Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние противовирусного препарата бонафтона на онтогенез крыс

Актуальность проблемы и постановка основных задач. Изучение этиологии и патогенеза врожденных аномалий развития необходимо для решения одной из важнейших задач современной медицины - разработки более эффективных мер по охране здоровья человека в антенатальный период жизни (П.Г.Светлов, 1966; А.П.Дыбан, 1973; Л.С.Пер-сианинов, 1973).

В последнее время статистика свидетельствует об увеличении во всем мире числа врожденных отклонений развития (Е.В.Белогор-ская И др., 1980; Persaud, Moore, 1974; Shepard, Miller, 1976; Warkany,I979). Это обусловлено, в частности, воздействием факторов внешней среды, в том числе лекарственных препаратов, принимаемых матерью во время беременности (Ю.В.Гулькевич и др., 1973;Fra-ser, 1977; Tanimura, 1982). В связи с этим, согласно существующим законодательным актам, практически во всех развитых странах мира каждый новый лекарственный препарат перед его допуском в клинику должен пройти испытание на тератогенную активность на эмбрионах млекопитающих, что существенно снижает опасность поражения плодов человека этим препаратом (Г.А.Ульянова, В.К.Лепахин, 1976; Б.И.Любимов И др., 1981; Kelsey, 1974,1982; Rezabek, Marhan,1975; Wendler, 1975,1980; Tanimura, 1976,1978,1982; Frohberg, 1977).

Созданный во БНИХФИ оригинальный химиотерапевтический препарат бонафтон (6-бром-1,2-нафтохинон) имеет широкий спектр противовирусной активности, действуя как на РНК-содержащие, так и на ДЕЖ-с о держащие вирусы (Г.Н.Першин и др., 1975). Эспериментальные и влинические исследования показали, что бонафтон обладает высокой профилактической эффективностью в отношении вируса гриппа и, кроме того, является первым системным препаратом для лечения герпетической инфекции (Г.Н.Першин и др., 1975; И.С.Николаева и др., 1979а; Г.Н.Першин, 1981).

В литературе отсутствуют сведения об особенностях токсического действия и о фармакокинетике бонафтона, о его влиянии на течение беременности и развитие плода. Вместе с тем известно, что производные нафтохинона, к которым относится и бонафтон, небезразличны для организма, обладая как общетоксическими свойствами (Н.М.Василенко и др., 1969а,б; В.В.Лабунский, 1969, 1970; Н.М.Василенко, В.В.Ла-бунский, 1972а,б; Smith, 1946), так и некоторыми видами специфической токсичности - канцерогенной (Н.В.Лазарев, 1965; Schramm и др., 1971) и аллергенной (М.В.Крыжановская, 1966) активностью.

Основной целью работы являлось изучение тератогенной активности бонафтона. Вместе с тем в работе был применен комплексный подход, в соответствии с которым дая более адекватного тестирования повреждающего действия бонафтона на эмбриогенез предварительно были оценены токсические свойства бонафтона у беременных и небеременных животных, его фармакокинетические параметры и способность проникать через плаценту. Кроме того, помимо исследования состояния плодов и их плацент в период внутриутробного развития, проводили изучение постнатального развития потомства I поколения.

В соответствии с поставленными целями основными направлениями нашей работы являлись:

1. Изучение токсических свойств бонафтона и его способности к кумуляции.

2. Тестирование бонафтона в максимально переносимой для беременных самок дозе с установлением сроков наибольшей чувствительности плодов крыс к воздействию бонафтона.

3. Тестирование бонафтона в более низких дозах в наиболее чувствительные сроки развития с морфогистохшлическим изучением плодов и плацент.

4. Оценка состояния беременных самок крыс после воздействия бонафтона и полученного от них потомства I поколения.

5. Изучение фармакокинетических параметров и трансплацентарного перехода бонафтона.

Работа выполнялась в рамках программы ЕКНТ СССР 0.43.01 "Изыскать новые эффективные лекарственные средства, разработать технологию и освоить промышленное производство новых препаратов и их лекарственных форм", а также по плановой теме НИР филиала ВНИХШ: "Токсикологическое изучение синтетических лекарственных препаратов и их полупродуктов" Ор гос. регистрации 76070908).

Научная новизна. В настоящей работе впервые проведено комплексное изучение действия на эмбриогенез крыс нового отечественного противовирусного препарата бонафтона. Показано, что бонафтон не обладает тератогенной активностью. Увеличение внутриутробной гибели и неспецифические отклонения в развитии плодов отмечены только при воздействии токсических для самки доз. Установлено отсутствие влияния бонафтона на постнатальное развитие крыс.

Изучены особенности токсического действия бонафтона у беременных и небеременных животных с установлением порога токсического действия. Впервые показано преимущественное влияние бонафтона на печень, почки и периферическую кровь и отсутствие у препарата способности к метгемоглобинообразованию.

Впервые изучена фармакокинетика бонафтона и его трансплацен- ■ тарный переход. Показано, что препарат быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта, относительно равномерно распределяется по внутренним органам (за исключением жировой ткани и мозга) и драктически полностью выводится из организма, преимущественно с калом.

Установлено, что бонафтон в небольших количествах проникает через плаценту, причем трансплацентарный переход увеличивается с возрастом плода. При этом препарат не накапливается в тканях плода, обнаруживая высокую тропность к плодным оболочкам.

Практическая ценность. На основании проведенных исследований делается вывод об отсутствии тератогенной активности у нового отечественного противовирусного препарата бонафтона. Эти данные являются частью детального доклинического изучения бонафтона, на основании которого препарат прошел клиническое изучение и разрешен для широкого медицинского применения (приказ Министерства Здравоохранения СССР № 624 от 25 июня 1982 г., № гос. реестра 82/624/2).

Положения, вынесенные на защиту. Токсические свойства бонафтона проявляются только на высокм уровне доз, в 200-350 раз превышающих терапевтическую для человека, и имеют однонаправленный характер у небеременных и беременных самок крыс с преимущественным поражением системы кроветворения, печени и почек. Бонафтон при введении в различные периоды беременности не оказывает тератогенного и эмбриотоксического действия, а также не нарушает постнатального развития крыс. Увеличение внутриутробной гибели и неспецифические гипопластические и вдркуляторные отклонения у плодов отмечены только при воздействии высоких доз, вызывающих токсические явления у беременных самок и структурные и обменные нарушения в плацентах. В конце беременности препарат в небольших количествах проникает через плаценту, но не накапливается в тканях плода,околоплодной жидкости и плаценте,задерживаясь преимущественно в плодных оболочках.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Бонафтон как химиотерапевтический препарат для лечения вирусных инфекций

В настоящее время поиски химиотерапевтических средств против вирусных инфекций ведутся во всех развитых странах мира. В последнее десятилетие по этому вопросу наблюдается значительный рост публикаций и патентов, что отражено в отечественных и зарубежных монографиях и обзорах (Г.Н.Першин, Н.С.Богданова, 1973; Г.Н.Першин, 1974,1975,1976; А.Н.Гринев, 1976; Dubini, 1974; Hahn, 198O).

Трудность проблемы заключается в том, что, хотя вируцидное действие оказывает большое число соединений, относящихся к самым различным классам химических соединений, однако лишь немногие из них обладают химиотерапевтической активностью и только единицы нашли применение в медицинской практике (Г.Н.Дерпшн, Н.С.Богданова, 1973; В.М.Дцанов, Г.А.Галегов, 1974; Г.Н.Першин, 1974,1975,1976, 1981; Г.А.Галегов, 1982).

