Молекулярно-генетические подходы к пептидной фармакотерапии нейродегенеративных заболеваний

Гривенников, Игорь Анатольевич

Диссертации по медицине → Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Молекулярно-генетические подходы к пептидной фармакотерапии нейродегенеративных заболеваний

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Гривенников, Игорь Анатольевич Москва 2006 г.

Ученая степень: доктора биологических наук

ВАК РФ: 14.00.25

Автореферат диссертации по медицине на тему Молекулярно-генетические подходы к пептидной фармакотерапии нейродегенеративных заболеваний

На правах рукописи

ГРИВЕННИКОВ ИГОРЬ АНАТОЛЬЕВИЧ

"Молекулярнонгенетические подходы к пептидной фармакотерапии нейродегенеративных заболеваний"

Специальность: 14.00.25 - Фармакология, клиническая фармакология 03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 2006 г.

Работа выполнена в Отделе химии физиологически активных веществ и Отделе вирусной и клеточной молекулярной генетики Института молекулярной генетики РАН.

Научные консультанты:

академик РАН, проф.

д.б.н., проф.

Н.Ф. Мясоедов В.З. Тарантул

Официальные оппоненты:

д.б.н. чл-корр. РАН, проф. д.б.н., проф.

Т.А. Гудашева С.Н. Кочетков В.Б. Кошелев

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский Государственный Медицинский Университет» Росздрава.

Защита диссертации состоится " ^ " ЫЮ^сР 2006 года в часов на

заседании диссертационного совета Д 001.024.01 при ГУ НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, Балтийская ул. 8,125315 Москва.

С диссертацией можно ознакомиться в Ученой части ГУ НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, Балтийская ул. 8,125315 Москва.

Автореферат разослан " <£(С1<% 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н.

.А. Валь дм ан

ВВЕДЕНИЕ

Создание новых эффективных и безопасных фармакологических средств повышения эффективности умственного труда в сложных условиях и коррекции патологий центральной нервной системы (ЦНС), включая нейродегенеративные заболевания, особенно актуально в современную эпоху, которая характеризуется повышением влияния стрессогенных факторов на организм человека (Середенин, 2006), а также ухудшением экологической обстановки во многих областях земного шара. Длительное психическое напряжение, сопряженное с указанными выше факторами, постоянно сопровождает многие современные сферы деятельности человека, несмотря на постоянное совершенствование их технического обеспечения, и приводит к повреждению и гибели нервных, клеток. Развитие нейродегенеративных процессов в ЦНС также связано с различными патологиями, наследственной предрасположенностью и черепно-мозговыми травмами. Доля нейродегенеративных заболеваний в общей структуре заболеваемости возрастает при увеличении продолжительности жизни (Lewko, 2002). Наиболее распространенными являются болезнь Альцгеймера (Гаврипова и соавт., 1999; Lcmdrigan et. al, 2005) и инсульты (Гусев, Скворцова, 2001). Инсульты, по нашему мнению, могут бьггь отнесены к нейродегенеративным заболеваниям в связи с массовой гибелью клеток, в частности нейронов, в ЦНС. В настоящее время количество людей в мире, страдающих болезнью Альцгеймера, составляет по разным оценкам до 10 миллионов человек. По прогнозам, в случае, если ученые не найдут средство против этой болезни, уже через 25 лет от этого недуга будут страдать 22 миллиона жителей нашей планеты, а через 50 лет примерно 45 миллионов (Cole, 2005). Сходная ситуация с инсультами. Ежегодно в мире переносят инсульт около 6 миллионов человек, умирает 4,7. миллиона. В России в год регистрируется до 450 тысяч инсультов, причем большинство из них относятся к тяжелой и средней степени тяжести (Гусев, Скворцова, 2001). Лишь около 20% выживших больных могут вернуться к прежней работе.

Современная медицина располагает довольно широким перечнем соединений, обладающих определенным нейропротекторным действием, таких как модуляторы ионных каналов, соединения с анти-эксайтотоксическим действием, противовоспалительные агенты, соединения, понижающие уровень свободных радикалов, нейротрофические факторы (Lewko, 2002). Однако ни одно из них не сочетает одновременно высокую эффективность, длительность действия, быстроту наступления эффекта и отсутствие негативного последействия. Большие надежды на успехи в лечении инсультов, болезни Альцгеймера и

других нейродегенеративных заболеваний связывают в перспективе с клеточной и генной терапией (Угрюмое, 2000).

В поисках более эффективных и одновременно безопасных средств ученые обращаются к возможному использованию эндогенных регуляторов организма или близких их аналогов. В первую очередь внимание исследователей привлекают регуляторные пептиды (РП). Открытые еще в прошлом веке, они являются, как сейчас становится понятным, прямо или опосредованно, универсальными регуляторами всех физиологических процессов протекающих в живом организме. Общепринятым является представление о так называемом функциональном континууме РП (Агимарин и соавт., 1994; 2002; 2006). Согласно этой . концепции физиологическая функция модулируется достаточно большим количеством РП, как родственных по структуре, так и относящихся к разным семействам; в то же время каждый РП способен модулировать очень большой, хотя и вполне определенный спектр функций. Трактовка эффектов РП осложняется также тем обстоятельством, что, кроме прямого действия, многие из них оказывают влияние на синтез других РП. При этом каждый РП сохраняет свою "индивидуальность", обладая в целом уникальным спектром биоактивности.

Все эти особенности системы РП позволяют выделить два принципиально важных направления реализации их лечебно-профилактического потенциала при коррекции различных патологий ЦНС. Во-первых, использование наиболее рациональных комплексов РП, сложившихся в процессе эволюции живых существ. Во-вторых, наиболее полное раскрытие и адекватное использование спектров активности каждого РП. Кроме исследования спектров активности РП, избранных для практической реализации,-необходимо преодоление такого свойства большинства из них, как быстрота их распада во внутренних средах организма. Это требует создания стабилизированных аналогов соответствующих РП, либо создания пептидомиметиков (близких по действию непептидных соединений).

Одним из интересных и перспективных РП являются пептиды семейства меланокортинов, которое включает N-концевые фрагменты адренокортикотропного гормона, альфа-, бета-, гамма- меланоцитстимулирующие гормоны (МСГ) и их синтетические аналоги. Изучение функций этих пептидов выявило наличие у них способности модулировать такие процессы ЦНС как обучение, формирование памяти, внимание, а также различные формы поведения (De Wied, 1982). Кроме того, данные пептиды проявляют нейропротекторные и нейрорегенеративные активность как в центральной, так и в периферической нервной системе (Antonawich, 1994). Таким образом, меланокортины проявляют комплекс ноотрошгых и нейротрофических свойств, что в совокупности со

способностью некоторых из них проникать через гематоэнцефалический барьер делает данное пептидное семейство перспективным с точки зрения их медицинского применения.

Единственный клинически применяемый в настоящее время синтетический представитель семейства меланокортинов, Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), разработанный в Институте молекулярной генетики РАН В.Н. Незавибатько с сотр. (.Пономарева-Степная и со авт., 1984) также проявляет аналогичный комплекс свойств. Исследование активности Семакса в экспериментах на животных выявило его способность стимулировать процессы обучения, внимания и запоминания, что нашло в дальнейшем подтверждение в клинических испытаниях Семакса, подтвердивших его способность стимулировать эти процессы и у человека. Клиническое применение Семакса («Семакс-0.1% раствор») выявило его эффективность при лечении травм мозга, расстройств внимания и обучения и ряда других заболеваний ЦНС различного происхождения (Аишарин и соавт., 1997).

Несмотря на имеющиеся сведения о нейротрофических свойствах меланокортинов и характеристике их рецепторов, механизмы их действия во многом остаются неясными (Van der Kraan, 1999; Adán. 2000). Поэтому в настоящей работе основное внимание было уделено следующим аспектам:

1. Исследованию молекулярно-гепетических механизмов действия аналогов меланокортинов (на примере пептида Семакс) на клетки ЦНС млекопитающих с целью создания на их основе фармакологических препаратов с нейропротекторной активностью, которые могут быть использованы для лечения инсультов и других нейродегенеративных заболеваний (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона). Особое внимание было уделено взаимосвязи между эффектами меланокортинов и изменениями в уровне экспрессии генов ряда нейротрофических факторов: NGF (фактор роста нервов), BDNF (нейротрофический фактор, выделенный из мозга) в клетках ЦНС.

2. Созданию на основе как первичных клеточных культур, полученных из мозга млекопитающих, так и генетически модифицированных эукариотических клеток, модельных систем для скрининга соединений с потенциальной нейропротекторной активностью, представляющих фармакологический интерес.

моделирующих различные заболевания человека in vitro. В настоящей работе представлены данные по созданию клеточных моделей, имеющих отношение к процессам нейродегенсрации, протекающей в мозге при развитии болезни Альцгеймера, с использованием нормального и мутантного гена пресенилина-1 человека {Sherrington, Rogaev et al., 1995). С мутациями в этом гене связывают возникновение существенной части случаев ранней семейной (наследственной) формы болезни Альцгеймера (Alzheimer's Disease Collaborative Group, 1997).

Актуальность настоящей работы связана с отсутствием в мировой клинической практике стандартизованных препаратов пептидной природы, способных предотвращать гибель нервных клеток (в частности нейронов различной ергичности) (Gozes, 2001). Кроме того, на наш взгляд, лучшее понимание молекулярных механизмов действия Семакса, как представителя семейства меланокортинов, а также разработка клеточных моделей для широкомасштабного скрининга соединений с потенциальной нейропротекторной активностью, не только расширит спектр его возможного применения в клинической практике, но и приведет в перспективе к созданию других эффективных нейропротекторов.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ НАСТОЯЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Цели:

1. Исследовать молекулярно-генетические механизмы действия аналогов меланокортинов

(на примере пептида Семакс) на клетки ЦНС млекопитающих с целью создания на их основе фармакологических препаратов с нейропротекторной активностью.

2. На основе первичных культур клеток нервной системы, а также генетически модифицированных клеточных линий создать клеточные модели, позволяющие оценивать и отбирать соединения с целью последующего их использования для фармакотерапии нейродегенеративных заболеваний нервной системы, таких как инсульты, болезни Альцгеймера, Паркинсона и др.

Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:

1. Изучить способность Семакса и других представителей семейства меланокортинов предотвращать гибель нейронов различной ергичности в первичных культурах, полученных из мозга крысы.

2. Исследовать возможность существования специфических центров связывания Семакса ' на плазматических мембранах, полученных из мозга крысы, и изучить основные характеристики его связывания.

3. Изучить способность Семакса стимулировать в клетках ЦНС экспрессию ряда нейротрофинов как на уровне мРНК, так и белка, как промежуточной стадии его

нейропротекторного действия.

4. Исследовать возможность участия митогец-активируемых протеинкиназ (МАР-киназ) и гена быстрого ответа c-fos в механизме передачи сигнала от Семакса внутрь клетки.

5. Создать клеточную модель, основанную на использовании первичных культур нервных и глиальных клеток, которая позволяет проводить отбор соединений с нейропротекторной активностью, представляющих фармакологический интерес.

6. Оценить нейропротекторные свойства Семакса in vitro в модельных системах:

а) в системе индуцированной с помощью 6-гидроксидофамина (6-ГДА) цитотоксичности в первичных клеточных культурах;

б) в культуре клеток феохромоцитомы крысы линии PC 12, трансфицированных нормальным и мутантным геном пресенилина-1 человека, принимающим участие в патогенезе ранней семейной формы болезни Альцгеймера.

7. На основе полученных результатов разработать рекомендации по проведению предклинических и клинических исследований пептида Семакс с целью создания на его основе лекарственного препарата с нейропротекторным действием.

Научная новизна работы.

Впервые доказано существование специфических центров связывания для Семакса на плазматических мембранах базальных ядер переднего мозга крысы и получены характеристики его связывания. Изучена его биодеградация в присутствии плазматических мембран, первичных культур клеток нейронов и глии, полученных из базальных ядер переднего мозга крысы. Установлено влияние Семакса на выживаемость холинергических и дофаминергических нейронов, полученных из эмбрионального мозга крысы, при отсутствии его эффекта на жизнеспособность ГАМК-ергических нейронов. Впервые выявлено стимулирующее влияние Семакса на экспрессию мРНК для нейротрофинов: BDNF и NGF в первичных глиальных культурах, полученных из базальных ядер переднего мозга крысы. Установлено проникновение Семакса в мозг крысы при интраназальном введении и обнаружено его влияние в ряде отделов мозга на экспрессию BDNF и его рецепторов как на уровне мРНК, так и белка, что указывает на отделоспецифичность действия этого пептида. Полученные результаты подтверждают гипотезу о том, что регуляция экспрессии нейротрофинов и/или их рецепторов в клетках мозга является одним из этапов нейропротекторного действия меланокортинов и их аналогов. Установлена вовлеченность МАР-киназ и гена быстрого ответа c-fos в механизм передачи сигнала от Семакса внутрь клетки. Выявлены нейропротекторные свойства Семакса in vitro в двух модельных системах: а) в системе индуцированной с помощью 6-ГДА цитотоксичности в первичных клеточных

культурах; б) в культуре клеток феохромоцитомы крысы линии PC 12, трансфицированных нормальным и мутантным геном пресенилина-1 человека, принимающим участие в патогенезе ранней семейной формы болезни Альцгеймера. В совокупности, полученные данные расширяют наши представления о молекулярных механизмах действия представителей пептидного семейства меланокортинов и их функциях в ЦНС.

Научпо-практнческая значимость работы.

Разработанные и использованные клеточные модели рекомендованы для скрининга фармакологических препаратов с потенциальной нейропротекторной активностью. Полученные в настоящей работе результаты обосновывают перспективность использования системы нейротрофинов и их рецепторов в качестве мишени для поиска лекарственных препаратов с пейропротекторной активностью. На основе результатов выполненного исследования создан оригинальный отечественный лекарственный препарат «Семакс капли назальные 1%» (Патент N 2124365 «Способ лечения ишемического инсульта»), предназначенный для лечения острого периода ишемического инсульта и утвержденный к применению Фармакологическим комитетом Министерства здравоохранения РФ 29 марта 2001 года, протокол № 5. Обнаруженные нейропротекторные свойства Семакса позволили рекомендовать его при лечении таких нейродегенеративных заболеваний как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.

Апробация работы.

Основные положения работы были представлены на Российских и международных научных конференциях, симпозиумах, съездах, в том числе: International Symposium "Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds" (Квебек, Канада, 1991), Society for Neuroscience USA Meeting (США, 1995, 1997), Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2001), VIII-ом Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001), European Society for Neurochemistry Conference on "Advances in molecular mechanisms of neurological disorders" (Перуджа, Италия, 2001), Российском съезде биохимиков и молекулярных биологов (Санкт-Петербург, 2002), Международном симпозиуме "Neuron Differentiation and Plasticity - Regulation by Intercellular Signals" (Москва, 2003), International Symposium "Neurodegeneration and Neurorepair" (Магдебург, Германия, 2003), Russian-German Symposium "Chemistry and Biology of Peptides" (Фридрихрода, Германия, 2003) Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003; Санкт-Петербург, 2005), Conference of International Society for Neurochemistry "Changes in Neuronal Gene Expression and CNS Drug Responce" (Авиньон, Франция, 2004) и ряде других. В завершенном виде результаты диссертационной работы были представлены

на заседаниях Ученого совета ГУ НИИ фармакологам РАМН им. В.В. Закусова (сентябрь 2005 г.) и Ученого совета Института молекулярной генетики РАН (декабрь 2005 г.)

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН. В работе принимали участие коллеги из Медицинской школы Р.В. Джонсона (Пискатавей, США), Университета Ульма (Ульм, Германия), Университета Лейпцига (Лейпциг, Германия), Кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, ГУ НИИ фармакологии РАМН им. В.В. Закусова, Центра психического здоровья РАМН. Вклад отечественных и зарубежных коллег отражен в публикациях по теме диссертации. Автор выражает благодарность всем коллегам, принимавшим участие в выполнении работы и в обсуждении ее результатов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российской академии наук, Российского фонда фундаментальных исследований, Министерства образования и науки РФ, ИНТАС, Фонда Макдонелла (США) и Фонда ДААД (Германия).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 37 статей, 25 тезисов в материалах российских и международных конференций; получено 3 патента.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 2 страницах машинописного текста, включает 8 таблицы н ^^рисунков. Библиография включает наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Приготовление, хранение и проверка чистоты препаратов Семакса и других пептидов. Синтез и мечение тритием гептапептида Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), а также некоторых его фрагментов проводилось в Отделе химии физиологически активных веществ (ОХФАВ) Института молекулярной генетики (ИМГ) РАН. Чистота пептидных препаратов проверялась методами тонкослойной хроматографии и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Пептиды растворяли в воде или фосфатно-солевом растворе (PBS) в концентрациях от 1 до 10 мМ и фильтровали через фильтр 0,22 мкм. Растворы пептидов хранили при -70°С.

Выделение плазматических мембран из мозга крысы. Выделение плазматических мембран мозга проводили по методу Грэя и Виттакера с некоторыми модификациями (Gray et ah, 1962). Назальные ядра переднего мозга крысы гомогенизировали в гомогенизаторе тефлон-стекло, и с помощью последовательных центрифугирований выделяли плазматические

мембраны. Концентрацию белка в образцах определяли с помощью модифицированного метода Лоури (Peterson, 1977).

Радиолиганднъгй анализ. Эксперименты по связыванию Семакса с плазматическими мембранами проводили с использованием равномерно меченного тритием пептида с удельной радиоактивностью от 60 до 100 Ки/ммоль. Реакционная смесь в конечном объеме 1 мл содержала 10 нМ [3Н]Семакс, 1 мМ СаСЬ (кроме экспериментов по изучению влияния ионов кальция на связывание Семакса) в 50 мМ Трис-HCl буфере^ рН 7,4 и немеченный Семакс в соответствующих концентрациях. Реакцию начинали добавлением белка плазматических мембран. Инкубацию проводили при температуре 30°С при постоянном встряхивании в водяном шейкере-иккубаторе. По окончании инкубации плазматические мембраны отделяли фильтрованием через стекловолоконные фильтры (GF/B). Радиоактивность фильтров определяли на сцинтилляционном счетчике (Mark-3). Неспецифическое связывание определяли как количество метки, не вытесняемое 10 мкМ немеченным пептидом. Обратимость связывания пептида с мембранами выявляли путем вытеснения связавшейся метки 10 мкМ немеченным Семаксом. Все эсперименты по связыванию выполнялись с тремя повторами.

Изучение деградации Семакса в присутствии плазматических мембран и первичных клеточных культур, полученных из мозга. Инкубационная смесь содержала 440 нМ [3Н]Семакс. После инкубации при 37°С (клеточные культуры) или при 30°С (плазматические мембраны) реакцию останавливали кипячением (100°С, 5 мин). Для определения содержания Семакса и его фрагментов в пробах проводили экстракцию пептидной фракции образцов с последующей ВЭЖХ полученных экстрактов. В экстракты в качестве внутреннего стандарта вводили немеченые пептиды (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro, Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro, His-Phe-Pro-Gly-Pro, Phe-Pro-Gly-Pro, Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly, Met-Glu-His-Phe-Pro и His-Pro-Gly-Pro) и проводили разделение пептидов методом ВЭЖХ со спектрофотометрической детекцией с последующим выделением пиков соответствующих пептидов. С помощью жидкостного сцинтилляционного счета рассчитывали содержание радиоактивности в объеме элюента, соответствующем каждому из разделяемых пиков. Молярную радиоактивность пептидных фрагментов Семакса рассчитывали по данным распределения тритиевой метки в меченном Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro, полученным с помощью тритиевого ядерно-магнитного резонанса, и количества радиоактивности в пептидной фракции (Золотарев и соавт.,2004).

Получение и ведение первичных клеточных культур. Первичную культуру глиальных клеток получали и культивировали согласно стандартной методике (Cole et.al, 1989). Использовали новорожденных крыс в возрасте 1-3 дня (Р1-3) линии Спрэг-Доули или

Вистар. Животных усыпляли в атмосфере СОг, препарировали мозг и вырезали базальные ядра переднего мозга, которые затем механически диссоциировали на отдельные клетки. Полученную клеточную суспензию рассевали на обработанные поли-L-лизином пластиковые культуральньте флаконы. Для экспериментов использовали клетки после третьего пассажа. Первичную культуру нервных и глиальных клеток из fos-îacZ трансгенных мышей получали согласно описанному методу (Engele et. al, 1996). Анализ экспрессии гена c-fos в этих культурах проводили через 3-6 дней инкубации in vitro (DIV, days in vitro) и осуществляли с помощью гистохимической окраски на бета-галактозидазу, с использованием красителя X-Gal (З-бром^-хлор-З-индолил-Р-В-галактопиранозид) как описано ранее (Oberdick et. al., 1990; Shilling et. al., 1991). Первичные диссоциированные культуры нейронов базальных ядер переднего мозга получали из 16-17-дневных эмбрионов (Е16-17) крыс по стандартной методике (Hefti et al., 1989). Выделенные базальные ядра переднего мозга механически диссоциировали на отдельные клетки. Полученную клеточную суспензию рассевали на обработанные поли-L-лизином пластиковые планшеты в бессывороточной среде MEM/F12 (1:1) содержащей 6 г/л D-глюкозы, 2 мМ L-глютамин, 25 мг/л инсулина, 100 мг/л трансферрина, 20 нМ прогестерон, 100 нМ путресцин и 30 нМ селенит натрия. Культивирование клеток проводили в СОг-инкубаторе при 37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2. Аналогичным образом получали первичные нейрональные культуры и из других отделов мозга эмбрионов крысы (гиппокамп, кора, мозжечок, средний мозг). Культивирование клеток феохромоцитомы крысы линии РС12. Клетки феохромоцитомы крысы линии РС12 выращивали при 37°С и 5% СОг на среде RPMI-1640 («ICN», США) с добавлением 15% эмбриональной сыворотки коровы (ЭСК) и 80 мкг/мл гентамицина.

Подготовка плазмидной ДНК для трансфекции культур клеток млекопитающих,

Плазмидную ДНК выделяли из трансформированных клеток E.coli XU-Blue на колонках с помощью набора для выделения плазмидной ДНК («Qiagen», США). Для трансфекции клеток млекопитающих плазмидную ДНК дополнительно переосаждали и растворяли в стерильной Н2О (Милли-Q) до конечной концентации 2 мкг/мкл.

Трансфекция клеток линии РС12 с помощью электропорации. Введение плазмидной ДНК в клетки линии PC 12, находящиеся в логарифмической фазе роста, осуществляли с помощью электропорации на приборе СУМ4 (Институт молекулярной биологии РАН) при следующих экспериментально подобранных параметрах: продолжительность импульса - 1,5 мс, напряжение - 450 В. Для трансфекции 1000000 клеток использовали 10 мкг плазмидной ДНК. Электропорацию проводили в буфере: 20 мМ HEPES, 137 мМ KCI, 4 мМ NaCl, 1мМ

MgCb, 0,4%-ный Фикол 400, рН 7,2. После электропорации клетки высевали в стандартную культуральную среду для дальнейшей селекции.

