Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Влияние перфторана на течение раневого процесса на фоне антибиотикотерапии цефотаксимом и воздействия постоянного магнитного поля

На правах рукописи

Зюзя Екатерина Васильевна

ВЛИЯНИЕ ПЕРФТОРАНА НА ТЕЧЕНИЕ РАНЕВОГО ПРОЦЕССА НА ФОНЕ АНТИБИОТИКОТЕРАПИИ ЦЕФОТАКСИМОМ И ВОЗДЕЙСТВИЯ ПОСТОЯННОГО МАГНИТНОГО ПОЛЯ

14.03.06 — фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

2 8 НОЯ 2013

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Курск-2013

005539990

005539990

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители:_

кандидат медицинских наук, доцент Пашин Евгений Николаевич доктор медицинских наук, профессор Иванов Александр Викторович

Официальные оппоненты:

Резников Константин Михайлович - заслуженный деятель науки РФ, академик Международной академии информатизации при ООН, доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия имени H.H. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой фармакологии

Покровская Татьяна Григорьевна - доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет», профессор кафедры фармакологии и фармацевтических дисциплин Института последипломного медицинского образования

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится 13 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России.

Автореферат разослан « »_<<Л. 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Овод Алла Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В настоящее время в хирургии, несмотря на обилие предложенных методов, остро стоит проблема профилактики и лечения гнойных ран. По статистике гнойно-воспалительные процессы стоят на первом месте (35-45%) среди осложнений и на третьем месте в структуре причин летальности хирургического стационара. Частота развития инфекционных осложнений у больных, перенесших оперативные вмешательства на брюшной полости, составляет 2,7-38,5% (Малков И.С., 2006; Доброквашин C.B., 2008; Гараев В.Н., 2009).

При проведении терапии необходимо учитывать, что на течение и прогноз любого заболевания значительное влияние оказывает действие факторов внешней среды, в частности аномальных магнитных полей (МП), встречающихся на территориях геопатогенных зон. Примером может служить Курская магнитная аномалия, являющаяся самой большой региональной аномалией, занимающей площадь более 160 тысяч км2 (Черных A.M., 2005; Кустов М.В., 2007).

Известно, что у людей, проживающих на таких территориях, имеются определенные нарушения со стороны внутренней среды организма, механизмов ее регулирования и адаптационных систем, что неблагоприятно сказывается на течении и исходе заболеваний. Так, под действием постоянного магнитного поля (ПМП) происходит угнетение Т-клеточного звена иммунитета и реакций гиперчувствителыюсти замедленного типа; увеличение числа и избыточная активация нейтрофильных гранулоцитов, резко сменяющаяся их функциональной и количественной недостаточностью в ходе инфекционного процесса; также отмечается тенденция к развитию аутоантителообразования в условиях патологии (Разинькова Н.С., 2005; Беседин A.B., 2008; Калуцкий П.В., 2009). Кроме того, ПМП способно вызывать ряд метаболических нарушений, в частности усиливать процессы синтеза активных метаболитов кислорода и усугублять гипоксическое состояние в тканях (Агаджанян H.A., 2005; Остапенко В.А., 2004).

Установлено также, что ПМП влияет на биологические свойства микроорганизмов, при этом отмечается повышение скорости их размножения и вирулентности, устойчивости во внешней среде, развитие множественной антибиотикорезистентности. Данные изменения приводят к утяжелению течения инфекционного процесса и способствуют переходу в хронические формы (Черных A.M., 2005; Вельский В.В., 2009).

Раневой процесс представляет собой частный случай воспалительной реакции с присущими ей системными и местными изменениями, в частности, нарушением микроциркуляции, формированием отека в зоне повреждения и вокруг нее, стазом компонентов межклеточной жидкости, нарушением пространственной ориентации макромолекул (Шилов В.Н., 1997; Булы-нин В.И., 1998; Абушкин И.А., 2002). Особую выраженность данный процесс будет носить под действием ПМП.