К медикаментозным противовирусным препаратам, имеющим в настоящее время практическое применение, относятся некоторые производные пуриновых и шфимидиновых оснований, адамантана и тиосеми-карбазона (Г.Н.Першин, Н.С.Богданова, 1973; Г.Н.Першин, 1981; Hahn, 1980). Кратко охарактеризуем эти препараты.

Одним из рациональных и научно обоснованных направлений противовирусной химиотерапии является поиск в ряду производных пуриновых и пиримидиновых оснований - антиметаболитов нуклеинового обмена. В жизненном цикле вируса синтез нуклеиновых кислот является одним из основных процессов и его нарушение приводит к подавлению размножения вируса. Среди аналогов пуриновых и пиримидиновых ну-клеозидов обнаружено большое количество противовирусных веществ, но с недостаточной избирательностью действия. Наибольшее практическое значение приобрели 2 вещества - производные пиримидина: 5-йод-21- дезоксиуридин (син. :идоксуридин, керецид и др.) и I-^-D- ара-бинофуранозилцитозин (син. гцитарабин, цитозар и др.). Они эффективны при лечении герпетических кератитов путем местного применения. Однако попытка использовать эти препараты внутривенно при системных герпетических инфекциях связана с применением высоких доз, вызывающих тяжелые токсические явления, в том числе угнетение кроветворения (Д.М.Злыдников и др., 1979; Renis, 1980). В опытах с введением новорожденным крысятам и мышатам керецида и цитарабина в их пост-натальном развитии выявлены серьезные нарушения: дисплазия мозжечка, сетчатки и почек, что авторы объясняют антимитотическим действием препаратов (Percy, Albert, 1974а,б). Аналогичные явления у потомства наблюдали и при воздействии препаратов в пренатальный период (Percy, 1975). Цитарабин обладает выраженной тератогенной активностью у мышей и крыс даже цри однократном введении во время беременности (Kasubuchi и др. , 1977; Scott И др., 1977; Kochhar И др., 1978; Renis, 1980).

Аминопроизводные адамантана- амантадин (син. :мидантан, симмет-рел) и ремантадин - применяются в лечебной практике для профилактики гриппа, вызванного вкусом гриппа типа А (но не В). Ремантадин оказывает и некоторое лечебное действие при этой инфекции. Мидан-тан используется также в качестве антипаркинсонического средства. Вместе с тем аминопроизводные адамантана оказывают выраженное влияние на центральную нервную систему (С.К.Германе и др., 1977), что ограничивает их применение в качестве противогриппозных средств. Имеются данные об угнетающем действии ремантадина на цролифератив-ную активность лимфоцитов человека (Kof f и др., 1979). В качестве побочных эффектов цри лечении мидантаном описаны нарушения периферического кровообращения (Pearce и др., 1974; cloarec и др., 1976) И развитие фотоаллергической реакции (van Ketel, Goedhart-van Di;jk, 1974). Ремантадин и мидантан в эксперименте ингибируют микросомаль-ное окисление чужеродных веществ, снижая активность цитохрома Р-450 (Т.Г.Хлопушина и др., 1981; Beianger и др., 1979). Кроме того, известно, что мидантан нарушает эстральный цикл крыс (кип и др., 1980) и вызывает у них повышение артериального давления (Maj, Przewiocka, 1974). В опытах одних авторов мидантан вызывал аномалии развития у 1фыс линии Hoitzman, но не у новозеландских белых 1ф о ликов (ьашаг и др., 1970), в опытах других - не оказывал тератогенного действия на плоды крыс (Vernier и др., 1969). Ремантадин, как установлено в наших экспериментах (В.А.Пройнова, Л.Ф.Шаш-кина, 1981), не оказывал повреждающего действия на развитие плодов белых крыс.

В медицинской практике нашли применение также производные тио-семикарбазона - метисазон и кутизон. Метисазон (син. :марборан) по химическому строению является и -метшшзатин- j3 -тиосемикарбазоном и обладает профилактической эффективностью цри натуральной оспе. Показана также профилактическая и лечебная активность при гриппе куминальтиосемикарбазона (кутизон). Вместе с тем стало известно, что при экспериментальных вирусных инфекциях мышей производные тиосемикарбазона, обладающие противовирусными свойствами, угнетают гуморальные и клеточные факторы иммунного ответа у животных (Zgor-niak-Nowosieiska и др., 1979). Сведений о тератогенной активности упомянутых препаратов в литературе найти не удалось, однако известно, что некоторые производные семикарбазона повышают эмбриональную смертность И ВЫЗЫВают аномалии у ПЛОДОВ МЫШеЙ (Nomura и ДР., 1976).

Таким образом, описанные выше противовирусные препараты имеют цределы их эффективного лечебного применения, обусловленные спектром противовирусного действия и наличием побочных токсических свойств. Поэтому важнейшей задачей противовирусной химиотерапии является поиск новых препаратов, предпочтительно широкого спектра действия, малотоксичных, с различным характером распределения их в организме (Г.Н.Першин, 1975,1981; Hahn, 198O).

Во многих лабораториях мира весьма широко изучалась противовирусная активность циклических полиоксосоединений. В медицинскую практику вошли 3 вещества из этого класса - оксолин, теброфен и флореналь. Они являются новыми отечественными оригинальными препаратами и используются в качестве местнодействующих средств для лечения вирусных заболеваний глаз, кожи и слизистых оболочек, а также для профилактики гриппа (Г.Н.Першин, Н.С.Боэданова, 1973; А.Н.Гринев, Г.Н.Першин, 1974; Г.Н.Першин, 1975).

Механизм противовирусного действия полиоксосоединений точно не известен. По цредположению Г.Н.Першина, эти вещества инактиви-руют вирусы в фазе внеклеточного существования или в фазе адсорбции их клеткой. Инактивация вируса может осуществляться за счет непосредственного реагирования полиоксосоединения с гуаниновым остатком нуклеиновой кислоты вируса (Г.Н.Першин, Н.С.Богданова, 1973; Г.Н.Першин, 1975, 1976).

Предпринятое во ЕНИХФИ широкое изучение цротивовирусной активности циклических полиоксосоединений позволило выявить новый оригинальный препарат бонафтон, который обладает широким спектром цротивовирусной активности, действуя как на РНК- содержащие (вирус гриппа), так и на ДНК- содержащие (вирус герпеса простого) вирусы.

Бонафтон проявлял высокую вируцвдную и вирусостатическую активность в отношении вируса гриппа типа А, а также обладал химио-терапевтической активностью при гриппозной пневмонии мышей, вызванной вщ)усом гриппа А2/Фрунзе и А2/Гонконг/68 (Н.С.Богданова и др., 1972; Г.Н.Перпшн и др., 1975; Pershin и др.,1976). Электронномик-роскопическое изучение легких мышей показало, что бонафтон влияет на репродукцию вируса гриппа А в клетке, нарушая процессы отпочкования вириона от плазмолеммы альвеолярных клеток. По мнению авторов, действие бонафтона может быть обусловлено как подавлением в клетках синтеза вирусспецифического мембранного белка, так и нарушением транспорта компонентов этого полипептида к клеточной мембране (JI. Ф. Стебаева и др., 1980а).

Дальнейшее тестирование препарата выявило его цротивогерпети-ческие свойства в культуре клеток и химиотералевтическую активность при экспериментальном кератите роликов при местном и пероральном применении (Н.С.Богданова и др., 1972; Г.Н.Першин и др., 1975; Н.С.Богданова и др., 1975; И.С.Николаева и др., 1979а; Pershin и др., 1976).