Получение трансфицированных поликлональных культур клеток линии РС12 и клонов индивидуального происхождения. Клетки линии PC 12 после электропорации рассевали как для получения поликлоналъных культур трансфектантов (по 250000 на чашку 0 60мм в 5 мл стандартной среды), так и для выделения индивидуальных клонов (по 1000 клеток на лунку 9б-луночной плашки в 100 мкл стандартной среды). Селекцию начинали на вторые сутки после рассева добавлением в культуральную среду антибиотика G418 до конечной концентрации 0,5 мг/мл. Смену селективной среды проводили через каждые 3-е суток. Поликлональные культуры каждого варианта трансфекции снимали с чашек на 14-16-й день селекции в виде суммарного пула С418-резистентных клонов. Индивидуальные клоны трансфектантов выделяли только из тех лунок, в которых в результате селекции выросли единичные колонии. С помощью указанной схемы достигалась независимость происхождения индивидуальных клонов.

Анализ стабильно-трансфицированных культур РС12 с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР-анализ проводили в стандартных условиях (см. выше) при 25 циклах амплификации с использованием Taq-полимеразы и пары праймеров 5'-CTCCAGCAGGCATATC, 5'-ACCTCGTCCCTCAAATCTG. Геномную ДНК клеточных культур добавляли в количестве 40 нг на одну реакцию. Размер ПЦР-продукта составлял 1007 п.н. Получение ПЦР-продукты анализировали с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле.

Хранение полученных клеточных линий. Клетки смывали с поверхности чашки или флакона пипетированием, осаждали центрифугированием (1000 об/мин, 5 мин) и осадок суспендировали в растворе, содержавшем 93% ЭСК и 7% ДМСО («Serva», Германия), после чего аликвоты клеток по 1 мл (от 1000000 до 5000000 клеток) сначала охлаждали в холодильнике при +4°С, затем переносили в кельвинатор для кратковременного хранения при -70°С и, наконец, в жидкий азот для долговременного хранения.

Анализ пролиферации клеток. Рост и гибель клеток линии РС12 определяли по изменению их числа, вычисляемого по показателям оптической плотности при добавлении МТТ (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенил тетразолиум бромид) (Sherman, 1994). Для определения ростовых характеристик клетки рассевали по 2000 на лунку 96-луночной плашки и по 12500 на лунку 24-луночной плашки. В каждой временной точке показатели снимались с 3-4 лунок после инкубации с 0,1 мг/мл МТТ в течение 4 ч с последующим лизисом и определением оптической плотности при 600 нм. Полученные в результате эксперимента значения

соотносили с числом клеток по предварительно построенной калибровочной кривой.

Пролиферацию глиальных клеток оценивали путем измерения включения [3Н]тнмндина в ДНК клеток по стандартной методике (Freshney et al., 1994). В качестве положительного контроля использовали ЭСК (до концентрации в среде 15%). Оценка жизнеспособности нейронов in vitro. Жизнеспособность культивируемых нейронов оценивали путем подсчета цитохимически или иммуноцитохимически окрашенных клеток через 7-12 дней культивирования (7-12 DIV). Холинэргические нейроны визуализировали с помощью цитохимической окраски на ацетилхолинэстеразу. Тотальную (общую) популяцию нейронов и ГАМК-ергические нейроны визуализировали с помощью антител к нейронспецифической енолазе (NSE) и антител к ГАМК, соответственно, дофаминергические нейроны с помощью антител к тирозингидроксилазе и затем проявляли с помощью набора "ABC reagent" («Vector Laboratories», США) согласно методике и рекомендациями производителя.

Определение активности холинацетилтрансферазы. Активность

холинацетилтрансферазы измеряли, как было описано ранее (Martinez et al, 1985). Клетки собирали с 2-луночных плашек в 10 мкл буфера, содержащего 0.5% (в/в) Тритона Х-100 в 10 мМ ЭДТА, рН 7,4. Клетки разрушали замораживанием-оттаиванием и 2 мкл клеточного гомогената добавляли к 5 мкл среды инкубации. Реакционная среда (конечный объем 7 мкл) содержала: 50 мМ фосфат натрия, 20 мМ ЭДТА, 300 мМ NaCl, 8 мМ холин бромид, 0.1 мМ фигостигмин и 0.2 мМ [14С]-ацетил-СоА (100000 распадов/мин), рН 7,4. Пробы инкубировали 1 ч при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 5 мл 10 мМ фосфата натрия, рН 7,4. Реакционные пробирки переносили в сцинтилляционные флаконы, в которые добавляли 10 мл смеси ацетонитрил/ECONOFLUR, и радиактавность считали на счетчике Mark-3 («Nuclear Chicago», США) с эффективностью 30%.

Анализ количества фосфорилированной формы МАР-киназы с помощью иммуноблотинга. Определение количества фосфорилированной формы MAP кииазы (р44/42) проводили в первичных нервных и глиальных клетках, полученных из мозга крысы, с помощью иммуноблотинга как описано ранее (Bayatti et.ál., 2001).

Содержание лабораторных животных и эксперименты in vivo. Использовали самцов крыс линии Вистар, массой 250-300 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище и 12-часовым циклом освещения (включение света в 9:00, выключение — в 21:00). Были созданы все условия для минимизации стресса животных до проведения и при проведении экспериментов. Животных содержали в клетках таким образом, что каждая клетка содержала представителей и контрольных, и экспериментальных животных. Семакс, в разных количествах, интраназально вводили в виде водного раствора в

объеме 100 мкл/кг массы тела животного. Контрольным животным вводили эквивалентный объем растворителя. Все эксперименты с животными проводились при одобрении Этическим комитетом Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Определение уровня белкового продукта BDNF в отделах мозга крысы in vivo. Уровень BDNF в белковых экстрактах тканей определяли с помощью сэндвич-модификации иммуноферментпого анализа с использованием набора BDNF Еща*® Immunoassay System («Promega», США) в соответствии с методикой и рекомендациями производителя. Концентрацию белка в экстрактах определяли с помощью модифицированного метода Лоури.

Оценка уровня экспрессии мРНК нейротрофинов и TrkB in vitro и in vivo. Оценку уровня мРНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Полученные относительные количества продуктов для NGF и BDNF нормализовали по относительному количеству продукта для ß-актина Тотальную РНК выделяли из образцов с помощью фенол-хлороформной экстракции с использованием наборов RNAgents® Total RNA Isolation System («Promega», США) и PeqGold RNAPure («PeqLabs», Германия) в соответствии с методиками производителей. Реакцию обратной транскрипции проводили с помощью обратной транскриптазы (M-MLV). С полученными образцами кДНК проводили ПЦР в следующих модификациях.

а) Оценка уровней мРНК для BDNF и NGF в первичных культурах глиалъных клеток из базальных ядер переднего мозга крысы. Использовали меченые фосфором-32 праймеры следующих последовательностей и в указанных условиях амплификации:

BDNF: 5-CAGTGGACATGTCCGGTGGGACGGTC-3'

5'-TTCTTGGCAACGGCAACAAACCACAAC-3', 94°С - 1 мин, 72°С - 1 мин NGF: 5'-GGCGTACAGGCAGAACCGTACACAG-3'

5'-CCGTGGCTGTGGTCTTATCTCCAACCCACAC-3\ 94°С - 1 мин, 72°С - 1 мин ß-актин: 5-TTGTAACCACCTGGGACGATATGG-3'

5'-GATCTTGATCTTCATGG TGCTAG-3', 94°С - 1 мин, 61°С - 1 мин, 72°С - 1 мин После 28 циклов, соответствующих пропорциональности количества продукта амплификации от количества исходной кДНК, продукты ПЦР разделяли электрофоретически, визуализировали с помощью бромистого этидия и с помощью жидкостного сцинтилляционного счета определяли относительные количества продуктов.

б) Оценка уровня экспрессии мРНК BDNF и TrkB. Оценку уровня экспрессии мРНК BDNF проводили с использованием количественной ПЦР в реальном режиме времени (realtime quantitative PCR, система Light Cycler, «Roche Diagnostics») с применением красителя SYBR green I и следующих праймеров:

bdnf. 5'-GGGAGCTGAGCGTGTGTGACA-3,,5'-CCTTATGAACCGCCAGCCAAT-3' TrkB: 5'-CACCAACCATCACATTTCTC-3', 5'-ATCTGTCTCTCGTCCTTCCC-3' ß-актин: 5'-CTACAATGAGCTGCGTGTGGC-3', 5'-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3 Реакцшо осуществляли при следующих условиях: 40 циклов, 95°С - 15 с, 55°С - 15 с, 72°С -20 с, измеряя флуоресценцию при 530 нм в конце каждого шага элонгации. Для подтверждения специфичности продуктов амплификации после окончания амплификации образцы охлаждали до 65°С и через 15 с получали кривые плавления с непрерывной детекцией флуоресценции. Для получения калибровочных кривых продукты амплификации (BDNF и ß-актин) очищали с помощью колонок (QIAquic spin columns, «Qiagen», США), и последовательным разбавлением получали стандартные растворы с известной относительной концентрацией соответствующего продукта. С использованием программного обеспечения производителя определяли номер цикла, соответствующий максимальному ускорению процесса амплификации, получали калибровочную кривую числа данных циклов от относительной концентрации продукта, и определяли относительную концентрацию в неизвестном образце с последующей нормализацией по ß-актину. Оценку уровня экспрессии мРНК TrkB проводили с использованием количественной ОТ-ПЦР с флуориметрической оценкой количества продукта амплификации. Проводили амплификацию с использованием праймеров к TrkB и ß-актина в следующем режиме: 22 цикла (ß-актин) и 27 циклов (ТгкВ) включающих 30 с при 95°С, 45 с при 68°С, 45 с при 72°С. Данные условия обеспечивали пропорциональность количества продукта амплификации от количества исходной кДНК. Продукты разделяли электрофоретически с визуализацией с помощью бромистого этидия. Калибровочную кривую получали введением в реакцию кДНК известных относительных концентраций. С помощью системы Alphalmager2000 («Alpha Innotech Corporation») определяли интенсивность свечения в УФ-свете соответствующего продукта, и с помощью программного обеспечения производителя получали значения исходных относительных количеств соответствующих кДНК, и проводили их нормализацию относительно ß-актина. Статистистическая оценка результатов. Результаты обрабатывались с помощью программ Jandel Scientific SigmaPlot и Statsoft Statisica. Достоверности различий групповых средних оценивались с помощью дисперсионного анализа.- На графиках представлены средние значения с учетом стандартной ошибки среднего (Mean+SEM). Обозначения уровней значимости: *-р<0.05; **-р<0.01; ***-р<0.001.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Связывание Семакса с плазматическими мембранами базальных ядер мозга крысы. Предпринятые ранее попытки выявить связывание Семакса с плазматическими

мембранами, полученными из целого мозга крысы, оказались неудачными (Arefyeva et al, 1992). Отсутствие связывания Семакса с этими мембранами могло свидетельствовать либо о низкой концентрации связывающих центров для Семакса в целом мозге, либо о нерецепторпом механизме действия этого гептапептида. С другой стороны, физиологические эффекты Семакса указывали на то, что одной из мишеней действия пептида были базальные ядра переднего мозга - отдела, считающегося ответственным за восприятие информации и внимание (Perry et al., 1999). Исходя из этого, нами было проведено изучение связывания [3Н]Семакса с плазматическими мембранами из базальных ядер переднего мозга крысы.

Данные, представленные . па рис. 1, свидетельствуют о том, что связывание зависит от времени и специфично. Изотерма связывания Семакса при представлении в координатах Скэтчарда имеет линейный вид, и связывание наилучшим • образом описывается одноцентровой моделью (рис. 2) с константой диссоциации лиганд-рецепторного комплекса K<j=2,41+1,02x10"9 М и концентрацией связывающих центров ВтирЗ 3,5±7,9х 10"15 моль/мг белка. Специфическое связывание гептапептида зависело от присутствия в инкубационной среде ионов кальция. Максимальное увеличение связывания (в 2 раза) наблюдалось при концентрации кальция 1мМ. (рис. 3). В связи с полученными нами данными, следует отметить, что к настоящему времени охарактеризовано пять подтипов мелапокортиновых рецепторов, три из которых (обозначаемые как MC3-R, MC4-R и MC5-R) экспрессируются в мозге млекопитающих (Hoi et al, 1994). Показано, что передача сигнала от этих рецепторов внутрь клетки происходит через соответствующие G-белки и регуляция аффинности рецепторов осуществляется внеклеточными ионами кальция (Zohar et al., 1993). Следует отметить, что связывание Семакса также зависит от ионов кальция. и вопрос о принадлежности охарактеризованных нами связывающих центров к известным меланокортиновым рецепторам требует дальнейшего исследования.

мин

Рис. 1. Зависимость связывания [3Н] Семакса

с плазматическими мембранами, полученными из базальных ядер переднего мозга крысы, от времени.

Стрелкой указан момент введения немеченного

Семакса до конечной концентрации 10 мкМ. 1- Общее связывание; 2 — Неспецифическое связывание, 3 - Вытеснение [3Н]Семакса избытком немеченного пептида.

Рис. 2. Связывание Семакса с плазматическими мембранами базальных ядер переднего мозга крысы в координатах Скэтчарда.

Б — концентрация свободного лиганда, М. В — концентраты связанного лиганда, М.

Рис. 3. Зависимость специфического связывания [3Н]Семакса с плазматическими мембранами базальных ядер переднего мозга крысы от концентрации ионов Са.

2. Деградация Семакса в присутствии плазматических мембран, культивируемых нейронов и глии базальных ядер переднего мозга крысы. Одним из основных моментов в изучении механизма действия физиологически активных пептидов является выяснение кинетики и путей их образования в тканях, кинетики и путей их протеолитической биодеградации. В связи с этим нами было проведено изучение деградации Семакса в присутствии одной из предполагаемых мишеней его действия — базальных ядер переднего мозга. Были использованы плазматические мембраны и первичные культуры клеток нейронов и глии, полученные из этого отдела мозга.

Скорость деградации Семакса (конечная концентрация 440 нМ) практически одинакова в присутствии клеток глии и нейронов и несколько выше в присутствии плазматических мембран. Во всех случаях деградация Семакса происходит и с 1<Г-, и с С-конца пептидной цепи. Однако расщепление Семакса с И-конца пептидной цепи происходит более интенсивно. Деградация Семакса в присутствии всех трех объектов с образованием пентапептидов с отщеплением двух аминокислотных остатков как с И-, так и с С-конца значительно преобладает над образованием гексапептидов (табл. 1). Данные о деградации Семакса в присутствии плазматических мембран базальных ядер переднего мозга также свидетельствуют о том, что к моменту выхода связывания на плато (30 - 40 мин) преобладающим в инкубационной смеси пептидом является интактный Семакс.

Табл. 1. Деградация Ссмакса в присутствии плазматических мембран, нейронов и клеток глии, полученных из базальных ядер переднего мозга крысы (Семакс 440 нМ (100%); 1 ч инкубации).

Объект Пептид Плазматические мембраны Нейроны Глиальные клетки

Met-Glu-His-Phe-Pro-GIy-Pro 74,1 92,1 90,2

Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro <1,0 <1,0 1Д

Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly 3,2 1,3 <1,0

His-Phe-Pro-Gly-Pro 14,3 3,4 8,0

Met-Glu-His-Phe-Pro 8,2 3,0 <1,0

3. Влияние Семакса на пролиферацию глиальных клеток, полученных из базальных ядер переднего мозга крысы in vitro. Полученные нами данные о наличии специфических связывающих центров для Семакса на плазматических мембранах базальных ядер переднего мозга крысы указывают на возможность того, что часть ноотропных эффектов Семакса может осуществляться через его влияние на функции этого отдела мозга. В связи с этим нами была предпринята попытка выявить на клеточном уровне мишени действия Семакса в базальных ядрах переднего мозга крысы. Для исследования эффектов Семакса на пролиферацию были использованы первичные культуры глиальных клеток, выделенных из базальных ядер переднего мозга новорожденных крыс. Нам не удалось обнаружить достоверного влияния Семакса в концентрациях 10"9-10'5 м на пролиферацию глиальных клеток из этого отдела мозга (данные не приведены).

4. Влияние Семакса на выживаемость культивируемых нейронов базальных ядер переднего мозга крысы. Было исследовано действие Семакса на выживаемость различных типов нейронов в первичных культурах, полученных из эмбрионального мозга крыс in vitro. Семакс при однократном введении в концентрациях 10*7 М и 10'5 М в день посева примерно в 1,5 раза по сравнению с контролем увеличивал количество холинэргических нейронов через 7 дней культивирования (рис. 4). В качестве положительного контроля использовали BDNF в концентрации 20 нг/мл. Следует отметить, что эффект Семакса на выживаемость холинергических нейронов проявлялся только в случае добавления пептида в первые часы после начала культивирования нейронов. В то же время, Семакс в указанных концентрациях не влиял на выживаемость ГАМК-ергических нейронов и общей популяции нейронов, что указывает на определенную специфичность нейропротекторного действия этого пептида в условиях проводимого эксперимента (рис. 4). Для получения дополнительных данных относительно преимущественного действия Семакса на

I 1" 1 - контроль ШЯЯ - Сенате, 1<Г М ШБ - Сфмакс, 10 М ВОКР, 20нгУмп

Холинергические Тотальная нейроны популяция

ГАМК-ергически» нейроны

Рис. 4. Влияние Семакса на выживаемость нейронов базальных ядер переднего мозга крысы в культуре. Первичная культура нейронов, полученная из эмбрионов крысы (Е17); 7 РГУ, п= 12, *- р< 0.05.

Контроль Семакс (1 нМ)

Семакс Семакс (100 нМ) (10 мкМ)

Рис. 5. Влияние Семакса на активность холинацетилтрапсферазы в первичных нейрональных культурах, полученных нз базальных ядер переднего мозга эмбрионов крысы. (Е17); 7 ШУ, п= 6, *- р< 0.05.

— 200

выживаемость именно холинергических нейронов, было изучено его влияние на активность холииацетилтрансферазы (ХАТ), которая колокализована в этом отделе мозга с АХЭ {Ескеюгет et а!., 1983). Как видно на рис. 5, Семакс увеличивает активность ХАТ

примерно на 20-30%. Способность Семакса предотвращать гибель нейронов в первичных культурах позволила провести сравнение его эффективности с некоторыми другими меланокортинами, такими как альфа-МСГ и АКТГ(4-10), а также с его аналогом Рго-С1у-Рго-Семакс, у которого группировка Рго-С1у-Рго находилась и на К-конце пептидной молекулы. Полученные результаты указывают на то, что только Семакс эффективно предотвращал спонтанную гибель холинергических нейронов в нашей экспериментальной модели (рис. 6).

Контроль Семакс АКТГ(4-10) МСГ РбР-Семакс

Рис. б. Сравнительная эффективность некоторых меланокортинов и их аналогов в предотвращении гибели холинергических нейронов в первичных нейрональных культурах, полученных нз базальных ядер переднего мозга эмбрионов крысы (£17).

5. Влияние Семакса па выживаемость тирозингидроксилаза-ноложнтельных нейронов, полученных из мезенцефалона мозга эмбрионов крысы. Семакс при однократном введении в концентрациях 10"7 М и 10"5 М в день

посева клеток увеличивал в 3-5 раз по сравнению с контролем количество тирозингидроксилаза (ТГ)-положительных нейронов в первичных культурах, полученных из среднего мозга эмбрионов крыс (Е15-16) через 12 дней культивирования (рис. 7). Известно, что этот фермент экспрессируется в частности в дофаминергических нейронах в различных отделах ЦНС и является одним из их маркеров. Суммируя полученные результаты, можно констатировать, что Семакс способен. предотвращать спонтанную гибель нейронов различной ергичности в опытах in vitro.

б. Исследование нейропротекторных эффектов Семакса в клеточных моделях индуцированной нейротокснчностн. Учитывая способность Семакса предотвращать спонтанную гибель нейронов различной ергичности в первичных клеточных культурах, полученных из эмбрионального мозга крыс, было интересным и необходимым оценить его нейропротекгорные свойства в модельных клеточных системах с так называемой индуцированной нейротоксичностью. В наших исследованиях были использованы две различные модели. В первой модели для индукции гибели дофаминергических нейронов в первичных культурах, полученных из среднего мозга эмбрионов крыс (Е15-16), добавляли 6-ГДА. Во втором случае использовали генетически модифицированные генами пресенилина-1 человека hPS-1 клетки феохромоцитомы крысы линии PC 12. Известно, что мутации в этом гене приводят к развитию ранней семейной формы болезни Альцгеймера (Sherrington, Rogaev et al, 1995). Клетки феохромоцитомы крысы линии РС12 являются удобным и общепризнанным объектом для индукции нейрональной дифференцировки in vitro под действием NGF.

6а. Модель гибели дофаминергических нейронов in vitro, индуцированной 6-гидроксидофамином. Принимая во внимание большое значение глиального окружения,

с:

о §

§ iC

I I Контроль. ■Ш Семакс, Ю М Семакс, 10 М

мщ

few's. ibi-V-:

".'iIS'K

Рис. 7. Влияние Семакса на количество тирозингидроксилаза-положительных (ТГ) нейронов в первичных клеточных культурах, полученных из среднего мозга крыс. (El5); 12 DIV, п= 6, р< 0.01.

120

100

ш О X

>х S о с я. т о 80

¿i

s §

для поддержания жизнеспособности нейронов как in vitro, так и in vivo были изучены цитопротекторные эффекты Семакса в смешанной нейроглиальной культуре, полученной из

среднего мозга эмбрионов крысы (El 516). Нейротоксин б-ГДА, добавленный к клеткам в концентрациях 2 и 5 мкМ, вызывал дозозависимое снижение количества ТГ-положительных нейронов (рис. 8). Причем в присутствии 5 мкМ 6-ГДА наблюдалась гибель примерно 60% ТГ-положительных нейронов по

сравнению с контролем. Семакс (100 нМ), добавленный за 30 мин до 6-ГДА (5 мкМ), достоверно повышал количество ТГ-ноложительпых нейронов примерно на 7075%, демонстрируя существенный защитный эффект (рис. 8). В присутствии

2 мкМ 6-ГДА достоверного защитного

эффекта пептида обнаружено не

Контроль 6-ГДА Семакс+ 6-ГДА С«макс+ (2 мкМ) в-ГДА (ЗмкМ) 6-ГДА (2 ыкМ) (5 мкМ)

Рис. 8. Влияние Семакса на количество тирозингидроксилаза — положительных нейронов в первичных клеточных культурах, полученных из среднего мозга эмбрионов крыс в условиях цитотоксичности, вызванной 6-ГДА. (Е16); п= 6, *- р< 0.05.

было, вследствие незначительной гибели клеток в присутствии нейротоксина. При добавлении Семакса к клеточным культурам за 1 сутки до нейротоксина, защитного влияния пептида на выживаемость ТГ-положительных нейронов обнаружено не было. Выявленные в наших опытах цитопротекторные эффекты пептида могут быть обусловлены повышением уровня нейротрофических факторов, таких как NGF, BDNF {Shadrina et al, 2001; Долотов

O.B. и соавт., 2003) и GDNF, которые обладают выраженными нейропротееторными свойствами и могут препятствовать гибели дофаминергических нейронов {Spina et al, 1992; Eggert et al., 1999; Kawamata et al, 2003). В литературе ранее были описаны нейропротекторные эффекты аналога АКТГ(4-10) ORG 2766, на модели 6-ГДА вызванной нейротоксичности у крыс in vivo (Vos et al, 1991,1999; Antonawich et al, 1993, 1994), однако

об эффективности этого пептида в условиях in vitro не сообщалось. Кроме того, ORG2766 не является в отличие от Семакса клинически применяемым пептидом.

