Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние семакса (АКТГ4-7-Pro-Gly-Pro) на нейрохимические характеристики серотонин- и дофаминергических систем мозга и оценка его нейропротекторной активности

Направахрукописи

ЕРЁМИН Кирилл Олегович

ВЛИЯНИЕ СЕМАКСА (AKTГ4-7-Pro-Gly-Pro) НА НЕЙРОХИМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СЕРОТОНИН- И ДОФАМИНЕРГИЧЕСКИХ СИСТЕМ МОЗГА И ОЦЕНКА ЕГО НЕЙРОПРОТЕКТОРНОЙ АКТИВНОСТИ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2004

Работа выполнена в ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова Российской Академии медицинских наук

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, профессор К.С. Раевский кандидат биологических наук И.А Гривенников

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Т.А Воронина доктор биологических наук, профессор А.А. Каменский

Ведущая организация:

Российский Государственный Медицинский Университет

Защита состоится «_»_2004 г. в_часов

На заседании Диссертационного совета Д.001.024.01 в ГУ НИИ фармакологии им В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Ученой части ГУ НИИ фармакологии РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, 8.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук

ЕА Вальдман

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Одной из актуальных проблем современной биомедицины, в частности фармакологии, является поиск и изучение веществ, стимулирующих когнитивные функции мозга (внимание, познавательная деятельность, процессы обучения и памяти). Нарушения этих функций характерны для широкого круга неврологических и психических заболеваний, в том числе травматических повреждений мозга, цереброваскулярных расстройств, нейродегенеративных заболеваний мозга (болезнь Альцгеймера, Паркинсона). Когнитивные нарушения относятся к одному из важнейших проявлений шизофрении. Для лечения когнитивных нарушений широкое применение получили ноотропные препараты, в том числе пирацетам и его аналоги [Воронина Т.А. и Середенин СБ., 1998]. Вместе с тем известно, что ноотропные средства не лишены ряда недостатков, что свидетельствует о целесообразности поиска новых соединений с подобным профилем действия. Важно отметить, что пирацетам и его аналоги неэффективны при когнитивных нарушениях в основе которых лежит нейродегенеративное повреждение мозга. В связи с этим возникает необходимость создания и изучения механизма действия веществ, обладающих не только ноотропной, но и нейропротекторной активностью [Островская Р.У. и соавт., 2002].

Оригинальное направление нейробиологии и психофармакологии памяти и обучения' связано с исследованиями пептидов, являющихся фрагментами адренокортикотропного гормона (АКТГ). Было показано, что ряд структурных аналогов АКТГ обладают способностью активировать процессы обучения и памяти у животных и человека [De Wied, 1997]. Недостатком этих соединений оказалась короткая продолжительность эффекта, связанная с их быстрой метаболической деградацией в организме.

В исследованиях Института молекулярной генетики РАН и кафедры физиологии человека и животных МГУ им. М.В.Ломоносова было обнаружено, что модификация фрагмента АКТГ4-7 путем введения дополнительной аминокислотной последовательности Pro-Gly-Pro с С-конца молекулы приводит к значительному увеличению продолжительности действия пептида [Пономарева-Степная М.А. и соавт., 1986]. Результатом этих исследований явилось создание нового оригинального гептапептида - семакса (Met-Glu-His-Phe-Pro-GIy-Pro), обладающего широким спектром нейротропной активности [Ашмарин И.П. и соавт., 1997]. В настоящее время семакс

широко применяется в клинике в качестве ноотропного и нейропротекторного средства при лечении когнитивных расстройств, неврологических нарушений при остром ишемическом инсульте, в офтальмологии и других областях медицины.

Известно о тесных функциональных и анатомических, связях между меланокортиновой и моноаминергическими системами мозга [Florijn et al., 1993; Drago et al., 1999; Lindblom et al., 2001]. He вызывает сомнения также участие дофаминергической и серотонинергической систем мозга в процессах памяти и нейрональной пластичности [Раевский К.С., 1998; Barros et al., 2003; Hefco et al., 2003; Jay, 2003]. В то же время, нейрохимические механизмы, лежащие в основе действия аналогов АКТГ, в частности семакса, до настоящего времени изучены недостаточно. Несмотря на наличие у семакса антиишемических и антигипоксических свойств, нейропротекторные свойства пептида на нейротоксических моделях повреждения мозга не исследовались.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение влияния семакса (AKIT4-7-Pro-Gly-Pro) на нейрохимические характеристики серотонин- и дофаминергических систем мозга, а также оценка возможной нейропротекторной активности пептида на моделях дофамин- и серотонинергической нейротоксичности в условиях in vitro и in vivo.

В соответствии с указанной целью, были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние семакса на нейрохимические характеристики серотонинергических систем мозга животных: тканевое и внеклеточное содержание серотонина и его метаболита 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК) в гипоталамусе и стриатуме мозга животных.

2. Исследовать эффекты семакса на нейрохимические параметры дофаминергической системы мозга: тканевое и внеклеточное содержание дофамина и его метаболитов 3,4-дигидроксифенилуксусной (ДОФУК) и гомованилиновой кислот (ГВК) в стриатуме, а также способность семакса модулировать психостимулирующее действие d-амфетамина.

3. Оценить возможную нейропротекторную активность семакса в культуре мезенцефалических нейронов, полученных из эмбрионального мозга крыс (Е16), при моделировании цитотоксического повреждения, обусловленного 6-гидроксидофамином (6-ОНДА) in vitro.

4. Оценить нсйропротекторные свойства с семакса на моделях дофаминергической нейротоксичности, вызванной 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидрошфидином (МФТП) и d-амфетамином на мышах линии С57/Ы.

5. Изучить нейропротекторные свойства семакса на модели серотонинергической нейротоксичности, вызванной внутримозговым введением 5,7-дигидрокситриптамина (5,7-ДГТ) на мышах линии С57/Ы.

Научная новизна. При изучении эффектов семакса на нейрохимические показатели моноаминергических систем мозга впервые показано, что семакс вызывает активацию серотонинергических систем мозга, которая проявляется в повышении тканевого и внеклеточного содержания метаболита серотонина 5-ГИУК через 30 мин, 2 и 24 ч после введения пептида. В микродиализных исследованиях на свободноподвижных крысах обнаружено свойство семакса усиливать эффект d-амфетамина, проявляющийся в повышении внеклеточной концентрации дофамина в диализатах стриатума, что свидетельствует об усилении дофаминергической нейропередачи в этих условиях. Потенцирующее влияние семакса на психостимулирующие эффекты d-амфетамина проявляется, также, в экспериментах с регистрацией локомоторной активности мышей линии С57/Ы.

Впервые проведено исследование нейропротекторной активности семакса с использованием моделей дофамин- и серотонинергической нейротоксичности in vitro и in vivo. Выявлен цитопротекторный эффект семакса в нейро-глиальной культуре клеток мезенцефалона крыс (Е16) in vitro при их нейротоксическом повреждении 6-гидроксидофамином, который, однако, не проявляется в нейрональной культуре клеток, полученных из того же отдела мозга. На моделях дофамин- и серотонинергической нейротоксичности на мышах линии С57/Ы ex vivo выявлены умеренные нейропротекторные эффекты семакса в стриатуме при воздействии d-амфетамина (р<0,1) и 5,7-дигидрокситриптамина (р<0,05).

Научно-практическая значимость. Полученные в работе данные расширяют представления о нейрохимических и нейропротекторных свойствах семакса, а также вносят существенный вклад в понимание нейрохимических основ механизма действия семакса как оригинального нейротропного средства. Результаты, полученные в диссертационной работе, раскрывают новый аспект механизма действия семакса - его способность усиливать действие веществ, активирующих дофаминергическую передачу

в мозге. Обнаружено также свойство семакса оказывать позитивное модулирующее влияние на серотонинергическую передачу в структурах мозга. Эти данные могут послужить основой для разработки новых стратегий терапии дофамин и серотониндефицитных состояний.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на VIII Всероссийской школе молодых ученых «Актуальные проблемы нейробиологии», Казань, 2001; Всероссийской научной конференции «Нейрофармакология в XXI веке», Санкт-Петербург, 2002; II Съезде Российского Научного Общества Фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии», Москва, 2003; Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов, Москва, 2003; на межлабораторной конференции Института молекулярной генетики РАН, 2004, а также на лабораторных и межлабораторных конференциях ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи и б тезисов.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы содержащего 53 отечественных и 265 зарубежных источников. Диссертация содержит 5 таблиц и 28 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ П МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе было использовано 296 самцов мышей линии С57/Ы массой 18-24 г, 35 самцов крыс линии Спрег-Доули и 10 самцов крыс линии Вистар массой 250-300 г.

В работе использовали следующие фармакологические агенты: семакс [ИМГ РАН], МФТП [ГУ НИИФ РАМН], паргилин [Serva], 5,7-ДГТ [Пика], d-амфетамин, 6-ОНДА и NSD1015 все - [Sigma]. Для приготовления буферных растворов, перфузирующих растворов, сред для культивирования клеток in vitro, а также подвижных фаз для хроматографического разделения веществ использовались реактивы фирм Биохром, ICN, Merk, Sigma.

1. Определение тканевого содержания моноаминов и их метаболитов в структурах мозга методом ВЭЖХ. Мышей С57/Ы забивали через указанные промежутки времени после введения веществ, выделяли структуры мозга, которые размельчали на холоду в гомогенизаторе Поттера стекло-тефлон. Структуры гомогенизировали в 40 объемах среды выделения, которая содержала 0,1н НСЮ4 с добавлением внутреннего стандарта 2,3-дигидроксибензойной кислоты (0,25 нмоль/мл). Пробы центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин (+4°С) на центрифуге K70D (ГДР). Супернатант использовали для определения моноаминов и их метаболитов.