Электронномшфоскопическое изучение действия бонафтона при герпетической инфекции показало, что препарат значительно уменьшает количество вируса, адсорбированного на клеточных мембранах, и увеличивает время его проникновения в клетку, что сокращает число инфицированных клеток (И.С.Николаева и др., 1979а,б). Наличие в ядрах больших скоплений вирусной ДНК и единичных нуклеокадсидов, часто имеющих дефектную структуру, дало авторам возможность предположить, что бонафтон частично подавляет синтез поздних белков, способствуя тем самым нарушению сборки нуклеокапсидов в ядре (И.С.Николаева и др., 1979а; Л.Ф.Стебаева и др., 19806).

На примере бонафтона показана принципиальная возможность излечения герпетического кератита у 1фоликов при применении препарата только внутрь, без местного лечения очага поражения. Возможность системного применения бонафтона может явиться большим преимуществом црепарата в тех случаях, когда местное лечение недостаточно эффективно (И.С.Николаева, 1978).

Полученные экспериментальные данные о противовирусной активности бонафтона позволили рекомендовать препарат для клинического изучения при герпесвирусных заболеваниях глаз, кожи и слизистых оболочек (местное и пероральное применение), а также для профилактики гриппа типа А. В связи с этим бонафтон широко изучался в кли-нико-фармакологическом и эпидемиологическом отношениях.

Эти исследования подтвердили выраженную профилактическую эффективность препарата при гриппозной инфекции у человека. Бонафтон в терапевтической дозе 75-100 мг как при ежедневном цриеме, так и при одно1фатном введении за 3 дня до инфицирования более чем у половины добровольцев предотвратил заболевание, вызванное живой гриппозной вакциной. При эпидемиологическом испытании бонафтона установлено более легкое клиническое течение заболевания и уменьшение продолжительности болезни. Индекс эффективности был равен 1,8-2,9, показатель защищенности - 44,7-66,7$. Лечебным действием при гриппозной инфекции бонафтон не обладал.

При изучении переносимости бонафтона на добровольцах установлено, что препарат в дозе 100 мг не оказывал побочного действия на сердечно-сосудистую, дыхательную, нервную, мочевыделительную и пищеварительную системы человеческого организма, а также на функции печени и основные биохимические показатели обмена веществ (Д.М.Злыдников и др., 1974, 1976; М.П.Зыков и др., 1975; С.Г.Стель-мах, 1975; С.Г.Стельмах, Е.А.Шабловская, 1976; Ю.А.Романов, 1976).

Результаты клинического изучения бонафтона при герпетической болезни глаз показали, что препарат при энтеральном введении оказывал лечебное действие цри древовидном кератите с поражением стромы, улучшал клиническое состояние у части больных с глубокими формами герпетического кератита (кератоувеит, дисковидный кератит) (Л.Е.Орловская и др., 1976). Клиницисты отмечают эффективность бонафтона, примененного энтерально, при лечении глубоких форм кератита у людей, которые перед этим безуспешно лечились другими противовирусными препаратами. Хорошее лечебное действие, в основном, при поверхностных формах кератита, оказывает 0,05% мазь бонафтона при местных аппликациях 4-5 раза в день. Бонафтон с успехом изучался при системном и местном применении в лечении герпетических поражений кожи, слизистой оболочки гениталий (В.Н.Гребенюк, В.И.Ха-пилова, 1976; Л.Е.Орловская и др., 1976) и при герпетических стоматитах. Клиницисты отмечают хорошую переносимость препарата больными (Н.В.Терехова, М.И.Лялина, 1981).

Бонафтон оказался высокоэффективным ингибитором передачи фактора резистентности синегнойной палочки, значительно превосходящим другие ингибиторы по активности (А.Ф.Мороз и др., 1976).

В настоящее время изучается эффективность препарата при вирусных инфекциях сельскохозяйственных животных (Г.Н.Першин, 1981).

Таким образом, бонафтон обладает высокой профилактической эффективностью в отношении вируса гриппа и, кроме того, является первым системным препаратом для лечения герпетической инфекции. Это дает авторам основание считать бонафтон перспективным противовирусным препаратом широкого спектра действия (Г.Н.Першин и др., 1975; И.С.Николаева, 1978; И.С.Николаева и др., 1979а,б; Г.Н.Першин, 1981; Pershin и др., 1976).

ВЫВОДЫ

1. Бонафтон умеренно токсичен для самок мышей и крыс, обладает слабыми кумулятивными свойствами. Повторное введение препарата в желудок в токсической дозе вызывает у небеременных и беременных крыс однонаправленные специфические эффекты, характерные для нафтохинонов, с преимущественным поражением системы кроветворения, печени и почек. Бонафтон- (однократное введение в желудок крысам на терапевтическом уровне) быстро всасывается в кровь, распределяется преимущественно в печени, селезенке, почках и легких и полностью выводится из организма с мочой (15$) и калом (85$).

2. При изучении влияния бонафтона на эмбриогенез крыс в различные сроки развития в 5 дозах, определенных по действию на беременных самок: 700 мг/кг (максимально переносимая), 400 мг/кг (токсическая), 100 мг/кг (пороговая), 50 мг/кг (нетоксическая) и

2 мг/кг (на уровне терапевтической для человека) отмечен дозозави-симый эффект. Бонафтон в дозах 2; 50 и 100 мг/кг не вызывал отклонений у плодов, в дозе 400 мг/кг индуцировал незначительный эм-бриотропный эффект со структурными и обменными отклонениями в плодах и плацентах. Бонафтон в дозе 700 мг/кг оказывал повреждающее действие в виде повышения внутриутробной гибели и появления неспецифических циркуляторных отклонений у плодов и деструктивно-дистрофических, циркуляторных и обменных (снижение содержания РНК и белков, накопление нейтральных мукополисахарццов) нарушений в плацентах.

3. При исследовании в динамике потомства крыс, получавших бонафтон в дозе 400 мг/кг на 10-13-й день беременности, не выявлено отклонений в их постнатальном развитии. Не отмечено гибели крысят, уменьшения продолжительности жизни, нарушения мышечной работоспособности, основного обмена, состояния сердечно-сосудистой и нервной систем и показателей периферической крови, изменения функционального состояния органов и систем и их микроструктуры, а также увеличения числа опухолей.

4. При изучении в динамике трансплацентарного перехода бонафтона- ^С (однократное введение в терапевтической дозе на 10, 18 и 19-й день развития) установлено, что в конце беременности препарат в небольших количествах проникает через плаценту. Собственно плодам переходит 0,55% количества бонафтона- ^С, поступившего в кровь матери. В течение 2-х суток препарат не накапливается в плодах, плацентах и околоплодной жидкости, задерживаясь преимущественно в плодных оболочках.

5. Бонафтон не обладает тератогенной и эмбриотоксической активностью у крыс. Неспецифическое повреждающее действие на эмбриогенез проявляется только в высоких дозах, в 200-350 раз превышающих терапевтическую дозу для человека. Препарат разрешен для широкого медицинского применения в качестве противовирусного средства.

Заключение

Трансплацентарный переход и содержание бонафтона-*^ в элементах плодовместилшца изучали в динамике на модели с внутривенным введением вещества. Установлено, что бонафтон в небольших количествах проникает через плацентарный барьер. Величина трансшгацен-тарного перехода зависит от возраста плода и составляет через сутки 1,7 и 5,8$ от количества, введенного крысам соответственно на 18 и 19-й день беременности.

Анализ распределения бонафтона-^С в различных элементах пло-довместшшща после введения препарата на 18-й день беременности показал, что на протяжении 2-х суток не происходит достоверного увеличения концентрации вещества в тканях плода, плаценте и околоплодной жидкости. Лишь в оболочках плода концентрация препарата резко возрастала за 48 ч.

Таким образом, увеличение трансплацентарного перехода с возрастом плода обусловлено, главным образом, возрастанием концентрации вещества в его оболочках. Собственно плодам в конце беременности переходит только 0,55$ количества бонафтона, поступившего в вровь матери.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Основное внимание в нашей работе было уделено изучению влияния на эмбриогенез крыс бонафтона - нового отечественного противовирусного препарата, производного 1,2-нафтохинона.