66. «Пресенилиновая» клеточная модель болезни Альцгсймера. Для создания «пресенилиновой» клеточной модели в клетки PC 12 методом электропорации вводили следующие вектора: pcDNA3 (контроль) и сконструированные на его основе плазмиды. Были использованы следующие плазмиды: pcPSlwt (со вставкой кДНК гена hPSl дикого типа), pcPSlC410Y (со вставкой кДНК мутантной С410Y формы гена hPSl), а также pcPSlM146V

(со вставкой кДНК мутантной M146V формы гена hPSl). Точечные мутации C410Y и M146V в гене hPSl характеризуются аутосомно-доминантным наследованием и приводят к развитию наиболее агрессивной ранней семейной формы болезни Альцгеймера (Sherrington, Rogaev etal, 1995; Alzheimer's Disease Collaborative Group, 1997). В результате трансфекции и последующей селекции на устойчивость к антибиотику G418 (все рекомбинантные плазмиды несли ген резистентности к неомицину пео1) были получены 4 поликлональные культуры, а именно: К-poly (трансфекция вектором pcDNA3), wt-poly (pcPSl wt) и C410Y-poly (pcPSlC410Y) и M146V-poly (pcPSlM146V). Каждая поликлональная культура представляла собой суммарный пул из 300-400 G418-резистентных клонов. Параллельно с выделением поликлональных культур были отобраны индивидуальные клоны независимого происхождения для каждого варианта трансфекции. ПЦР-анализ геномной ДНК полученных поликлональных культур и клонов показал, что в каждом варианте трансфекции все поликлональные культуры и приблизительно 75-80% клонов, резистентных к G418, содержали вставки кДНК гена человека PS1. Вестерн-блот анализ с использованием полученных нами поликлональных антител к N-концевому участку белка hPSl, показал, что в поликлональных культурах wt-poly, C410Y-poly и M146V-poly, в отличие от контрольной культуры К-poly, наблюдался сигнал в районе 43-45 кДа,. соответствующий нспроцессированному белку экзогенного PS1 человека. Кроме того, во всех культурах присутствовала 30 кДа-форма эндогенного пресенилина крысы (степень гомологии крысиного и человеческого пресенилинов составляет ~96%). Известно, что полноразмерный экзогенный белок как дикого типа (wt), так и мутантных форм подвергался эндопротеолитическому расщеплению в районе гидрофильной петли. При этом экзогенный мутантный пресспилин, особенно с мутацией C410Y, процессировался с существенно меньшей эффективностью. Изучение пролиферативной активности клеток поликлональных культур К-poly, wt-poly, C410Y-poly и M146V-poly показало, что при их культивировании на различных средах (в стандартных условиях с 15% сыворотки, на среде с пониженным содержанием сыворотки (1%) и в условиях, приводящих к дифференцировке (добавление NGF)) статистически достоверных различий в скорости роста не было выявлено. В то же время была показана повышенная чувствительность к апоптотическим стимулам (депривации по сыворотке и добавлению в среду перекиси водорода) клеток, экспрессирующих мутантную форму гена hPSl - C410Y. Кроме того, при изучении пролиферативной активности ряда индивидуальных клонов независимого происхождения нами были выявлены различия опытных и контрольных культур. На среде, обедненной факторами роста и трофическими факторами (содержание сыворотки снижено до 1%), и на среде с NGF, вызывающим нейрональную дифференцировку, клетки клонов с мутантным

ЬР81-С410У обладали более низкой пролиферативной активностью, чем клетки клонов, трансфицированные нормальным ЬРБЬуЛ или контрольные культуры РС12. Выявленные с помощью иммуноблотпшга клоны со стабильной, но различной степенью экспрессии ЬР81, были использованы для дальнейшего анализа действия мутантной формы пресенилина. Была показана зависимость уровня пролиферации клеток на среде, содержащей ЫвЕ, от количества белкового продукта гена: гиперэкспрессия непроцессированной формы 43 кД ЬР81 дикого типа (клон (£М-Р4) угнетала рост клеток по сравнению с контрольной культурой (К-ро1у). Мутантный ЬР81-С410У (клон М1-Б5) даже с меньшей экспрессией, чем у дикого типа, оказывал еще более негативное действие на пролиферацию клеток (Рис. 9). Таким образом, получена «пресенилиновая» клеточная модель с негативным воздействием мутантпых форм ЬРв1 (С410У, М146У), приводящим к повышенной чувствительности клеток к различным апоптотическим стимулам и угнетению их пролиферативной активности. На одной из полученных трансфицированных клеточных культур (М146У) было исследовано действие Семакса и некоторых его аналогов (Рго-Фу-Рго, Рго-О1у-Рго-Рго-С1у-Рго) на ростовые свойства этих клеток. В результате проведенных экспериментов было

2 4 6 8 10 Время культивирования (Дни)

Рис. 9. Динамика роста дифференцированных клеточных культур на среде с 1% сыворотки и 100 нг/мл ЖИГ.

1 — контрольная политональная культура К-ро1у (трансфекция вектором рсОЫАЗ);

2 — моноклональная культура (<1Ы-Р4), экспрессирующая нормальный АР5/ (трансфекция плазмидой рсРБЬл^);

3 — моноклональная культура М1-Е5 экспрессирующая мутантный ЬР81 (трансфекция плазмидой рсРБ 1-С41ОУ).

показано, что в отсутствие апоптотических агентов Семакс, хотя и достоверно, но лишь

Рис. 10. Эффект Семакса и некоторых его аналогов на рост трансфицированных мутантным геном пресенилина-1 клеток РС12.

1 - в отсутствии апоптотических факторов.

2 - в присутствии 25 мкМ перекиси водорода.

незначительно (чуть более 10%) увеличивал количество клеток в трансфицированных культурах, тогда как Pro-Gly-Pro не оказывал действия, a Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro снижал их количество примерно на 25% (рис. 10). В присутствии индуктора гибели клеток перекисиводорода (25 мкМ) только Семакс в высокой концентрации (100 мкМ) достоверно уменьшал гибель клеток в среднем на 30 % (рис. 10). Таким образом, полученные и исследованные нами АР5./-трансфицированные клеточные культуры мог>т представлять интерес, как для дальнейшего изучения функций данного гена, так и в качестве модельной системы для поиска и тестирования лекарственных препаратов, которые потенциально эффективны для терапии ранней семейной формы болезни Альцгеймера, связанной с мутациями в генах пресенилинов.

С учетом полученных нами результатов, а также известных физиологических и клинических эффектов Семакса нами была сформулирована рабочая гипотеза, которая позволяет объяснить механизмы нейропротекторных эффектов данного пептида. Основное положение данной гипотезы заключается в том, что Семакс способен осуществлять свое нейропротекторного действие через регуляцию экспрессии ряда нейротрофических факторов, в частности представителей семейства нейротрофинов. Для получения данных, свидетельствующих в пользу или опровергающих предложенную гипотезу, были изучены эффекты некоторых пептидов, представителей семейства меланокортинов, включающих Семакс, на экспрессию нейротрофических факторов (BDNF и NGF) в экспериментах как in vitro, так и in vivo. Основное внимание было уделено исследованию влияния этих пептидов на экспрессию BDNF — фактора, играющего одну из ключевых ролей в процессах гибели нервных клеток в ЦНС при различных патологических процессах (Griesbach et. al., 2004; Castren, 2004; Fumagalli et.al., 2006).

7. Влияние альфа-МСГ на уровень BDNF в первичных нейрональных культурах, полученных из среднего мозга эмбрионов крыс. Для получения информации, относящейся к возможной регуляции уровня экспрессии BDNF под действием меланокортиновых пептидов, была использована первичная нейрональная культура, полученная из среднего мозга эмбрионов крыс (Е15-16). Методом ИФА было показано, что данный пептид вызывал дозозависимое увеличение количества BDNF в этих культурах (рис. 11). Максимально происходило 2-х кратное увеличение по сравнению с контролем. Таким образом, впервые в экспериментах in vitro установлено, что эндогенный меланокортин - альфа-МСГ, способен увеличивать уровень одного из представителей семейства нейротрофинов - BDNF.

8. Влияние Семакса на экспрессию мРНК BDNF н NGF в культуре глиальных клеток, полученных из базальных ядер переднего мозга крысы. Полученные нами данные о влиянии Семакса на выживаемость нейронов базальных ядер переднего мозга

крысы и существовании связывающих центров Семакса на плазматических мембранах этого

отдела мозга указывают на то, что часть физиологических эффектов пептида может 300,-

§ 250 а. н х

° 200

иГ Z о ш

J 100

<и а

Я 50

r'/V-i

¿Ш

т$ tiff

0,001 0,01

0,1 1,0 10,0 [а-МСГ]. мкМ

10 15 Время, ч

Рис. 11. Влияние альфа-МСГ на уровень ВБКР в первичных нейрональных культурах, полученных из среднего мозга эмбрионов крысы. (Е15-16); п=6, *- р<0.05.

Рис. 12. Влияние Семакса (100 нМ) на уровень экспрессии BDNF и NGF мРНК в культуре глиальных клеток базальных ядер переднего мозга крысы (Р2).

1 - мРНК BDNF, 2 - мРНК NGF.

осуществляться посредством влияния на состояние или функции клеток этого отдела мозга. В связи с этим базальные ядра переднего мозга представлялись подходящим объектом для проверки в условиях in vitro нашей гипотезы о вовлеченности нейротрофииов в осуществление действия Семакса Хорошо известна важнейшая роль глиалышх клеток в поддержании функций нейронов и снабжении их нейротрофическими факторами. Нами было проведено изучение влияние Семакса на экспрессию на уровне мРНК двух наиболее изученных нейротрофических факторов семейства нейротрофинов - BDNF и NGF - в культивируемых глиальных клетках, полученных из базальных ядер переднего мозга новорожденных крыс (Р2, 2-ой день после рождения). Из данных, приведенных на рис. 12, видно, что Семакс в концентрации 100 нМ вызывал быстрое (максимум через 30-40 мин) увеличение уровней этих нейротрофинов. Уровень мРНК NGF возрастал максимально в 5 раз, а уровень мРНК BDNF - примерно в 8 раз по сравнению с контролем. Через 3 ч наблюдалось снижение уровней этих мРНК практически до контроля. Затем через 18ч после введения Семакса наблюдалось дополнительное двукратное увеличение экспрессии мРНК данных нейротрофинов. Обращает на себя внимание быстрота и двухфазность в течение суток ответа этих генов на введение пептида. В тоже время, не было обнаружено увеличения экспрессии мРНК для нейротрофина-3 (NT-3) в этих культурах. С учетом отсутствия влияния Семакса на пролиферацию культивируемых глиальных клеток, увеличение уровня экспрессии данных нейротрофинов не связано с изменением количества клеток.

9. Влияние Семакса на уровень BßNF в базальных ядрах переднего мозга крысы in vivo. Полученные данные о влиянии Семакса на экспрессию нейротрофинов в культуре глиальных клеток базальных ядер переднего мозга крысы и данные о проникновении

Семакса в мозг крысы как при внутривенном (Potaman et al, 1991), так и при интраназальном введении (Долотов и соавт., 2003; Шевченко и соавт., 2006) позволили предположить, что аналогичное влияние Семакс оказывает и in vivo. В связи с тем, что максимум экспрессии BDNF на уровне мРНК в культивируемых глиальных клетках данного отдела мозга наблюдался уже через 40 мин после введения Семакса, нам представлялось обоснованным измерение уровня BDNF через 3 ч после введения пептида. Семакс в дозах 50 и 250 мкг/кг веса примерно в 1,2 раза по сравнению с контролем увеличивал уровень BDNF в базальных ядрах переднего мозга крысы уже через 3 ч после интраназального введения (рис. 13). Через 24 ч после введения Семакса уровень BDNF возвращался к контрольным значениям.

10. Влияние Семакса на экспрессию BDNF в гиппокампе, мозжечке и коре больших полушарий мозга крысы in vivo. Полученные данные о влиянии Семакса на уровень BDNF в базальных ядрах переднего мозга крысы поставили вопрос о возможных эффектах этого пептида на экспрессию гена bdnf в других отделах мозга, и прежде всего в гиппокампе, как важнейшем отделе мозга, принимающем участие в процессах переработки информации и формирования памяти {Berger et. al, 1976, 1986; Lynch et. al, 1984; Bliss et. al, 1993; Kandel et. al., 1995) На первом этапе методом ПЦР в реальном режиме времени было проведено изучение влияния Семакса на уровень мРНК BDNF в этом отделе мозга после интраназального введения пептида. Данные представленные на рис. 14, показывают, что уже через 1 ч после введения Семакс в дозе 50 мкг/кг быстро увеличивал уровень мРНК BDNF. Повышенный уровень экспрессии сохранялся и через 3 ч и только через 24 ч снижался до контрольного.

г i • Контроль гдгз - Семакс, 50 мкг/кг веса тела I - Семакс, 250 мкг/кг веса тела

Зч

24 ч

Рие. 13. Влияние Семакса на уровень ВБЛТ в базальных ядрах переднего мозга крысы после интраназального введения пептида.

По оси абсцисс — время после введения пептида. Контроль (100%) = 25 пг ВИКТ / мг белка; п= 5, р< 0.05.

2000

1600

Ё В

5 1200

О 800 Ш ье х

% 400

30 мин

Рис. 14. Влияние Семакса (50 мкг/кг) на экспрессию мРНК ВБОТ в гиппокампе крысы после интраназального введения пептида.

По оси абсцисс — время после введения пептида. Данные ПЦР в реальном режиме времени. п= 5, **- р< 0.01, р< 0.05.

На следующем этапе работ было изучено влияние Семакса на уровень белкового продукта ВБИР в этом отделе мозга. Данные, представленные на рис. 15, свидетельствуют о том, что уже через 3 ч. после введения Семакс в дозе 50 мкг/кг веса примерно на 30% увеличивал уровень BDNF. Через 24 ч после введения пептида уровень ВОИР в гиппокампе был на 40% выше, чем в контроле. Обращает на себя внимание сохранение повышенного уровня ВБКР в гиппокампе и через 48 ч после введения Семакса. Таким образом, максимальный эффект после

интраназального введения Семакса на

уровень ВОЫР в гиппокампе крысы наблюдался через 24 ч. В связи с этим было проведено изучение влияния различных доз Семакса от 0,5 до 500 мкг/кг на уровень ВООТ через 24 ч после введения (рис. 16). Статистически значимое повышение уровня БИОТ в гиппокампе

160

1 5 50

Семакс, мкг/кг веса

500

Рис. 15. Влияние Семакса (50 мкг/кг) на уровень ВО!ЧТ в гиппокампе крысы после интраназального введения пептида.

По оси абсцисс — время после введения пептида. Контроль (100%) = 85 пг ВБОТ/мг белка; п= 5, *** - р< 0.001.

отмечается при дозе Семакса 50 мкг/кг, и практически такое же увеличение уровня ВБЫР

сохраняется при дозе 500 мкг/кг. В более низких концентрациях пептид не оказывал влияния

Рис. 16. Дозовая зависимость влияния Семакса на уровень ВВГ'ПР в гиппокампе крысы.

24 ч после введения пептида. Контроль (100%) = 85 пг ВЭКР/мг белка; п= 5, р<0.001.

на уровень ВОМч

Наши исследования выявили определенную специфичность действия Семакса в зависимости от отдела мозга. В коре больших полушарий и мозжечке экспериментальных животных достоверных изменений в уровне ВРОТ как при введении 50, так и 250 мкг/кг пептида обнаружено не было (рис. 17). Кроме того, оказалось, что данный пептид не оказывал достоверного влияния на уровень другого нейротрофина - ТЯТ-З - как в базальных ядрахпереднего мозга, так и в гиппокампе. Таким образом, Семакс в физиологически активной дозе 50 мкг/кг веса увеличивает уровень ВООТ в гиппокампе крысы как на уровне мРНК, так и белка.

А Б

3 ч 24 ч 3 ч 24 ч

CZZ3 Контроль бШ Семакс, 50 мкг/кг ИИ Семакс, 250 мкг/кг

Рис. 17. Влияние Семакса на уровень BDNF в коре (А) и мозжечке (Б) крысы. По оси абсцисс — время после введения пептида. п= 5.

Обнаруженная нами способность Семакса увеличивать экспрессию нейротрофинов в мозге может являться одной из стадий осуществления клинически наблюдаемых нейропротекторных эффектов Семакса. Действительно, при таких патологических состояниях мозга, как травма и инсульт, вокруг непосредственно некротического очага поражения формируется обширная область нейронов, гибнущих по пути апоптоза (программированной клеточной гибели) (Linnik et al., 1993). Этот путь клеточной гибели обратим и на начальных стадиях может быть остановлен, в частности, с помощью нейротрофинов. Создание повышенных концентраций нейротрофинов в областях мозга с развивающейся апоптотической гибелью нейронов считается одним из перспективных подходов к терапии нейродегенеративных заболеваний, последствий инсульта и других повреждений мозга (Lindsay et al., 1994). Более того, внутрижелудочковое введение

рекомбинантных плазмид, экспрессирующих нейротрофические факторы, в том числе BDNF, через 30 мин или 4-6 ч после экспериментальной глобальной ишемии приводило к повышению выживаемости нейронов гиппокампа (Shirakura et al, 2004). Наряду с быстрым увеличением уровня BDNF под воздействием Семакса чрезвычайно важным является факт, что его уровень остается повышенным в течение длительного времени (как минимум 48 ч), что может приводить и к более долговременным физиологическим эффектам. Известно, например, что BDNF является фактором, влияющим на нейрогенез в гихшокампе взрослых млекопитающих (Lee et al., 2002). В настоящее время считается, что нейрогенез может играть чрезвычайно важную роль в регенерационных процессах, запускающихся в мозге в ответ на его повреждения, такие как инсульт {Felling et al, 2003). Полученные нами результаты позволили рекомендовать Семакс для включения в противоипсультную терапию, особенно в первые часы после инсульта.

Ноотропное действие пептида также может быть связано с его влиянием на экспрессию BDNF, поскольку в настоящее время показано участие нейротрофинов (главным образом BDNF) в процессах обучения и формирования энграмм в мозге млекопитающих {Alomo et al., 2002). BDNF, связываясь со специфическими TrkB-рецепторами на постсинаптических мембранах, регулирует как кратковременные синаптические функции, так и долговременную потенциацию, возникающую в нейронных сетях {Minichiello et al, 1999; Kovalchuk et al, 2002). Показано увеличение экспрессии мРНК BDNF в гиппокамле при обучении {Hall J., 2000; Mizimo et al, 2000). Снижение уровня эндогенного BDNF в мозге крысы при введении антител к BDNF или антисмысловых олигонуклеотидов приводит к ухудшению обучения и запоминания {Alonso et al, 2002; Mu et al, 1999; Mizuno et al, 2000). В связи с этим мы предположили, что ноотропное действие Семакса может быть связано с увеличением уровня экспрессии BDNF - фактора, одной из функций которого является регуляция свойств синапсов в гиппокамле. Вместе с тем, пока нет достаточных данных о роли BDNF в регуляции функций синапсов в базальных ядрах переднего мозга -отделе, который, как считается, участвует в процессах, связанных с вниманием и восприятием информации. Обнаруженное нами увеличение уровня BDNF в этом отделе мозга под действием пептида Семакс, в совокупности с физиологическими и клиническими данными о его влиянии на внимание и восприятие, может косвенно свидетельствовать в пользу нашего предположения об участии BDNF в регуляции этих процессов. Полученные нами данные о влиянии Семакса на экспрессшо BDNF в гиппокамле крысы согласуются и с известными физиологическими и клиническими эффектами Семакса {Ашмарин и соавтп., 1997), и с существующими в настоящее время представлениями о нейротрофинах как важнейших участниках таких протекающих в ЦНС процессах, как поддержапие

жизнеспособности нейронов, обучение, формирование памяти, депрессия, стресс. Так, согласно "нейротрофиновой" гипотезе возникновения депрессии фитап & а.1, 1997; БЫгауата е/ а1., 2002), стресс вызывает снижение экспрессии ВБ^ в гиппокампе, что приводит к атрофии гиппокампа и развитию депрессии. Применение же антидепрессантов увеличивает уровень ЕШОТ в гиппокампе и ведет к устранению депрессивного состояния. Учитывая, что Семакс показал эффективность в качестве средства, применяемого при мнестических нарушениях, возникших вследствие стресса, наши данные о влиянии Семакса на экспрессию ВО№ в гиппокампе крысы находятся в соответствии с "нейротрофиновой" гипотезой возникновения депрессии.

11. Влияние Семакса на экспрессию ТгкВ в гиппокампе крысы. Полученные нами данные о способности Семакса регулировать экспрессию ВОМР в гиппокампе крысы ставят вопрос о возможности влияния этого пептида на экспрессию высокоаффинных рецепторов (ТгкВ) для ВРОТ, так как клеточный ответ на увеличенное количество ВБОТ должен зависеть также и от количества ТгкВ на поверхности клетки. В связи с этим нами было проведено изучение влияния Семакса на экспрессию мРНК ТгкВ в гиппокампе крысы. Было показано, что Семакс через 24 ч после интраназального введения в дозе 50 мкг/кг веса примерно в 2 раза увеличивал экспрессию мРНК ТгкВ в гиппокампе крысы (рис. 18 А).

Остается пока недостаточно ясным вопрос о том, в каких клетках гиппокампа - нейронах или глиальных клетках -происходит увеличение экспрессии мРНК ТгкВ под действием Семакса. Однако нами получены данные, свидетельствующие о вовлеченности глиальных клеток гиппокампа в этот процесс (рис. 18 Б). Семакс в концентрации 1 нМ увеличивал примерно в 2 раза уровень мРНК ТгкВ в первичных глиальных культурах, полученных из гиппокампа крыс через 24 ч после введения. Следует отметить, что в клетках глии экспрессируется

исключительно укороченная форма ТгкВ-рецепторов, лишенная внутриклеточного тирозинкиназного домена, но способная связывать ВБОТ, регулировать высвобождение ионов кальция и осуществлять за счет этого

Рис. 18. Влияние Семакса на уровень мРНК ТгкВ в гиппокампе крысы через 24 ч после введения пептида.

А - интраназальное введение Семакса (50 мкг/кг веса тела). Б — добавление Семакса в культуру глиальных клеток, полученных из гиппокампа, концентрация пептида 1 нМ. о<0.001. о<0.05.

модуляцию нейрональиой активности (Rose et al., 2003). Более того, показано, что в гиппокампе после связывания BDNF с укороченной формой ТгкВ-рсцсптора, локализованной на глиальных клетках, происходитэндоцитоз этого нейротрофина и накопление его внутри клетки без заметной деградации в течение, по меньшей мере, 48 ч (Alderson et al, 2000). При этом BDNF способен при определенных условиях высвобождаться во внеклеточное пространство, что указывает па важную роль укороченной формы TrkB в регуляции внеклеточного уровня BDNF.

Остается неясным, является ли увеличение экспрессии TrkB самостоятельным эффектом Семакса или отражением способности BDNF регулировать экспрессию своих высокоаффинных рецепторов. К настоящему времени, имеются данные о том, что BDNF действительно способен повышать уровень экспрессии TrkB-рецепторов в гиппокампе крысы (Ferrer et al., 1998). Таким образом, наши данные указывают на то, что Семакс может регулировать в мозге как экспрессию bdnf, так и гена, кодирующего его рецепторы (TrkB), как минимум на уровне мРНК. Полученные в ходе работы результаты свидетельствуют в пользу сформулированной нами гипотезе об осуществлении ряда эффектов меланокортинов, включая Семакс, через регуляцию экспрессии некоторых нейротрофичсских факторов.