Содержание дофамина (ДА), серотонина (5-НТ) и их метаболитов ДОФУК, ГВК и 5-ГИУК определяли с помощью ВЭЖХ с ЭД на хроматографе LC - 304 Т (BAS, США) и Gilson-307 на колонке Phenomenex С-18, 4 мкм, 150x4,6 мм и амперометрическом детекторе LC - 4В с ячейкой TL - 5 (BAS, США). Измерения проводили на стеклоуглеродном электроде +0.85В против электрода сравнения Ag/AgCl. Объем

вводимого образца составлял 20 мкл. Подвижная фаза содержала (г/л): дигидрофосфат калия - 9,56; цитрат натрия - 5,76; 1-октансульфонат натрия - 0,4 г; ЭДТА Na^ — 0,1; ацетонитрил - 8%, рН - 3,0. Скорость подвижной фазы составляла 1,0 мл/мин [Кудрин B.C. и соавт., 1995].

2. Определение внеклеточного содержания моноаминов и их метаболитов в стриатуме свободноподвижных крыс с использованием методики внутримозгового микродиализа и ВЭЖХ. Крыс линии Спрег-Доули анестезировали хлоралгидратом (400 мг/кг, в/б) и фиксировали в стереотаксическом аппарате. В работе применялись аналоги микродиализных зондов СМА12 (СМА Microdialysis, Швеция) изготовленные в лаборатории по оригинальной методике (с диализной мембраной проницаемостью до 10 кДа), которые имплантировали в стриатум с координатами АР +0,5, L -3.0, DV +6,5 относительно т. Брегма [Paxinos & Watson, 1986] и фиксировали на черепе. Перфузию проводили через 1 сут после имплантации зондов искусственной цереброспинальной жидкостью, содержащей (в мМ): Na+ - 155,0, К" - 2,9, Са1* - 1,1, Mg** - 0,8, Cl" - 133,0, рН - 7,4 (30 мин 5% СОг). Для подачи жидкости использовали шприцевый насос (СМА, Швеция), скорость тока составляла 2 мкл/мин. Для «уравновешивания» имплантированных зондов их перфузировали в течение 1-1,5 ч перед экспериментом. Диализаты собирали каждые 20 мин в течение всего эксперимента. Для предотвращения разрушения моноаминов в каждую пробирку предварительно добавляли 10 мкл 0,Ш НС1.3-4 базальные пробы были собраны перед первой инъекцией препарата.

Образцы диализата (50 мкл) без дополнительной очистки анализировали на содержание ДА, ДОФУК, ГВК и 5-ГИУК с помощью ВЭЖХ с ЭД на хроматографе ESA 850 с электрохимическим детектором Coulochem II (ESA) и ячейкой Microdialysis Cell 5014 В (ESA) при потенциалах -175 и +200 мВ на колонке Phenomenex C-18, 4 мкм, 150x4,6 мм. Подвижная фаза содержала (г/л): дигидрофосфат натрия - 9,16; цитрат натрия - 5,76; 1-октансульфонат натрия - 0,4; ацетонитрил - 8%, рН -

2,8. Скорость потока подвижной фазы составляла 1,0 мл/мин [Андяржанова Э.А. и соавт., 1999].

Эффекты веществ рассчитывали по отношению к среднему содержанию ДА, ДОФУК, ГВК и 5-ГИУК в базальных образцах. По окончании эксперимента животных декапитировали и проводили морфологический контроль для определения положения зонда.

3. Методика оценки скорости биосинтеза дофамина и серотонина в структурах мозга мышей линии С57/Ы. Для изучения эффектов семакса на скорость биосинтеза дофамина и серотонина использовали центральный ингибитор декарбоксилазы 1-ароматических аминокислот NSD 1015. По скорости накопления диоксифенилаланина (ДОФА) и 5-гидрокситриптофана (5-ГТ) судили об активности ключевых ферментов биосинтеза дофамина и серотонина - тирозингидроксилазы (ТГ) и триптофангидроксилазы, соответственно.

Семакс в дозах 0,15 и 0,6 мг/кг (в/б) вводили однократно или хронически ежедневно в течение 1 недели. NSD 1015 в дозе 100 мг/кг (в/б) вводили за 30 мин до декапитации животных. Тканевое содержание ДОФА, 5-ГТ, а также ДА, 5-НТ, ДОФУК, ГВК и 5-ГИУК в стриатуме мозга мышей определяли с помощью ВЭЖХ с ЭД.

4. Методика регистрации спонтанной двигательной активности мышей линии С57/Ы.

Регистрацию индивидуальной локомоторной активности мышей проводили с помощью установки Opto-Varimex (США) в течение 10 мин. В каждой группе было 1014 животных. В ходе опыта животных каждой группы трижды последовательно

помещали в регистрационную камеру, измеряя их двигательную активность в течение 10 мин [Новоселов И.А. и Раевский К.С., 2003]. Первая посадка - тестирование 0-10 мин, сразу после этого введение семакса в дозе 0,6 мг/кг (в/б) или 0,9% NaCl. Вторая посадка - через 10 мин после инъекции (20-30 мин), сразу после этого введение d-амфетамина в дозе 2 мг/кг (в/б) или 0,9% NaCl. Третья посадка - через 20 мин после второй инъекции (50-60 мин).

5. Моделирование нейротоксического повреждения.

5.1. Моделирование повреждения дофаминергических нейронов, вызванного 6-ОНДА в мезенцефалических клеточных культурах in vitro

Получение нейроналъной культуры клеток Культуру нейронов получали из среднего мозга 16-дневных (Е16) эмбрионов крыс линии Вистар. Ткань мезенцефалона ресуспендировали в среде, содержащей DMEM:F-12 (1:1) с 20% эмбриональной бычьей сыворотки. Суспензию клеток в объеме 500 и 150 мкл и плотностью 200 и 60 тыс/лунку помещали, соответственно, на 48- и 96-луночные плашки (Costar), предварительно (за 1 сут) обработанные поли-L-лизином (0,1 мг/мл). Клетки культивировали в среде DMEM:F-12 (1:1), содержащей: HEPES 15мМ, NaHC03 1,2 г/л, d-глюкозу 6 г/л, 1-глутамин 0,665 г/л, трансферин 0,1 г/л, инсулин 0,025 г/л, путресцин 100 нМ, селенит 30 нМ и прогестерон 20 нМ при 37°С, 5% СО? И 100% отн. влажности воздуха [Konig et al 1989; Lauderetal, 1989].

Получение смешанной нейро-глиалъной культуры клеток. Все операции проводились как описано выше за исключением того, что клетки содержали в 48-луночных плашках в объеме 500 мкл и плотностью 200 тыс/лунку в среде (см. выше), содержащей также 10% эмбриональной бычьей и 10% лошадиной сыворотки (HS).

Добавление веществ к культурам. На 5-е сутки in vitro в нейрональные и нейроглиальные культуры клеток добавляли 6-ОНДА в конечной концентрации 5 мкМ в объеме 1% от общего объема среды. Семакс в концентрациях 0,1 и 1 мкМ в объеме 1% от общего объема среды добавляли к культурам за 24 ч (4-е сутки in vitro) или за 30 мин (5-е сутки in vitro) до добавления токсина.

Иммуноцитохимическое определение количества ТГ-положительных нейронов. Через 24 ч после добавления 6-ОНДА (6-е сутки in vitro), нейрональные и нейроглиальные культуры клеток (48-луночные плашки) фиксировали 4% параформальдегидом в течение 1 ч. Фиксированные клетки инкубировали в течение ночи в растворе PBS (0,015 М), содержащем 2% HS, 0,1% Triton Х-100 и моноклональные антитела (разведение 1:5000) к тирозингидроксилазе (ТГ) [Sigma]. Дальнейшую окраску клеток осуществляли с помощью Vectastain ABC Kit [Vector] и диаминобензидина. Количество дофаминергических нейронов в культурах определяли путем подсчета количества ТГ-положительных нейронов в половине лунки на микроскопе Olympus CKX41 (Япония).

Оценка выживаемости нейронов (МТТ анализ). Через 24 ч после добавления 6-ОНДА, к нейрональным культурам клеток (96-луночные плашки) добавляли митохондриальный краситель 3-(4,6-диметилтиазолил-2)-2,6-дифенилтетразол бромид (МТТ) в конечной концентрации 0,1 мг/мл. Через 5 ч инкубации при и 5% СО? образовавшиеся кристаллы формазана растворяли в 100 мкл ДМСО в течение 30 мин при перемешивании. Оптическую плотность, которая была прямо пропорциональна количеству живых клеток в культуре, определяли при 600 нм на автоматическом плашечном спектрофотометре (ELISA Reader).

5.2. Моделирование повреждения дофаминергических нейронов, вызванного МФТП in vivo. 1-метил-4-фенил-1,2Д6-тетрагидропиридин (МФТП) вводили однократно (30 мг/кг, в/б) мышам линии С57/Ы. Нейротоксический эффект МФТП определяли через 1 нед нейрохимически, измеряя тканевое содержание дофамина и его метаболитов ДОФУК и ГВК в стриатуме мозга мышей линии С57/Ы [Sedelis et al, 2000].

Семакс в дозах 0,15 и 0,6 мг/кг (в/б) вводили за 30 мин до и через 2 ч после введения нейротоксина и далее каждые сутки в течение 1 недели.

5.3. Моделирование повреждения дофаминергических нейронов, вызванного d-амфетамином in vivo. D-амфетамин (5 и 10 мг/кг, в/б) вводили 4-х кратно через каждые 2 ч мышам линии С57/Ы при температуре окружающей среды 21-25 С. Нейротоксический эффект d-амфетамина определяли через 1 нед нейрохимически, измеряя тканевое содержание дофамина и его метаболитов ДОФУК и ГВК в стриатуме мозга мышей линии С57/Ы.

Семакс в дозах 0,15 и 0,6 мг/кг (в/б) вводили за 30 мин до каждого введения психостимулятора и далее каждые сутки в течение 1 недели.

5.4. Моделирование повреждения серотонинергических нейронов, вызванного 5,7-дигидрокситриптамином in vivo. 5,7-дигидрокситриптамин (5,7-ДГТ) в количестве 50 мкг (в пересчете на основание) вводили в объеме 5 мкл в латеральный желудочек мозга мышей линии С57/Ы с координатами АР = -0,6, L = 1,2, DV = 2,5 относительно т. Брегма [Franklin & Paxinos, 1997]. Нейротоксический эффект определяли нейрохимически, измеряя тканевое содержание серотонина и 5-ГИУК во фронтальной коре, гипоталамусе и стриатуме мозга мышей линии С57/Ы через 1 нед после введения нейротоксина [Hall et al, 1999]. Также определяли индивидуальную двигательную активность мышей в установке Opto-Varimex в течение 10 мин на 2-е и 6-е сутки после введения 5,7-ДГТ.