Традиционным и наиболее распространенным методом профилактики и лечения раневых осложнений была и остается антибиотикотерапия. Однако в связи с прогрессирующим нарастанием резистентности микроорганизмов к антибиотикам и наличием ряда осложнений после их приема, внимание клиницистов обращено к поиску качественно новых методов борьбы с раневой инфекцией. Так, были созданы раневые покрытия на основе биосинтезированного коллагена, проводятся клинические исследования с введением в рану иммуномодуляторов, антиоксидантов, ростовых факторов, культуры фибробластов и другие (Базарный В.В., 2007; Кочетов М.В., 2007; Metcalfe A.D., 2007).

Все вышеперечисленные способы оказывают комплексное воздействие, однако ни один из них не способен направленно влиять на восстановление микроциркуляции и купирование тканевой гипоксии, которые являются основными звеньями патогенеза раневого процесса.

В связи с этим интерес для исследования представляет препарат из группы перфторорганических соединений под названием «Перфторан» (ПФ), относящийся к классу газотранспортных кровезаменителей. Особенности строения перфторуглеродов таковы, что они обладают способностью растворять в себе большие объемы различных газов (в частности кислорода и углекислого газа) с последующей полной их отдачей в местах пониженной концентрации (Иваницкий Г.Р., 2001; Софронов Г. А., 2002).

Известно, что при минимальном количестве побочных эффектов ПФ обладает газотранспортными, мембраностабилизирующими,

цитопротекторными, детоксикационными свойствами, благоприятно влияет на реологические показатели крови и микроциркуляцию, оказывает противошоковое и антигипоксическое воздействие, модулирует активность иммунной системы и процессов тканевого дыхания. Все вышеперечисленное дает возможность расширить области применения перфторана. В частности, использовать его с целью коррекции раневого процесса. В литературе уже опубликован ряд работ, посвященных клиническому и экспериментальному применению ПФ в лечении ран, ожогов и трофических язв. При этом отмечено, что препарат ускоряет сроки эпителизации и заживления ран, способствует уменьшению воспалительного отека и активации репаративных процессов (Орлов A.A., 2004; Крапивин Е.А., 2005; Дроботов В.Н., 2005; Иванов A.B., 2010).

Однако несмотря на большое количество проведенных экспериментов, эффекты ПФ на динамику раневого процесса изучены не полностью, не достаточно ясными остаются механизмы его воздействия на клеточное звено иммунного ответа. Кроме того, в современных литературных данных нет информации о влиянии перфторана на течение инфекционного раневого процесса в условиях воздействия на организм постоянного магнитного поля, а также эффектах его сочетанного введения с антибактериальными препаратами.

Таким образом, актуальность выбранной темы не вызывает сомнений.

Цель исследования: определить возможности синергетических эффектов антибиотика цефотаксима и кровезаменителя с газотранспортной функцией перфторана на фоне воздействия на организм постоянного магнитного поля в условиях моделирования септического раневого процесса и разработать новый способ стимуляции процессов заживления ран.

Задачи исследования:

, 1. Изучить в эксперименте влияние кровезаменителя с газотранспортной функцией перфторана на течение инфекционного раневого процесса при его местном введении на фоне действия постоянного магнитного поля на организм экспериментальных животных.

2. Выявить в эксперименте эффект влияния антибиотика цефотаксима на течение инфекционного раневого процесса при его местном введении на фоне воздействия постоянного магнитного поля на организм экспериментальных животных.

3. Установить в эксперименте эффекты сочетанного влияния кровезаменителя с газотранспортной функцией перфторана и антибиотика цефотаксима при их местном введении на течение инфекционного раневого процесса на фоне воздействия постоянного магнитного поля на организм экспериментальных животных.

4. Исследовать в эксперименте влияние кровезаменителя с газотранспортной функцией перфторана и антибиотика цефотаксима при их сочетанном и раздельном местном введении на фоне воздействия постоянного магнитного поля на организм экспериментальных животных на процесс репаративной регенерации тканей кожи после моделирования инфекционного раневого процесса.