12. Возможный механизм действия Семакса в центральной нервной системе. Для получения дополнительных данных относительно возможных механизмов действия Семакса

(время, мин) к 115 30 50. с 15 30 50, i15 30( Семакс МСГ BDNF

(100 нМ) (100 нМ) (50нг/мл)

Рис. 19. Влияние семакса и альфа МСГ на количество фосфорилированной формы МАР-кнназы в первичных нейрональных культурах, полученных из базальпых ядер переднего мозга эмбрионов крысы (£17). Данные иммуноблотинга с антителами к фосфорилированной форме МАР-киназы. п=2.

1В0

160

§140

о.

Ё 120

ж 100

»в 80

Е 3 40

&1Г

kliw '•Ж

Р1? iji

•'яъ

К i15 30

Семакс (100 нМ)

(время, мин) 50) |15 30 50i

МСГ (100 нМ)

Рис. 20. Влияние Семакса и альфа-МСГ на количество фосфорилированной формы МАР-киназы в первичпых глиальных культурах, полученных из базальпых ядер переднего мозга крысы (Р1-2). Данные иммуноблотинга с антителами к фосфорилированной форме МАР-киназы. п=2. в ЦНС изучали действие этого пептида на активность митогенактивируемых протеинкиназ

(МАР-киназ) в первичных нейрональных и глиальных культурах, полученных из мозга крысы. Из результатов, представленных на рис. 19 и 20 видно, что Семакс в концентрации 100 нМ увеличивал примерно на 40-50% количество фосфорилированной (активной) формы МАР-киназы, как в нейрональной, так и в глиальной клеточной культуре.

Следует отметить, что альфа-МСГ также увеличивал количество этой формы, что согласуется с данными, полученными другими авторами (Smalley et al, 2000; Daniels et al,2003). В качестве положительного контроля был использован BDNF в концентрации 50 нг/мл. Таким образом, одним из возможных путей передачи информации от Семакса внутрь клетки может быть МАР-киназный путь.Для выяснения возможности влияния Семакса на один из генов быстрого ответа (c-fos ) была использована модель fos-lacZ-vpsaicremibTX. мышей (Engele et al., 1996; Schmidt et ed., 1998). Первичные глиальные клеточные культуры, полученные от таких мышей, обрабатывали различными пептидами, включая Семакс. Результаты, представленные на рис. 21, свидетельствуют о влиянии Семакса (10 мкМ) на экспрессию гена c-fos. В то же время АКТГ(4-10) и Pro-GIy-Pro (PGP) в той же концентрации не увеличивали количество экспрессирующих c-fos клеток. Существенное увеличение (примерно в 10 раз) количества c-^öi-экспрессирующих клеток было получено как при обработки клеток альфа-МСГ, так и форсколином, соединением стимулирующим

500,-

400

га

х к

§ § 300 |1

2 Í 200 Ж о CL ^

л х

о £

100

Контроль

Семакс

Рис. 21. Влияние некоторых меланокортинов на экспрессию с/м в глиальных культурах, полученных из базальных ядер переднего мозга/¿«-/во? трансгенных мышей. (Р 2); п= б, *р< 0.05.

Рис. 22. Влияние Семакса (50 мкг/кг веса) иа уровень экспрессии мРНК ВБОТ (экзон III) в гиппокампе крысы.

3 ч после интраназального введения, данные полуколичественной ОТ-ПЦР. п= 6, * - р<0.05.

активность аденилатциклазы (Ач>ас1 е/ а!., 1983; ЬЫЬа$Ы е/ а!., 1984). Не было получено достоверного влияния Семакса на экспрессию этого гена в нейрональных культурах, полученных из этого же отдела трансгенных мышей (данные не приведены).

Учитывая быстрые временные изменения в экспрессии ЪсЬ\/ под действием Семакса, было предположено, что в данном случае экспрессия этого гена осуществляется через Ш-ий экзон, находящийся под контролем таких вторичных мессенджеров, как кальций и сАМР. Известно, что эти мессенджеры осуществляют быструю регуляцию генного ответа через фактор транскрипции С11ЕВ. На рис. 22 представлены данные относительно влияния Семакса на экспрессию Ш-го экзона Ьс1п/ в гиппокампе крысы через 3 ч после интраназального введения пептида. Увеличение экспрессии в 3 раза свидетельствует о возможности осуществления эффекта Семакса через транскрипционный фактор СЯЕВ.

С е м а к с (Ме1-С1и-Н18-РЬе-Рго-С1у-Рго)

Рецепторы

на плазматических мембранах клеток мозга

I *

Вторичные мессенжеры I

MAP киназы I \

CREB

CREB-зависимые гены

(с fos, BDNF и др.) / \

различные молекулярные и клеточные эффекты (синтез нейротрансмиттеров, предотвращение гибели клеток, дифференцировка нервных и глиальных клеток, нейрогенез, процессы обучения и памяти, поведения)

Рис. 22. Предполагаемый молекулярный механизм действия Семакса.

Таким образом, полученные в данной работе результаты позволили предложить следующий

механизм действия Семакса, который схематично представлен на рис.-23. Основными стадиями передачи сигнала от Семакса внутрь клетки являются: связывание этого пептида с рецепторами на поверхности клетки, активация системы МАР-киназ (р 44/42), увеличение транскрипционной активности транскрипционного фактора CREB, увеличение экспрессии гена быстрого ответа c-fos и генов нейротрофических факторов, в частности гена bdnf. В дальнейшем нейротрофические факторы способны осуществлять широкий спектр эффектов как на клеточном, так и на организменном уровне. Однако предложенный механизм не претендует на исчерпывающее описание многочисленных эффектов Семакса и требует дальнейшего уточнения. Так, остается практически неисследованной ситуация с влиянием этого пептида на системы вторичных мессенджеров (cAMP, cGMP, кальция и др.), хотя недавно было установлено влияние Семакса на кальциевые потоки в нейтрофилах {Асташкин и соавт. 2000).

13. Се макс в качестве лекарственного препарата для лечения нейродегенеративных заболеваний (ишемический инсульт, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона). Полученные в работе результаты легли в основу проведения широких клинических испытаний Семакса в качестве соединения, способного оказывать благоприятное действие на больных ишемическим инсультом, особенно в тяжелых случаях и случаях средней тяжести. Проведение таких испытаний в ведущих лечебных учреждениях нашей страны (1-ая Градская больница, 20-ая и 31-ая городские больницы, кафедра неврологии РГМУ) {Гусев с сотр., 1998; Мясоедов с сотр., 1999; Скворцова с сотр., 1999) привело к созданию нового лекарственного препарата «Семакс капли назальные 1%», который был утвержден Фармакологическим комитетом Министерства здравоохранения РФ 29 марта 2001 года протокол № 5. Разработана технология и налажено производство препарата в Институте молекулярной генетики РАН. К настоящему времени выпущено более 30000 упаковок препарата «Семакс капли назальные 1%». Кроме того, обнаруженная нейропротекторная активность Семакса позволяет рекомендовать его для клинических испытаний на больных с нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, особенно на начальных стадиях этих заболеваний.

14. Клеточная система для тестирования соединений с потенциальной нейропротекторной активностью. Тестирование соединений на наличие у них нейропротекторной активности представляет собой чрезвычайно важную задачу. Для этой цели нами были использованы первичные культуры нервных и глиальных клеток, полученные из различных отделов мозга крысы. Общая схема тестирования соединений in vitro приведена на рис. 24. Отличительной чертой предлагаемой схемы является тестирование соединений не только на общей нейрональной популяции и нейронах

различной ергичности по их способности предотвращать гибель клеток по пути некроза или апоптоза, но и одновременное тестирование их и на культурах первичных глиальных клеток. Использование глиальных клеток позволяет оценить не только влияние тестируемых соединений на жизнеспособность и пролиферативную активность клеток (что само по себе важно, учитывая, что количество глиальных клеток в мозге млекопитающих примерно в 10 раз превышает количество нейронов), но и на способность потенциальных нейропротекторов стимулировать экспрессию нейротрофических факторов этими клетками. Поэтому, па наш взгляд, такая система скрининга соединений дает более полное представление о свойствах того или иного тестируемого соединения, что в свою очередь позволяет более эффективно проводить дальнейшее тестирование и в экспериментах in vivo. ^

Исследуемые соединения (пептиды, непептидные соединения)

первичная первичная

нейрональная культура глнальная культура

оценка влияния на некроз

\ / \

оценка влияния оценка оценка экспрессии

на апоптоз пролиферативной нейротрофических

активности факторов

первичные

нейрональные

культуры различной

ергичности

/ I Ч

холинергическне | глутаматергнческие дофаминергнческие

Рис. 23. Стратегия использования первичных клеточных культур из нервной ткапи для отбора соединений с нейропротекторной активностью.

Заключение.

Полученные в данной работе результаты позволили выявить новую неизвестную прежде активность пептида Семакс — синтетического аналога семейства меланокортинов -способность предотвращать спонтанную гибель нервных клеток in vitro. Важным моментом была специфичность действия пептида: преимущественное нейропротекторное действие на определенные типы нервных клеток. Кроме того, были проведены эксперименты по оценке

нейропротекторных свойств Ссмакса в модельных клеточных системах с так называемой индуцированной нейротоксичностъю и была выявлена его способность частично предотвращать гибель клеток. Совокупность полученных данных позволила создать на основе Семакс новый отечественный пептидный нейропротектор ("Семакс-1% раствор"), предназначенный для лечения острого периода ишемического инсульта, утвержденный к применению в клинике Фармакологическим комитетом Министерства здравоохранения РФ 29 марта 2001 года протокол № 5. Нейропротекгорная активность Семакса позволяет рекомендовать его для клинических испытаний на больных с другими нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, особенно на начальных стадиях этих заболеваний, когда количество погибших нейронов еще незначительно.

Исследование молекулярных механизмов действия Семакса позволило предположить, что один из возможных механизмов осуществления его ноотропного и нейропротекторного действия на ЦНС включает в себя связывание пептида с находящимися на поверхности клеток мозга рецепторами и быстрое увеличение уровня экспрессии генов семейства нейротрофинов (ВБИР, КОБ) в ряде структур мозга, включая гиппокамп и базальные ядра переднего мозга. В свою очередь, эти белки, регулируя через соответствующие рецепторы как синаптинескве функции, так и жизнеспособность нейронов, могут быть ответственны за проявление Семаксом его ноотропных и нейропротекторных активностей.

В связи с этим мы считаем, что полученные в работе результаты могут быть использованы для дальнейшего изучения роли нейротрофинов и их рецепторов в осуществлении эффектов Семакса и других меланокортинов на ЦНС, а также для синтеза новых пептидных соединений, обладающих еще более выраженной нейропротекторной активностью. Разработанная модельная клеточная система, включающая первичные нейрональные и глиальные культуры может быть использована для скрининга соединений с потенциальной нейропротекторной активностью. Большой интерес в перспективе представляет и полная расшифровка путей передачи информации от Семакса и других меланокортинов внутрь клетки. Разработанный нами на примере пептида Семакс молекулярно-генетический подход может быть применен и к другим пептидным соединениям, которые могут найти применение для лечения нейродегенеративных заболеваний.

Выводы

1. Предложен механизм действия Семакса, в основе которого лежит способность меланокортинов и их аналогов оказывать нейротрофическос и нейропротекторное действие за счет регуляции экспрессии генов нейротрофических факторов.

2. Установлен нейропротекторный эффект пептида Семакс на спонтанную гибель холинергических и дофаминергических нейронов in vitro и на гибель дофаминергических нейронов в клеточной модели нейротоксичности, индуцированной б-гидроксидофамином.

3. На плазматических мембранах, полученных из мозга крысы, идентифицированы участки связывания для пептида Семакса, характеризующиеся следующими параметрами: К4=2,А\ ± 1,02 х 10"9М и В max — 33,5 ± 7,9 х 10"15 моль/мг белка.

4. Установлена способность пептида Семакса стимулировать экспрессию мРНК BDNF и NGF в первичных клеточных культурах, полученных из мозга. Предложены клеточные модели для скрининга фармакологических препаратов с потенциальной нейропротекторной активностью.

5. Установлена специфичность стимуляции синтеза BDNF в различных отделах мозга крысы при однократном интраназальном введении Семакса в дозах 50 и 250 мкг/кг. Наибольший уровень экспрессии этого нейротрофина наблюдается в гиппокампе через 24 ч и сохраняется повышенным как минимум в течение 2-х суток.

6. Создана клеточная модель одной из форм болезни Альцгеймера. На этой модели установлена способность Семакса частично предотвращать гибель мутантных клеток in vitro.

7. На модели пептида Семакс разработан комплексный подход к молекулярно-генетическим исследованиям соединений с потенциальной нейропротекторной активностью.

8. На основе результатов выполненного исследования создан оригинальный отечественный лекарственный препарат "Семакс-1% раствор", предназначенный для лечения острого периода ишемического инсульта и утвержденный Фармакологическим комитетом Министерства здравоохранения РФ 29 марта 2001 года протокол № 5.

Список публикаций.

1. Арефьева И.А., Алфеева Л.Ю., Андреева Л.А., Гривенников И.А., Зайцев Д.А., Ильина Г.С., Потаман В.Н., Незавибатько В.Н. Изучение связывания аналога АКТГ(4-7) и тафтсина с плазматическими мембранами мозга крысы и с клетками глиомы и нсйробластомы. Биологические мембраны. (1991), 8, N 11, 1167-1168.

2. Арефьева И.А., Алфеева Л.Ю., Гривенников И.А. Связывание тафтсина с • плазматическими мембранами мозга крысы, клетками глиомы крысы и нейробластомы мыши. Нейрохимия. (1991), 10,28-37.

3. Ро1атап У-И., Агйопоуа Ь.У., БиЬупт У.А., Отетикоу 1.А., Катспзку А.А., Ьеукгкауа N,0., МуаБоес1оу КБ., Кегау!Ьа1ко У.М., гакгеу Б.А., 2о1о1агеу У.А.

Pharmacokinetics of synthetic ACTH (4-10) analog semax following intravenous injection. Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds. (1991), E. Bimcel and G.W. Kabalka (Ed.). Elsevier Science Publishers B.V., pp. 715-718.

4. Arefyeva I.A., Zaitzev D.A., Grivennikov I.A., Andreeva L.A., Potaman V.N., Nezavibat'ko V.N., Myasoedov N.F. Application of high radioactive tritium labelled behaviorally active ACTH (4-10) analogue for investigation of its binding to rat brain. Neurosci. Res. Communs. (1992), 11, N1,37-44.

5. Arefyeva LA., Alfeeva L.Yu., Uyina G.S., Nezavibatko V.N., Myasoedov N.F., Grivennikov I.A. Binding sites for the immunomodulating peptide tuftsin in rat brain. Neurosci. Res. Communs. (1992), 11,N 3,137-143.

6. Arefyeva I.A., Andreeva L.A., Nezavibat'ko V.N., Grivennikov I.A. Characterization of tuftsin binding sites in rat brain. Neurosci. Res. Communs. (1993), 12,2, 85-91.

7. Исаев H.K., Долотов O.B., Незавибатько B.H., Викторов И.В., Гривенников И.А. Трофическое действие тафтсина в реагрегированных культурах спинного мозга крысы. Нейрохимия. (1995), 12, 2, 23-27.

8. Ашмарин И.П., Незавибатько В.Н., Мясоедов Н.Ф., Каменский А.А., Гривенников И.А., Пономарева-Степная М.А., Андреева Л.А., Каплан АЛ., Кошелев В.Б., Рясина Т.В. Ноотропный аналог адренокортикотропина 4-10-Семакс (15-летний опыт разработки и изучения). Журнал высшей нервной деятельности им. И.П. Павлова. (1997), 47, 2, 420430.

9. Чернявская Л.И., Григоренко А.П., Бобрышева И.В., Кальина Н.Р., Гривенников И.А., Тарантул В.З., Флис С.Г., Гуляева Н.В., Рогаев Е.И. Трансфекция мутантного гена пресенилина-1 человека увеличивает чувствительность клеток PC-12 к апоптозу. Нейрохимия. (1998), 15,308-311.

10. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Насонов ЕЛ., Журавлева Е.Ю., Гривенников И А., Арсеньева Е.Л., Суханов И.И., Мясоедов Н.Ф. Исследование роли пептидэргических иммупомодуляторов в остром периоде полушарного ишемического инсульта (Клинический и иммунобиохимический мониторинг). Сб. статей Сосудистая патология нервной системы. Санкт-Петербург, (1998), 187-189.

11. Dolotov O.V., Grivennikov I.A. Application of primary cultures of rat fetal neurons to the study of neurotrophic action of peptides, in: New Developments and New Applications in Animal Cell Technology. (1998), Ed: O.-W. Merten, P. Perrin and B. Griffits, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 725-727.

12. Гривенников И.А., Долотов О.В., Гольдина Ю.И. Факторы пептидной природы в процессах пролиферации, дифференцировки и поддержания жизнеспособности клеток нервной системы млекопитающих. Молекулярная биология. (1999), 33,120-126.

13. Мясоедов Н.Ф., Скворцова В.И., Насонов E.JL, Журавлева Е.Ю., Гривенников И.А., Арсеньева EJL, Суханов И.И. Изучение механизмов нейропротективного действия семакса в остром периоде ишемического инсульта. Журнал неврологии и психиатрии. (1999), N5,15-19.

14. Скворцова В.И., Насонов E.JL, Журавлева Е.Ю., Гривенников И .А., Арсеньева Е.Л., Суханов И.И., Мясоедов Н.Ф., Гусев Е.И. Клинико-иммунобиохимический мониторинг факторов локального воспаления в остром периоде полушарного ишемического инсульта. Журнал неврологии и психиатрии. (1999), N5,27-31.

15. Асташкин Е.И., Беспалова Ю.Б., Гривенников И.А., Смирнов О.Н., Глезер М.Г., Грачев C.B., Мясоедов Н.Ф. Изучение влияния семакса на Са2+ - ответы нейтрофилов человека. ДАН. (2000), 374, №3, 401-403.

16. Bobrysheva I.V., Chernyavskaya L.I., Onufriev M.V., Grivennikov I.A., Gulyaeva N.V. Hydrogen peroxide dose-dependently inhibits caspase-3 in PC 12 cells. Нейрохимия. (2000), 17, №2,93-98.

17. Асташкин Е.И., Беспалова Ю.Б., Смирнов О.Н., Гривенников И.А., Глезер М.Г., Мясоедов Н.Ф., Грачев C.B. Сравнительное изучение действия семакса на Са2+- ответы нейтрофилов человека и клеток HL-60. Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. (2000), №4, 50-54.

18. Умрюхин П.Е., Коплик Е.В., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф., Судаков К.В. Экспрессия гена c-fos в мозге у крыс с различной устойчивостью к эмоциональному стрессу в условиях внутрибрюшинного введения аналога АКТГ(4-10) - Семакса. Журнал высшей нервной деятельности им. И.П. Павлова. (2001), 51, №2,220-227.

19. Кост Н.В., Соколов О.Ю., Габаева М.В., Гривенников И.А., Андреева Л.А., Мясоедов Н.Ф., Зозуля A.A. Ингибирующее действие семакса и селанка на энкефалиндеградирующие ферменты сыворотки крови человека. Биоорганическая химия. (2001), 27,3,180-183.

20. Зозуля АЛ., Кост Н.В., Соколов О.Ю., Габаева М.В., Гривенников И.А., Андреева Л.А., Золотарев Ю.А., Иванов C.B., Андрющенко A.B., Мясоедов Н.Ф., Смулевич А.Б. Ингибирующий эффект селанка на активность энкефалиндеградирующих ферментов как один из возможных механизмов его анксиолитического действия. Бюлл. Эксп. Биол. Мед. (2001), 131,4,376-378.

21. Kukhtina V.V., Inozemtseva L.S., Grivennikov I.A., Tsetlin V.l., Utkin Yu.N. Two forms of nerve growth factor from cobra venom prevent the death of PC 12 cells in serum-free medium. Journal of Natural Toxins. (2001), 10,1,9-16.

22. Асташкнн Е.И., Петров E.A., Беспалова Ю.Б., Глезер М.Г., Гривенников И.А., Грачев C.B. Изучение влияния аналога АКТГ(4-10) (пептида Семакса) на дыхательный взрыв нейтрофилов человека. ДАН. (2001), 378,1,121-123.

23. Shadrina M.I., Dolotov O.V., Grivennikov I.A., Inozemtzeva L.S., Slominsky P.A., Limborska S.A., Myasoedov N.F. Rapid and efficient NGF and BDNF mKNA induction in the rat glial cell cultures upon ACTH(4-10) analog "Semax" action. Neuroscience Letters. (2001), 308, 115-118.

24. Асташкин Е.И., Петров Е.А., Беспалова Ю.Б., Глезер М.Г., Гривенников И .А., Грачев C.B. Аналог АСТН 4-10 вызывает дыхательный взрыв, связанный с фагоцитами крови человека. Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. (2001), 3, 25-29.

25. Сафарова Э.Р., Шрам С.И., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф. Трофическое действие ноотропных пептидных препаратов церебролизина и семакса на культивируемые клетки феохромоцитомы крысы. Бюлл. Эксп. Биол. Мед. (2002), 133,4,462-465.

26. Еремин К.О., Кудрин B.C., Андреева JI.A., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф., Раевский К.С. Влияние семакса на содержание и обмен моноаминов в мозге мышей линии C57/BL. Нейрохимия. (2002), 19,202-205.

27. Долотов О.В., Середенина Т.С., Левицкая Н.Г., Каменский A.A., Андреева JI.A., Алфеева Л.Ю., Нагаев И.Ю., Золотарев Ю.А., Гривенников И.А., Энгеле Ю., Мясоедов Н.Ф. Гептапептид Семакс стимулирует экспрессию BDNF в различных отделах мозга крысы in vivo. ДАН. (2003), 391,131-134.

28. Бобрышева И.В., Григоренко А.П., Кальина Н.Р., Арсеньева Е.Л., Новосадова Е. В., Гривенников И.А., Тарантул В.З., Рогаев Е.И. Влияние изоформ прссенилина-1 человека на пролиферацию и выживаемость клеток феохромацитомы крысы линии PC 12. Биохимия. (2003), 68, 750-758.

29. Гривенников И.А., Бобрышева И.В., Варшавер Н.Б., Григоренко А.П., Иноземцева Л.С., Мануйлова Е.С. Молекулярные механизмы дифференцировки, злокачественной трансформации и гибели соматических клеток млекопитающих in vitro. В сб.: «Проблемы и перспективы молекулярной генетики». (2003), М., Наука, т. 1,248-289.

30. Долотов О.В., Золотарев Ю.А., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Гривенников И .А., Мясоедов Н.Ф. Изучение связывания и биодеградации ноотропного и нейропротективного аналога АКТГ(4-10) гептапептида Семакс с плазматическими

мембранами базальных ядер переднего мозга крысы. Биоорганическая химия. (2004), 30, 3,241-246.

31. Мясоедов Н.Ф., И.А. Гривенников. Нейропептиды и их аналоги в регуляции функций нервной системы млекопитающих, включая человека. От синтеза и изучения механизмов их действия до создания лекарственных средств нового поколения. В сб. «Проблемы и перспективы молекулярной генетики». (2004), М., Наука, т. 2,195-236.

32. Еремин К.О., Кудрин B.C., Гривенников И.А., академик Мясоедов Н.Ф., Раевский К.С. Влияние семакса на дофамин- и серотонинергические системы мозга. ДАН. (2004), 394, 130-132.

33. Ashmarin I.P., Samonina G.E., Lyapina L.A., Kamenskii A.A., Levitskaya N.G., Grivennikov I.A., Dolotov O.V., Andreeva L.A., Myasoedov N.F. Natural and hybrid ("chimeric") stable regulatory glyproline peptides. Pathophysiology. (2005), 11,4,179-185.