Семакс в дозах 0,15 и 0,6 мг/кг (в/б) вводили за 30 мин до и через 2 ч после введения нейротоксина и далее каждые сутки в течение 1 недели.

6. Статистическая обработка. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы Statistica 5.O. Результаты нейрохимических экспериментов (тканевое содержание моноаминов и их метаболитов), поведенческих экспериментов, а также опытов с культурами клеток in vitro обрабатывались с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Результаты микродиализных экспериментов обрабатывались с помощью дисперсионного анализа ANOVA для повторных измерений с использованием Duncan's post hoc критерия. Данные представлены в виде среднее±стандартная ошибка среднего.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Влияние семакса на нейрохимические показатели серотонинергической нейропередачи в мозге животных

Тканевое содержание серотонина и его метаболита 5-ГИУК в структурах мозга мышей линии С57/Ь1. Среднее тканевое содержание серотонина и его метаболита 5-ГИУК в стриатуме мышей линии С57/Ы (контрольная группа) составляло, соответственно: 3,3-3,8 и 1,8-2,5 нмоль/г ткани. Семакс в дозе 0,15 мг/кг (в/б) не вызывал изменений тканевого содержания серотонина в гипоталамусе и стриатуме

мышей С57/Ы через 0,5, 2 и 24 ч после однократного, а также после хронического в течение 1 недели введения. Было обнаружено достоверное (р<0,05) повышение тканевого содержания метаболита серотонина 5-ГИУК в гипоталамусе мышей С57/Ы через 0,5 и 2 ч после введения пептида, причем эффект оказался более выраженным через 2 ч после инъекции, достигая 130% по сравнению с контролем. Обнаружено также повышение (р<0,05) тканевого содержания 5-ГИУК в стриатуме мышей через 2 и 24 ч после введения семакса (рис. 1), в то время как через 0,5 ч содержание 5-ГИУК в стриатуме оставалось неизменным. В условиях хронического (1 нед) ежедневного введения пептида в дозе 0,15 мг/кг (в/б) изменений тканевого содержания 5-ГИУК в структурах мозга мышей линии С57/Ы выявлено не было.

В дозе 0,6 мг/кг (в/б) семакс существенно не изменял тканевое содержание серотонина и 5-ГИУК в гипоталамусе и стриатуме мышей линии С57/Ы как в условиях острого (через 24 ч), так и хронического введения (1 нед).

Внеклеточное содержание метаболита серотонина 5-ГИУК в стриатуме мозга крыс Спрег-Доули. Для более детального изучения эффектов пептида на серотонинергическую систему мозга была использована методика внутримозгового микродиализа на свободноподвижных крысах, которая позволяет оценить нейрохимические параметры синаптической передачи в структурах мозга путем измерения внеклеточной концентрации нейромедиатора и его метаболитов. Базальный уровень метаболита серотонина 5-ГИУК в стриатуме крыс Спрег-Доули в условиях наших экспериментов составлял 250-340 пмоль/мл. Было обнаружено, что семакс в дозах 0,15 и 0,6 мг/кг (в/б) вызывает постепенное повышение внеклеточного уровня 5-ГИУК в диализатах стриатума крыс (рис. 2), которое наблюдается через 1 час после введения пептида и сохраняется на протяжении 4-х часов эксперимента (ANOVA, р<0,05). Обращает на себя внимание тот факт, что эффект семакса был более выраженным в дозе 0,15 мг/кг. Это, по-видимому, свидетельствует о «колоколообразном» характере зависимости «доза-эффект» семакса, которая часто встречается и у других пептидных соединений [Ашмарин И.П. и соавт., 1997; Воронина ТА. и Середенин СБ., 1998; Островская Р.У. и соавт., 2002; De Wied, 1997].

Семам; хронич. (1 нед)

Рис. 1 Влияние семакса (0,15 мг/кг) на тканевое содержание серотонина и его метаболита 5-ГИУК в стриатуме мышей С57/Ы через различные промежутки времени после в/б введения (в % от контроля) **-р<0,05 по сравнению с контролем (и-тест)

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 Время (мин)

Рис 2 Влияние семакса (0,15 и 0,6 мг/кг, в/о) на внеклеточное содержание 5-ГИУК в стриатуме свободноподвижных крыс Спрег-Доули (в % к базальному уровню). Стрелкой показан момент введения семакса. *-р<0.1, **-р<0.05, ***-р<0.01 по сравнению с контролем (ANO VA, Duncan's post hoc тест).

Обнаруженное увеличение тканевого содержания 5-ГИУК в гипоталамусе и стриатуме мышей линии C57/bl (рис. 1) хорошо коррелирует с временной динамикой внеклеточного уровня этого метаболита, регистрируемого у крыс Спрег-Доули в условиях микродиализного эксперимента (рис. 2). Увеличение содержания метаболита серотонина 5-ГИУК, принято рассматривать как показатель ускорения оборота этого моноамина, отражающего, по-видимому, повышение функциональной активности серотонинергических систем мозга. Полученные результаты согласуются с данными других исследователей, наблюдавших влияние семакса и других аналогов АКТГ на содержание серотонина и его метаболита в структурах мозга [Гецова В.М. и соавт., 1988; Крутиков Р.И. и соавт., 1991; Ramaekers et al., 1978].

Скорость биосинтеза серотонина в структурах мозга мышей линии С57/Ы Как показали проведенные исследования семакс в дозах 0,15 и 0,6 мг/кг (в/б) при однократном (через 24 ч) или хроническом (1 нед) введении не оказывает заметного влияния на скорость накопления 5-гидрокситриптофана в гипоталамусе и стриатуме мышей линии C57/bl в условиях .предварительного введения NSD 1015 ингибитора декарбоксилазы 1-ароматических аминокислот. Это свидетельствует об отсутствии влияния пептида в условиях данного эксперимента на скорость гидроксилирования триптофана in vivo.

Механизмы, с помощью которых семакс вызывает активацию серотонинергических систем мозга к настоящему времени не известны. Тот факт, что многие серотонинергические ядра способны коэкспрессировать меланокортиновые МС4 рецепторы позволяет предположить возможность модулирующего влияния семакса, обладающего свойствами антагониста этих рецепторов [Adan et al., 1994], на серотонинергические системы мозга [Adan & Gispen, 1997]. Известно также, что другой антагонист МС4 рецепторов MCL0129, проявляющий свойства антидепрессанта, обладает активирующим влиянием на серотонинергические системы мозга [Chaki et al., 2003]. Приведенные данные дают основание предположить участие МС4 рецепторов в механизме действия семакса с одной стороны и вероятность проявления антидепрессантной активности пептида - с другой.

Известны данные об участии серотнинергической системы мозга в регуляции болевой чувствительности. Так показано, что внутримозговое введение серотонина приводит к повышению порога болевого восприятия [Аринова А.А., 1994; Bardin et al.,

1997, 2000; Goettl et al., 2002]. С другой стороны, в экспериментальных [Иванова Д.М. и соавт., 2003] и клинических [Королева М.В. и соавт., 1996] исследованиях сообщается об анальгетическом действии семакса. Наши результаты, демонстрирующие серотонин-позитивные свойства семакса согласуются с результатами приведенных исследований.

2. Влияние семакса на нейрохимические параметры дофаминергической передачи в мозге

Тканевое содержание дофамина и его метаболитов в мозге мышей С57/Ь1. Среднее содержание дофамина и его метаболитов ДОФУК и ГВК в ткани стриатума мышей линии С57/Ы (контрольная группа) составляло, соответственно: 84,0-90,0, 3,3-5,1 и 6,39,4 нмоль/г ткани. Семакс в дозе 0,15 мг/кг (в/б) не вызывал значительных изменений тканевого содержания дофамина и его метаболитов в стриатуме мышей линии С57/Ы через 0,5,2,24 ч, а также в условиях хронического введения. При хроническом введении семакса в дозах 0,6 мг/кг (в/б) в течение 1 недели наблюдается достоверное снижение тканевого содержания дофамина и ДОФУК на 15% и 25% по отношению к контролю, соответственно. Учитывая длительный характер наблюдаемых изменений, логично предположить, что последние могут быть обусловлены как снижением оборота дофамина, так и изменениями в афинности или плотности дофаминовых рецепторов.

Внеклеточное содержание дофамина и его метаболитов в стриатуме мозга крыс Спрег-Доули. Базальный уровень дофамина и его метаболитов ДОФУК и ГВК в стриатуме крыс Спрег-Доули в условиях наших экспериментов составлял, соответственно: 0,4-1,0, 680-980 и 390-720 пмоль/мл. Достоверных изменений внеклеточных уровней дофамина, ДОФУК и ГВК в стриатуме свободноподвижных крыс Спрег-Доули в условиях микродиализного эксперимента не было выявлено, что, по-видимому, свидетельствует об отсутствии непосредственного эффекта семакса на синаптический баланс и скорость оборота дофамина в стриатуме животных.

Скорость биосинтеза дофамина в структурах мозга мышей линии С57/Ь1. Как показали проведенные исследования семакс в дозах 0,15 и 0,6 мг/кг (в/б) при однократном (за 24 ч) или хроническом в течение 1 недели введении не оказывает заметного влияния на скорость накопления ДОФА в стриатуме мышей лини С57/Ы в условиях предварительного введения NSD 1015 ингибитора декарбоксилазы 1-ароматических аминокислот. Это свидетельствует об отсутствии влияния пептида в условиях данного эксперимента на скорость гидроксилирования тирозина in vivo.

Потенцирование семаксом эффектов d-амфетамина на внеклеточное содержание дофамина и его метаболитов в диализатах стриатума крыс Спрег-Доули. Можно предположить, что эффекты семлкса на дофоминергичсские сйстемы мезга, в cc;:csx;ci:,

проявляются в условиях ее гипер- и/или гипоактвности. В связи с этим, в настоящем исследовании были изучены эффекты семакса в дозе 0,6 мг/кг (в/б), непрямого дофаминергического агониста - d-амфетамина в дозе 5 мг/кг (в/б), а также их комбинации (семакс + d-амфетамин с интервалом в 20 мин) на внеклеточное содержание дофамина, ДОФУК и ГВК в диализатах стриатума свободноподвижных крыс Спрег-Доули.