5. Провести сравнительный анализ репаративной и иммунотропной активности кровезаменителя с газотранспортной функцией перфторана и антибиотика цефотаксима при их сочетанном и раздельном местном введении на фоне воздействия постоянного магнитного поля на организм экспериментальных животных в условиях моделирования инфекционного раневого процесса.

Научная новизна исследования. Установлен регенераторный эффект кровезаменителя с газотранспортной функцией перфторана и антибиотика цефотаксима при их сочетанном и раздельном местном введении на фоне воздействия постоянного магнитного поля на организм экспериментальных животных в условиях моделирования инфекционного раневого процесса, проявляющийся ускорением смены фаз процесса репаративной регенерации в месте моделирования и более быстрым созреванием грануляционной ткани.

Выявлен синергетический эффект действия перфторана в отношении антибиотика цефотаксима при их сочетанном местном применении, проявляющийся в ускорении очищения экспериментальной инфицированной раны,

Показано влияние перфторана на состояние сорбционной емкости эритроцитов и гликокаликса эритроцитов при его местном введении.

Научная новизна подтверждается получением одного патента РФ на изобретение и одного патента РФ на полезную модель.

Практическая значимость. Экспериментально показана перспективность местного применения перфторана и антибиотика цефотаксима для стимуляции репарагивной регенерации инфицированных кожных ран.

Выявлена более выраженная ранозаживляющая активность этих субстанций при их сочетанном местном (внутрикожном) введении по сравнению с раздельным введением.

Полученные в эксперименте данные позволяют обосновать рекомендации по их применению. Выявленные эффекты могут быть учтены при экспериментальном или клиническом применении других антибиотиков при лечении инфицированных трофических язв или ран кожных покровов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Перивульнарное введение кровезаменителя с газотранспортной функцией перфторана на фоне воздействия постоянного магнитного поля в условиях экспериментального инфицированного раневого процесса способствует более интенсивной миграции фагоцитов в очаг воспаления, что ускоряет элиминацию продуктов распада тканей и микроорганизмов, а также формирование грануляционной ткани.

2. Одновременное перивульнарное введение кровезаменителя с газотранспортной функцией перфторана и антибиотика цефотаксима на фоне воздействия постоянного магнитного поля в условиях экспериментального инфицированного раневого процесса снижает резистентность факультативных анаэробов к антибиотику.

3. Одновременное перивульнарное введение кровезаменителя с газотранспортной функцией перфторана и антибиотика цефотаксима на фоне воздействия постоянного магнитного поля в условиях экспериментального инфицированного раневого процесса обладает синергетическим положительным эффектом в отношении скорости смены фаз воспалительного процесса и репаративной регенерации тканей кожи.

4. При перивульнарном введении вокруг области экспериментальной инфицированной раны в условиях воздействия на организм постоянного магнитного поля кровезаменитель с газотранспортной функцией перфторана не проявляет иммуномодулирующего действия вне зависимости от того, вводится он изолированно или в сочетании с антибиотиками.

Внедрение результатов исследования. Результаты работы используются в научной работе и учебном процессе кафедр фармакологии КГМУ (акт внедрения от 02.04.2013 г.); кафедры гистологии, эмбриологии, цитологии КГМУ (акт внедрения от 02.04.2013 г.); кафедры анатомии и гистологии человека НИУ «БелГУ» (акт внедрения от 17.04.2013 г.).

Личный вклад автора. Автором лично проанализированы источники отечественной и зарубежной литературы по теме диссертационного исследования, проведены серии экспериментов, получены и обобщены результаты исследования, проведена статистическая обработка и анализ полученных данных, сделаны выводы и практические рекомендации. В работах,

выполненных в соавторстве, использованы результаты исследования с долей личного участия автора не менее 85%.