34. Eremin K.O., Kudrin V.S., Saransaari P., Oja S., Grivennikov I.A., Myasoedov N.F., Rayevsky K.S. Semax, an ACTH(4-10) Analogue with Nootropic Properties, Activates Dopamine- and Serotonergic Brain Systems in Animals. Neurochemical Research. (2005), 30 (12), 1493-1500.

35. Шевченко K.B., Нагаев И.Ю., Алфеева Л.Ю., Андреева Л.А., Каменский А.А., Левицкая Н.Г., Шевченко В.П., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф. Кинетика проникновения семакса в мозг и кровь крыс при интраназальном введении. Биоорганическая химия. (2006), 32,1,64-70.

36. Золотарев Ю.А., Дадаян А.К., Долотов О.В., Козик B.C., Кост Н.В., Соколов О. Ю., Дорохова Е.М., Мешавкин В.К., Иноземцева Л.С., Габаева М.В., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Павлов Т.С., Бадмаева К.Е., Бадмаева С.Е., Бакаева З.В., Копылова Г.Н., Самонина Г.Е., Васьковский Б.В., Гривенников И.А., Зозуля А.А., Мясоедов Н.Ф. Равномерно меченные тритием пептиды в исследованиях по их биодеградации in vivo и in vitro. Биоорганическая химия. (2006), 32,2, 80-88.

37. Dolotov O.V., Karpenko Е.А., Seredenina T.S., Inozemtseva L.S., Levitskaya N.G., Zolotarev Y.A., Kamensky A.A., Grivennikov I.A., Engele J., Myasoedov N.F. Semax, an analog of adrenocorticotropin (4-10), possesses binding sites and increases BDNF level in the rat basal forebrain. J. Neurochem. (2006), 97, si, 82-86.

Патенты.

1. Патент N 2206573. Семейство пептидов, обладающих нейротропными свойствами. Приоритет от 27.12.2001. Авторы: Ашмарин И.П., Алфеева Л.Ю., Андреева Л.А., Гривенников И.А., Дубинин В.А., Каменский А.А., Козловская М.М., Левицкая Н.Г., Мясоедов Н.Ф., Незавибатько В.Н. Середенин С.Б.

2. Патент N 2124365. Способ лечения ишемического инсульта. Приоритет от 13.05.1997. Авторы: Гусев Е.И., Скворцова В.И., Журавлева Е.Ю., Андреева Л.А., Незавибатько В.Н., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф.

3. Патент. Способ лечения расстройства нервной системы у детей младшего возраста и фармацевтическая композиция. Приоритет от 25.05.2003.

Авторы: Алфеева Л.Ю., Андреева Л .А., Гривенников И.А., Журба Л.Т. Козловская Г.В., Мариничев Б.М., Мясоедов Н.Ф., Нагаев И.Ю., Царегородцев А.Д. Решение о выдаче патента на изобретение № 2003115020/14(016229).

Подписано в печать 09.03.2006. Формат 60x84 1/16 Бумага офисная. Печать офсетная. Усл. п. л. 1,6 Тираж 120 экз. Заказ № П-203

Типография «Телер» 127299, Москва, ул. Космонавта Волкова, 12 Тел.: (495) 937-8664,156-4084

Оглавление диссертации Гривенников, Игорь Анатольевич :: 2006 :: Москва

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ НАСТОЯЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

ПУБЛИКАЦИИ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Некоторые проблемы создания лекарственных препаратов на основе пептидов.

Меланокортины и их аналоги, функции в ЦНС.

Пептидное семейство меланокортинов.

Меланокортины как нейропептиды.

Локализация меланокортинов в мозге млекопитающих. Проблема места синтеза меланокортинов. Нормальный и поврежденный мозг.

Общие трофические свойства меланокортинов.

Влияние меланокортинов на нейроны ЦНС.

Ноотропные и нейропротекторные эффекты меланокортинов.

Ноотропные и нейропротекторные эффекты Семакса.

Нейротрофины и их характеристика.

Общая характеристика семейства нейротрофинов.

Характеристика нейротрофина BDNF.

Экспрессия BDNF в нервной системе.

Строение гена bdnf и регуляция его транскрипции.

Рецепторы для BDNF.

Суточные колебания уровня BDNF.

Факторы, влияющие на экспрессию BDNF в ЦНС.

Нейродегенерации Альцгеймеровского типа и гены пресенилина.

Клинические и гистопатологические признаки болезни Альцгеймера.

Генетические факторы и гены Болезни Альцгеймера.

Функции генов пресенилинов.

Участие пресенилинов в апоптозе клеток.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Использованные материалы и реагенты.

Приготовление, хранение и проверка чистоты препаратов Семакса и других пептидов

Выделение плазматических мембран мозга.

Определение концентрации белка.

Радиолигандный анализ.

Изучение деградации Семакса в присутствии плазматических мембран и клеточных культур.

Получение и ведение первичных клеточных культур.

Оценка выживаемости нейронов in vitro.:.

Оценка уровня пролиферации клеток.

Подготовка плазмидной ДНК для трансфекции культур клеток млекопитающих.

Трансфекция клеток линии PC 12 с помощью электропорации.

Получение трансфицированных поликлональных культур клеток PC 12 и клонов индивидуального происхождения.

Выделение высокополимерной геномной ДНК клеточных культур.

Анализ стабильно-траясфицированных культур PC 12 с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Изучение дифференцировки PC 12 клеток.

Анализ пролиферации клеток PC 12.

Изучение апоптоза в трансфицированных культурах клеток PC 12.

Получение антител, использованных в работе.

Выделение белковых гомогенатов из культур клеток PC 12, глиальных и нейрональных культур. Электрофорез белков в полиакриламидном геле. Вестерн-блоттинг.

Анализ количества фосфорилированной формы МАР-киназы с помощью иммуноблотинга.

Определение активности холинацетилтрансферазы.

Оценка уровня экспрессии мРНК нейротрофинов в культуре глии.

Оценка уровня экспрессии trkB мРНК в первичных культурах глиальных клеток.

Оценка уровня экспрессии мРНК для bdnf и trkB in vivo.

Определение уровня BDNF в отделах мозга крысы in vivo.

Статистистическая оценка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Связывание Семакса с плазматическими мембранами базальных ядер переднего мозга крысы.

2. Деградация Семакса в присутствии плазматических мембран, культивируемых нейронов и глии базальных ядер переднего мозга крысы.

3. Влияние Семакса на пролиферацию глии базальных ядер переднего мозга крысы in vitro.

4. Влияние Семакса на выживаемость культивируемых нейронов, полученных из базальных ядер переднего мозга крысы.

5. Влияние Семакса на выживаемость тирозингидроксилаза-положительных нейронов, полученных из среднего мозга эмбрионов крысы.

6. Исследование нейропротекторных эффектов Семакса в клеточных моделях индуцированной нейротоксичности. ба. Модель гибели дофаминергических нейронов in vitro, индуцированной 6ГДА. бб. «Пресенилиновая» клеточная модель болезни Альцгеймера.

7. Влияние а-МСГ на уровень BDNF в первичных нейрональных культурах, полученных из среднего мозга эмбрионов крыс.

8. Влияние Семакса на экспрессию мРНК BDNF и NGF в культуре глиальных клеток, полученных из базальных ядер переднего мозга крысы.

9. Влияние Семакса на уровень BDNF в базальных ядрах переднего мозга крысы in vivo

10. Влияние Семакса на экспрессию BDNF в гиппокампе, мозжечке и коре больших полушарий мозга крысы in vivo.

11. Влияние Семакса на экспрессию TrkB в гиппокампе крысы.

12. Возможный механизм действия Семакса в ЦНС.

13. Семакс в качестве лекарственного препарата для лечения нейродегенеративных заболеваний (ишемический инсульт, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона) ■.

14. Клеточная система для тестирования соединений с потенциальной нейропротекторной активностью.

Введение диссертации по теме "Фармакология, клиническая фармакология", Гривенников, Игорь Анатольевич, автореферат

Создание новых эффективных и безопасных фармакологических средств для повышения эффективности умственного труда в сложных условиях и коррекции патологий центральной нервной системы (ЦНС), включающих нейродегенеративные заболевания, особенно актуально в современную эпоху, которая характеризуется повышением влияния стрессогенных факторов на организм человека, а также ухудшением экологической обстановки во многих областях земного шара. Длительное психическое напряжение, сопряженное с указанными выше факторами, постоянно сопровождает многие современные сферы деятельности человека, несмотря на постоянное совершенствование их технического обеспечения, и приводит к повреждению и гибели нервных клеток. Развитие нейродегенеративных процессов в ЦНС также связано с различными патологиями, наследственной предрасположенностью и черепно-мозговыми травмами. Доля нейродегенеративных заболеваний в общей структуре заболеваемости возрастает при увеличении продолжительности жизни [197]. Наиболее распространенными являются болезнь Альцгеймера [8,9,190] и инсульты [13]. Инсульты, по нашему мнению, могут быть отнесены к нейр о дегенеративным заболеваниям в связи с массовой гибелью клеток, в частности нейронов, в ЦНС. В настоящее время количество людей в мире, страдающих болезнью Альцгеймера, составляет по разным оценкам до 10 миллионов человек. По прогнозам, в случае, если ученые не найдут средство против этой болезни, уже через 25 лет от этого недуга будут страдать 22 миллиона жителей нашей планеты, а через 50 лет -примерно 45 миллионов [190,197]. Сходная ситуация и с инсультами. Ежегодно в мире переносят инсульт около 6 миллионов человек, умирает 4,7 миллиона. В России в год регистрируется до 450 тысяч инсультов, причем большинство из них относятся к тяжелой и средней степени тяжести [13]. Лишь около 20% выживших больных могут вернуться к прежней работе.

Современная медицина располагает довольно широким перечнем соединений, обладающих определенным нейропротекторным действием, таких как модуляторы ионных каналов, соединения с анти-эксайтотоксическим действием, противовоспалительные агенты, соединения, понижающие уровень свободных радикалов, нейротрофические факторы [13,197]. Однако ни одно из них не сочетает одновременно высокую эффективность, длительность действия, быстроту наступления эффекта и отсутствие негативных последействий. Большие надежды на успехи в лечении инсультов, болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний связывают в перспективе с клеточной и генной терапией [28,29].

В поисках более эффективных и одновременно безопасных средств ученые обращаются к возможному использованию эндогенных регуляторов организма или близких их аналогов. В первую очередь внимание исследователей привлекают регуляторные пептиды (РП). Открытые еще в прошлом веке, они являются, как сейчас становится понятным, прямыми или опосредованными универсальными регуляторами всех физиологических процессов протекающих в живом организме. Общепринятым является представление о так называемом функциональном континууме РП [4,185,186]. Согласно этой концепции физиологическая функция модулируется достаточно большим количеством РП, как родственных по структуре, так и относящихся к разным семействам; в то же время каждый РП способен модулировать очень большой, хотя и вполне определенный спектр функций. Трактовка эффектов РП осложняется обстоятельством, что, кроме прямого действия, многие из них оказывают влияние на синтез других РП. При этом каждый РП сохраняет свою "индивидуальность", обладая в целом уникальным спектром биоактивности.

Все эти особенности системы РП позволяют выделить два принципиально важных направления реализации их лечебно-профилактического потенциала при коррекции различных патологий ЦНС. Во-первых, использование наиболее рациональных комплексов РП, сложившихся в процессе эволюции живых существ. Во-вторых, наиболее полное раскрытие и адекватное использование спектров активности каждого РП. Кроме исследования спектров активности РП, избранных для практической реализации, необходимо преодоление такого свойства большинства из них, как быстрота их распада во внутренних средах организма. Это требует создания стабилизированных аналогов соответствующих РП, либо создания пептидомиметиков (близких по действию непептидных соединений) [20].

Одним из интересных и перспективных РП являются пептиды семейства меланокортинов, которые включают N-концевые фрагменты адренокортикотропного гормона, альфа-, бета-, гамма- меланоцитстимулирующие гормоны (МСГ) и их синтетические аналоги. Изучение функций этих пептидов выявило наличие у них способности модулировать такие процессы ЦНС как обучение, формирование памяти, внимание, а также различные формы поведения [93]. Кроме того, данные пептиды проявляют нейропротекторные и нейрорегенеративные активности как в центральной, так и в периферической нервной системе [45]. Таким образом, меланокортины проявляют комплекс ноотропных и нейротрофических свойств, что в совокупности со способностью некоторых из них проникать через гематоэнцефалический барьер делает данное пептидное семейство перспективным с точки зрения их медицинского применения.

Единственный клинически применяемый в настоящее время синтетический представитель семейства меланокортинов, Семакс (Met-Glu-His-Phe-Pro-Gly-Pro), разработанный в Институте молекулярной генетики РАН В.Н. Незавибатько с сотр. [22,23] также проявляет аналогичный комплекс свойств. Исследование активности Семакса в экспериментах на животных выявило его способность стимулировать процессы обучения, внимания и запоминания, что нашло в дальнейшем подтверждение в клинических испытаниях Семакса, подтвердивших его способность стимулировать эти процессы и у человека. Клиническое применение Семакса («Семакс-0.1% раствор») выявило его эффективность при лечении травм мозга, расстройств внимания и обучения и ряда других заболеваний ЦНС различного происхождения [3].

Несмотря на имеющиеся сведения о нейротрофических свойствах меланокортинов и характеристике их рецепторов, механизмы их действия во многом остаются неясными [35,162,320]. Поэтому в настоящей работе основное внимание было уделено следующим аспектам:

1. Исследованию молекулярно-генетических механизмов действия аналогов меланокортинов (на примере пептида Семакс) на клетки ЦНС млекопитающих с целью создания на их основе фармакологических препаратов с нейропротекторной активностью, которые могут быть использованы для лечения инсультов и других нейродегенеративных заболеваний (болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона). Особое внимание было уделено взаимосвязи между эффектами меланокортинов и изменениями в уровне экспрессии генов ряда нейротрофических факторов: NGF (фактор роста нервов), BDNF (нейротрофический фактор, выделенный из мозга) в клетках ЦНС.

Следует отметить, что эксперименты in vitro являются необходимой стадией в процессе создания лекарственных соединений и позволяют тестировать гораздо большее количество соединений, чем при проведении экспериментов непосредственно на животных сразу на первых стадиях создания препаратов. Использование генетически измененных или трансфицированных клеточных культур представляет собой удобную и весьма ценную модель как для изучения функций отдельных генов в клетке, так и в качестве систем, моделирующих различные заболевания человека in vitro. В настоящей работе представлены данные по созданию клеточной модели, имеющей отношение к процессам нейродегенерации, протекающей в мозге при развитии болезни Альцгеймера, с использованием нормального и мутантного гена пресенилина-1 (ps-1) человека [293]. С мутациями в этом гене связывают возникновение существенной части случаев ранней семейной (наследственной) формы болезни Альцгеймера [40,293].

Актуальность настоящей работы связана с отсутствием в мировой клинической практике стандартизованных препаратов пептидной природы, способных предотвращать гибель нервных клеток (в частности нейронов различной ергичности) [133]. Кроме того, на наш взгляд, понимание молекулярных механизмов действия Семакса, как представителя семейства меланокортинов, а также разработка клеточных моделей для широкомасштабного скрининга соединений с потенциальной нейропротекторной активностью, не только расширит спектр его возможного применения в клинической практике, но и приведет в перспективе к созданию других эффективных нейропротекторов.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ НАСТОЯЩЕГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Цели:

1. Исследовать молекулярно-генетические механизмы действия аналогов меланокортинов (на примере пептида Семакс) на клетки ЦНС млекопитающих с целью создания на их основе фармакологических препаратов с нейропротекторной активностью.

Для достижения поставленных целей решались следующие задачи:

2. Исследовать возможность существования специфических центров связывания Семакса на плазматических мембранах, полученных из мозга крысы, и изучить основные характеристики его связывания.

3. Изучить способность Семакса стимулировать в клетках ЦНС экспрессию ряда нейротрофинов как на уровне мРНК, так и белка, как промежуточной стадии его нейропротекторного действия.

4. Исследовать возможность участия митоген-активируемых протеинкиназ (МАР-киназ) и гена быстрого ответа c-fos в механизме передачи сигнала от Семакса внутрь клетки.

6. Оценить нейропротекторные свойства Семакса in vitro в модельных системах: а) в системе индуцированной с помощью 6-гидроксидофамина (6-ГДА) цитотоксичности в первичных клеточных культурах; б) в культуре клеток феохромоцитомы крысы линии PC 12, трансфицированных нормальным и мутантным геном пресенилина-1 человека, принимающим участие в патогенезе ранней семейной формы болезни Альцгеймера.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

В рамках настоящей работы разработан новый молекулярно-генетический подход к пептидной фармакотерапии ряда нейродегенеративных заболеваний.

Открыта способность эндогенных пептидов семейства меланокортинов и их аналога Семакса регулировать экспрессию генов нейротрофических факторов в

ЦНС. Создано научное направление по разработке и созданию пептидных нейропротекторов, предназначенных для лечения таких нейродегенеративных заболеваний, как инсульты, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Разработанные и использованные клеточные модели рекомендованы для скрининга фармакологических препаратов с потенциальной нейропротекторной активностью. Полученные в настоящей работе результаты обосновывают перспективность использования системы нейротрофинов и их рецепторов в качестве мишени для поиска лекарственных препаратов с нейропротекторной активностью. На основе результатов выполненного исследования создан оригинальный отечественный лекарственный препарат «Семакс капли назальные 1%» (Патент N 2124365 «Способ лечения ишемического инсульта»), предназначенный для лечения острого периода ишемического инсульта и утвержденный к применению Фармакологическим комитетом Министерства здравоохранения РФ 29 марта 2001 года, протокол № 5. Обнаруженные нейропротекторные свойства Семакса позволили рекомендовать его при лечении таких нейродегенеративных заболеваний как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения работы были представлены на Российских и международных научных конференциях, симпозиумах, съездах, в том числе:

International Symposium "Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds" (Квебек, Канада, 1991), Society for Neuroscience USA Meeting (США, 1995, 1997), Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2001), VIII-om Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001), European Society for Neurochemistry Conference on "Advances in molecular mechanisms of neurological disorders" (Перуджа, Италия, 2001), Российском съезде биохимиков и молекулярных биологов (Санкт-Петербург, 2002), Международном симпозиуме "Neuron Differentiation and Plasticity - Regulation by Intercellular Signals" (Москва, 2003), International Symposium "Neurodegeneration and Neurorepair" (Магдебург, Германия, 2003), Russian-German Symposium "Chemistry and Biology of Peptides" (Фридрихрода, Германия, 2003) Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003; Санкт-Петербург, 2005), Conference of International Society for Neurochemistry "Changes in Neuronal Gene Expression and CNS Drug Responce" (Авиньон, Франция, 2004) и ряде других. В завершенном виде результаты диссертационной работы были представлены на заседаниях Ученого совета ГУ НИИ фармакологии РАМН им. В.В. Закусова (сентябрь 2005 г.) и Ученого совета Института молекулярной генетики РАН (декабрь 2005 г.)

ПУБЛИКАЦИИ

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 243 страницах машинописного текста, включает 8 таблиц и 48 рисунков. Библиография включает 350 наименований.

Заключение диссертационного исследования на тему "Молекулярно-генетические подходы к пептидной фармакотерапии нейродегенеративных заболеваний"

выводы

1. Предложен механизм действия Семакса, в основе которого лежит способность меланокортинов и их аналогов оказывать нейротрофическое и нейропротекторное действие за счет регуляции экспрессии генов нейротрофических факторов.

3. На плазматических мембранах, полученных из мозга крысы, идентифицированы участки связывания для пептида Семакса, характеризующиеся следующими параметрами: Kd =2,41 ± 1,02 х 10"9М и Втах = 33,5 ± 7,9 х 10"15 моль/мг белка.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Арефьева И.А., Алфеева Л.Ю., Андреева Л.А., Гривенников И.А., Зайцев Д.А., Ильина Г.С., Потаман В.Н., Незавибатько В.Н. Изучение связывания аналога АКТГ(4-7) и тафтсина с плазматическими мембранами мозга крысы и с клетками глиомы и нейробластомы. Биологические мембраны. (1991), 8, N 11, 1167-1168.

2. Арефьева И.А., Алфеева Л.Ю., Гривенников И.А. Связывание тафтсина с плазматическими мембранами мозга крысы, клетками глиомы крысы и нейробластомы мыши. Нейрохимия. (1991), 10, 28-37.

3. Potaman V.N., Antonova L.V., Dubynin V.A., Grivennikov I.A., Kamensky A.A., Levitzkaya N.G., Myasoedov N.F., Nezavibatko V.N., Zaitzev D.A., Zolotarev Y.A. Pharmacokinetics of synthetic ACTH (4-10) analog semax following intravenous injection. Synthesis and Applications of Isotopically Labelled Compounds. (1991), E. Buncel and G.W. Kabalka (Ed.). Elsevier Science Publishers B.V., pp. 715-718.

5. Arefyeva I.A., Alfeeva L.Yu., Ilyina G.S., Nezavibatko V.N., Myasoedov N.F., Grivennikov I.A. Binding sites for the immunomodulating peptide tuftsin in rat brain. Neurosci. Res. Communs. (1992), 11, N 3, 137-143.

6. Arefyeva I.A., Andreeva L.A., Nezavibat'ko V.N., Grivennikov I.A. Characterization of tuftsin binding sites in rat brain. Neurosci. Res. Communs. (1993), 12, 2, 85-91.

7. Исаев Н.К., Долотов О.В., Незавибатько В.Н., Викторов И.В., Гривенников И.А. Трофическое действие тафтсина в реагрегированных культурах спинного мозга крысы. Нейрохимия. (1995), 12, 2, 23-27.

8. Ашмарин И.П., Незавибатько В.Н., Мясоедов Н.Ф., Каменский А.А., Гривенников И.А., Пономарева-Степная М.А., Андреева JI.A., Каплан А.Я., Кошелев В.Б., Рясина Т.В. Ноотропный аналог адренокортикотропина 4-10-Семакс (15-летний опыт разработки и изучения). Журнал высшей нервной деятельности им. И.П.Павлова. (1997), 47, 2,420-430.

10. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Насонов E.JL, Журавлева Е.Ю., Гривенников И.А., Арсеньева Е.Л., Суханов И.И., Мясоедов Н.Ф. Исследование роли пептидэргических иммуномодуляторов в остром периоде полушарного ишемического инсульта (Клинический и иммунобиохимический мониторинг). Сб. статей Сосудистая патология нервной системы. Санкт-Петербург, (1998), 187-189.

11. Dolotov О.V., Grivennikov LA. Application of primary cultures of rat fetal neurons to the study of neurotrophic action of peptides, in: New Developments and New Applications in Animal Cell Technology. (1998), Ed: O.-W. Merten, P. Perrin and B. Griffits, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 725-727.

12. Гривенников И.А., Долотов O.B., Гольдина Ю.И. Факторы пептидной природы в процессах пролиферации, дифференцировки и поддержания жизнеспособности клеток нервной системы млекопитающих. Молекулярная биология. (1999), 33, 120-126.

13. Мясоедов Н.Ф., Скворцова В.И., Насонов E.JL, Журавлева Е.Ю., Гривенников И.А., Арсеньева E.JL, Суханов И.И. Изучение механизмов нейропротективного действия семакса в остром периоде ишемического инсульта. Журнал неврологии и психиатрии. (1999), N5, 15-19.