D-амфетамин сульфат в дозе 5 мг/кг (в пересчете на основание), в/б вызывал резкое пикообразное повышение внеклеточного уровня дофамина с максимумом через 20-40 мин после введения. Максимальные пиковые концентрации дофамина в диализате достигали уровня 20 пмоль/мл (рис. 3), что приблизительно в 20-30 раз выше базального уровня. К концу 2-го часа уровень дофамина снижался до 5 пмоль/мл. Повторные введения той же дозы d-амфетамина вызывали аналогичные по высоте и форме подъемы внеклеточного содержания дофамина в стриатуме крыс.

При предварительном введении семакса в дозе 0,6 мг/кг (в/б) за 20 мин до d-амфетамина внеклеточный уровень дофамина оказался достоверно более высоким с 20 по 200 минуту по сравнению с эффектами одного d-амфетамина (ANOVA, р<0.05). Максимальные внеклеточные концентрации дофамина при комбинированном введении препаратов достигали уровня 36-38 пмоль/мл, что приблизительно в 1,8-2 раза выше соответствующих пиковых уровней дофамина при введении только d-амфетамина (рис. 3). Достоверные различия между этими группами были выявлены (Duncan's post hoc тест) на 40 и 160 мин (р<0.05), а также на 20 и 180 мин (р<0.1). Во второй половине наблюдения (после 240 мин) потенцирующий эффект семакса в отношении вызванного d-амфетамином подъема внеклеточной концентрации дофамина не наблюдался. Следует отметить, что в этот период часть животных (3 из 7), которым вводили семакс и d-амфетамин погибала, в то время как при введении только d-амфетамина гибели животных не отмечалось. По-видимому, это может быть обусловлено значительным усилением семаксом возбуждающего и, возможно, гипертермического эффектов амфетамина.

-80 -40 0 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400 440 480

Время (мин)

Рис. 3 Влияние семакса (0,6 мг/кг, в/б) и d-амфегамина (5 мг/кг, в/б) на внеклеточное содержание дофамина в стриатуме свободноподвижных крыс Спрег-Доули (в пмоль/мл). Стрелками показано введение препаратов: С - семакс, А - d-амфетамин. *-р<0,1, **-р< 0,05, ***-р<0,01 - ANOVA, Duncan's post hoc тест при сравнении с группой амфетамина.

? 4000

1-ая

□ Контроль ЩМаСК0,9%>+(1-амф(2 mifa) Ш Семакс (0,6 мг/кг)+с1-вмф(2 мг/кг)

2-ая Посадки:

3-я

Рис. 4 Влияние семакса (0,6 мг/кг, в/б, за 20 мин до введения психостимулятора) и ¿-амфетамина (2 мг/кг, в/б) на горизонтальную активность мышей С57/Ы; ллл-р<0,01 - по сравнению с контрольной группой (и-тест), ** р<0,05 - по сравнению с группой амфетамина (и-тест)

При введении ё-амфетамина (5 мг/кг, в/б) внеклеточный уровень ДОФУК в стриатуме крыс Спрег-Доули значительно снижался и составлял 30% от базального уровня, что обусловлено известным из литературы ингибирующим влиянием психостимулятора на моноаминоксидазу (МАО) мозга [МШег Ы а1., 1980]. При совместном действии препаратов отмечалось еще более выраженное снижение концентрации ДОФУК в диализатах (ЛЫОУЛ р<0.01), которая в этом случае составляет 20% от базального уровня. Логично предположить, что и в этом случае семакс усиливает действие ё-амфетамина, следствием чего является более глубокое угнетение активности фермента МАО.

Таким образом, полученные данные позволяют сделать заключение о наличии у семакса свойства усиливать нейрохимические эффекты ё-амфетамина, что проявляется в еще большем повышении внеклеточного уровня дофамина и снижении уровня ДОФУК в стриатуме крыс Спрег-Доули. В то же время, в отсутствие ё-амфетамина семакс не вызывал достоверных изменений нейрохимических характеристик дофаминергической системы стриатума у животных.

Потенцирование семаксом стимулирующего эффекта d-амфетамина на локомоторную активность мышей линии С57/Ь1. С целью дальнейшего анализа потенцирующего эффекта пептида были выполнены эксперименты по оценке эффектов семакса и ё-амфетамина при их совместном применении на локомоторную активность мышей линии С57/Ы, которая, как известно, связана с высвобождением дофамина в стриатуме и прилежащем ядре. Были изучены эффекты совместного воздействия семакса в дозе 0,6 мг/кг (в/б, за 20 мин до введения психостимулятора) и ё-амфетамина в дозе 2 мг/кг (в/б) на локомоторную активность мышей линии С57/Ь1. Схема введения веществ была аналогична использованной в микродиализных экспериментах.

На рис. 4 представлены эффекты семакса и ё-амфетамина на горизонтальную двигательную активность мышей линии С57/Ы. В контрольной группе локомоторная активность животных снижалась в течение всего эксперимента. Так, при третьей посадке количество движений составило 75±7% по сравнению с активностью при

второй посадке. Семакс в дозе 0,6 мг/кг (в/б) не вызывал достоверных изменений

«

показателей двигательной активности животных. Б-амфетамин в дозе 2 мг/кг (в/б) вызывал значительное увеличение двигательной активности мышей, которая достигала уровня 182± 18% по сравнению с показателями предыдущей посадки (р<0,01) (рис. 4).

При комбинированном применении семакса (0,6 мг/кг, в/б) и d-амфетамина (2 мг/кг, в/б) наблюдалось достоверное (р<0.05) повышение локомоторной активности мышей по сравнению с животными, которым вводили только d-амфетамин. Так, горизонтальная активность животных при последовательном введении семакса и d-амфетамина достигала уровня 261±30% по сравнению с соответствующими данными предыдущей посадки (рис. 4).

При сравнении данных микродиализных и поведенческих экспериментов можно видеть, что их результаты в целом коррелируют друг с другом. Это дает основание предположить, что наблюдаемое усиление локомоторных эффектов d-амфетамина при его совместном применении с семаксом является следствием повышения дофаминергической нейропередачи в стриатуме.

В последнее время получены убедительные данные о вовлечении нейротрофических факторов в модуляцию дофаминергической нейропередачи в мозге. Показано, что BDNF (нейротрофический фактор из мозга) и NGF (фактор роста нервов) дозозависимо усиливают как базальное высвобождение дофамина, так и высвобождение дофамина, вызванное деполяризацией ионами К* (30 мМ), в мезенцефалической культуре нейронов in vitro [Blochl & Sirrenberg, 1996]. Также известно, что рецепторы нейротрофина BDNF - тирозинкиназа В (TrkB) - коэкспрессируются на дофаминергических нейронах черной субстанции [Blochl & Sirrenberg, 1996]. Все эти данные свидетельствуют о том, что BDNF может модулировать дофаминергическую передачу в мозге путем активации TrkB рецепторов. Данное предположение подтверждается исследованиями in vivo, в которых было обнаружено вовлечение нейротрофического фактора BDNF в процессы высвобождения дофамина и дофамин-зависимое поведение, вызванное метамфетамином у животных [Narita et al., 2003]. Так, обнаружено, что предварительное введение антител к BDNF или к его рецептору TrkB в прилежащее ядро вызывает дозозависимое снижение внеклеточного уровня дофамина в прилежащем ядре, а также локомоторной активности крыс Спрег-Доули в условиях гиперактивации дофаминергической системы, вызванной метамфетамином (1 мг/кг, п/к). С другой стороны, в недавних исследованиях выявлено, что семакс стимулирует экспрессию нейротрофических факторов BDNF и NGF как в глиальной культуре клеток in vitro [Shadrina et al., 2001], так и в структурах мозга крыс in vivo [Долотов О.В. и соавт., 2003]. Все вышесказанное, дает основание предположить, что обнаруженное

нами потенцирование семаксом психостимулирующих эффектов d-амфетамина, может быть, связано с активацией экспрессии нейротрофических факторов BDNF и NGF.

3. Оценка нейропротекторных эффектов семакса при моделировании нейротоксического повреждения

Модель дофаминергическойнейротоксичности, вызванной б-гидроксидофамином в мезенцефалических клеточных культурах in vitro. Данные о наличии нейропротекторных и нейротрофических свойств у пептидов семейства АКТГУМСГ послужили основанием для изучения нейропротекторной активности семакса на модели дофаминергической нейротоксичности, вызванной воздействием б-ОНДА на первичные культуры клеток, полученные из эмбрионального среднего мозга крыс in vitro. Цитотоксический эффект 6-ОНДА в культуре нейронов среднего мозга (Е16) на 6-е сутки культивирования in vitro представлен на рис. 5. Как видно из рисунка (светлые столбики) 6-ОНДА в концентрациях 2 и 5 мкМ через 24 ч вызывал гибель, соответственно, 30 и 80% ТГ-иммунореактивных нейронов. При предварительном за 30 мин или за 24 ч добавлении семакса (0,1 и 1 мкМ) повышения выживаемости дофаминергических нейронов обнаружено не было.

Принимая во внимание большое влияние глиального окружения, в том числе нейротрофических факторов глии на выживаемость нейронов, были изучены цитопротекторные эффекты семакса в смешанной нейро-глиальной культуре среднего мозга (Е16). Как и в предыдущих экспериментах, 6-ОНДА (2 и 5 мкМ) вызывал дозозависимое снижение выживаемости ТГ-иммунореактивных нейронов (рис. 5, черные столбики). Семакс (0,1 мкМ), добавленный за 30 мин до 6-ОНДА (5 мкМ), достоверно повышал выживаемость ТГ-положительных нейронов (рис. 5) в условиях 6-ОНДА-вызванной нейротоксичности. При добавлении семакса к культуре за 24 ч до нейротоксина, защитного влияния пептида на выживаемость нейронов обнаружено не было.

