепностн жирных кислот в мембране па 28,7, 12,8%, 4,5 % соответственно, а доза в 24,0 Дж/см2 — насыщенных жирных кислот на 14,4 %. Данные согласуются с результатами, полученными С. П. Свиридовой, 1990, при изучении мембран эритроцитов крови, в которых зафиксировано, что при облучении гелий-неоновым лазером в дозах 12_'— 18 Дж/см2 содержание ненасыщенных жирных кислот увеличивается, а при увеличении дозы до 36,0 и 48,0 Дж/см2 возрастало^содержанпе насыщенных жирных кислот.

Облучение гелий-неоновым лазером вызывало перераспределение мембранных липидои и повлияло па структурное сос-'юяпие плазматических мембран лейкоцитов, выражающееся в дозозавпеимом снижении вязкости мембран. Изменения жидкостных свойств плаз.молем мы и фракционного состава липндов ■ отразились на характере лнпид-белковых взаимодействий в мембране, что выражается сродством лнпнд-белковых комплексов к зонду АНС, и соответственно его спектральных характеристиках: флуоресценция зонда последовательно возрастала при' облучении в дозах 1,2, 6,0, 12,0 Дж/см2 — па 6 %Л2.%, 17 % и снижалась до уровня -контроля при .облучении в дозе 24,0 Дж/см2.

Как считает Д. Д. Браун, в начальный период воздействия неблагоприятного фактора изменения метаболизма схожи в основных чертах с изменениями при физиологическом возбуждении. Одним из показателей функциональной активности клеток является величина потенциалов на плазматической и митохонд-риальной мембранах. В ходе облучения различными дозами гелий-неонового лазера нами зарегистрировано дозозависимое повышение суммарного'трансмембранного потенциала лейкоцитов в пределах физиологической нормы — с 182,25 мВ до 199,6 мВ.

Об адаптации лейкоцитов к применяемым дозам гелий-неонового лазерного излучения мы судили по восстановлению микровязкости мембран лейкоцитов в пострадиационный период: через 2 — 3 часа после облучения микровязкость плазматических мембран лейкоцитов возвращается к исходному уровню, за исключением дозы в 24,0 Дж/см2,.где она и через три часа остается ниже контроля на 20 %.

Гелий-неоновый лазер вызывал в тромбоцитах и лейкоцитах эффекты, механизм реализации которых скорее всего связан с возрастанием под действием облучения уровня радикалов кислорода, повышением активности антиоксидантного фермента каталазы и структурными перестройками мембран, вызванными тепловыми эффектами низкоинтенсивного лазерного излучения (Кару и др., 1989, Туртаева и др., 1993).

Первичные механизмы, задействованные в мембранах при облучении гелий-неоновым лазером, вызывают изменения в ее липидпых и белковых молекулах, снижение уровня-холестерина: па 17 % в тромбоцитах и 15% в лейкоцитах. Уровень фосфоли-пидов в тромбоцитах и лейкоцитах максимально повышался на 17 %, но при этом дозы облучения, вызывающие эти изменения, были различны, в тромбоцитах — 6,0 Дж/см2, а в лейкоцитах — 24,0 Дж/см2. Различия в коэффициенте насыщенности жирных кислот были существенны, у тромбоцитов он был выше контроля на 28 % и у лейкоцитов на 34 %. Количество связанной воды в мембранах возрастало, о чем свидетельствует увеличение экси-мерной формы зонда пнренг и некоторое усиление флуоресценции зонда АНС — на 8 % у тромбоцитов и 17 % у лейкоцитов. Выявленные изменения показателей: повышение уровня связанной воды, и текучести мембр-аны приводят к ее стабилизации и благотворно влияют на работу мембранных ферментов, рецепторов п ионных каналов, о чем свидетельствует повышение трансмембранного потенциала изучаемых клеток: на 8 % у тромбоцитов и 10 % у лейкоцитов. Нами не зарегистрировано изменений в ультраструктурной организации тромбоцитов и лейкоцитов.

выводы

1. Впервые показано, что под влиянием ультрафиолетового света и излучения гелпй-пеонгавото лазера в исследованных клетках выявляются основные признаки неспецифического адаптационного синдрома, который в первую очередь затрагивает структурно-функциональнее состояние биомембран.