14. Скворцова В.И., Насонов Е.Л., Журавлева Е.Ю., Гривенников И.А., Арсеньева Е.Л., Суханов И.И., Мясоедов Н.Ф., Гусев Е.И. Клинико-иммунобиохимический мониторинг факторов локального воспаления в остром периоде полушарного ишемического инсульта. Журнал неврологии и психиатрии. (1999), N5, 27-31.

15. Асташкин Е.И., Беспалова Ю.Б., Гривенников И.А., Смирнов О.Н., Глезер М.Г., Грачев С.В., Мясоедов Н.Ф. Изучение влияния семакса на Са2+ - ответы нейтрофилов человека. ДАН. (2000), 374, №3, 401-403.

16. Bobrysheva I.V., Chernyavskaya L.I., Onufriev M.V., Grivennikov I.A., Gulyaeva N.V. Hydrogen peroxide dose-dependently inhibits caspase-3 in PC12 cells. Нейрохимия. (2000), 17, № 2, 93-98.

17. Асташкин Е.И., Беспалова Ю.Б., Смирнов О.Н., Гривенников И.А., Глезер М.Г., Мясоедов Н.Ф., Грачев С.В. Сравнительное изучение действия семакса на Са2+-ответы нейтрофилов человека и клеток HL-60. Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. (2000), №4, 50-54.

АКТГ(4-10) - Семакса. Журнал высшей нервной деятельности им. И.П. Павлова. (2001), 51, №2, 220-227.

19. Кост Н.В., Соколов О.Ю., Габаева М.В., Гривенников И.А., Андреева JI.A., Мясоедов Н.Ф., Зозуля А.А. Ингибирующее действие семакса и селанка на энкефалиндеградирующие ферменты сыворотки крови человека. Биоорганическая химия. (2001), 27, 3, 180-183.

20. Зозуля А.А., Кост Н.В., Соколов О.Ю., Габаева М.В., Гривенников И.А., Андреева JI.A., Золотарев Ю.А., Иванов С.В., Андрющенко А.В., Мясоедов Н.Ф., Смулевич А.Б. Ингибирующий эффект селанка на активность энкефалиндеградирующих ферментов как один из возможных механизмов его анксиолитического действия. Бюлл. Эксп. Биол. Мед. (2001), 131, 4, 376-378.

21. Kukhtina V.V., Inozemtseva L.S., Grivennikov I.A., Tsetlin V.I., Utkin Yu.N. Two forms of nerve growth factor from cobra venom prevent the death of PC 12 cells in serum-free medium. Journal of Natural Toxins. (2001), 10, 1,9-16.

22. Асташкин Е.И., Петров E.A., Беспалова Ю.Б., Глезер М.Г., Гривенников И.А., Грачев С.В. Изучение влияния аналога АКТГ(4-10) (пептида Семакса) на дыхательный взрыв нейтрофилов человека. ДАН. (2001), 378, 1, 121-123.

23. Shadrina M.I., Dolotov O.V., Grivennikov I.A., Inozemtzeva L.S., Slominsky P.A., Limborska S.A., Myasoedov N.F. Rapid and efficient NGF and BDNF mRNA induction in the rat glial cell cultures upon АСТЩ4-10) analog "Semax" action. Neuroscience Letters. (2001), 308, 115-118.

24. Асташкин Е.И., Петров E.A., Беспалова Ю.Б., Глезер М.Г., Гривенников И.А., Грачев С.В. Аналог АСТН 4-10 вызывает дыхательный взрыв, связанный с фагоцитами крови человека. Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. (2001), 3, 25-29.

27. Долотов О.В., Середенина Т.С., Левицкая Н.Г., Каменский А.А., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Нагаев И.Ю., Золотарев Ю.А., Гривенников И.А., Энгеле Ю., Мясоедов Н.Ф. Гептапептид Семакс стимулирует экспрессию BDNF в различных отделах мозга крысы in vivo. ДАН. (2003), 391, 131-134.

28. Бобрышева И.В., Григоренко А.П., Кальина Н.Р., Арсеньева Е.Л., Новосадова Е. В., Гривенников И.А., Тарантул В.З., Рогаев Е.И. Влияние изоформ пресенилина-1 человека на пролиферацию и выживаемость клеток феохромацитомы крысы линии PC 12. Биохимия. (2003), 68, 750-758.

30. Долотов О.В., Золотарев Ю.А., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф. Изучение связывания и биодеградации ноотропного и нейропротективного аналога АКТГ(4-10) гептапептида Семакс с плазматическими мембранами базальных ядер переднего мозга крысы. Биоорганическая химия. (2004), 30, 3, 241-246.

33. Ashmarin I.P., Samonina G.E., Lyapina L.A., Kamenskii A.A., Levitskaya N.G., Grivennikov I.A., Dolotov O.Y., Andreeva L.A., Myasoedov N.F. Natural and hybrid ("chimeric") stable regulatory glyproline peptides. Pathophysiology. (2005), 11, 4, 179-185.

34. Eremin K.O., Kudrin V.S., Saransaari P., Oja S., Grivennikov I.A., Myasoedov N.F., Rayevsky K.S. Semax, an АСТЩ4-10) Analogue with Nootropic Properties, Activates Dopamine- and Serotonergic Brain Systems in Animals. Neurochemical Research. (2005), 30 (12), 1493-1500.

36. Золотарев Ю.А., Дадаян А.К., Долотов О.В., Козик B.C., Кост Н.В., Соколов О. Ю., Дорохова Е.М., Мешавкин В.К., Иноземцева JI.C., Габаева М.В., Андреева JI.A., Алфеева Л.Ю., Павлов Т.С., Бадмаева К.Е., Бадмаева С.Е., Бакаева З.В., Копылова Г.Н., Самонина Г.Е., Васьковский Б.В., Гривенников И.А., Зозуля А.А., Мясоедов Н.Ф. Равномерно меченные тритием пептиды в исследованиях по их биодеградации in vivo и in vitro. Биоорганическая химия. (2006), 32, 2, 8088.

ПАТЕНТЫ

1. Патент N 2206573. Семейство пептидов, обладающих нейротропными свойствами. Приоритет от 27.12.2001. Авторы: Ашмарин И.П., Алфеева Л.Ю., Андреева Л.А., Гривенников И.А., Дубынин В.А., Каменский А.А., Козловская М.М., Левицкая Н.Г., Мясоедов Н.Ф., Незавибатько В.Н. Середенин С.Б.

Авторы: Алфеева Л.Ю., Андреева Л.А., Гривенников И.А., Журба Л.Т. Козловская Г.В., Мариничев Б.М., Мясоедов Н.Ф., Нагаев И.Ю., Царегородцев А.Д.

Решение о выдаче патента на изобретение № 2003115020/14(016229).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в данной работе результаты позволили выявить новую неизвестную прежде активность пептида Семакс - синтетического аналога семейства меланокортинов - способность предотвращать спонтанную гибель нервных клеток in vitro. Важным моментом была специфичность действия пептида: преимущественное нейропротекторное действие на определенные типы нервных клеток. Кроме того, были проведены эксперименты по оценке нейропротекторных свойств Семакса в модельных клеточных системах с так называемой индуцированной нейротоксичностью и была выявлена его способность частично предотвращать гибель клеток. Совокупность полученных данных позволила создать на основе Семакс новый отечественный пептидный нейропротектор ("Семакс-1% раствор"), предназначенный для лечения острого периода ишемического инсульта, утвержденный к применению в клинике Фармакологическим комитетом Министерства здравоохранения РФ 29 марта 2001 года протокол № 5. Нейропротекторная активность Семакса позволяет рекомендовать его для клинических испытаний на больных с другими нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, особенно на начальных стадиях этих заболеваний, когда количество погибших нейронов еще незначительно.

Исследование молекулярных механизмов действия Семакса позволило предположить, что один из возможных механизмов осуществления его ноотропного и нейропротекторного действия на ЦНС включает в себя связывание пептида с находящимися на поверхности клеток мозга рецепторами и быстрое увеличение уровня экспрессии генов семейства нейротрофинов (BDNF, NGF) в ряде структур мозга, включая гиппокамп и базальные ядра переднего мозга. В свою очередь, эти белки, регулируя через соответствующие рецепторы как синаптические функции, так и жизнеспособность нейронов, могут быть ответственны за проявление Семаксом его ноотропных и нейропротекторных активностей.

В связи с этим мы считаем, что полученные в работе результаты могут быть использованы для дальнейшего изучения роли нейротрофинов и их рецепторов в осуществлении эффектов Семакса и других меланокортинов на ЦНС, а также для синтеза новых пептидных соединений, обладающих еще более выраженной нейропротекторной активностью. Разработанная модельная клеточная система, включающая первичные нейрональные и глиальные культуры может быть использована для скрининга соединений с потенциальной нейропротекторной активностью. Большой интерес в перспективе представляет и полная расшифровка путей передачи информации от Семакса и других меланокортинов внутрь клетки. Разработанный нами на примере пептида Семакс молекулярно-генетический подход может быть применен и к другим пептидным соединениям, которые могут найти применение для лечения нейр о дегенеративных заболеваний.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2006 года, Гривенников, Игорь Анатольевич

1. Асташкин Е.И., Беспалова Ю.Б., Гривенников И.А., Смирнов О.Н., Глезер М.Г., Грачев С.В., Мясоедов Н.Ф. Изучение влияния семакса на Са2+ ответы нейтрофилов человека. ДАН. 2000, 374, №3, 401-403.

2. Ашмарин И.П., Королева С.В. Роль взаимодействий и функционального континиума нейропептидов (на пути к общей концепции). Вестник Росс. Акад. Мед. Наук. 2002, (6), 40-48.

3. Воронина Т.А., Середенин С.Б. Ноотропные препараты, достижения и новые проблемы. Экспериментальная и клиническая фармакология. 1998, 61(4), 3-9.

4. Виндиш М. Церебролизин последние результаты в оценке мультимодального действия препарата. 3-ий Международный симпозиум по церебролизину. М. 1991. 81-86.

5. Гаврилова С.И., Братсан А.Л. Эпидемиология и факторы риска в болезни Альцгеймера. Вестник Росс. Акад. Мед. Наук. 1999, (1), 39-46.

6. Гаврилова С.И., Жариков Г.А. Современные стратегии патогенетической терапии болезни Альцгеймера. Вестник Росс. Акад. Мед. Наук. 2001,(7), 13-18.

7. Гривенников И.А., Долотов О.В., Гольдина Ю.И. Факторы пептидной природы в процессах пролиферации, дифференцировки и поддержания жизнеспособности клеток нервной системы млекопитающих. Молекулярная биология. 1999,33, 120-126.

8. Гусев Е.И., Скворцова В.И., Журавлева Е.Ю., Андреева Л.А., Незавибатько В.Н., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф. Способ лечения ишемического инсульта. Патент № 2124365. 1999. Бюлл. 1.

9. Гусев Е.И., Скворцова В.И. Ишемия головного мозга. М. Медицина. 2001, 327 с.

10. Еремин К.О., Кудрин B.C., Андреева Л.А., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф., Раевский К.С. Влияние семакса на содержание и обмен моноаминов в мозге мышей линии C57/BL. Нейрохимия. 2002, 19, 202-205.

11. Еремин К.О., Кудрин B.C., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф., Раевский К.С. Влияние семакса на дофамин- и серотонинергические системы мозга. ДАН. 2004, 394, 130-132.

12. Кост Н.В., Соколов О.Ю., Габаева М.В., Гривенников И.А., Андреева Л.А., Мясоедов Н.Ф., Зозуля А.А. Ингибирующее действие семакса и селанка на энкефалиндеградирующие ферменты сыворотки крови человека. // Биоорг. хим. 2001. - Т. 27, № 3, С. 180 - 183.

13. Левицкая Н.Г., Себенцова Е.А., Глазова Н.Ю., Воскресенская О.Г., Андреева

14. Л.А., Алфеева Л.Ю., Каменский А.А., Мясоедов Н.Ф. Исследование192нейротропной активности продуктов ферментативной деградации семакса // Доклады Академии Наук. 2000. - Т. 372, С. 268 - 271.

15. Островская Р.У., Гудашева Т.А., Воронина Т.А., Середенин С.Б. Оригинальный ноотропный и нейропротективный препарат ноопепт. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2002, 65(5), 66-72.

16. Пономарева-Степная М.А., Незавибатько В., Антонова JL, Андреева JL, Алфеева Л., Потаман В., Каменский А., Ашмарин И. Аналог АКТГ(4-10) стимулятор обучения пролонгированного действия // Хим.-фарм. ж. 1984. -Т. 18, №7, С. 790- 795.

17. Пономарева-Степная М.А., Бахарев В.Д., Незавибатько В.Н., Андреева Л.А, Алфеева Л.Ю., Потаман В.Н. Сравнительные исследования аналогов АКТГ(4-10) стимуляторов обучения и памяти. Хим.-фарм. ж. 1986, 20, № 6, С. 667- 670.

18. Раевский К.С., Сотникова Т.Д., Гайнетдинов P.P. Дофаминергические системы мозга: рецепторная гетерогенность, функциональная роль, фармакологическая регуляция. Успехи физиол. наук. 1996, 27(4), 3-30.

19. Ткачук В.А. // Введение в молекулярную эндокринологию. М.: Изд-во МГУ.-1983.-256 с.

20. Угрюмов М.В., Ермаков А.С., Попов А.П., Жданов Р.И. Генная и генно-клеточная терапия и нейродегенеративные заболевания. Вопросы медицинской химии. 2000, №3, 1-11.

21. Угрюмов М.В., Коновалов А.Н., Гусев Е.И. Результаты и перспективы использования клеточных технологий в лечении нейрологических заболеваний. Вестник Росс.Акад. Наук., 2004, 11, 8-17.

22. Умрюхин П.Е., Коплик Е.В., Гривенников И.А., Мясоедов Н.Ф., Судаков К.В.

23. Экспрессия гена c-fos в мозге у крыс с различной устойчивостью к эмоциональному стрессу в условиях внутрибрюшинного введения аналога

24. АКТГ(4-10) Семакса. Журнал высшей нервной деятельности им. И.П. Павлова. 2001, 51, №2, 220-227.

25. Яковлева Е.В., Кузенков B.C., Федоров В.Н., Скворцова В.И., Кошелев В.Б., Гусев Е.И., Ашмарин И.П. Исследование эффективности семакса при глобальной ишемии мозга in vivo // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1999. - Т. 127, С. 172 - 174.

26. Acheson A., Barker Р.А., Alderson R.F., Miller F.D., Murphy R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF // Neuron. 1991. - V. 7, № 2, P. 265 - 275.

27. Adan R.A., Cone R.D., Burbach J.P., Gispen W.H. Differential effects of melanocortin peptides on neural melanocortin receptors // Mol. Pharmacol. 1994. - V. 46, №6, P. 1182- 1190.

28. Alderson R.F., Alterman A.L., Barde Y.A., Lindsay R.M. Brain-derived neurotrophic factor increases survival and differentiated functions of rat septal cholinergic neurons in culture // Neuron. 1990. - V. 5, № 3, P. 297 - 306.

29. Alderson R.F., Curtis R., Alterman A.L., Lindsay R.M., DiStefano P.S. Truncated TrkB mediates the endocytosis and release of BDNF and neurotrophin-4/5 by rat astrocytes and Schwann cells in vitro // Brain Res. 2000. - V. 871, № 2, P. 210 -222.

30. Altar C.A., Cai N., Bliven Т., Juhasz M., Conner J.M., Acheson A.L., Lindsay R.M., Wiegand S.J. Anterograde transport of brain-derived neurotrophic factor and its role in the brain // Nature. 1997. - V. 389, № 6653, P. 856 - 860.

31. Alzheimer's Disease Collaborative Group. The structure of the presenilin 1 (SI82) gene and identification of six novel mutations in early onset AD families. Nat.Genet., 1995, v.ll, pp.219-222.

32. Angeletti R.H., Bradshaw R.A. Nerve growth factor from mouse submaxillary gland: amino acid sequence // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1971. V. 68, № 10, P. 2417-2420.

33. Anton E.S., Weskamp G., Reichardt L.F., Matthew W.D. Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1994. - V. 91, № 7, P. 2795 - 2799.

34. Antonawich F.J., Azmitia E.C., Strand F.L. Rapid neurotrophic actions of an ACTH/MSH(4-9) analogue after nigrostriatal 6-OHDA lesioning. Peptides. 1993, 14(6), 1317-1324.

35. Antonawich F.J., Azmitia E.C., Kramer H.K., Strand F.L. Specificity versus redundancy of melanocortins in nerve regeneration. Ann N Y Acad Sci. 1994, 739, 60-73.

36. Araki, W., Yuasa, K., Takeda, S., Shirotani, K., Takahashi, K., and Tabira, T. Overexpression of presenilin-2 enhances apoptotic death of cultured cortical neurons

37. Ann.N.Y.Acad.Sci., 2000, v.920, pp.241-244.

38. Ashmarin I.P., Nezavibat'ko V.N., Levitskaya N.G., Koshelev V.B., Kamensky A.A. Desing and investigation of АСТЩ4-10) analog deprived of D-aminoacids and hydrophobic radicals // Neuroscience Research Communications. 1995. - V. 16, P. 105 - 112.

39. Attella M.J., Hoffman S.W, Pilotte M.P., Stein D.G. Effects of BIM-22015, an analog of ACTH4-10, on functional recovery after frontal cortex injury // Behav. Neural. Biol. 1992. - V. 57, № 2, P. 157 - 166.

40. Awad J.A., Johnson R.A., Jakobs K.H., Schultz G. Interactions of forskolin andadenylate cyclase. Effects on substrate kinetics and protection against inactivation by heat and N-ethylmaleimide.J Biol Chem. 1983, 258(5), 2960-2965.

41. Azmitia E.C., de Kloet E.R. ACTH neuropeptide stimulation of serotonergic neuronal maturation in tissue culture: modulation by hippocampal cells // Prog. Brain Res. 1987. - V. 72, P. 311 - 318.

42. Baek J.K., Heaton M.B., Walker D.W. Chronic alcohol ingestion: nerve growth factor gene expression and neurotrophic activity in rat hippocampus // Alcohol Clin. Exp. Res. 1994. - V. 18, № 6, P. 1368 - 1376.

43. Barbany G., Persson H. Regulation of Neurotrophin mRNA Expression in the Rat Brain by Glucocorticoids // Eur. J. Neurosci. 1992. - V. 4, № 5, P. 396 - 403.

44. Barde Y.A., Edgar D., Thoenen H. Purification of a new neurotrophic factor frommammalian brain // EMBO J. 1982. - V. 1, № 5, P. 549 - 553.198

45. Barinaga, M. Is apoptosis key in Alzheimer's disease? Science, 1998, v.281, pp.1303-1304.

46. Bayatti N., Engele J. Cyclic AMP modulates the response of central nervous system glia to fibroblast growth factor-2 by redirecting signalling pathways. J Neurochem. 2001,78(5), 972-980.

47. Beckwith B. and Kastin A. / In: Peptide Hormones: Effects and Mechanisms of Action. Eds.: A. Negro-Vilar and P. Conn. Boca Raton: CRC Press, 1987. - P. 196 -218.

48. Berchtold N.C, Oliff H.S., Isackson P., Cotman C.W. Hippocampal BDNF mRNA shows a diurnal regulation, primarily in the exon III transcript // Brain Res. Mol. Brain Res. 1999. - V. 71, № 1, P. 11 - 22.

49. Bessho Y., Nakanishi S., Nawa H. Glutamate receptor agonists enhance the expression of BDNF mRNA in cultured cerebellar granule cells // Brain Res. Mol. Brain Res. 1993.-V. 18, № 3, P. 201 - 208.

50. Bibel M., Barde Y.A. Neurotrophins: key regulators of cell fate and cell shape in the vertebrate nervous system // Genes Dev. 2000. - V. 14, № 23, P. 2919 - 2937.

51. Bothwell M.A., Shooter E.M. Dissociation equilibrium constant of beta nerve growth factor//J. Biol. Chem. 1977. - V. 252, № 23, P. 8532 - 8536.

52. Bova R., Micheli M.R., Qualadrucci P., Zucconi G.G. BDNF and trkB mRNAs oscillate in rat brain during the light-dark cycle // Brain Res. Mol. Brain Res.1998.-V. 57, №2, P. 321 -324.

53. Brenneman D.E., Westbrook G.L., Fitzgerald S.P., Ennist D.L., Elkins K.L., Ruff M.R., Pert C.B. Neuronal cell killing by the envelope protein of HIV and its prevention by vasoactive intestinal peptide // Nature. 1988. - V. 335, № 6191, P. 639 - 642.

54. Brownstein M.J. Localizing peptides in the central nervous system: a progress report // Adv. Biochem. Psychopharmacol. 1980. - V. 21, P. 365 - 371.

55. Buchman V.L., Davies A.M. Different neurotrophins are expressed and act in a developmental sequence to promote the survival of embryonic sensory neurons // Development. 1993.-V. 118, № 3, P. 989 - 1001.

56. Carter B.D., Kaltschmidt C., Kaltschmidt В., Offenhauser N., Bohm-Matthaei R., Baeuerle P.A., Barde Y.A. Selective activation of NF-kappa В by nerve growth factor through the neurotrophin receptor p75 // Science. 1996. - V. 272, № 5261, P. 542 - 545.

57. Casaccia-Bonnefil P., Carter B.D., Dobrowsky R.T., Chao M.V. Death of oligodendrocytes mediated by the interaction of nerve growth factor with its receptor p75 //Nature. 1996. - V. 383, № 6602, P. 716 - 719.

58. Castren E., Zafra F., Thoenen H., Lindholm D. Light regulates expression of brain-derived neurotrophic factor mRNA in rat visual cortex // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1992. V. 89, № 20, P. 9444 - 9448.

59. Castren E. Neurotrophins as mediators of drug effects on mood, addiction andneuroprotection. Mol. Neurobiology. 2004, 29, 289-301.

60. Cirelli C., Tononi G. Differential expression of plasticity-related genes in waking and sleep and their regulation by the noradrenergic system // J Neurosci. 2000. -V. 20, №24, P. 9187 -9194.

61. Cole C.S., Richards K.C. Sleep and cognition in people with Alzheimer's disease. Issues Ment Health Nurs. 2005, 26(7), 687-98.

62. Collazo D., Takahashi H., McKay R.D. Cellular targets and trophic functions of neurotrophin-3 in the developing rat hippocampus // Neuron. 1992. - V. 9, № 4, P. 643 -656.

63. Combarros, О., varez-Arcaya, A., Sanchez-Guerra, M., Infante, J., and Berciano, J. Candidate gene association studies in sporadic Alzheimer's disease. Dement.Geriatr.Cogn Disord., 2002, v.14, pp.41-54.

64. Daniels D., Patten C.S., Roth J.D., Yee D.K., Fluharty S.J. Melanocortin receptorsignaling through mitogen-activated protein kinase in vitro and in rat hypothalamus. Brain Res. 2003, 986(1-2), 1-11.

65. Davey F., Davies A.M. TrkB signalling inhibits p75-mediated apoptosis induced by nerve growth factor in embryonic proprioceptive neurons // Curr. Biol. 1998. - V. 8, №16, P. 915-918.

66. Davies A.M. The survival and growth of embryonic proprioceptive neurons is promoted by a factor present in skeletal muscle // Dev. Biol. 1986. - V. 115, № 1, P. 56 - 67.