Изучение тератогенной и эмбриотоксической активности соединений из ряда нафтохинона представляет определенный теоретический интерес, поскольку в литературе отсутствуют сведения об их эмбрио-тропной активности. В медицинской црактике в настоящее время используется отечественный противовирусный препарат из ряда нафтохинона - оксолин. Однако его тератогенная активность при системном применении не изучалась, так как оксолин предназначен только для местных аппликаций. Бонафтон является единственным лекарственным препаратом из группы нафтохинонов, предназначенным для приема внутрь.

Проведение исследования имели также непосредственное научно-практическое значение, так как они являлись обязательным элементом доклинического изучения бонафтона как нового лекарственного препарата (Г.А.Ульянова, В.К.Лепахин, 1976; В.К.Лепахин и др., 1977) и были необходимы для получения разрешения на его применение в медицинской практике.

Кроме изучения влияния бонафтона на эмбриогенез, были исследованы его общетоксические свойства. Сведения о токсическом действии препарата в литературе практически отсутствуют. Влесте с тем, согласно сложившимся в мировой практике современным подходам к оценке безопасности новых лекарственных средств, доклинические испытания проводят интегрирование, т.е. результаты изучения общетоксических свойств препарата учитывают при проведении последующих оштов по выявлению специфической токсичности (В.К.Лепахин и др., 1977).

Важно отметить, что токсические свойства бонафтона изучали как у небеременных, так и беременных животных. Экспериментальная проверка действия препарата на течение беременности приобретает большое значение в связи с тем, что предполагается применение бонафтона среди широких слоев населения, в том числе, возможно, и беременными женщинами. Известно, что беременность, отягощенная токсическими поражениями материнского организма, может отрицательно влиять на развитие плода (К.С.Лобынцев, 1973; А.П.Киркнценков, 1978; Ю.И.Савченков и др., 1979). Представляло интерес проследить и за постнатальным развитием потомства после воздействия бонафтона.

В литературе отсутствуют данные о поведении бонафтона в организме. Поэтому важным этапом нашей работы явилось изучение параметров фармакокинетики и уровней трансплацентарного перехода меченого соединения.

При изучении фармакокинетики препарата нами показана его быстрая всасываемость из желудочно-кишечного тракта в 1фовь, где концентрация и содержание бонафтона-^^С сохранялись на одном уровне в течение суток, йшвлено довольно равномерное распределение вещества по всем изученным органам и тканям (за исключением жировой ткани и мозга, где препарат не обнаружен), с преимущественным содержанием в селезенке, печени, почках и легких. Этот факт указывает на способность бонафтона проникать к месту возможной локализации инфекционного процесса, подтверждая хорошие химиотерапевти-ческие свойства препарата.

При изучении острой токсичности препарата на небеременных животных установлено, что бонафтон, согласно существующим классификациям Hodge и sterner (1943) и С.Д. Заутольникова с соавт. (1970), умеренно токсичен для самок крыс и мышей при введении внутрь. При внутрибрюшинном введении препарата как у крыс, так и у мышей токсичность его резко возрастала по сравнению с внутриже-лудочным введением, что совпадает с литературными данными (С.С.Ли-берман и др., 1976). Возможно, этот факт косвенно указывает на активный обмен бонафтона в печени с образованием менее токсичных метаболитов.

На возможность образования метаболитов бонафтона в организме косвенно указывают и другие факты. Так, в период с 3-х по 9-е сутки, как видно при сравнении таблиц 5.1.4 и 5.1.5, выведение меченого вещества с мочой было на порядок ниже выведения с калом, в то время как в первые сутки после введения элиминация с мочой составила 4/5 (12$) от всего количества, выведенного этим путем (15,3$) (табл. 5.1.4). Такая смена путей выведения наводит на мысль об изменении химической формы соединения, присутствующего в организме, т.е. о появлении метаболита или метаболитов, выведение которых происходит преимущественно с калом.

Подробное изучение токсических эффектов бонафтона в дозах 400 мг/кг (1/10 ЛДзд) и 100 мг/кг (1/40 ЛД50) проводили у небеременных крыс через 20 и 37 введений и у беременных 1фыс при 4-кратном введении на I0-13-й и 16-19-й день беременности. Выбор тестов и методов обследования был проведен с учетом литературных данных о токсических свойствах производных хинона (см. обзор литературы) .

Установлена низкая кумулятивная способность препарата (Ккум. = 11,0), что отличает его от других представителей ряда нафтохинона, кумулирующих в организме (Н.М.Василенко, В.В.Лабун-ский, 1972а). Это находится в соответствии с нашими опытами по фармакокинетике бонафтона, в которых показано выведение вещества из организма с мочой и калом и отсутствие накопления во внутренних органах крыс.

Воздействие на беременных крыс бонафтона в дозе 100 мг/кг вызывало снижение числа эритроцитов (т.е. развитие анемии), кратковременное повышение относительной массы селезенки и угнетение обезвреживающей функции печени - причем только при введении на 1013-й день беременности (табл. 2.2.5, 2.2.7). Это позволяет считать дозу 100 мг/кг (в 50 раз превышающую терапевтическую для человека) близкой к порогу токсического действия для беременных крыс.

Токсические свойства бонафтона в дозе 400 мг/кг были более выраженными и обширными, чем в дозе 100 мг/кг, и наблюдались при введении как на 10-13-й, так и 16-19-й день беременности. Полученные нами результаты полностью совпадают с литературными данными о преимущественном влиянии производных нафтохинона на функциональное состояние нервной системы, печень, почки и систему кроветворения (Н.М.Василенко и др., 1969а; Н.М.Василенко, В.В.Лабунский, 1972а).

При изучении системного действия бонафтона особое внимание уделяли оценке периферической 1фови, как системе, подвергающейся специфическому токсическому воздействию производных хинона.

У беременных самок воздействие бонафтона вызывало снижение числа эритроцитов после введения на 10-13-й день беременности (табл. 2.2.7). Шесте с тем обнаруженное у них в селезенке через 7 дней после отмены препарата увеличение числа мегакариоцитов, по-видимому, можно расценивать как проявление компенсаторной активизации процесса кроветворения. У небеременных самок отмечено увеличение числа эритроцитов через 37 введений (табл. 2.1.7). По всей видимости, это также свидетельствует о компенсаторном возбуждении костно-мозгового кроветворения в результате повреждающего действия бонафтона.

Вместе с тем влияние бонафтона на периферическую 1фовь было менее выраженным, чем у других представителей ряда нафтохинона. Например, бонафтон, в отличие от 1,4-нафтохинона и некоторых других производных хинона (Н.М.Василенко и др., 1969а; Ю.Н.Талакин, 1966; Н.М.Василенко, В.В.Лабунский, 1972а,б), не вызывал изменений уровня гемоглобина, числа лейкоцитов и формулы белой крови, а также повышения метгемоглобинообразования. В этом отношении его свойства совпадают с другим галоидным производным - 2,3-дихлор--1,4-нафтохиноном (Э.В.Лисовская, Р.К.Рожковецкая, 1966).

Проанализируем некоторые другие токсические эффекты бонафтона, выявленные у беременных и небеременных самок.

Существенное повышение относительной массы надпочечников с увеличением их функциональной активности в виде снижения уровня аскорбиновой кислоты, а также значительное падение относительной массы тимуса (только у небеременных 1фыс) можно рассматривать, по-видимому, как неспецифическое проявление нейро-эндокринного ответа организма в условиях адаптации его к токсическому воздействию (Селье, 1972).