Апробация работы. Полученные результаты и выводы докладывались на 75-й Всероссийской научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современность, посвященной 75-летию КГМУ (2010); итоговой научной конференции сотрудников КГМУ, Центрально-Черноземного научного центра РАМН и отделения РАЕН, посвященной 78-летию Курского государственного медицинского университета (2013); конференции кафедр фармакологии, клинической фармакологии, биологической химии, патологической анатомии, инфекционных болезней и эпидемиологии, гистологии, оториноларингологии (2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, в том числе 3 - в рецензируемых изданиях, включенных в перечень журналов, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации основных научных трудов; получены 1 патент на изобретение и 1 патент на полезную модель.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и включает в себя; введение, обзор литературы, главы «Материалы и методы исследования», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение полученных результатов», выводы, практические рекомендации и список литературы, содержащий 184 источника, из которых 138 источников отечественных и 46 - зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 22 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объем исследования и схема проведения эксперимента.

Экспериментальное исследование проведено на 80 половозрелых крысах-самцах линии \Vistar массой 200-220 г. Все исследования проводились с соблюдением принципов Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986).

Создано 4 группы наблюдения, сформированные из 20 животных, с целью получения статистически достоверных результатов (табл. 1). Вначале животные всех серий на протяжении 14 суток подвергались воздействию ПМП. После чего производилось моделирование инфицированной раны, а животные продолжали пребывать в условиях воздействия ПМП. Начиная с третьих суток от начала эксперимента, рану обкалывали исследуемыми препаратами. Введение препаратов проводилось подкожно из четырех точек вокруг раны.

В контрольной группе животных в соответствующие сроки после создания модели гнойной раны производилось введение физиологического раствора хлорида натрия в объеме 0,5 мл. Во 2-й группе в соответствующие сроки после моделирования гнойной раны осуществлялось введение препарата «Перфторан» (ОАО НПФ «Перфторан», г. Пущино) в объеме 0,5 мл. В 3-й

группе в соответствующие сроки после моделирования гнойной раны производилось введение 0,5 мл перфторана в объеме 0,5 мл и 0,2 мл цефалоспорина 3 поколения - цефотаксима (Ц) (содержащих 8 мг растворенного вещества из расчета среднесуточной дозы 40 мг/кг). Выбор данного антибактериального препарата обусловлен широким спектром его действия, а также вхождением цефотаксима в стандарты лечения гнойно-воспалительных заболеваний мягких тканей. В 4-й группе животных в соответствующие сроки после моделирования гнойной раны производилось введение 0,2 мл цефотаксима (содержащих 8 мг растворенного вещества из расчета среднесу точной дозы 40 мг/кг).

Экспериментальная модель гнойной раны. После отбора животных, прошедших карантинный режим в условиях вивария, в асептических условиях под наркозом готовили операционное поле, для чего удаляли шерсть и затем обрабатывали кожу 96% спиртом и раствором йода. Иссекали кожу с подкожно-жировой клетчаткой размерами 1,5x1,5 см, после чего в рану помещали марлевый шарик, пропитанный смесью взвесей суточных агаровых культур Staphylococcus aureus № 606 и Escherichia coli № 195. Инфицирующая смесь включала в свой состав 0,5 мл взвеси культуры стафилококка концентрацией 500 млн. микробных тел и 0,5 мл взвеси культуры кишечной палочки в том же разведении. Использование микробной взвеси с таким составом обусловлено частой встречаемостью ассоциаций Staphylococcus aureus и Escherichia coli в клинической практике. Кроме того, в работах различных авторов модель гнойной раны создавалась с помощью данного набора микроорганизмов (Климова Л.Г., 2003; Чадаев А.П., 2004), что дает возможность сопоставлять результаты настоящего исследования с проводимыми ранее.

После введения марлевого шарика рану ушивали. Через 48 часов производили снятие швов, разводили края раны и удаляли марлевый шарик.