67. Davies A.M., Horton A., Burton L.E., Schmelzer C., Vandlen R., Rosenthal A.

68. Neurotrophin-4/5 is a mammalian-specific survival factor for distinct populations of sensory neurons//J. Neurosci. 1993.-V. 13, № 11, P. 4961 - 4967.

69. Deng, G., Pike, C. J., and Cotman, C. W. Alzheimer-associated presenilin-2 confers increased sensitivity to apoptosis in PC12 cells. FEBS Lett., 1996, v.397, pp.50-54.

70. De Wied D. Influence of anterior pituitary on avoidance learning and escape behavior. Am.J. Physiol. 1964, 207, 255-259.

71. De Wied D., Witter A., Greven H.M. Commentary: behaviourally active ACTH analogues // Biochem. Pharmacol. 1975. - V. 24, № 16, P. 1463 - 1468.

72. De Wied D., Jolles J. Neuropeptides derived from pro-opiocortin: behavioral, physiological, and neurochemical effects // Physiol. Rev. 1982. - V. 62, № 3, P. 976- 1059.

73. Du Y.C., Yan Q.W., Qiao L.Y. Function and molecular basis of action of vasopressin 4-8 and its analogues in rat brain // Prog Brain Res. 1998. - V. 119, P. 163 - 175.

74. Dudar J.D., Whishaw I.Q., Szerb J.C. Release of acetylcholine from thehippocampus of freely moving rats during sensory stimulation and running //

75. Neuropharmacology. 1979. - V. 18, № 8-9, P. 673 - 678.204

76. Duman R.S., Heninger G.R., Nestler E.J. A molecular and cellular theory of depression // Arch. Gen. Psychiatry. 1997. - V. 54, № 7, P. 597 - 606.

77. Eckenstein F., Sofroniew M.V. Identification of central cholinergic neurons containing both choline acetyltransferase and acetylcholinesterase and of central neurons containing only acetylcholinesterase. JNeurosci. 1983, 3(11), 2286-2291.

78. Eckert, A., Marques, C. A., Keil, U., Schussel, K., and Muller, W. E. Increased apoptotic cell death in sporadic and genetic Alzheimer's disease. Ann.N.Y.Acad.Sci, 2003, v.1010, pp.604-609.

79. Eggert K., Schlegel J, Oertel W, Wurz C. Krieg J.C, Vedder H. Glial cell linederived neurotrophic factor protects dopaminergic neurons from 6-hydroxydopamine toxicity in vitro.Neurosci Lett. 1999, 269(3), 178-182.

80. Egles C., Rene F., Varon S., Louis J.C., Felix J.M., Schimchowitsch S. Differentiation of rat hypothalamic dopaminergic neurons is stimulated in vitro by target cells: the melanotrophs // Eur. J. Neurosci. 1998. - V. 10, № 4, P. 1270 -1281.

81. Engele J. Spatial and temporal growth factor influences on developing midbrain dopaminergic neurons. J. Neurosci. Res. 1998, 53(4), 405-414.

82. Engele J, Schilling K. Growth factor-induced c-fos expression defines distinct subsets of midbrain dopaminergic neurons. Neuroscience. 1996, 73(2), 397-406.

83. Ernfors P., Persson H. Developmental^ Regulated Expression of HDNF/NT-3 mRNA in Rat Spinal Cord Motoneurons and Expression of BDNF mRNA in Embryonic Dorsal Root Ganglion // Eur. J. Neurosci. 1991. - V. 3, № 10, P. 953 -961.

84. Evans R.M. The steroid and thyroid hormone receptor superfamily // Science. -1988. V. 240, № 4854, P. 889 - 895.

85. Fekete M., De Wied D. Dose-related facilitation and inhibition of passive avoidance behavior by the ACTH 4-9 analog (ORG 2766) // Pharmacol. Biochem. Behav. 1982. - V. 17, № 2, P. 177 - 182.

86. Felling R.J., Levison S.W. Enhanced neurogenesis following stroke // J. Neurosci. Res. 2003. - V. 73, № 3, P. 277 - 283.

87. Ferrer I., Ballabriga J., Marti E., Perez E., Alberch J., Arenas E. BDNF up-regulates TrkB protein and prevents the death of CA1 neurons following transient forebrain ischemia // Brain Pathol. 1998. - V. 8, № 2, P. 253 - 261.

88. Finkbeiner S., Tavazoie S.F., Maloratsky A., Jacobs K.M., Harris K.M., Greenberg M.E. CREB: a major mediator of neuronal neurotrophin responses // Neuron. -1997,-V. 19, №5, P. 1031 1047.

89. Forman, M. S. Genotype-phenotype correlations in FTDP-17: does form follow function? Exp.Neurol., 2004, v. 187, pp.229-234.

90. Forslin Aronsson S., Spulber S., Popescu L.M., Winblad В., Post C., Oprica M.,

91. Schultzberg M. alpha-Melanocyte-stimulating hormone is neuroprotective in ratglobal cerebral ischemia. Neuropeptides. 2006, 40(1), 65-75.207

92. Frade J.M., Rodriguez-Tebar A., Barde Y.A. Induction of cell death by endogenous nerve growth factor through its p75 receptor // Nature. 1996. - V. 383, № 6596, P. 166- 168.

93. Freshney R. // Culture of Animal Cells: a Manual of Basic Technique. New-York: Wiley-Liss, 1994.-486 p.

94. Fumagalli F., Racagni G., Riva M.A. The expanding role of BDNF: a therapeutic target for Alzheimer's disease? The Pharmacogenomics journal. 2006, 6, 8-15.

95. Gispen W.H., De Koning P., Kuiters R.R., Van der Z.e.C., Verhaagen J. On the neurotrophic action of melanocortins // Prog. Brain Res. 1987. - V. 72, P. 319 -331.

96. Givelli O., Birnberg N., Herbert E. Detection and quantitation of proopiomelanocortin mRNA in pituitary and brain tissues from different species // J. Biol. Chem. 1982. - V. 297, P. 6783 - 6787.

97. Glenner G.G., Wong, C.W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1984, 120, .885-890.

98. Glenner G.G., Wong C.W. Alzheimer's disease and Down's syndrome: sharing of a unique cerebrovascular amyloid fibril protein. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1984, 122, 1131-1135.

99. Gnahn H., Hefti F., Heumann R., Schwab M.E., Thoenen H. NGF-mediated increase of choline acetyltransferase (ChAT) in the neonatal rat forebrain: evidence for a physiological role of NGF in the brain? // Brain Res. 1983. - V. 285, № 1, P. 45 - 52.

100. Gibbs R.B. Levels of trkA and BDNF mRNA, but not NGF mRNA, fluctuate across the estrous cycle and increase in response to acute hormone replacement // Brain Res. 1998. - V. 787, № 2, P. 259 - 268.

101. Gotz R., Koster R., Winkler C., Raulf F, Lottspeich F., Schartl M., Thoenen H. Neurotrophin-6 is a new member of the nerve growth factor family // Nature. -1994. V. 372, № 6503, P. 266 - 269.

102. Gotz R., Schartl M. The conservation of neurotrophic factors during vertebrate evolution // Сотр. Biochem. Physiol. Pharmacol. Toxicol. Endocrinol. 1994. - V.108, № 1,Р. 1 10.

103. Gozes I., Fridkinb M., Hill J.M., Brenneman D.E. Pharmaceutical VIP: prospects and problems. Curr. Med. Chem. 1999, 6(11), 1019-1034.

104. Gozes I. Neuroprotective peptide drug delivery and development: potential new therapeutics. TRENDS inNeurosciences.2001, 12, 700-705.

105. Graeber, M. B. and Mehraein, P. Reanalysis of the first case of Alzheimer's disease. Eur.Arch.Psychiatry Clin.Neurosci., 1999, v.249 Suppl 3, pp.10-13.

106. Gray E.G., Whittaker V.P. The isolation of nerve endings from brain: an electron-microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation // J. Anat. 1962. - V. 96, P. 79 - 88.

107. Greene L., Tischer A. Establishmet of a nonadrenergic clonal line of rat adrenal pheochromocytoma cellc wich respond to nerve grouth factor. PNAS., 1976, 73, 2424-2428.

108. Griesbach G.S., Hovda D.A., Molteni R., Wu A., Gomez-Pinilla F. Voluntary exercise following traumatic brain injury: brain-derived neurotrophic factor upregulation and recovery of function. Neuroscience. 2004,125(1),129-139.

109. Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Quinlan, M., Tung, Y. C., Zaidi, M. S., and Wisniewski, H. M. Microtubule-associated protein tau. A component of Alzheimer paired helical filaments. J.Biol.Chem, 1986, v.261, pp.6084-6089.

110. Guo, Q., Fu, W., Holtsberg, F. W., Steiner, S. M., and Mattson, M. P. Superoxide mediates the cell-death-enhancing action of presenilin-1 mutations. J. Neurosci. Res., 1999, v.56, pp. 457-470.

111. Hagen R.M. Sapolsky M.P. Mattson S. Christakos 0. Early induction of mRNA for calbindin-D28k and BDNF but not NT-3 in rat hippocampus after kainic acid treatment. Brain Res. Mol. Brain Res. 1997, 47, 183-194.

112. Hall J., Thomas K.L., Everitt B.J. Rapid and selective induction of BDNF expression in the hippocampus during contextual learning // Nat. Neurosci. 2000. - V. 3, № 6, P. 533 - 535.

113. Hallbook F., Ibanez C.F., Persson H. Evolutionary studies of the nerve growth factor family reveal a novel member abundantly expressed in Xenopus ovary // Neuron. 1991. - V. 6, № 5, P. 845 - 858.

114. Hardy J.A., Higgins G.A. Alzheimer's disease: the amyloid cascade hypothesis. Science, 1992,256, 184-185.

115. Hardy, J., Duff, K., Hardy, K. G., Perez-Tur, J., and Hutton, M. Genetic dissection of Alzheimer's disease and related dementias: amyloid and its relationship to tau. Nat.Neurosci., 1998, v.l, pp.355-358.

116. Hardy J. The Genetics of Alzheimer's Disease. Alzheimer's Disease and Related Disorders: Research Advances. Ana Asian Intl. Acad, of Aging, Bucharest, Romania, 2003, 29-47.

117. Hattori, S., Sakuma, K., Wakutani, Y., Wada, K., Shimoda, M., Urakami, K., Kowa, H., and Nakashima, K. A novel presenilin 1 mutation (Y154N) in a patient with early onset Alzheimer's disease with spastic paraparesis. Neurosci.Lett., 2004, v.368,

118. Hefti F., Hartikka J. and J. S.-R. / In: A Dissection and Tissue Culture Manual of the Nervous System. Eds.: A. Shahar and J. de Vellis. New-York: Wiley-Liss, 1989. P. 172-182.

119. Henderson C.E. Role of neurotrophic factors in neuronal development // Curr. Opin. Neurobiol. 1996. - V. 6, № 1, P. 64 - 70.

120. Hock F.J., Gerhards H.J., Wiemer G., Usinger P., Geiger R. Learning and memory processes of an ACTH4-9 analog (ebiratide; Hoe 427) in mice and rats // Peptides. 1988. V. 9, № 3, P. 575 581.

121. Hofer M., Pagliusi S.R., Hohn A., Leibrock J., Barde Y.A. Regional distribution of brain-derived neurotrophic factor mRNA in the adult mouse brain // EMBO J. -1990,-V. 9, № 8, P. 2459 2464.

122. Hohn A., Leibrock J., Bailey K., Barde Y.A. Identification and characterization of a novel member of the nerve growth factor/brain-derived neurotrophic factor family // Nature. 1990. - V. 344, № 6264, P. 339 - 341.

123. Hoi E.M., Gispen W.H., Bar P.R. ACTH-related peptides: receptors and signal transduction systems involved in their neurotrophic and neuroprotective actions // Peptides. 1995. - V. 16, № 5, P. 979 - 993.

124. Hoi E.M., Verhage M., Gispen W.H., Bar P.R. The role of calcium and cAMP in the mechanism of action of two melanocortins: alpha MSH and the ACTH4-9 analogue Org 2766 // Brain Res. 1994. - V. 662, № 1-2, P. 109 - 116.

125. Hutter P., Johansson M., Saria A., Humpel C. Acute and chronic noradrenergic214regulation of neurotrophin messenger RNA expression in rat hippocampus: evidence from lesions and organotypic cultures // Neuroscience. 1996. - V. 70, № 1,P. 15-29.

126. Hyman C., Hofer M., Barde Y.A., Juhasz M., Yancopoulos G.D., Squinto S.P., Lindsay R.M. BDNF is a neurotrophic factor for dopaminergic neurons of the substantia nigra//Nature. 1991. - V. 350, № 6315, P. 230 - 232.

127. Isackson P.J., Towner M.D., Huntsman M.M. Comparison of mammalian, chicken and Xenopus brain-derived neurotrophic factor coding sequences // FEBS Lett. -1991,- V. 285, №2, P. 260 -264.

128. Ishibashi S., Kurokawa Т., Higashi K., Dan'ura T. Regulation of the catalytic unit of adenylate cyclase system in rat brain. Adv. Exp. Med. Biol. 1984,175, 63-74.

129. Iwasaki Y., Gay В., Wada K., Koizumi S. Association of the Src family tyrosine kinase Fyn with TrkB // J. Neurochem. 1998. - V. 71, № 1, P. 106 -111.

130. Janicki, S. and Monteiro, M. J. Increased apoptosis arising from increased expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin-2 mutation (N1411). J.Cell Biol., 1997, v. 139, pp.485-495.

131. Jing S., Tapley P., Barbacid M. Nerve growth factor mediates signal transductionthrough trk homodimer receptors // Neuron. 1992. - V. 9, № 6, P. 1067 - 1079.215

132. Johnson EM J.r., Gorin P.D., Brandeis L.D., Pearson J. Dorsal root ganglion neurons are destroyed by exposure in utero to maternal antibody to nerve growth factor// Science. 1980. - V. 210, № 4472, P. 916 - 918.

133. Johnson J.E., Barde Y.A., Schwab M., Thoenen H. Brain-derived neurotrophic factor supports the survival of cultured rat retinal ganglion cells // J. Neurosci. -1986,-V. 6, № 10, P. 3031 3038.

134. Jorge R.E., Robinson R.G., Arndt S., Starkstein S. Mortality and poststroke depression: a placebo-controlled trial of antidepressants // Am. J. Psychiatry. -2003. V. 160, № 10, P. 1823 - 1829.

135. Kang J., Lemaire H.G., Unterbeck A., Salbaum J.M., Masters C.L., Grzeschik K.H., Multhaup G., Beyreuther K., Muller-Hill B. The precursor of Alzheimer's disease amyloid A4 protein resembles a cell-surface receptor. Nature. 1987, 325, 733-736.

136. Katoh-Semba R., Takeuchi I.K., Semba R., Kato K. Distribution of brain-derived neurotrophic factor in rats and its changes with development in the brain // J. Neurochem. 1997. - V. 69, № 1, P. 34 - 42.

137. Kawamata Т., Yamaguchi Т., Shin-ya K., Hori T. Divergence in signaling pathways involved in promotion of cell viability mediated by bFGF, NGF, and EGF in PC 12 cells. Neurochem Res. 2003, 28(8),1221-1225.

138. Kehoe, P., Wavrant-De, V. F, Crook, R., Wu, W. S., Holmans, P., Fenton, I., Spurlock, G., Norton, N., Williams, H., Williams, N., Lovestone, S., Perez-Tur, J., Hutton, M., Chartier-Harlin, M. C., Shears, S., Roehl, K., Booth, J., Van, V. W.,

139. Ramie, D., Williams, J., Goate, A., Hardy, J., and Owen, M. J. A full genome scan for late onset Alzheimer's disease. Hum.Mol.Genet., 1999, v.8, pp.237-245.

140. Kenny P.J., File S.E., Rattray M. Acute nicotine decreases, and chronic nicotine increases the expression of brain-derived neurotrophic factor mRNA in rat hippocampus // Brain Res. Mol. Brain Res. 2000. - V. 85, № 1-2, P. 234 - 238.

141. Kernie S.G., Liebl D.J., Parada L.F. BDNF regulates eating behavior and locomotor activity in mice // EMBO J. 2000. - V. 19, № 6, P. 1290 - 1300.

142. Khachaturian H., Alessi N.E., Munfakh N., Watson S.J. Ontogeny of opioid and related peptides in the rat ens and pituitary: an immunocytochemical study // Life Sci. 1983. - V. 33 Suppl 1, P. 61 - 64.

143. Knapp R.J., Goldenberg R., Shuck C., Cecil A., Watkins J., Miller C., Crites G., Malatynska E. Antidepressant activity of memory-enhancing drugs in the reduction of submissive behavior model // Eur. J. Pharmacol. 2002. - V. 440, № 1, P. 27 -35.

144. Kolch W.Coordinating ERK/MAPK signaling through scaffolds and inhibitors. Nature reviews.,2005, 6, 827-837.

145. Koroleva S.V., Ashmarin I.P. A functional continuum of regulatory anxietyenhancing peptides. The search for complexes providing the optimal basis for217developing inhibitory therapeutic agents.Neurosci. Behav. Physiol. 2006, 36(2),157-162.

146. Koroleva S.V., Ashmarin I.P. Functional continuum of regulatory peptides (RPs): vector model of RP-effects representation. J. Theor. Biol. 2002, 216(3), 257-271.

147. Korte M., Carroll P., Wolf E., Brem G., Thoenen H., Bonhoeffer T. Hippocampal long-term potentiation is impaired in mice lacking brain-derived neurotrophic factor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1995. V. 92, № 19, P. 8856 - 8860.

148. Kovalchuk Y., Hanse E., Kafitz K.W., Konnerth A. Postsynaptic Induction of BDNF-Mediated Long-Term Potentiation // Science. 2002. - V. 295, № 5560, P. 1729- 1734.

149. Landrigan P.J., Sonawane В., Butler R., Trasande L., Callan R., Droller D. Early environmental origins of neurodegenerative disease in later life. Environmental Health Perspectives, 2005, 113,9, 1230-1233.

150. Lapchak P.A., Araujo D.M., Heffi F. Cholinergic regulation of hippocampal brain-derived neurotrophic factor mRNA expression: evidence from lesion and chronic cholinergic drug treatment studies // Neuroscience. 1993. - V. 52, № 3, P. 575 - 585.

151. Leibrock J., Lottspeich F., Hohn A., Hofer M., Hengerer В., Masiakowski P., Thoenen H., Barde Y.A. Molecular cloning and expression of brain-derived neurotrophic factor //Nature. 1989. - V. 341, № 6238, P. 149 - 152.

152. Levi-Montalcini R. The nerve growth factor 35 years later // Science. 1987. - V. 237, №4819, P. 1154 - 1162.

153. Levy-Lahad E., Wasco W., Poorkaj P., Romano D.M., Oshima J., Pettingell W.H., Yu С. E., Jondro P.D., Schmidt S.D., Wang K. Candidate gene for the chromosome 1 familial Alzheimer's disease locus. Science, 1995, 269, 973-977.

154. Lewko M., Safar E., Birrer R. Advances in the treatment of dementia. P & Т., 2002, 27, 10,514-520.

155. Li, X. and Greenwald, I. HOP-1, a Caenorhabditis elegans presenilin, appears to be functionally redundant with SEL-12 presenilin and to facilitate LIN-12 and GLP-1 signaling. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 1997, v.94, pp. 12204-12209.

156. Li, J., Xu, M., Zhou, H., Ma, J., and Potter, H. Alzheimer presenilins in the nuclear membrane, interphase kinetochores, and centrosomes suggest a role in chromosome segregation. Cell, 1997, v.90, pp.917- 927.

157. Liang F.Q., Walline R., Earnest D.J. Circadian rhythm of brain-derived neurotrophic factor in the rat suprachiasmatic nucleus // Neurosci. Lett. 1998. - V. 242, № 2, P. 89 - 92.

158. Lindefors N., Ernfors P., Falkenberg Т., Persson H. Septal cholinergic afferents regulate expression of brain-derived neurotrophic factor and beta-nerve growth factor mRNA in rat hippocampus // Exp. Brain Res. 1992. - V. 88, № 1, P. 78 -90.

159. Lindsay R.M. Neurotrophic growth factors and neurodegenerative diseases: therapeutic potential of the neurotrophins and ciliary neurotrophic factor // Neurobiol. Aging. 1994. - V. 15, № 2, P. 249 - 251.

160. Lindvall O., Kokaia Z., Bengzon J., Elmer E., Kokaia M. Neurotrophins and brain insults // Trends Neurosci. 1994. - V. 17, № 11, P. 490 - 496.

161. Linnik M.D., Zobrist R.H., Hatfield M.D. Evidence supporting a role for programmed cell death in focal cerebral ischemia in rats // Stroke. 1993. - V. 24, № 12, P. 2002 - 8; 2008-2009.

162. Liotta A.S., Gildersleeve D., Brownstein M.J., Krieger D.T. Biosynthesis in vitro of220immunoreactive 31,000-dalton corticotropin/beta-endorphin-like material by bovine hypothalamus //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1979. V. 76, № 3, P. 1448 - 1452.

163. Liu X., Ernfors P., Wu H., Jaenisch R. Sensory but not motor neuron deficits in mice lacking NT4 and BDNF // Nature. 1995. - V. 375, № 6528, P. 238 - 241.

164. MacLennan A.J., Lee N., Walker D.W. Chronic ethanol administration decreases brain-derived neurotrophic factor gene expression in the rat hippocampus // Neurosci. Lett. 1995. - V. 197, № 2, P. 105 - 108.

165. Maisonpierre P.C., Belluscio L., Squinto S., Ip N.Y., Furth M.E., Lindsay R.M., Yancopoulos G.D. Neurotrophin-3: a neurotrophic factor related to NGF and BDNF // Science. 1990. - V. 247, № 4949 Pt 1, P. 1446 - 1451.

166. Majdan M., Lachance C., Gloster A., Aloyz R., Zeindler C., Bamji S., Bhakar A., Belliveau D., Fawcett J., Miller F.D., Barker P.A. Transgenic mice expressing the intracellular domain of the p75 neurotrophin receptor undergo neuronal apoptosis //

167. J. Neurosci. 1997. - V. 17, № 18, P. 6988 - 6998.

168. Mamounas L.A., Blue M.E., Siuciak J.A., Altar C.A. Brain-derived neurotrophic factor promotes the survival and sprouting of serotonergic axons in rat brain // J. Neurosci. 1995. - V. 15, № 12, P. 7929 - 7939.

169. Marmigere F., Givalois L., Rage F., Arancibia S., Tapia-Arancibia L. Rapid induction of BDNF expression in the hippocampus during immobilization stress challenge in adult rats // Hippocampus. 2003. - V. 13, № 5, P. 646 - 655.

170. Martinez H.J., Dreyfus C.F., Jonakait G.M., Black I.B. Nerve growth factor promotes cholinergic development in brain striatal cultures // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1985. V. 82, № 22, P. 7777 - 7781.

171. Maurer, K., Volk, S., and Gerbaldo, H. Auguste D and Alzheimer's disease. Lancet, 1997, v.349, pp.1546-1549.

172. Mattson, M. P. and Chan, S. L. Neuronal and glial calcium signaling in Alzheimer's disease. Cell Calcium, 2003, v.34, pp.385-397.

173. Mattson, M. P. Oxidative stress, perturbed calcium homeostasis, and immune dysfunction in Alzheimer's disease. J.Neurovirol., 2002, v.8, pp.539-550.

174. McDonald N.Q., Blundell T.L. Crystallization and characterization of the high molecular weight form of nerve growth factor (7 S NGF) // J. Mol. Biol. 1991. -V. 219, №4, P. 595 - 601.