У небеременных и беременных крыс выявлены однонаправленные изменения во внутренних органах в виде застойных явлений и нераспространенных, умеренных и обратимых дистрофических изменений, особенно выраженных в печени (набухание гепатоцитов и жировая дистрофия отдельных печеночных клеток; вакуолизация эндотелия сосудистых клубочков и набухание эпителия извитых канальцев проксимального отдела в почках; неравномерное окрашивание мышечных волокон миокарда). Возможно, это связано с особенностями фармакоки-нетики бонафтона, а именно, преимущественным его содержанием в печени и почках - органах метаболизма и выведения - в течение всего периода наблюдения (табл. 5.1.2).

У небеременных крыс в почках выявлены компенсированные функциональные нарушения в виде некоторого увеличения концентрации эк-скретируемых с мочой белка и хлоридов (табл. 2.1.5). Обнаруженное нами набухание эпителия извитых канальцев на фоне незначительной цротеинурии следует расценивать, согласно мнению Smith (цит. по Г.Маждраков, Н.Попов, 1969), не как свидетельство дегенерации, а как признак гиперфункции почечных канальцев.

В печени также, наряду с дистрофическими изменениями, идет и процесс регенерации (много двуядерных клеток, видны единичные митозы). Функциональным отражением компенсаторного процесса, по всей видимости, являются активизация углеводной и обезвреживающей функций печени, отмеченная через 37 введений, что проявилось в тенденции к увеличению содержания гликогена в ткани органа и увеличении количества выводимой с мочой гиппуровой кислоты (табл. 2.1.5).

Следует подчеркнуть, что у беременных животных по сравнению с небеременными обнаружены несколько более выраженные морфологические изменения в ткани печени. Это явление, в частности, можно объяснять тем, что развитие интоксикации у беременных животных происходит на фоне повышенной сведении эстрогенов, количество которых в крови, как известно, резко возрастает во время беременности (Fishman и др., 1962). В литературе имеются данные, что структурные нарушения в печени самок 1фыс при острой интоксикации модельным гепатотропным ядом - четыреххлористым углеродом - усиливаются как в период естественного повышения концентрации эстрогенов в 1фови (стадия цроэструса), так и под влиянием экзогенного эстрадиола (Г.С.Якобсон и др., 1978). Клинические данные по изучению функциональных показателей печени при вирусном гепатите на протяжении менструального цикла также подтверждают вывод о том, что женские половые гормоны можно считать фактором, отягощающим течение патологического процесса в печени (Л.А.Яценко, 1969; цит. по Г.С.Якобсон и др., 1978).

Интересно отметить, что степень повреждения печеночной ткани зависит от срока беременности. Если у животных, получавших бонафтон в более ранний срок беременности (10-13-й день), после отмены препарата обнаружены выраженные морфологические изменения в ткани печени, сохраняющиеся даже через 7 дней после прекращения воздействия, то у самок, получавших бонафтон в более поздний срок беременности (16-19-й день), изменения в печени были значительно менее выраженными и приблизительно соответствовали таковым у небеременных крыс.

Аналогичные факты были обнаружены другими авторами при оценке степени поражения печени беременных крыс после воздействия некоторыми химическими агентами - по мере развития беременности уменьшалась степень повреждения печеночной ткани (С.Г.Добровольская и др., 1973). По всей вероятности, это объясняется тем, что в процессе развития нормальной беременности, по мере обеспечения возрастающих запросов материнского организма и развивающегося плода, изменяются различные стороны обмена и структурная характеристика печени (Н.А.Фарбер, 1970; С.А.Мисайлова, 1974 и др.), что и определяет своеобразие реакций органа на повреждающие воздействия в различные периоды беременности.

Переходя к вопросам оценки эмбриотропной активности бонафтона, подчеркнем важность выбора доз для тестирования. Этот момент является определяющим при проведении эксперимента. Завышение уровня воздействия может вызвать только неспецифическое общетоксическое действие на плод, либо только эмбриолетальное действие без проявления тератогенного эффекта (Wilson, 1973), а занижение не позволит выявить весь диапазон ответа на введение вещества.

Кроме того, в литературе нет единогласия в вопросе количества испытуемых доз. Некоторые исследователи считают достаточным для тестирования использование двух крайних доз—максимально переносимой и близкой к терапевтической (Prohberg, 1977а). Однако следует, по-видимому, согласиться с точкой зрения о необходимости включения дополнительно одной шш нескольких промежуточных доз (А.П.ДОбан и др., 1970) дня оценки соотношения доза-эффект. При этом важным моментом является выявление минимального уровня воздействия, на котором обнаруживается эмбриотропное действие

Tanimura, 1978).

В соответствии с изложенными выше соображениями, тестирование тератогенной активности бонафтона проводили в 5 дозах: на сублетальном (700 мг/кг), токсическом (400 мг/кг), пороговом (100 мг/кг) и нетоксическом уровне доз (50 и 2 мг/кг).

Для предварительной оценки повреждающих свойств бонафтона на эмбриогенез был избран метод однохфатного введения препарата в максимально переносимой дозе в различные сроки беременности. По мнению ряда авторов (А.П.фбан и др., 1970; А.П.,Иыбан, 1977; Rob-so11» 1970; Wilson,1973) t именно цри этих условиях наиболее отчетливо проявляется эмбриотропное действие фармакологических агентов.

В наших опытах установлено, что бонафтон в максимально переносимой для беременных крыс дозе 700 мг/кг оказывает повреждающее действие на развитие плодов. Это проявлялось в повышении внутриутробной смертности зародышей (до 18-31$ после введения вещества в различные дни беременности при 8$ в контроле) и возникновении у них микроанатомических отклонений, преимущественно циркулятор-ного характера (расширение мочевого пузыря и полости правого предсердия, кровоизлияния в брюшную и плевральную полости, отек подкожной клетчатки, пупочная грыжа). Наибольшую частоту и выраженность изменений наблюдали при воздействии на 10-й, II-й, 12-й, 13-й, 1б-й и 17-й день беременности (табл. 3.1.I, 3.1.2).

Для выявления минимальной дозы, оказывающей эмбриотропное действие, бонафтон тестировали в более низких дозах в установленные нами наиболее чувствительные к его воздействию сроки развития - 10-13-й и 16-19-й день беременности, т.е. во время активного органогенеза и последней трети беременности.

При этом установлено, что бонафтон в токсической для самок дозе 400 мг/кг не вызывал повышения внутриутробной табели, но индуцировал незначительные нарушения эмбриогенеза. Отмечена тенденция к снижению средней массы плодов (воздействие на 10-13-й день) и умеренное отставание в развитии костной системы (воздействие на 16-19-й день).

Бонафтон в дозе 100 мг/кг (на уровне порога токсического действия для беременных крыс) не вызывал у плодов отклонений от нормального развития.

При введении бонафтона в дозах, нетоксических для беременных самок - 2 мг/кг (на уровне терапевтической для человека) и превышающей ее в 25 раз (50 мг/кг) - не выявлено какого-либо повреждающего действия на эмбриогенез по изученным показателям.

Таким образом, из приведенных материалов можно сделать вывод, что 400 мг/кг - доза, токсическая для беременных самок, - является минимальной дозой, оказывающей слабовыраженный эмбриотропный эффект.

При анализе результатов воздействия бонафтона обращает на себя внимание тот факт, что почти во все сроки введения препарата в дозе 700 мг/кг выявлено довольно существенное возрастание средней массы (на 33$), а иногда и среднего размера (на 14$) плаценты. К£юме того, после воздействия бонафтона в дозе 700 и, в меньшей степени, в дозе 400 мг/кг в плацентах при гистологическом изучении отмечены выраженные структурные нарушения в виде ярупно-очаговых деструктивно-дистрофических изменений на фоне стека, полнокровия, геморрагий, капилляростаза. Наряду с этим гистохимическими методами выявлены существенные нарушения обменных процессов - резкое снижение содержания РНК и белков и накопление нейтральных мукополисахаридов.