Полученные результаты свидетельствуют о существенной роли глиального окружения в поддержании жизнеспособности дофаминергических нейронов в присутствии семакса в условиях 6-ОНДА-вызванного повреждения. Выявленные в наших опытах цитопротекторные эффекты пептида, могут быть обусловлены повышением уровня нейротрофических факторов, таких как NGF, BDNF [Shadrina et al., 2001; Долотов О.В. и соавт., 2003] и GDNF, которые обладают выраженными

нейропротекторными свойствами и могут препятствовать гибели дофаминергических нейронов [Spina et al., 1992; Eggert et al., 1999; Kawamata et al, 2003].

В литературе описаны нейропротекгорные эффекты аналога АКТГ ORG2766, на модели 6-ОНДА-вызванной нейротоксичности у крыс in vivo [Vos et al., 1991, 1999; Antonawich et al., 1993, 1994], однако об эффективности этого пептида в условиях in vitro не сообщалось.

Модель дофаминергической нейротоксичности, вызваннойМФТПm vivo. Показана четкая корреляция между степенью гибели дофаминергических нейронов и снижением уровней дофамина и его метаболитов в соответствующих структурах мозга [Heikhla et al., 1985; Blum et al., 2001]. Учитывая вышесказанное, нами было изучено влияние семакса на вызванное МФТП снижение содержания дофамина и его метаболитов в стриатуме мозга мышей линии С57/Ы. Тканевое содержание биогенных аминов определяли методом ВЭЖХ с ЭД.

Через 1 нед после введения МФТП в дозе 30 мг/кг (в/б) было выявлено значительное снижение уровней дофамина, ДОФУК и ГВК в стриатуме (рис. 6). Семакс в дозах 0,15 и 0,6 мг/кг в условиях хронического (1 нед) введения не оказывал заметного влияния на тканевое содержание дофамина и его метаболитов, сниженное МФТП, в стриатуме мышей.

Вместе с тем, в недавней работе [Левицкая Н.Г. и соавт., 2002] показано, что семакс в дозе 0,2 мг/кг (интраназально) вызывает увеличение горизонтальной и вертикальной активности крыс, сниженной под влиянием МФТП (25 мг/кг, в/б). Можно предположить, что семакс, не проявляя прямого цитопротекторного действия в отношении дофаминергических нейронов стриатума, по-видимому, обладает способностью компенсировать функциональные нарушения дофаминергических систем мозга в условиях повреждения, вызванного МФТП.

Принимая во внимание, что при токсическом воздействии МФТП наблюдается преимущественно некротический тип гибели дофаминергических нейронов [Choi et al., 1999; Soldner et al., 1999; Lotharius et al., 1999], представлялось целесообразным изучить возможные защитные эффекты семакса на модели нейротоксичности, вызванной d-амфетамином in vivo, для которой характерен апоптотический механизм гибели нейронов [Sramm et al, 1999; Blum et al, 2001; Davidson et al, 2001].

120 -i

Н20

6-ОНДА 6-ОНДА Сем+ Сем+ Сем+ Сем+ (2мхМ) (5мкМ) б-ОНДА б-ОНДА 6-ОНДА б-ОНДА

v:

(2мкМ)

(5мкМ)^ у@мкМ)

(5мкМ)

J

30 мин 24 ч

Рис. S Влияние семакса (0,1 мкМ) при добавлении за 30 мин и 24 ч до 6-ОНДА (2 и 5 мкМ) на выживаемость ТГ-положительных нейронов на модели 6-ОНДА-вызванной нейротоксичности в нейрональной (светлые столбики) и нейро-глиальной (черные столбики) культурах эмбрионального (Е1б) среднего мозга крыс линии Вистар на б день культивирования in vitro (в % к контолю) л-р<0,1, ^-p-sO.OS, ллл-р<0,01 по сравнению с контролем, ** - р<0,05 по сравнению с группой 6-ОНДА (U-тест) 140 т

□ДАОДОФУК ИГВК

Контроль МФТП (30мг/кг)+- МФТП(30мгУкг^

ИаС1 (0,9%, 1 нед) Семакс (0,6 мг/кг, 1 нед)

Рис. 6 Влияние семакса (0,6 мг/кг, в/б, ежедн, в теч 1 нед) на тканевое содержание дофамина и его метаболитов ДОФУК и ГВК в стриатуме мышей С57/Ы через 1 вед после введния МФТП (30 мг/кг, в/б) (в % от контроля) ^-рО.Об по сравнению с контролем (У-тест)

Модельдофаминергическопнейротоксичности, вызваннойd-амфетамином in vivo. Известно, что d-амфетамин в условиях 4-х кратного через каждые 2 ч введения вызывает гибель дофаминергических нейронов мозга, сопровождающуюся значительным повышением уровня генерации гидроксильных (ОН*) радикалов, уменьшением тканевого содержания дофамина и его метаболитов в структурах мозга [Андяржанова Э.А. и соавт., 1999; Afanas'ev et al., 2001; Davidson et al., 2001; Krasnova et al., 2001]. Наши эксперименты показали, что d-амфетамин в дозах 5 и 10 мг/кг (4-х кратное введение через каждые 2 ч, в/б) вызывает снижение тканевых концентраций дофамина на 27 и 76%, ДОФУК на 22 и 50% и ГВК на 17 и 54%, соответственно, в стриатуме мышей линии C57/bl через 1 нед после нейротоксического воздействия (рис. 7). Семакс в дозах 0,15 и 0,6 мг/кг (в/б) в условиях хронического (1 нед) введения не вызывал значительных изменений тканевой концентрации дофамина и его метаболитов в стриатуме мышей, сниженной d-амфетамином в дозе 10 мг/кг. При токсическом воздействии более низкой дозы психостимулятора (5 мг/кг), наблюдалась тенденция (р<0,1) к повышению тканевого содержания дофамина и ДОФУК в стриатуме в условиях хронического (1 нед) введения семакса в дозе 0,15 мг/кг (рис. 7).

Модель серотонинергической нейротоксичности, вызванной 5,7-дигидрокситрипамином in vivo. Дегенерацию серотониновых нейронов вызывали путем введения нейротоксина 5,7-дигидрокситриптамина (5,7-ДГТ) в количестве 50 мкг (в пересчете на основание) в латеральные желудочки мозга мышей линии C57/bl. Через 1 нед после введения 5,7-ДГТ вызывал значительное (р<0,01) снижение тканевой концентрации серотонина и его метаболита 5-ГИУК во фронтальной коре, гипоталамусе и стриатуме (рис. 8) мозга мышей линии C57/bl. Снижение тканевой концентрации серотонина и 5-ГИУК составило 65-70% по отношению к контролю. Было обнаружено, что семакс при хроническом (1 нед) введении в дозах 0,15 и 0,6 мг/кг (в/б) вызывал небольшое (+10%), но достоверное (р<0,05) повышение уровня серотонина в стриатуме мышей в условиях вызванного 5,7-ДГТ повреждения мозга. Во фронтальной коре и гипоталамусе изменения нейрохимических показателей не достигали уровня статистической значимости. Семакс не оказывал заметного влияния на показатели локомоторной активности животных, сниженные при действии нейротоксина.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о наличии умеренных защитных эффектов семакса, наблюдаемых в условиях in vivo и in vitro, при моделировании дофамин- и серотонинергических повреждений В целом, результаты наших исследований позволяют предположить, что наблюдаемые нами нейропротекторные эффекты семакса могут быть обусловлены активацией нейротрофических факторов, в частности, NGF и BDNF [Shadrina et al., 2001; Долотов О.В. и соавт., 2003].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленном исследовании проведено изучение влияния пептидного препарата семакса на нейрохимические характеристики

серотонин- и дофаминергических систем мозга животных, а также исследованы нейропротекторные свойства семакса с использованием моделей повреждения дофамин-и серотонинергических нейронов мозга в условиях in vivo и in vitro

Было обнаружено, что семакс в дозе (0,15 мг/кг, в/б) при однократном введении вызывает активацию серотонинергических систем в гипоталамусе и стриатуме животных, проявляющуюся в повышении тканевого и внеклеточного уровня метаболита серотонина 5-ГИУК. Скорость гидроксилирования триптофана при этом не изменяется. Аналогичный эффект в стриатуме обнаруживается и через 24 ч после введения семакса, что согласуется с известными данными о длительном характере действия пептида [Ашмарин И.П. и соавт., 1997]. Предполагается, что механизмы лежащие в основе, наблюдаемых нами серотонин-позитивных эффектов семакса, могут быть связаны с вовлечением системы меланокортиновых МС4 рецепторов, по отношению к которым семакс проявляет свойства антагонита [Adan et al, 1994].

С использованием методики внутримозгового микродиализа было выявлено, что семакс (0,6 мг/кг, в/б), усиливает эффект d-амфетамина на дофаминергические системы стриатума, повышая внеклеточный уровень дофамина в диализатах стриатума крыс Спрег-Доули. Эти результаты получили подтверждение в опытах, в которых было показано, что семакс усиливает активирующий эффект d-амфетамина в отношении локомоторной активности мышей линии C57/bl. Можно предположить, что наблюдаемый нами эффект потенцирования семаксом психостимулирующего действия d-амфетамина, вероятнее всего, обусловлен активацией нейротрофических факторов BDNF и NGF, что было недавно продемонстрировано в опытах in vitro [Shadrina et al.,

2001] и in vivo [Долотов О.В. и соавт., 2003]. Это предположение согласуется с недавними наблюдениями, показавшими, что нейротрофические факторы, в частности BDNF, вызывают усиление высвобождения дофамина в культуре клеток мезенцефалона [Blochl & Sirrenberg, 1996] и в опытах на свободноподвижных животных с микродиализной регастрацией внеклеточного уровня дофамина в структурах мозга [Narita et al., 2003].