175. McDonald N.Q., Hendrickson W.A. A structural superfamily of growth factors containing a cystine knot motif// Cell. 1993. - V. 73, № 3, P. 421 - 424.

176. Mei Dong, Yongfei Wu 1, Yunxia Fan, Ming Xu, Jianhua Zhang, c-fos modulates brain-derived neurotrophic factor mRNA expression in mouse hippocampal CA3 and dentate gyrus neurons. Neuroscience Letters.2006, 313, 108-111.

177. Minichiello L., Korte M., Wolfer D., Kuhn R., Unsicker K., Cestari V., Rossi-Arnaud C., Lipp H.P., Bonhoeffer Т., Klein R. Essential role for TrkB receptors in hippocampus-mediated learning // Neuron. 1999. - V. 24, № 2, P. 401 -414.

178. Miranda R.C., Sohrabji F., Toran-Allerand D. Interactions of estrogen with the neurotrophins and their receptors during neural development // Horm. Behav. -1994.-V. 28, №4, P. 367 -375.

179. Mirsky I., Miller C., Stein M. Relation of adrenocortical activity and adaptive behavior // Psychosom. Med. 1953. - V. 15, № 6, P. 584 - 84.

180. Mizuno Т., Endo Y., Arita J., Kimura F. Acetylcholine release in the rat hippocampus as measured by the microdialysis method correlates with motor activity and exhibits a diurnal variation // Neuroscience. 1991. - V. 44, № 3, P. 607-612.

181. Mizuno Т., Arita J., Kimura F. Spontaneous acetylcholine release in the hippocampus exhibits a diurnal variation in both young and old rats // Neurosci. Lett. 1994. - V. 178, № 2, P. 271 - 274.

182. Mizuno M., Yamada K., Olariu A., Nawa H., Nabeshima T. Involvement of brain-derived neurotrophic factor in spatial memory formation and maintenance in a radial arm maze test in rats // J. Neurosci. 2000. - V. 20, № 18, P. 7116 - 7121.

183. Mobley W.C, Rutkowski J.L, Tennekoon G.I, Buchanan K, Johnston M.V. Choline acetyltransferase activity in striatum of neonatal rats increased by nerve growth factor // Science. 1985. - V. 229, № 4710, P. 284 - 287.

184. Moon, R. T, Kohn, A. D, De Ferrari, G. V, and Kaykas, A. WNT and beta-catenin signalling: diseases and therapies. Nat.Rev.Genet, 2004, v.5, pp.691-701.

185. Mu J.S, Li W.P, Yao Z.B, Zhou X.F. Deprivation of endogenous brain-derived neurotrophic factor results in impairment of spatial learning and memory in adult rats // Brain Res. 1999. - V. 835, № 2, P. 259 - 265.

186. Murphy J, Miller R.E. The effect of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) on avoidance conditioning in the rat // J. Сотр. Physiol. Psychol. 1955. - V. 48, № 1, P. 47 -49.

187. Narisawa-Saito M., Nawa H. Differential regulation of hippocampal neurotrophins during aging in rats // J. Neurochem. 1996. - V. 67, № 3, P. 1124 - 1131.

188. Nawa H., Bessho Y., Carnahan J., Nakanishi S., Mizuno K. Regulation of neuropeptide expression in cultured cerebral cortical neurons by brain-derived neurotrophic factor // J. Neurochem. 1993. - V. 60, № 2, P. 772 - 775.

189. Neeper S.A., Gomez-Pinilla F., Choi J., Cotman C. Exercise and brain neurotrophins //Nature. 1995. - V. 373, № 6510, P. 109.

190. Neeper S.A., Gomez-Pinilla F., Choi J., Cotman C.W. Physical activity increases mRNA for brain-derived neurotrophic factor and nerve growth factor in rat brain // Brain Res. 1996. - V. 726, № 1-2, P. 49 - 56.

191. Nibuya M., Nestler E.J., Duman R.S. Chronic antidepressant administration increases the expression of cAMP response element binding protein (CREB) in rathippocampus // J. Neurosci. 1996. - V. 16, № 7, P. 2365 - 2372.

192. Nilsson A.S., Fainzilber M., Falck P., Ibanez C.F. Neurotrophin-7: a novel member of the neurotrophin family from the zebrafish // FEBS Lett. 1998. - V. 424, № 3, P. 285 -290.

193. Novak, M., Kabat, J., and Wischik, С. M. Molecular characterization of the minimal protease resistant tau unit of the Alzheimer's disease paired helical filament. EMBO J, 1993, v.12, pp.365-370.

194. Nowakowska E., Chodera A., Kus K. Anxiolytic and memory improving activity of fluoxetine // Pol. J. Pharmacol. 1996. - V. 48, № 3, P. 255 - 260.

195. Oberdick J, Smeyne RJ, Mann JR, Zackson S, Morgan JI. A promoter that drives transgene expression in cerebellar Purkinje and retinal bipolar neurons. Science. 1990, 13; 248(4952), 223-226.

196. Obrietan K., Gao X.B., Van Den P.o.A. Excitatory actions of GABA increase

197. BDNF expression via a MAPK-CREB-dependent mechanism~a positive feedback226circuit in developing neurons // J. Neurophysiol. 2002. - V. 88, № 2, P. 1005 -1015.

198. Okazawa H., Murata M., Watanabe M., Kamei M., Kanazawa I. Dopaminergic stimulation up-regulates the in vivo expression of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in the striatum // FEBS Lett. 1992. - V. 313, № 2, P. 138 - 142.

199. Oliff H.S., Berchtold N.C., Isackson P., Cotman C.W. Exercise-induced regulation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) transcripts in the rat hippocampus // Brain Res. Mol. Brain Res. 1998. - V. 61, № 1-2, P. 147 - 153.

200. Oliver C., Porter J.C. Distribution and characterization of alpha-melanocyte-stimulating hormone in the rat brain // Endocrinology. 1978. -V. 102, №3, P. 697 -705.

201. O'Malley B. The steroid receptor superfamily: more excitement predicted for the future // Mol. Endocrinol. 1990. - V. 4, № 3, P. 363 - 369.

202. Oppenheim R.W., Yin Q.W., Prevette D., Yan Q. Brain-derived neurotrophic factor rescues developing avian motoneurons from cell death // Nature. 1992. - V. 360, № 6406, P. 755 - 757.

203. Pellegri G., Magistretti P.J., Martin J.L. VIP and PACAP potentiate the action of glutamate on BDNF expression in mouse cortical neurones // Eur. J. Neurosci. -1998.-V. 10, № 1, P. 272 -280.

204. Pericak-Vance, M. A., Bass, M. P., Yamaoka, L. H., Gaskell, P. C, Scott, W. K.,

205. Terwedow, H. A., Menold, M. M., Conneally, P. M., Small, G. W., Vance, J. M.,

206. Saunders, A. M., Roses, A. D., and Haines, J. L. Complete genomic screen in late227onset familial Alzheimer disease. Evidence for a new locus on chromosome 12. JAMA, 1997, v.278, pp.1237-1241.

207. Perry R.J., Hodges J.R. Attention and executive deficits in Alzheimer's disease. A critical review // Brain. 1999. - V. 122, P. 383 - 404.

208. Peterson G.L. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more generally applicable // Anal. Biochem. 1977. - V. 83, № 2, P. 346 - 356.

209. Peulve P., Laquerriere A., Hemet J., Tadie M. Comparative effect of alpha-MSH and b-FGF on neurite extension of fetal rat spinal cord neurons in culture // Brain Res. 1994.-V. 654, №2, P. 319 -323.

210. Potaman V.N., Antonova L.V., Dubynin V.A., Zaitzev D.A., Kamensky A.A., Myasoedov N.F., Nezavibat'ko V.N. Entry of the synthetic ACTH(4-10) analogue into the rat brain following intravenous injection // Neurosci. Lett. 1991. - V. 127, P. 133 - 136.

211. Potaman V.N., Alfeeva L.Y., Kamensky A.A., Levitskaya N.G., Nezavibat'ko V.N.228

212. N-terminal degradation of АСТЩ4-10) and its synthetic analog semax by the rat blood enzymes // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. - V. 176, P. 741 - 746.

213. Potaman V.N, Alfeeva L.Y, Kamensky A.A, Nezavibatko V.N. Degradation of ACTH/MSH(4-10) and its synthetic analog semax by rat serum enzymes: an inhibitor study // Peptides. 1993. - V. 14, № 3, P. 491 - 495.

214. Qian X, Riccio A, Zhang Y, Ginty D.D. Identification and characterization of novel substrates of Trk receptors in developing neurons // Neuron. 1998. - V. 21, №5, P. 1017- 1029.

215. Prasher, V. P, Farrer, M. J, Kessling, A. M, Fisher, E. M, West, R. J, Barber, P.

216. C, and Butler, A. C. Molecular mapping of Alzheimer-type dementia in Down's syndrome. Ann.Neurol, 1998, v.43, pp.380-383.

217. Rabizadeh S„ Oh J, Zhong L.T, Yang J, Bitler C.M, Butcher L.L, Bredesen D.E. Induction of apoptosis by the low-affinity NGF receptor // Science. 1993. - V. 261, №5119, P. 345 - 348.

218. Rage F, Givalois L, Marmigere F, Tapia-Arancibia L, Arancibia S. Immobilization stress rapidly modulates BDNF mRNA expression in the hypothalamus of adult male rats // Neuroscience. 2002. - V. 112, № 2, P. 309 -318.

219. Raux, G, Gantier, R, Thomas-Anterion, C, Boulliat, J, Verpillat, P, Hannequin,

220. D, Brice, A, Frebourg, T, and Campion, D. Dementia with prominent frontotemporal features associated with L113P presenilin 1 mutation. Neurology, 2000, v.55, pp.1577-1578.

221. Rius R.A., Chikuma Т., Loh Y.P. Prenatal processing of pro-opiomelanocortin in the brain and pituitary of mouse embryos // Brain Res. Dev. Brain Res. 1991. - V. 60, №2, P. 179- 185.

222. Robinson R.C., Radziejewski C., Stuart D.I., Jones E.Y. Structure of the brain-derived neurotrophic factor/neurotrophin 3 heterodimer // Biochemistry. -1995.-V. 34, № 13, P. 4139 -4146.

223. Rocamora N., Welker E., Pascual M., Soriano E. Upregulation of BDNF mRNA expression in the barrel cortex of adult mice after sensory stimulation // J. Neurosci. 1996. - V. 16, № 14, P. 4411 - 4419.

224. Rocchi, A., Pellegrini, S., Siciliano, G., and Murri, L. Causative and susceptibility genes for Alzheimer's disease: a review. Brain Res.Bull., 2003, v.61, pp.1-24.

225. Rodriguez-Tebar A., Dechant G., Barde Y.A. Binding of brain-derived neurotrophic factor to the nerve growth factor receptor // Neuron. 1990. - V. 4, № 4, P. 487 - 492.

226. Rose C.R., Blum R., Pichler В., Lepier A., Kafitz K.W., Konnerth A. Truncated TrkB-Tl mediates neurotrophin-evoked calcium signalling in glia cells // Nature. -2003. V. 426, № 6962, P. 74 - 78.

227. Rosenthal A., Goeddel D.V., Nguyen Т., Lewis M., Shih A., Laramee G.R., Nikolics K., Winslow J.W. Primary structure and biological activity of a novel human neurotrophic factor // Neuron. 1990. - V. 4, № 5, P. 767 - 773.

228. Roux P.P., Colicos M.A., Barker P.A., Kennedy Т.Е. p75 neurotrophin receptor expression is induced in apoptotic neurons after seizure // J. Neurosci. 1999. - V. 19, № 16, P. 6887 - 6896.

229. Said S.I. Molecules that protect: the defense of neurons and other cells // J. Clin. Invest. 1996. - V. 97, № 10, P. 2163 - 2164.

230. Sandman C.A., George J.M., Nolan J.D., van Riezen H., Kastin A.J. Enhancement231of attention in man with ACTH/MSH 4-10 // Physiol. Behav. 1975. - V. 15, № 5, P. 427 -431.

231. Schaaf M.J., Duurland R., de Kloet E.R., Vreugdenhil E. Circadian variation in BDNF mRNA expression in the rat hippocampus // Brain Res. Mol. Brain Res. -2000.-V. 75, №2, P. 342-344.

232. Schilling K, Luk D, Morgan JI, Curran T. Regulation of a fos-lacZ fusion gene: a paradigm for quantitative analysis of stimulus-transcription coupling.Proc Natl Acad Sci USA. 1991, 88(13), 5665-5669.

233. Schlessinger J., Ullrich A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases // Neuron. 1992. - V. 9, № 3, P. 383 - 391.

234. Segal R.A., Takahashi H., McKay R.D. Changes in neurotrophin responsiveness during the development of cerebellar granule neurons // Neuron. 1992. - V. 9, № 6, P. 1041 - 1052.

235. Segal R.A., Greenberg M.E. Intracellular signaling pathways activated by neurotrophic factors // Annu. Rev. Neurosci. 1996. - V. 19, P. 463 - 489.

236. Serpell, L. C. Alzheimer's amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim.Biophys.Acta, 2000, v.1502, pp.16-30.

237. Shaywitz A.J., Greenberg M.E. CREB: a stimulus-induced transcription factor activated by a diverse array of extracellular signals // Annu. Rev. Biochem. 1999. - V. 68, P. 821 - 861.

238. Sherrington R., Rogaev E.I., Liang Y., Rogaeva E.A., Levesque G., Ikeda M., Chi H., Lin C., Li G., Holman K., St. George-Hyslop P. H. Cloning of a gene bearingmissense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease. Nature, 1995, .375, 754-760.

239. Shirayama Y, Chen A.C, Nakagawa S, Russell D.S, Duman R.S. Brain-derived neurotrophic factor produces antidepressant effects in behavioral models of depression // J. Neurosci. 2002. - V. 22, № 8, P. 3251 - 3261.

240. Siegfried K.R. First clinical impressions with an ACTH analog (HOE 427) in the treatment of Alzheimer's disease // Ann. N Y Acad. Sci. 1991. - V. 640, P. 280 -283.

241. Smalley K, Eisen T. The involvement of p38 mitogen-activated protein kinase in the alpha-melanocyte stimulating hormone (alpha-MSH)-induced melanogenic andanti-proliferative effects in В16 murine melanoma cells. FEBS Lett. 2000, 476(3),198-202.

242. Smeyne R.J., Schilling K., Oberdick J., Robertson L., Luk D., Curran Т., Morgan J.I. A fos-lac Z transgenic mouse that can be used for neuroanatomic mapping. Adv. Neurol. 1993,59, 285-291.

243. Smith M.A., Makino S., Kvetnansky R., Post R.M. Stress and glucocorticoids affect the expression of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 mRNAs in the hippocampus // J. Neurosci. 1995. - V. 15, № 3 Pt 1, P. 1768 -1777.

244. Sohrabji F., Miranda R.C., Toran-Allerand C.D. Identification of a putative estrogen response element in the gene encoding brain-derived neurotrophic factor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1995. V. 92, № 24, P. 11110 - 11114.

245. Solum D.T., Handa R.J. Estrogen regulates the development of brain-derived neurotrophic factor mRNA and protein in the rat hippocampus // J. Neurosci. -2002. V. 22, № 7, P. 2650 - 2659.

246. Su, J. H., Anderson, A. J., Cummings, B. J., and Cotman, C. W. Immunohistochemical evidence for apoptosis in Alzheimer's disease. Neuroreport, 1994, v.5, pp.2529-2533.

247. Stephens R.M., Loeb D.M., Copeland T.D., Pawson Т., Greene L.A., Kaplan D.R. Trk receptors use redundant signal transduction pathways involving SHC and PLC-gamma 1 to mediate NGF responses // Neuron. 1994. - V. 12, № 3, P. 691 -705.

248. St George-Hyslop P., Haines J., Rogaev E., Mortilla M., Vaula G., Pericak-Vance M., Foncin J. F., Montesi M., Bruni A., Sorbi S. Genetic evidence for a novel familial Alzheimer's disease locus on chromosome 14. Nat.Genet., 1992, 2, 330334.

249. Tao X., Finkbeiner S., Arnold D.B., Shaywitz A.J., Greenberg M.E. Ca2+ influx regulates BDNF transcription by a CREB family transcription factor-dependent mechanism //Neuron. 1998. - V. 20, № 4, P. 709 - 726.

250. Tao X., West A.E., Chen W.G., Corfas G., Greenberg M.E. A calcium-responsive transcription factor, CaRF, that regulates neuronal activity-dependent expression of BDNF // Neuron. 2002. - V. 33, № 3, P. 383 - 395.

251. Tatro J.B. Melanocortins defend their territory: multifaceted neuroprotection in cerebral ischemia.Endocrinology. 2006, 147(3), 1126-1135.

252. Timmusk Т., Palm K., Metsis M., Reintam Т., Paalme V., Saarma M., Persson H. Multiple promoters direct tissue-specific expression of the rat BDNF gene // Neuron. 1993. - V. 10, № 3, P. 475 - 489.

253. Tongiorgi E., Righi M., Cattaneo A. Activity-dependent dendritic targeting of BDNF and TrkB mRNAs in hippocampal neurons // J. Neurosci. 1997. - V. 17, № 24, P. 9492 - 9505.

254. Toran-Allerand C.D., Miranda R.C., Bentham W.D., Sohrabji F., Brown T.J.,

255. Hochberg R.B., MacLusky N.J. Estrogen receptors colocalize with low-affinity nerve growth factor receptors in cholinergic neurons of the basal forebrain // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1992. V. 89, № 10, P. 4668 - 4672.

256. Tranchand-Bunel D., Delbende C., Guy J., Jegou S., Jenks B.J., Mocaer E., Pelletier G., Vaudry H. Pro-opiomelanocortin neuronal systems // Rev. Neurol. (Paris). -1987.-V. 143, №6-7, P. 471 -489.

257. Van der Neut R., Bar P.R., Sodaar P., Gispen W.H. Trophic influences of alpha-MSH and ACTH4-10 on neuronal outgrowth in vitro // Peptides. 1988. - V. 9, №5, P. 1015 - 1020.

258. Van der Neut R., Hoi E., Gispen W., Bar P. Stimulation by melanocortins of neurite outgrowth from spinal and sensory neurons in vitro // Peptides. 1992. - V. 13, № 6, P. 1109-1115.

259. Ventimiglia R., Mather P.E., Jones B.E., Lindsay R.M. The neurotrophins BDNF, NT-3 and NT-4/5 promote survival and morphological and biochemical differentiation of striatal neurons in vitro // Eur. J. Neurosci. 1995. - V. 7, № 2, P. 213 -222.

260. Vesa J., Kruttgen A., Cosgaya J.M., Shooter E.M. Palmitoylation of the p75 neurotrophin receptor has no effect on its interaction with TrkA or on

261. TrkA-mediated down-regulation of cell adhesion molecules // J. Neurosci. Res. -2000.-V. 62, №2, P. 225 -233.

262. Vos P.E, Bluemink G.J, Wolterink G, Van Ree J.M. The ACTH-(4-9) analogue ORG 2766 facilitates denervation supersensitivity after a unilateral 6-OHDA lesion of the corpus striatum in rats. Neuropeptides. 1991, 19(4), 271-279.

263. Vos P.E, Steinbusch H.W, Ronken E, van Ree J.M. Short and long term plasticity after lesioning of the cell body or terminal field area of the dopaminergic mesocorticolimbic system in the rat.Brain Res. 1999, 831(1-2), 237-247.

264. Weihl, С. C, Ghadge, G. D, Kennedy, S. G, Hay, N, Miller, R. J, and Roos, R. P. Mutant presenilin-1 induces apoptosis and downregulates Akt/PKB. J.Neurosci. , 1999, v.19, pp.5360-5369.

265. West A.E, Chen W.G, Dalva M.B, Dolmetsch R.E, Kornhauser J.M, Shaywitz A.J, Takasu M.A, Tao X, Greenberg M.E. Calcium regulation of neuronal gene expression //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2001. V. 98, № 20, P. 11024 - 11031.

266. Wetmore C, Ernfors P, Persson H, Olson L. Localization of brain-derived neurotrophic factor mRNA to neurons in the brain by in situ hybridization // Exp. Neurol. 1990. - V. 109, № 2, P. 141 -152.

267. Wikberg J.E.S. Melanocortin receptors: new opportunities in drug discovery // Exp. Opin. Ther. Patents. 2001. - V. 11, P. 1 - 16.

268. Wisniewski, К. E., Wisniewski, H. M., and Wen, G. Y. Occurrence of neuropathological changes and dementia of Alzheimer's disease in Down's syndrome. Ann.Neurol., 1985, v. 17, pp.278-282.

269. Wolterink G., van Ree J.M., van Nispen J.W., de Wied D. Structural modifications of the ACTH-(4-9) analog ORG 2766 yields peptides with high biological activity // Life Sci. 1991. - V. 48, № 2, P. 155 - 161.

270. Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., and Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 1986, v.83, pp.4040-4043.

271. Xiong H., Yamada K., Han D., Nabeshima Т., Enikolopov G., Carnahan J., Nawa

272. H. Mutual regulation between the intercellular messengers nitric oxide and240brain-derived neurotrophic factor in rodent neocortical neurons // Eur. J. Neurosci. -1999.-V. 11, №5, P. 1567 1576.

273. Yamamoto H., Gurney M.E. Human platelets contain brain-derived neurotrophic factor // J. Neurosci. 1990. - V. 10, № 11, P. 3469 - 3478.

274. Yamatsuji, Т., Okamoto, Т., Takeda, S., Murayama, Y., Tanaka, N., and Nishimoto, I. Expression of V642 APP mutant causes cellular apoptosis as Alzheimer trait-linked phenotype. EMBO J., 1996, v.15, pp.498-509.

275. Yan Q., Elliott J.L., Matheson C., Sun J., Zhang, L., Mu X., Rex K.L., Snider W.D. Influences of neurotrophins on mammalian motoneurons in vivo // J. Neurobiol. -1993.-V. 24, № 12, P. 1555 1577.

276. Yan Q., Radeke M.J., Matheson C.R., Talvenheimo J., Welcher A.A., Feinstein S.C. Immunocytochemical localization of TrkB in the central nervous system of the adult rat // J. Сотр. Neurol. 1997. - V. 378, № 1, P. 135 - 157.

277. Yan Q., Rosenfeld R.D., Matheson C.R., Hawkins N., Lopez O.T., Bennett L., Welcher A.A. Expression of brain-derived neurotrophic factor protein in the adult rat central nervous system // Neuroscience. 1997. - V. 78, № 2, P. 431 - 448.

278. Yuen E.C., Howe C.L., Li Y., Holtzman D.M., Mobley W.C. Nerve growth factor and the neurotrophic factor hypothesis // Brain Dev. 1996. - V. 18, № 5, P. 362 -368.

279. Zafra F., Hengerer В., Leibrock J., Thoenen H., Lindholm D. Activity dependent regulation of BDNF and NGF mRNAs in the rat hippocampus is mediated by non-NMDA glutamate receptors // EMBO J. 1990. - V. 9, № 11, p. 3545 - 3550.

280. Zhou A.W., Li W.X., Guo J., Du Y.C. Facilitation of AVP(4-8) on gene expression ofBDNF and NGF in rat brain//Peptides.- 1997.-V. 18,№8,P. 1179- 1187.

281. Сотрудникам Отдела молекулярной генетики человека: д.б.н. Петру Андреевичу Сломинскому и к.б.н. Марии Игоревне Шадриной за сотрудничество на одном из ключевых для развития работы этапе;