По всей вероятности, обнаруженные в плаценте структурные и метаболические нарушения могли повлечь за собой и функциональную неполноценность этого органа. Как известно, плацента, являющаяся важным звеном в системе мать-плацента-плод, характеризуется высокой повревдаемостью при действии различных альтерирующих агентов, что может обусловить ряд эмбриопатий животных и человека. С этих позиций плаценту следует рассматривать как орган, 1де может быть локализован первичный эмбриопатогенный эффект (П.Г.Светлов, 1966; В.И.Бодяжина и др., 1969; А.Г.Пап, Л.Б.Гутман, 1969; А.П.Кирннцен-ков, 1978).

Известно, что деструктивные цроцессы в плаценте часто приводят к гипоксии плода и таким путем влияют на развитие самого эмбриона (А.П.Кирющенков, 1978). Многочисленными работами показано, что кислородное голодание любой этиологии оказывает неблагоприятное влияние на эмбриональное развитие всех изученных видов млекопитающих (Grabowski, 1970). В клинических исследованиях также установлено, что гипоксия часто становится ведущим звеном в патогенезе различных нарушений у плода и новорожденного (В.И.Бодяжина, 1963; П.Г.Светлов, 1966; Л.С.Персианинов и др., 1971; Л.С.Персиа-нинов, 1973; А.П.Кирющенков, 1978; М.В.Федорова, 1982).

Выявленные нами отклонения у 20-дневных плодов после воздействия бонафтона в высоких дозах 700 и 400 мг/кг (отек подкожной клетчатки, расширение мочевого пузыря и полости правого предсердия, 1фовоизлияния в брюшную и плевральную полости, пупочная грыжа, задержка окостенения скелета) аналогичны картине нарушений, вызываемых гипоксией. Действительно, по данным различных авторов, в эксперименте гипоксия вызывает у плодов характерные циркуляторные нарушения - отек, кровоизлияния, но вместе с тем может наблюдаться и широкий набор других отклонений, в частности, общая задержка развития, задержка окостенения скелета, пупочные грыжи, различные аномалии сердца, крупных сосудов, мочеполовой системы, глаз и нервной зрубки (см. обзор Grabowski, 1970; М.И.Руднев и др., 1974). Физиологический механизм развития циркуляторных нарушений у плодов в условиях гипоксии связан с вызываемыми ею функциональными изменениями в организме (Л. С. Персианинов, 1973; Grabowski, 1970, 1977). Как известно, гипоксия приводит к развитию метаболического ацидоза, что, в свою очередь, оказывает неблагоприятное влияние на клеточный обмен и гемодинамику плода. В частности, в условиях ацидоза повышается проницаемость капилляров, что приводит к отеку и точечным кровоизлияниям в окружающие ткани. Более крупные очаги кровоизлияний связаны с разрывом сосудов (Н.Т.Шутова, Е.Д.Черникова, 1974; М.В.Федорова, 1982, 1983).

В наших опытах с введением бонафтона в дозе 700 мг/кг в каждый из дней беременности упомянутые отклонения у плодов становились особенно выраженными, начиная с 10-ого дня. По всей вероятности, это объясняется тем, что именно к указанному сроку эмбрионального развития резко снижается способность зародыша к анаэробному гликолизу и возрастает роль кислородного дыхания (neubert и др., 1971; KOhler И др., 1972; Spielmann и Др., 1973).

Кроме нарушения функций плаценты, другим фактором гипоксиче-ского состояния плода, по-видимому, является анемия беременных самок, проявляющаяся уже через два дня после воздействия бонафтона.

Таким образом, при микроанатомическом изучении у плодов после воздействия бонафтона в высоких дозах выявлены только неспецифические отклонения, по всей вероятности, обусловленные гипокси-ческим состоянием вследствие поражения плацент и анемии материнского организма. Для выявления возможных нарушений на клеточном уровне и в обмене веществ проводили гистологическое и гистохимическое изучение плодного материала.

При воздействии бонафтона в дозе 400 мг/кг в органах и системах 20-дневных плодов выявлены структурные изменения, характер которых зависит от срока воздействия следующим образом. Если введение препарата на 16-19-й день беременности приводит к острым циркуляторным нарушениям у плодов без серьезных изменений гистологической структуры (отек подкожной клетчатки и сетчатого слоя дермы, незначительный застой ликвора в желудочках мозга, избыточное наполнение кровью правой половины сердца с отеком стромы и эндокарда, венозное и капиллярное полнокровие с отеком интерсти-ция в легких), то при воздействии на 10-13-й день беременности циркуяяторные нарушения выражены слабее, но отмечены структурные, в основном гипопластические, изменения в органах и системах. Например, в миокарде видны признаки недостаточной дифференцировки мышечных волокон; в трубчатых костях обнаружено снижение количества и пшфинофильности костных балок с сохранением остатков хрящевого зачатка; в ткани легких несколько слабее развита бронхиальная сеть. Таким образом, воздействие препарата в более ранние сроки беременности приводит к нарушению гисто- и органогенеза, а в более поздние сроки - к циркуляторным нарушениям в уже сформированных системах плода.

При обработке препаратов галлоцианин-хромовыми квасцами в оба срока беременности отмечено увеличение содержания РНК во многих органах: в мышечных волокнах миокарда, в эндотелии клубочков и эпителии канальцев почек, в эпителии воздухоносных путей и в септалышх клетках легких, а также во всех элементах кости. Закономерным образом в этих же клетках отмечено и увеличение содержания белка. Очевидно, увеличение содержания РНК может быть связано с интенсивно протекающими процессами восстановления и пролиферации, так как известно, что стимуляция белкового синтеза всегда сопровождается повышением содержания РНК (Браше, I960). Это свидетельствует о развитии репаративных процессов на фоне отклонений, вызванных воздействием бонафтона.

В противоположность остальным эмбриональным структурам, в печени после воздействия бонафтона на 10-13-й день беременности в дозе 400 мг/кг выявлено не повышение, а снижение содержания

РНК и белка, что, по-видимому, свидетельствует о нарушении синтеза эмбрио специфических белков в этом органе.

При введении бонафтона в дозе 100 мг/кг как на 10-13-й, так и на 16-19-й день беременности отмеченные выше гистологические и гистохимические изменения либо совсем не наблюдались, либо степень их выраженности была гораздо слабее и приближалась к контрольному уровню.

Следует отметить, что у подопытных плодов выявлены некоторые особенности в обмене веществ, в частности, в углеводном обмене, которые, наряду с характерными для гипоксии циркуляторными нарушениями, также можно поставить в связь с гипоксическим состоянием. Так, при воздействии бонафтона в дозе 400 мг/кг наблюдали повышение содержания гликогена в некоторых органах плода: в коже, головном мозге и сердце. Наши данные согласуются с результатами, полученными Л.С.Персианиновым с сотрудниками, которые показали, что при гипоксии углеводный обмен плода претерпевает характерные изменения, отражающие его тканевые адаптационные реакции. К числу таких реакций относится реакция накопления гликогена в тканях плода. Например, установлено, что в ответ на гипоксию у плода повышается удельный вес анаэробного гликолиза в обменных процессах, благодаря чему он может поддерживать энергетический баланс в тканях, лишенных достаточного количества кислорода. Анаэробный гликолиз является не экономичным способом тканевого дыхания, так как требует большого количества энергетического материала. Поэтому увеличение синтеза гликогена в тканях при гипоксии может рассматриваться как приспособительная реакция организма, способствующая осуществлению анаэробного дыхания. Описана четкая корреляция между временем переживания плодов при гипоксии и резервами гликогена (Л.С.Персианинов и др., 1971).