2. Ультрафиолетовый свет, оказывая мембрапотропный эффект на тромбоциты н лейкоциты, приводит к формированию иеспецнфического адаптационного синдрома:

•в первой фазе происходи г снижение уровня общих липидов, фосфолипидов, повышение уровня холестерина и насыщенности жирных кп'слот, что 1в конечном итоге приводит к возрастанию микровязкости мембран. Эти изменения не затрагивают ультра-структурпую ерганизаиию клеток; 'Во второй фазе регистрируется дальнейшее углубление .молекулярных перестроек в мембранах, касающееся в первую очередь повышения коэффициента насыщенности жирных кислот фссфолнпидоа, дальнейшего возрастания микровнзкостн, изменения лнпнд-белковых взаимодействий, данные процессы .являются молекулярной основой ультраструктуриой и функциональной модификации клеток: появление мелких и средних вакуолей, фагосом и аутофаго-сом у нейтрефнлоз; появление псевдоподии, просветление цитоплазмы у тромбоцитов; в третьей фазе существенные молекулярные перестройки лнпидного бислоя, резкое 'возрастание мнкровязкостп приводят к 'Кластеризации и обводнению мембран, что в конечном- итоге способствует гидратации цитоплазмы и глубоким морфофункциопальным изменениям клеток, характеризующихся:" наличием в цитоплазме крупных .вакуолей и деформацией ядра у пейтрофилов, разрушением грапуломера и перемещением гранул на периферию, частичным нарушением целостности плазматических мембран у тромбоцитов, что в целом отражается на снижении их функциональной активности.

3. Механизм формирования клеточного ответа па воздейстг •вис гелий-неонового лазера находи г свое завершение в первой фазе развития песпецифического адаптационного синдрома и включает в себя следующие ,моменты: молекулярные перестройки мембран — снижение уровня холестерина и коэффициента •насыщенности жирных кислот, повышение доли фосфолипидов и снижение микровязкссти; функциональную модификацию мембран — изменение липид-белкэвых взаимодействий и повышение траи'смембраиного потенциала; функциональную модификацию клеток — повышение процента и индекса фагоцитоза пейтрофилов, снижение адгезив!юй способности тромбоцитов.

4. Особенности влияния ультрафиолетового света и гелнй-неонотого лазера на уровне клеточных систе,м связаны 'с бифаз-

ностыо действия ультрафиолетового излучения, длительностью пострадиационного периода и градуалыностью действия лазерной стимуляции. Специфичность ответа опосредована изме,нениями в липидном вислое биомембран, что в конечном итоге находит свое отражение в интегральном показателе их морфо-функционального состояния — микровязкости.

5. Нами установлено, что ранним и постоянным показателем развития иеспецифического адаптационного синдрома под действием ультрафиолетового и гелий-неонового лазерного облучения является изменение микровязкости плазматических мембран фотостимулированных тромбоцитов и лейкоцитов, носящее дозозависимый характер.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Электромагнитные волны и регуляториые механизмы биомембран, ответственные за' адаптационно-трофические реакции клеток // Отчет по заказу-наряду № 53/27—89, Саранск, 1992. — 60 с. (в соавт. с Р. Е. Киселевой, Г. С. Барнашевой, Н. В. Альба,

B. А. Трофимовым).

2. Фотомодифнцирующее действие лазерного и ультрафиолетового излучения на мембраны тромбоцитов // Механизмы действия сверхмалых доз: Материалы симпозиума ИФХ РАН, Москва, 1992. (в соавт.- с Р. Е. Киселевой, В. А. Трофимовым,

C. П. Бякиным, Р. Р. Иргугановым).

3. Некоторые аспекты молекулярных механизмов действия ультрафиолетового излучения на мембранные структуры форменных элементов крови // Тез. науч. копф. Огаревские чтения, г. Саранск, 1993. С. 104 — 105. (в соавт. с Л. С. Дорофеевой, Н. В. Туртаевой, Л. В. Кузьмичевой).

4. Влияние ультрафиолетового облучения на антиоксидант-иую систему крови // Тез. науч. конф\ Огаревские чтения, г; Саранск, 1993. С. 106 .(в соавт. с Н. В. Туртаевой, Г. С. Барнашевой).

5. Влияние, различных доз ультрафиолетового излучения на функциональное состояние лейкоцитов крупного рогатого скота // Гигиена, ветсанитария и экология животноводства (Материалы Всероссийской конф.). Чебоксары, 1994. С. 14 (в соавт. с Р. Е. Киселевой, Л. В. Кузьмичевой, Д. Р. Курмаевым).

6. Влияние излучения гелий-неонового лазера на иммуноком-петентные клетки // Гигиена, ветсанитария и экология животноводства (материалы конференции). Чебоксары, 1994. С. 15 (в соавт. с Р. Е. Киселевой, Л. В. Кузьмичевой).

20 ' 4

7. Влияние ультрафиолетового излучения па морфофункцно-пальное состояние лейкоцитов // Вест. Морд, ун-та. 1994. № 2. С. 43 — 46. (в соавт. с Р. И. Киселевой, Л. В. Кузьмичевой).

8. Влияние излучения гелий-неонового лазера на ФИ-цикл и фотомодификацию функциональной активности клеток крови // Материалы 6-го симпозиума по биохимии липидов. Санкт-Петербург, 1994 (в соавт. с В. А. Трофимовым, Р. Е. Киселевой, В. Т. Николаевым, Л. В. Кузьмичевой).

Сдано в набор 26.10.94. Подписано в печать 28.10.91. Объем 1,25 п. л. Тираж 100 экз. Заказ № 728.

Типография Издательства Мордовского университета 430000 Саранск, ул. Советская,'24