Моделирование воздействия магнитного поля. Постоянное магнитное поле, сопоставимое с аномальным МП, воспроизводилось в специальной установке, состоящей из высокостабилизировагшого источника питания и колец Гельмгольца радиусом 1,5 м (расстояние между кольцами 1 м), внутри которых создавалось МП с индукцией 3x10"4 Тл (фоновое значение вертикальной составляющей геомагнитного поля (ГМП) составляет 5x10" Тл). Вектор ПМП находился в суперпозиции с вертикальной составляющей вектора ГМП г. Курска. Лабораторные животные в течение эксперимента находились в центре установки, где неравномерность напряженности ПМП не превышала 30%, данный факт позволяет считать поле однородным. Вышеизложенная методика моделирования ПМП дает возможность сопоставления полученных нами результатов с результатами других исследователей, проводивших эксперимент в аналогичных условиях (Черных A.M., 2001; Литвинова Е.А., 2007; Беседин А.В., 2008; Калуцкий П.В., 2009).

Клиническая оценка заживления раны. Клиническая оценка заживления раны производилась с учетом выраженности отека, инфильтрации, времени очищения раны, образования эпителиального вала.

Планиметрические методы исследования. Оценка заживления раневого дефекта проводилась путем определения в динамике площади раневой поверхности. Для этого контуры раны ежедневно с помощью перманентного маркера переносились на прозрачную пленку, а оттуда - на миллиметровую бумагу. После чего производили вычисления площади в мм . Показатель уменьшения площади (ПУП) раны рассчитывался по формуле:

5"о -5 ПУП= ,9п х100%, где S0- исходная средняя площадь раны на начало лечения, S - средняя площадь раны на момент измерения.

Морфологические методы исследования. Выведение животных из эксперимента осуществлялось на 15 сутки с момента создания модели гнойной раны путем передозировки наркоза. Для морфологического исследования иссекались участки раневой поверхности с окружающими тканями. Материал фиксировался в 10% нейтральном формалине. После стандартных процедур заливки в парафин и микротомирования, срезы толщиной 10 мкм подвергались окраске гематоксилином-эозином но общепринятым прописям (Меркулов Г.А., 1969).

После юстировки оптической системы микроскопа Leica-CME с помощью фотоаппарата Olympus SP350 были сфотографированы интересующие участки препаратов при 100- и 400-кратных увеличениях. На цифровых микрофотографиях по кариологическим признакам определяли соотношение разных типов клеток в грануляционной ткани.

Иммунологические методы исследования. Функциональную активность нентрофилов периферической крови оценивали по фагоцитарному показателю (ФГ1), фагоцитарному числу (ФЧ) индексу активности фагоцитоза (ИАФ). Метаболическую активность нейгрофилов определяли по спонтанному и стимулированному опсонизированным и неопсонизированным зимозаном тесту восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-сп., HCT н/з, HCT о/з), а также коэффициентам опсонизации (КО), активации на опсонизированный (КАо) и неопсонизированный (КАн) зимозан.

Структурно-функциональные свойства эритроцитов определяли по показателям сорбционной способности эритроцитов (ССЭ) и сорбционной емкости гликокаликса (СЕГ). Получение эритроцитов производили по методу Е. Beutler (1985) из 5 мл гепаринизированной крови.

ССЭ (в %) вычисляли после инкубации с 0,025% раствором метиленового синего и центрифугирования в течение 10 минут при 3000 об/мин. После чего производили измерение оптической плотности полученного раствора и надосадочной жидкости (при длине волны 630 нм) по отношению к изотоническому раствору хлорида натрия.

СЕГ (в граммах/эритроцит) определяли путем инкубации с 0,005% раствором альцианового синего, десятиминутного центрифугирования при 1000 об/мин и последующего оптического измерения содержания красителя в

надосадочной жидкости в сравнении с изотоническим раствором хлорида натрия (при длине волны 617 нм).

Статистические методы исследования. В работе использованы возможности пакета анализа данных приложения MS Office 2003 - MS Excel. Лицензией на право использования этой версии программного комплекса обладает ГБОУ ВПО КГМУ Минздрава России.