При изучении нейропротекторных свойств семакса выявлено наличие умеренного защитного эффекта пептида при моделировании дофамин- и серотонинергической нейротоксичности. Так, при нейротоксическом повреждении дофамин- и серотонинергических систем мозга in vivo, вызванных воздействием d-амфетамина и 5,7-ДГТ семакс проявлял слабый нейропротекторный эффект. При повреждении дофаминергических нейронов в нейро-глиальной культуре клеток среднего мозга (Е16) in vitro вызванном 6-ОНДА семакс проявлял выраженный цитопротекторный эффект. Вместе с тем в нейрональной культуре защитный эффект семакса не проявлялся. Эти результаты указывают на важную роль глиального окружения в формировании защитного эффекта семакса в условиях повреждения дофаминергических нейронов 6-ОНДА. Можно предположить, что выявленные нами эффекты пептида связаны с активацией нейротрофических факторов глии, в частности BDNF [Shadrina et al., 2001; Долотов О.В. и соавт., 2003]. Как известно, нейротрофические факторы могут оказывать нейропротекторный эффект в отношении дофаминергических нейронов [Spina et al., 1992; Eggert et al., 1999; Kawamata et al., 2003].

В результате проведенной работы было установлено, что семакс оказывает активирующее влияние на моноаминергические (дофамин- и серотонинергические) системы мозга.

ВЫВОДЫ

1. Семакс (AKTT4-7-Pro-Gly-Pro) в дозе 0,15 мг/кг (в/б) вызывает повышение тканевого и внеклеточного содержания метаболита серотонина 5-гидроксииндолуксусной кислоты через 0,5, 2 и 24 ч после введения, что свидетельствует об активации серотонинергических систем мозга.

2. В дозе 0,6 мг/кг (в/б) семакс усиливает эффекты d-амфетамина на внеклеточное содержание дофамина в стриатуме мозга свободноподвижных крыс Спрег-Доули, а также на локомоторную активность мышей линии С57/Ы. Изменений в тканевом и

внеклеточном содержании дофамина и его метаболитов ДОФУК и ГВК при действии семакса не наблюдается.

3. В опытах in vitro на нейро-глиальной культуре клеток (Е16) мезенцефалона крыс при моделировании нейротоксического повреждения 6-гидроксидофамином семакс (0,1 мкМ) оказывает цитопротекторный эффект, проявляющийся в увеличении числа дофаминергических нейронов.

4. При моделировании дофамин- и серотонинергической нейротоксичности на мышах линии C57/bl семакс в дозах 0,15 и 0,6 мг/кг (в/б) проявляет умеренную нейропротекторную активность, частично ослабляя снижение тканевого содержания нейротрансмитгеров и их метаболитов в стриатуме, наблюдаемое при действии d-амфетамина и 5,7-дигидрокситриптамина.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

5,7-ДГТ - 5,7-дигидрокситриптамин; 5-ГИУК - 5-гидроксииндол-З-уксусная кислота; 5-НТ - серотонин 6-ОНДА - 6-гидоксидофамин; ВЭЖХ с ЭД - высокоэффективная жидкостная хромотография с электрохимической детекцией; ГВК - гомованилиновая кислота; ДА - дофамин; ДОФУК - 3,4-дигидроксифенилуксусная кислота; МФТП -1-мешл-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин; ТГ - тирозингидроксилаза; BDNF -нейротрофический фактор из мозга; NGF - фактор роста нервов;

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Еремин КО., Кудрин B.C., Раевский К.С. Изучение нейропротекторных свойств семакса на модели нейротоксичности, вызванной МРТР у мышей. Тезисы VIII Всероссийской школы молодых ученых «Актуальные проблемы нейробиологии». Казань, 2001. с. 34.

2. Еремин К.О., Кудрин B.C., Раевский КС. Изучение нейропротекторных свойств семакса и ноопепта на модели амфетаминовой нейротоксичности у мышей. Тезисы Всероссийской научной конференции «Нейрофармакология в XXI веке». Санкт-Петербург, 2002. Психофармакология и биологическая наркология, 2002,2(3-4), 394.

3. Еремин КО., Кудрин B.C., Андреева Л.А., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф., Раевский К.С. Влияние семакса на содержание и обмен моноаминов в мозге мышей линии С57/Ы. Нейрохимия, 2002,19(4), 269-272.

4. Еремин К.О., Кудрин B.C., Раевский К.С. Изучение нейропротекторных свойств семакса и ноопепта на модели дофаминергической нейротоксичности. II Съезд Российского Научного Общества Фармакологов «Фундаментальные проблемы фармакологии». Тезисы докладов. Москва, 2003. с. 177.

5. Еремин-КО., Кудрин B.C., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф., Раевский К. С. Влияние семакса на серотонинергические системы мозга животных. Российский симпозиум по химии и биологии пептидов. Тезисы докладов. Москва, 2003. с. 20.

6. Кудрин B.C., Еремин К.О., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф., Раевский КС. Влияние семакса на моноаминергические системы мозга. Научно-практическая конференция посвященная 40-летию медико-биологического факультета «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины». Тезисы докладов. Москва, 2003. с. 42.

7. Еремин КО., Кудрин B.C., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф., Раевский КС. Влияние семакса на дофамин- и серотонинергические системы мозга. Доклады академии наук, 2004,394(1), 130-132.

8. Еремин КО., Сарансаари П, Ойя С, Раевский КС. Семакс усиливает эффекты d-амфетамина на уровень внеклеточного дофамина в стриатуме крыс Спрег-Доули и на локомоторную активность мышей С57/Ь16. Экспериментальная и клиническая фармакология, 2004,67(2), 6-9.

9. Eremin K.O., Kudrin V.S., Oja S., Rayevsky K.S. Semax, an АСТН4-10) Analogue with Nootropic Properties, Activates Hypothalamic and Striatal Serotonergic Systems. Abstr of the XXTV СЮТ Congress, Paris, 2004. The International Journal of Neuropsychophannacology, 2004 (in press)

Подл, к веч. 29.03.2004 г. Заказ № 21/9 1 п. л. Формат 60x841/16. Тираж 120 эю.

Отпечатано:«ЮСК- полиграфия» г. Москва, ул. Краснобогатырская, д. 92 Тел.: 963-4111, 964-3139

" бззг

Одним из актуальных направлений современной нейропсихофармакологии является поиск и изучение веществ, стимулирующих когнитивные функции мозга, такие как внимание, познавательная деятельность, процессы обучения и памяти. Нарушения этих функций характерны для широкого круга неврологических и психических заболеваний, в том числе травматических повреждений мозга, цереброваскулярных расстройств, нейродегенеративных заболеваний центральной нервной системы, в частности, болезней Альцгеймера, Паркинсона и некоторых других. Для лечения когнитивных нарушений широкое применение получили ноотропные препараты, в том числе пирацетам и его аналоги [Воронина и Середенин, 1998]. Вместе с тем известно, что ноотропные средства не лишены ряда недостатков, в частности они оказались малоэффективными при лечении нарушений когнитивных функций, наблюдаемых при болезни Альцгеймера, шизофрении, некоторых психических и нейродегенеративных заболеваниях. Эти данные свидетельствуют о целесообразности поиска и создания новой генерации препаратов с ноотропной активностью. В связи с этим возникла необходимость создания и изучения механизма действия веществ, обладающих не только ноотропной, но и нейропротекторной активностью [Островская и соавт., 2002].

Известно, что в основе расстройств высших интегративных функций мозга, включая обучение и память, познавательную деятельность, может лежать нарушение функционирования важнейших нейромедиатрных систем мозга - глутаматергической, холинергической, ГАМК-ергической и других [Воронина и Середенин, 1998]. В настоящее время широкое распространение получили исследования направленные на создание эффективных модуляторов этих нейромедиаторных систем мозга.

Одним из оригинальных направлений нейробиологии и психофармакологии памяти и обучения явились исследования, показавшие важную роль пептидов семейства АКТГ/МСГ в регуляции мнестических процессов [de Wied, 1997]. Было показано, что некоторые из этих пептидов обладают также нейротрофическими и нейропротекторными свойствами [Darlington et al., 1996; Starowicz & Przewlocka, 2003]. Следует отметить, что меланокортины являются эндогенными веществами или их производными, образующимися в ЦНС, что, по-видимому, объясняет отсутствие у них выраженных побочных эффектов, низкую токсичность и хорошую переносимость. Хотя АКТГ и некоторые его аналоги проявляют ноотропные и нейропротекторные эффекты, в клинике они не нашли применения, что обусловлено, по-видимому, их недостаточно высокой стабильностью и, как следствие этого, короткой продолжительностью действия. В связи с этим предпринимались неоднократные попытки создания синтетических аналогов этих пептидов с более высокой устойчивостью к метаболической деградации эндогенными пептидазами организма. Одним из таких соединений явился аналог АКТГ 4-9 ORG 2766 (Met(02)-Glu-His-Phe-D-Lys-Phe-OH) с отсутствием гормональной активности и более выраженными эффектами на показатели памяти у животных по сравнению с АКТГ4-10 [de Wied, 1997]. ORG 2766 стал одним из эталонов при изучении эффектов аналогов АКТГ" на функции мозга. В ходе дальнейших модификаций структуры были получены более активные пептиды ORG 5042, НОЕ 427, которые проявляли активность также и при пероральном введении [Witter et al., 1975].

В совместных исследованиях Института молекулярной генетики РАН и кафедры физиологии человека и животных МГУ им.

М.В. Ломоносова было обнаружено, что модификация фрагмента АКТГ4-7 путем введения дополнительной аминокислотной последовательности Pro-Gly-Pro с С-конца молекулы приводит к значительному увеличению продолжительности действия пептида [Пономарева-Степная и соавт., 1984, 1986]. Результатом этих исследований явилось создание нового оригинального гептапептида -семакса (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), обладающего широким спектром нейротропной активности [Ашмарин и соавт., 1997]. К настоящему времени препарат используется в клинике в качестве ноотропного средства для улучшения процессов обучения и памяти у человека [Ашмарин и соавт., 1997; Kaplan et al., 1996], в качестве нейропротекторного средства при комплексной терапии острого полушарного ишемического инсульта [Гусев и соавт., 1997, Мясоедов и соавт., 1999], в отдаленном периоде у больных с постгипоксической патологией мозга, страдающих мнестическими расстройствами [Алексеева и соавт., 1999], а также в офтальмологии при патологии зрительного нерва [Полунин и соавт., 2000; Курышева и соавт., 2001]. В последствии были обнаружены и другие эффекты семакса, такие как антиульцерогенный [Ашмарин, 2001; Иваников и соавт., 2002; Жуикова и соавт., 2002], анальгетический [Королева и соавт., 1996; Иванова и соавт., 2003] и антитромботический [Ашмарин и соавт., 1996, Ашмарин, 2001]. Таким образом, результаты приведенных исследований свидетельствуют о том, что семакс обладает широким профилем терапевтической активности и находит применение в разных областях медицины.