Для объяснения гипоплас тических отклонений у плодов отметим резкое снижение содержания РНК и белков, выявленное гистохимиче-ски в плацентах после воздействия бонафтона как в дозе 700 мг/кг, так и 400 мг/кг в оба срока беременности.

Общеизвестно, что необходимой основой всех эмбриональных мор-фогенетических процессов, т.е. процессов пролиферации и дифферен-цировки, является синтез белков. При этом следует принять во внимание многочисленные литературные доказательства о возможности синтеза в плаценте эмбриоспецифических белков (А.И.Брусиловский, 1976; Kaufinann, Davidoff, 1977). В таком случае полученные нами данные о снижении уровня РНК и белка в плаценте свидетельствуют о том, что воздействие бонафтона в высоких дозах 700 и 400 мг/кг приводит к угнетению синтеза белков в плацентарных структурах, в том числе, вероятно, и эмбриоспецифических белков. Это обстоятельство, наряду с нарушением синтеза белков в эмбриональной печени, по всей видимости, также может иметь определенное значение в наличии гипоплас тиче ских явлений у плодов.

Несмотря на нарушения в обмене белков и нуклеопротеидов при введении препарата в дозе 400 мг/кг, другие стороны функционального состояния печени - эмбриональное кроветворение и накопление гликогена - у плодов всех подопытных групп не отличались от контроля.

У 20-дневных плодов всех экспериментальных групп микроскопически выявлена одинаковая насыщенность печени элементами крови, т.е. имеет место одинаковая интенсивность печеночного кроветворения у контрольных и подопытных плодов. Отсутствие задержки инволюции гемопоэтической ткани у подопытных плодов свидетельствует об одинаковой зрелости их печени с контрольными плодами. Кроме того, количественно не отмечено уменьшения содержания гликогена в печени и сахара в крови у подопытных плодов. По всей вероятности, эти факты косвенным образом свидетельствуют о нормальной функции коры надпочечников у плодов после воздействия бонафтона даже в высокой дозе 400 мг/кг. Такой вывод подтверждается данными литературы о взаимосвязи инволюции гемопоэтической ткани и процессов накопления гликогена в печени плодов с нормальным функционированием гипоталамо-гипофизарно- надпочечниковой системы.

Известно, что во второй половине эмбриогенеза кроветворение в печени постепенно замирает (В.М.Бреслер и др., 1969; О.В.Волкова, М. И.Пекарский, 1976). Важную роль в этом процессе играют кор-тикостероиды самого зародыша. В сериях опытов с интактными и адреналэктомированными самками и гипофизэктомированными плодами доказано, что для нормальной редукции гемопоэза в печени плода необходимо регулирущее влияние гипофизарно- надпочечниковой системы (Jacquot И др., 1973; Hagel, Billat, 1974; Jacquot, Uagel, 1976), которая, как известно, становится функционально активной уже в пренатальном периоде развития (М.С.Мицкевич, 1981).

Углеводный обмен в печени плода также обусловлен функциональной связью между печенью и корой надпочечников. Содержание гликогена в печени и сахара в крови зависят не только от уровня материнской глюкозы, но и от некоторых факторов развития плода. Многочисленными работами Jost с сотрудниками показано, что становление гликогенсинтетических процессов и накопление гликогена в печени плода происходит под влиянием его гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (Ноет, 1974).

Согласно литературным данным, как инволюция гемопоэтической ткани (Jacquot,uagel, 1976), так и быстрое накопление гликогена в печени нормальных плодов крыс (В.М.Бреслер и др., 1969) начинается с 18-ого дня внутриутробной жизни, коода под влиянием АКТГ надпочечники активизируют свою гормональную деятельность (Т.С.Сахац-кая, 1974).

До сих пор мы рассматривали неспецифические опосредованные механизмы эмбриотропного действия бонафтона вследствие структурного и функционального поражения плаценты и материнского организма. Вместе с тем нельзя было исключить возможность непосредственного поражения бонафтоном эмбриональных зачатков в случае его способности проникать через плацентарный барьер и накапливаться в тканях плода в значительных количествах.

В опытах с оценкой трансплацентарного перехода меченого бонафтона показано, что бонафтон-^^С проникает через плаценту и через 2 ч после введения содержится во всех элементах плодовмести-лища. При этом подчеркнем, что абсолютное количество препарата, переходящего к помету, весьма невелико по сравнению с содержанием в крови самки. Установлено, что трансплацентарный переход увеличивается с возрастом плода. Так, при введении бонафтона-^С на 19-й день беременности трансплацентарный переход за сутки составил 5,8+0,8$, что в 3,4 раза выше (Рс0,01) уровня перехода за такой же период после введения на 18-й день беременности (1,7+0,3$).

Несмотря на значительное возрастание трансплацентарного перехода в интервале 2 - 48 ч при введении на 18-й день беременности (с 0,28^0,04 до 2,56+0,4$), за двое суток не происходит достоверного изменения концентрации вещества в тканях плода, в околоплодной жидкости и в плаценте (уровни концентраций в этих объектах были, однако, различными). Напротив, в оболочках плода за указанный период времени концентрация бонафтона-*^С увеличилась почти в 15 раз и достигла наибольших значений - 34±5,3 нКи/г - через 48 ч. При введении препарата на 19-й день беременности наибольшая концентрация его также была выявлена в оболочках плода.

Плодные оболочки являются самыми малоизученными в экспериментальной эмбриологии структурами (Б.П.Токин, 1970). Известно, что они участвуют в создании необходимой для развития зародыша водной среды, а также, путем активного метаболизма, поддерживают состав и концентрацию органических и неорганических веществ в околоплодной жидкости. Данные об активности ферментных систем в эпителии амниона указывают на участие плодных оболочек в обеспечении гомео-стаза развивающегося плода (Говорка, 1970). Однако до настоящего времени их функциональные особенности недостаточно изучены даже цри нормально протекающей беременности (А.Ф.Мирошникова, А.И.Бру-силовский, 1974) и, тем более, в случае воздействия каких-либо лекарственных веществ.

Высокая тропность бонафтона к плодным оболочкам и накопление его против градиента концентрации позволяет предполагать способность препарата связываться с определенными структурами оболочек.

Возможность накопления бонафтона-*^С в оболочках за счет поступления вещества со стороны матки, по всей вероятности, надо отбросить, учитывая наличие лишь механического контакта между стенкой матки и плодными оболочками (Пэттен, 1959; Ю.В.Гулькевич. и др., 1968), а также отсутствие васкуляризации последних (Ю.В.Гулькевич и др., 1968; Говорка, 1970). По-видимому, можно предположить, что накопление препарата или его метаболитов, несущих метку, в оболочках происходит за счет сорбции вещества из амниотической жидкости, или, по нашему мнению, более вероятно, за счет активного перераспределения бонафтона из плаценты, в которой концентрация вещества в течение 2-х суток после введения оставалась на довольно высоком уровне, на порядок превышая концентрацию в тканях плода и околоплодной жидкости. Заметим, что, по-видимому, в этом случае ацриори не должно быть недостатка в энергетическом обеспечении процессов активного переноса, так как ни в плацентах, ни в плодных оболочках после воздействия бонафтона даже в высокой дозе 400 мг/кг не отмечено снижения запасов гликогена, являющегося важным внутриклеточным источником энергии.

Более подробно обсудить этот вопрос не цредставляется возможным, так как в литературе нам не встретились сведения о явлениях накопления в оболочках или о перераспределении в элементах плодовместилища каких-либо химических веществ. Кроме того, механизмы активного транспорта даже в общих чертах еще не получили окончательного объяснения (Иост, 1975).