Вместе с тем, необходимо отметить, что механизмы, лежащие в основе терапевтических эффектов семакса при мнестических и нейродегенеративных расстройствах до настоящего времени остаются недостаточно изученными. В частности, это относится к механизмам взаимодействия семакса с нейромедиаторными системами мозга. Из литературы известно о наличии тесных анатомических и функциональных связей между меланокортиновой и моноаминергическими системами мозга [Florijn et al., 1993; Drago et al., 1999; Lindblom et al., 2001]. He вызывает сомнения также участие серотонинергической и дофаминергической систем мозга в процессах памяти и нейрональной пластичности [Кругликов и соавт., 1991; Раевский, 1998; Barros et al., 2003; Jay, 2003]. Несмотря на наличие у семакса антиишемических и антигипоксических свойств, нейропротекторная активность пептида на нейротоксических моделях повреждения мозга не исследовались. Таким образом, можно заключить, что нейрохимические механизмы как антиамнестического, так и нейропротекторного действия остаются до настоящего времени недостаточно изученными.

Исходя из вышеизложенного, целью данной работы явилось изучение влияния семакса (AKTT4-7-Pro-Gly-Pro) на нейрохимические характеристики серотонин- и дофаминергических систем мозга, а также оценка возможной нейропротекторной активности пептида на моделях дофамин- и серотонинергической нейротоксичности в условиях in vitro и in vivo.

В соответствии с указанной целью, были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние семакса на нейрохимические характеристики серотонинергических систем мозга животных: тканевое и внеклеточное содержание серотонина и его метаболита 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК) в гипоталамусе и стриатуме мозга животных.

2. Исследовать эффекты семакса на нейрохимические параметры дофаминергической системы мозга: тканевое и внеклеточное содержание дофамина и его метаболитов 3,4-дигидроксифенилуксусной (ДОФУК) и гомованилиновой кислот (ГВК) в стриатуме, а также способность семакса модулировать психостимулирующее действие d-амфетамина.

3. Оценить возможную нейропротекторную активность семакса в нейрональной и нейро-глиальной культурах, полученных из эмбрионального среднего мозга крыс (Е16), при моделировании цитотоксического повреждения, обусловленного 6-гидроксидофамином (6-ОНДА) in vitro.

4. Оценить нейропротекторные свойства семакса на моделях дофаминергической нейротоксичности, вызванной 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридином (МФТП) и d-амфетамином на мышах линии С57/Ы.

5. Изучить нейропротекторные свойства семакса на модели серотонинергической нейротоксичности, вызванной внутримозговым введением 5,7-дигидрокситриптамина (5,7-ДГТ) на мышах линии С57/Ы.

Научная новизна

При изучении эффектов семакса на нейрохимические показатели моноаминергических систем мозга впервые показано, что семакс вызывает активацию серотонинергических систем мозга, которая проявляется в повышении тканевого и внеклеточного содержания метаболита серотонина 5-ГИУК через 30 мин, 2 и 24 ч после введения пептида. В микродиализных исследованиях на свободноподвижных крысах обнаружено свойство семакса усиливать эффект d-амфетамина, проявляющийся в повышении внеклеточной концентрации дофамина в диализатах стриатума, что свидетельствует об усилении дофаминергической нейропередачи в этих условиях. Потенцирующее влияние семакса на психостимулирующие эффекты d-амфетамина проявляется также в экспериментах с регистрацией локомоторной ' активности мышей линии С57/Ы.

Впервые проведено исследование нейропротекторной активности семакса с использованием моделей дофамин- и серотонинергической нейротоксичности in vitro и in vivo. Выявлен цитопротекторный эффект семакса в нейро-глиальной культуре клеток мезенцефалона крыс (Е16) in vitro при их нейротоксическом повреждении 6-гидроксидофамином, который, однако, не проявляется в нейрональной культуре клеток, I полученных из того же отдела мозга. На моделях дофамин- и i серотонинергической нейротоксичности на мышах линии С57/Ы ex vivo выявлены умеренные нейропротекторные эффекты семакса в стриатуме при воздействии d-амфетамина (р<0,1) и 5,7-дигидрокситриптамина (р<0,05).

Научно-практическая значимость

Полученные в работе данные расширяют представления о нейрохимических и нейропротекторных свойствах семакса, а также вносят существенный вклад в понимание нейрохимических основ механизма действия семакса как оригинального нейротропного средства, j Результаты, полученные в диссертационной работе, раскрывают новый аспект механизма- действия, семакса. - его способность - усиливать -действие веществ, активирующих дофаминергическую передачу в мозге. Обнаружено также свойство семакса оказывать позитивное модулирующее влияние на серотонинергическую передачу в структурах мозга. Эти данные могут послужить основой для разработки новых стратегий терапии дофамин- и серотониндефицитных патологий центральной нервной системы. I

I I

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

выводы

1. Семакс (AKTT4-7-Pro-Gly-Pro) в дозе 0,15 мг/кг (в/б) вызывает повышение тканевого и внеклеточного содержания метаболита серотонина 5-гидроксииндолуксусной кислоты через 0,5, 2 и 24 ч после введения, что свидетельствует об активации серотонинергических систем мозга.

2. В дозе 0,6 мг/кг (в/б) семакс усиливает эффекты d-амфетамина на внеклеточное содержание дофамина в стриатуме мозга свободноподвижных крыс Спрег-Доули, а также на локомоторную активность мышей линии С57/Ы. Изменений в тканевом и внеклеточном содержании дофамина и его метаболитов ДОФУК и ГВК при действии семакса не наблюдается.

3. В опытах in vitro на нейро-глиальной культуре клеток (Е16) мезенцефалона крыс при моделировании нейротоксического повреждения 6-гидроксидофамином семакс (0,1 мкМ) оказывает цитопротекторный эффект, проявляющийся в увеличении числа дофаминергических нейронов.

4. При моделировании дофамин- и серотонинергической нейротоксичности на мышах линии С57/Ы семакс в дозах 0,15 и 0,6 мг/кг (в/б) проявляет умеренную нейропротекторную активность, частично ослабляя снижение тканевого содержания нейротрансмиттеров и их метаболитов в стриатуме, наблюдаемое при действии d-амфетамина и 5,7-дигидрокситриптамина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Поиск и изучение веществ, стимулирующих когнитивные функции мозга: внимание, познавательная деятельность, процессы обучения и памяти, а также обладающих нейропротекторными свойствами является, несомненно, одним из актуальных направлений современной фармакологии. Такие вещества находят широкое применение при лечении нарушений мнестических функций, наблюдающихся при целом ряде патологических состояний ЦНС, таких как травмы мозга, цереброваскулярные расстройства различного генеза (ишемия, инсульт), постгипоксические энцефалопатии, нейроинфекции, хронический алкоголизм, нейродегенеративные заболевания ЦНС. Несмотря на определенные успехи в лечении мнестических расстройств, следует признать, что применяемая при этих состояниях терапия в ряде случаев является недостаточно эффективной. Так, известно, что ноотропные препараты, в частности, пирацетам и его аналоги малоэффективны в терапии когнитивных расстройств при шизофрении, болезни Альцгеймера и некоторых других.

Наряду с многочисленными попытками использования препаратов, воздействующих на глутаматергические, холинергические и ГАМК-ергические системы мозга, с целью коррекции когнитивных нарушений, связанных с дисфункцией этих нейромедиаторных систем, в последние годы внимание исследователей было привлечено к другой группе нейромодуляторов -пептидам семейства АКТГ/МСГ, в частности АКТГ4-10 и его производным, лишенным гормональной активности [de Wied, 1997, Adan & Gispen, 2000]. Эти исследования показали, что пептиды указанной группы способны улучшать процессы памяти и обучения, однако в связи с метаболической нестабильностью и связанной с этим короткой продолжительностью действия эти пептиды не нашли клинического применения.

Одновременно группа исследователей из Института молекулярной генетики РАН и биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова установили, что направленная химическая модификация молекулы АКТГ4-7, путем введения в ее структуру последовательности Pro-Gly-Pro с С-конца пептида позволяет получить соединение с высокой нейротропной активностью и достаточной длительностью фармакологического эффекта. Было установлено, что группировка Pro-Gly-Pro обеспечивает защиту молекулы пептида от метаболической деградации эндогенными пептидазами [Пономарева-Степная и соавт., 1984]. Указанный гептапептид получил название семакса, химически представляющего собой Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro, и в настоящее время широко используется в клинике.

В большом числе экспериментальных и клинических работ, посвященных изучению фармакологических свойств пептида, было показано, что препарат обладает высокой ноотропной и нейропротекторной активностью [Ашмарин и соавт., 1997; Гусев и соавт, 1997; Мясоедов и соавт, 1999; Фадюкова и соавт., 2001 и др.]. Несмотря на большое число фактов, убедительно демонстрирующих терапевтические эффекты семакса при разных патологических состояниях, механизмы действия пептида, в частности, влияние на нейромедиаторные системы мозга остаются малоизученными. В связи с этим целью данного исследования явилось изучение влияния семакса (AKTr4-7-Pro-Gly-Pro) на нейрохимические характеристики серотонин- и дофаминергических систем мозга, а также оценка возможной нейропротекторной активности пептида на моделях дофамин- и серотонинергической нейротоксичности в условиях in vitro и in vivo.

При изучении влияния семакса на нейрохимические характеристики серотонинергических систем мозга было обнаружено, что пептид в дозе 0,15 мг/кг при однократном системном введении вызывает активацию серотонинергических процессов мозга. Так, тканевое содержание основного метаболита серотонина 5-гидроксииндолукустной кислоты (5-ГИУК) в гипоталамусе мышей линии С57/Ы повышалось через 30 мин и 2 ч, соответственно, на 16 и 30% по отношению к контролю (р<0,05). В то же время тканевое содержание серотонина в этих условиях не изменялось. Аналогичные эффекты в стриатуме обнаруживаются не только через 2 ч, но и через 24 ч после введения семакса, что согласуется с данными о длительном характере эффектов пептида [Ashmarin et al., 1995; Ашмарин и соавт., 1997].