В методическом отношении полученные результаты свидетельствуют, по нашему мнению, о необходимости раздельной регистрации содержания лекарственных препаратов в элементах плодовместилища. Определение уровней трансплацентарного перехода по содержанию вещества в плодах совместно с амнионом, как это часто встречается во многих работах, может привести к завышенной оценке уровня поступления препаратов в ткани самого плода и не выявить возможного избирательного накопления в других элементах плодовместилища.

Действительно, в наших опытах собственно плодам в последней трети беременности переходит лишь 0,55$ количества бонафтона, поступившего в 1фовь матери. Низкий уровень трансплацентарного перехода и отсутствие накопления бонафтона в тканях плода в совокупности с ранее изложенными данными об отсутствии повреждающего действия на эмбриогенез дозы, в 50 раз превышающей терапевтическую дан человека (100 мг/кг), позволяют полагать, что применение терапевтических доз бонафтона в период беременности не окажет отрицательного воздействия на развитие плода.

Вместе с тем в последние годы в тератологии утвердилось мнение, что если в низких дозах препарат не вызывает анатомических пороков развития, то это отнюдь не может считаться надежным критерием отсутствия повреждающего действия на эмбриогенез (А.П. .Пдбан, 1977; Brent, 1974; Wilson, 19776; Larsson и др., 1982). Например, известно, что некоторые функциональные отклонения от нормального развития, вызванные воздействием лекарственных веществ на материнский организм, могут проявляться лишь после рождения в виде повышенной постнатальной смертности, отставания в росте, нарушений обмена веществ, меньшей продолжительности жизни, постнаталь-ного канцерогенеза, или в виде так называемой "тератологии поведения" (С.Н.Стрекалова, 1975; Н.М.Смольникова, 1982; Spyker, 1975; Tanimura, 1976; Grauwiler и др., 1976; Wilson, 19776; Buelke-Sam, Kimmel, 1979 И др.).

В нашей работе оценивалось постнатальное развитие потомства после введения бонафтона в дозе 400 мг/кг на 10-13-й день беременности, что вызывало у 20-дневных плодов незначительный эмбрио-тропный эффект (тенденция к снижению средней массы плодов) и некоторые гипопластические изменения в органах и системах. Поэтому данные по обследованию потомства рассматривались как с точки зрения оценки возможности репарации отклонений эмбриогенеза, так и в плане выявления возможных морфофункциональных изменений в пост-натальном развитии, обусловленных воздействием бонафтона.

Следует отметить, что исследования постнатального развития лишь в единичных странах (Англия, Япония) стали обязательным элементом доклинического изучения новых лекарственных црепаратов ( Tanimura, 1976; Tesh, 1977, цит. по Н.М.Смольникова, 1982).

В литературе неоднократно подчеркивалось отсутствие разработанных методических подходов и набора тестов для обследования потомства (Н.М.Смольникова, 1982; Wilson, 19776). В настоящее время эти исследования, по выражению Wilson (19776), "похожи на поиски иголки в стогу сена". Действительно, в нашем случае трудно было заранее предвидеть,какие тесты и на каких системах применять, поскольку бонафтон, являясь химиотерапевтическим препаратом, не обладает выраженной фармакодинамической активностью, а его побочные эффекты в клинике также неизвестны. Поэтому при обследовании потомства использовали возможно более широкий набор интегральных показателей, а также показатели, характеризующие состояние тех органов и систем, которые были поражены у 20-дневных плодов или у самок после воздействия бонафтона (периферическая кровь, печень, почки, ЦНС, сердечно-сосудистая система). Применяли и "нагрузочные" тести: холодовая нагрузка в пробе с плаванием цри оценке мышечной работоспособности, нагрузка бензойнокислым натрием в пробе Квика-Пытеля.

Учитывая литературные указания о том, что отклонения могут проявляться в различном возрасте (Spyker, 1975; Tanimura, 1976; Wilson, 19776), функциональное состояние органов и систем оценивали в динамике в сосунковом, юном и половозрелом периодах жизни у потомства обоего пола.

Морфогистохимические отклонения, выявленные у 20-дневных плодов после воздействия бонафтона в дозе 400 мг/кг, полностью репа-рировались после рождения, что подтверждается нормальным функционированием всех органов и систем потомства.

Функциональное состояние органов и систем по использованным нами количественным тестам практически не отличалось от контроля на протяжении всего периода обследования (возраст 3 недели - 4 месяца). У подопытного потомства не отмечено повышения постнаталь-ной гибели, задержки роста, уменьшения продолжительности жизни, нарушения мышечной работоспособности (в том числе с холодовой нагрузкой) , основного обмена, состояния нервной и сердечно-сосудистой систем и картины периферической крови, изменения гистологической структуры внутренних органов, изменения функционального состояния почек, а также белковообразовательной и обезвреживающей функций печени и системы микросомального окисления в гепатоцитах.

Практически одинаковая продолжительность жизни у контрольных и подопытных животных позволяет косвенным образом судить об отсутствии влияния бонафтона на иммунитет, основываясь на предположении Wilson (19776) о взаимосвязи уменьшения продолжительности жизни и поражения иммунной системы у потомства после внутриутробного воздействия лекарственных веществ.

Учитывая близость химического строения бонафтона к производным хинона, у которых выявлена или предполагается канцерогенная активность (Schramm и др., 1971), особое внимание обращали на оценку возможности трансплацентарного бластомогенного эффекта бонафтона. При этом в наших опытах у подопытного потомства не отмечено изменения частоты и локализации макроскопически выявляемых новообразований. Эти показатели достоверно не отличались от контроля и соответствовали известному из литературы спонтанному уровню опухолеобразования у крыс (В.Н.Анисимов, 1976; В.Н.Анисимов и др., 1978).

Кроме того, оказалось возможным сделать и другие косвенные заключения о нормальном становлении или функционировании некоторых систем.

В напшх опытах у подопытного потомства мужского пола достоверное укорочение гексеналового наркоза по сравнению с подопытными самками начинает выявляться в те же сроки, что и у контрольных самцов (табл. 4.4). Это позволяет косвенным образом полагать, что баланс половых гормонов у подопытных потомков мужского пола не нарушен, так как известно, что повышенная активность микросомальных ферментов печени у самцов крыс обусловлена действием половых гормонов (Парк, 1973).

Косвенным признаком нормального функционирования гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы служит, в частности, отсутствие гибели у потомства после рождения, так как дисфункция этой системы препятствует постнатальной выживаемости (Жост, 1974).

Таким образом, комплексная оценка состояния потомства бт самок, получавших бонафтон в токсической дозе 400 мг/кг, не выявила влияния препарата на постнатальное развитие.

В заключение подчернем, что анализ действия бонафтона на эмбриогенез белых крыс показал следующее. Отклонения в эмбриональном развитии отсутствовали при воздействии бонафтона в дозах 2, 50 и 100 мг/кг (т.е. на уровне терапевтической для человека и превышающей ее в 25 и 50 раз) и имели место только при введении препарата в токсических для беременных самок дозах 400 и 700 мг/кг (т.е. в 200 и 350 раз превышающих терапевтическую для человека).

По всей вероятности, обнаруженные неспецифические нарушения эмбриогенеза обусловлены опосредованным токсическим влиянием бонафтона на организм самки и функциональное состояние плаценты.

Это предположение подтверждается весьма невысоким уровнем трансплацентарного перехода и отсутствием накопления бонафтона в тканях плода. Не отмечено также наличия отдаленных эффектов у потомства после введения бонафтона в токсической дозе 400 мг/кг.

Приведенные материалы свидетельствуют о том, что бонафтон не является тератогеном для белых крыс.