Внеклеточный уровень метаболита серотонина 5-ГИУК в стриатуме свободноподвижных крыс Спрег-Доули в условиях микродиализного эксперимента постепенно повышался, достигая 180% по отношению к контролю (р<0,01) через 4 ч после введения пептида в дозе 0,15 мг/кг (в/б). Эксперименты с использованием ингибитора декарбоксилазы 1-ароматических аминокислот NSD 1015 не выявили значимого изменения скорости биосинтеза серотонина в структурах мозга in vivo.

Механизмы, с помощью которых семакс вызывает активацию серотонинергической системы до настоящего времени не выяснены. Обнаружено, что многие серотонинергические ядра могут коэкспрессировать меланокортиновые (МС) рецепторы [Adan & Gispen, 1997]. С другой стороны, наличие у семакса свойств антагониста меланокортиновых МС4 и МС5 рецепторов [Adan et al., 1994] позволяет предположить, что изменение активности меланокортиновой системы при действии семакса может модулировать активность серотонинергических процессов, в частности, вызывать их активацию. Данное предположение подтверждается результатами работы [Chaki et al., 2003 а] в которой обнаружено, что антагонист МС4 рецепторов MCL0129, проявляющий свойства антидепрессанта, может повышать активность серотонинергических систем мозга. Эффекты исследуемого пептида на серотонинергические системы мозга позволяют предположить у семакса наряду с известными ноотропными свойствами, наличие других центральных эффектов, в частности антидепрессантного действия. Так, известно, что семакс проявляет анальгетические свойства в эксперименте [Иванова и соавт., 2003] и в клинике [Королева и соавт., 1996].

При исследовании влияния семакса на нейрохимические характеристики дофаминергической системы стриатума выраженных эффектов пептида обнаружено не было. Так семакс при однократном введении в дозах 0,15 и 0,6 мг/кг (в/б) не изменял тканевое содержание дофамина и его метаболитов в стриатуме мышей линии С57/Ы. Не было также обнаружено изменений внеклеточных уровней дофамина и его метаболитов ДОФУК и ГВК в стриатуме свободноподвижных крыс Спрег-Доули при введении семакса в дозах 0,15 и 0,6 мг/кг (в/б). Эксперименты с использованием ингибитора декарбоксилазы 1-ароматических аминокислот NSD 1015 также не выявили значимых изменений скорости биосинтеза дофамина in vivo.

В условиях хронического (1 нед) введения семакса в дозе 0,6 мг/кг (в/б) наблюдается достоверное снижение тканевого содержания дофамина и ДОФУК на 15% и 25% по отношению к контролю, соответственно. Эти изменения могут быть обусловлены как замедлением оборота дофамина, так и изменениями в аффинности или плотности дофаминовых рецепторов.

Можно предположить, что эффекты семакса на дофаминергические системы мозга, в основном, проявляются в условиях ее гипер- и/или гипоактивности. В наших экспериментах было обнаружено, что семакс оказывает потенцирующее действие на дофаминергические системы стриатума, активированные d-амфетамином. Так, d-амфетамин в дозе 5 мг/кг (в/б) вызывал значительное повышение внеклеточного уровня дофамина в стриатуме свободноподвижных крыс Спрег-Доули с максимумом через 20-40 мин после введения. Максимальные пиковые концентрации дофамина в диализате достигали уровня 20 пмоль/мл, что приблизительно в 20 раз выше базального уровня. При предварительном введении семакса в дозе 0,6 мг/кг (в/б) за 20 мин до d-амфетамина внеклеточный уровень дофамина оказался достоверно более высоким по сравнению с эффектами одного d-амфетамина (ANOVA, р<0,05). Максимальные внеклеточные концентрации дофамина при комбинированном введении препаратов достигали уровня 36-38 пмоль/мл, что приблизительно в 1,8-2 раза выше соответствующих пиковых уровней дофамина при введении только d-амфетамина.

С целью дальнейшего анализа потенцирующего эффекта пептида были выполнены эксперименты по оценке влияния семакса и d-амфетамина при их совместном применении на локомоторную активность мышей линии С57/Ы, которая, как известно, связана с высвобождением дофамина в стриатуме и прилежащем ядре. Обнаружено, что при комбинированном применении семакса (0,6 мг/кг, в/б) и d-амфетамина (2 мг/кг, в/б) наблюдалось достоверное (р<0,05) повышение локомоторной активности мышей по сравнению с животными, которым вводили только d-амфетамин. Так, d-амфетамин в дозе 2 мг/кг (в/б) вызывал значительное увеличение двигательной активности мышей, которая достигала уровня 182±18% по сравнению с показателями предыдущей посадки (р<0,01). В то время, как локомоторная активность животных при последовательном введении семакса и d-амфетамина достигала уровня 261 ±30% по сравнению с соответствующими данными предыдущей посадки, что значимо (р<0,05) отличается от эффектов одного психостимулятора.

Представляется логичным предположить, что эффекты взаимодействия семакса и d-амфетамина могут быть следствием изменений пластичности дофаминергических систем мозга, в частности, нигростриатной и мезолимбической. Молекулярная природа таких изменений до настоящего времени остается неясной. Вместе с тем, логично предположить участие в этих процессах нейротрофических факторов. Так, в последнее время получены убедительные доказательства вовлечения нейротрофических факторов в модуляцию дофаминергической нейропередачи в мозге. Показано, например, что BDNF дозозависимо усиливает высвобождение дофамина в мезенцефалической культуре нейронов in vitro [Blochl & Sirrenberg, 1996]. Известно, что эффекты BDNF опосредуются специфическими рецепторами тирозинкиназы В (TrkB) [Minichiello et al., 1999, 2002; Postigo et al., 2002], которые коэкспрессируются, в частности, на дофаминергических нейронах черной субстанции [Blochl & Sirrenberg, 1996]. Все эти данные свидетельствуют о том, что BDNF может модулировать дофаминергическую передачу в мозге через TrkB рецепторы. Обнаружено, что предварительное введение антител к BDNF или к TrkB в прилежащее ядро вызывает дозозависимое снижение внеклеточного уровня дофамина в прилежащем ядре, а также локомоторной активности крыс Спрег-Доули в условиях гиперактивации дофаминергической системы, вызванной метамфетамином [Narita et al., 2003].

В недавних исследованиях выявлено, что семакс стимулирует экспрессию нейротрофических факторов BDNF и NGF как в глиальной культуре клеток in vitro [Shadrina et al., 2001], так и в некоторых структурах мозга крыс in vivo [Долотов и соавт., 2003].

Таким образом, в связи с вышесказанным, мы предполагаем, что потенцирование семаксом психостимулирующих эффектов d-амфетамина, вероятнее всего, связано с активацией экспрессии нейротрофических факторов BDNF и NGF [Shadrina et al., 2001; Долотов и соавт., 2003], что проявляется в изменении пластичности дофаминергической нейропередачи. Конкретным следствием этих изменений является усиление процесса высвобождения дофамина и, соответственно, большая выраженность поведенческих эффектов психостимулятора.

Далее были изучены нейропротекторные свойства семакса на моделях нейротоксического повреждения in vitro и in vivo. Повреждение дофаминергических нейронов вызывали воздействием специфического нейротоксина 6-ОНДА на первичные нейрональные и нейро-глиальные культуры клеток in vitro, полученные из эмбрионального мозга крыс Вистар. 6-ОНДА в концентрациях 2 и 5 мкМ через 24 ч вызывал гибель, соответственно, 30 и 80% ТГ-иммунореактивных нейронов. При предварительном за 30 мин или за 24 ч добавлении семакса (0,1 и 1 мкМ) к нейрональной культуре клеток повышения выживаемости дофаминергических нейронов обнаружено не было. Однако, в нейро-глиальной культуре клеток среднего мозга крыс Вистар семакс (0,1 мкМ), добавленный за 30 мин до 6-ОНДА (5 мкМ), значительно (р<0,05) повышал выживаемость дофаминергических нейронов (+30% по сравнению с контролем).

Полученные результаты свидетельствуют о существенной роли глиального окружения в поддержании жизнеспособности дофаминергических нейронов в присутствии семакса в условиях 6-ОНДА-вызванного повреждения. Выявленные в наших опытах цитопротекторные эффекты пептида, могут быть обусловлены повышением уровня нейротрофических факторов, таких как NGF, BDNF [Shadrina et al., 2001; Долотов и соавт., 2003] и GDNF, которые обладают выраженными нейропротекторными свойствами и могут препятствовать гибели дофаминергических нейронов [Spina et al., 1992; Eggert et al., 1999; Kawamata et al., 2003].

При моделировании повреждения дофамин- и серотонинергических систем мозга мышей линии С57/Ы in vivo с помощью специфических нейротоксинов (МФТП, d-амфетамин, 5,7-ДГТ) был обнаружен умеренный нейропротекторный эффект семакса в дозе 0,6 мг/кг (в/б) в условиях его хронического введения. Так, семакс уменьшал снижение тканевого содержания дофамина, ДОФУК и серотонина в стриатуме, вызванное введением d-амфетамина (5 мг/кг х 4, в/б) и 5,7-ДГТ (50 мкг, в латеральный желудочек мозга), соответственно. Однако, в условиях МФТП-вызванного повреждения дофаминергических нейронов стриатума защитный эффект пептида не проявлялся, что, по-видимому, может быть обусловлено преимущественно некротическим характером гибели нейронов в данных условиях [Choi et al., 1999 a, b; Soldner et al., 1999; Lotharius et al., 1999]. Можно предположить, что выявленные нами эффекты пептида связаны с активацией нейротрофических факторов, в частности NGF и BDNF [Shadrina et al., 2001; Долотов и соавт., 2003], которые, как было недавно показано, предупреждают гибель нейронов на различных моделях нейротоксического повреждения мозга [Spina et al., 1992; Eggert et al., 1999; Kawamata et al., 2003].