Учитывая низкую чувствительность к виду распределения данных в вариационных рядах, нами использован метод определения достоверности отличий в сравниваемых группах по расхождению доверительного интервала при заданном значении р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Клиническая оценка заживления раны.

Во всех группах исследования после снятия швов (первые сутки от моделирования гнойной раны) отмечались отек, инфильтрация, гиперемия, фибриновый налет, наличие некротических масс и обильное гнойное отделяемое из раны.

В контрольной (1-й) группе животных отек, гиперемия и инфильтрация сохранялись около 10 суток, поверхность раны была покрыта гнойно-некротической коркой, при надавливании на которую выделялся гной. Очищение раны происходило к 10-11-м суткам, а начало образования эпителиального вала по краям раны отмечалось на 12-13-е сутки.

У животных 2-й группы отек, инфильтрация и гиперемия не наблюдались уже на 5-е сутки от момента моделирования гнойной раны, а очищение происходило к концу первой недели (5-6-е сутки), краевая эпителизация отмечалась к 7-е суткам.

У животных 3-й группы исчезновение отека, инфильтрации, гиперемии и гноетечения регистрировалось на 3-й сутки, начало эпителизации наблюдалось на 4-5-е сутки, а к моменту выведения животных из эксперимента у части из них отмечалось практически полное заживление с формированием рубца.

У животных 4-й группы отек, гиперемия сохранялись до 5-6-х суток, очищение раны происходило на 7-е сутки, образование эпителиального вала отмечалось на 9-е сутки от моделирования раны.

Таким образом, при сочетанном местном введении эмульсии «Перфгоран» и антибиотика цефотаксима отмечается их синергетическое действие, выражающееся более чем в 2-кратном ускорении сроков очищения раневого дефекта (в сравнении с группой контроля), что говорит о быстрой смене фазы экссудации на фазу пролиферации и, как следствие, раннем начале эпителизации и образования грануляционной ткани.

2. Оценка планиметрических методов исследования.

Анализ полученных данных планиметрического исследования показал, что наибольший процент уменьшения площади раны отмечался 3-й группе животных, получавших в течение 12 суток ПФ в объеме 0,5 мл из четырех

точек и цефотаксим по 0,2 мл. Так, на момент выведения животных из эксперимента ПУП раны составлял 73,8±5,44% от исходной (табл. 1).

Площадь раневой поверхности животных 2-й группы, получавших ПФ местно в течение 12 суток, уменьшилась на 63,2±2,76% от исходной (табл. 1).

Наименьшая динамика заживления наблюдалась у контрольной группы животных, получавшей физиологический раствор. Так, ПУП раны на момент выведения из эксперимента составил 11,1 ±2,36% (табл. 1).

По результатам данных планиметрического исследования достоверные отличия присутствовали между всеми четырьмя группами исследования (табл. 1).

Таблица 1

Средние значения процента уменьшения площади раны в группах наблюдения на 15-е сутки после моделирования инфицированной раны

№ группы 1-я группа 2-я группа 3-я группа 4-я группа

ПУП(М±ш) 11,1±2,36 2'3'4 63,2±2,76 |Д4 73,8±5,44 и-4 40,3±2,40 1АЗ

Коэффициент вариации (ш/М*100) 21,26% 4,37% 7,37% 5,96%

Примечание. Надстрочные символы обозначают достоверность отличий с соответствующими группами эксперимента.

Таким образом, местное введение эмульсии «Псрфторан», обладающей газотранспортным и антигипоксическим действием, активирует репаративно-регенераторные процессы и в 5,7 раза ускоряет темпы заживления раневого дефекта (в сравнении с контролем).

При местном введении эмульсия «Перфторан» повышает чувствительность микроорганизмов к антибиотику цефотаксиму, способствуя тем самым более быстрому очищению раны от гнойно-некротических масс, что приводит к ускорению наступления пролиферативных процессов и раннему началу образования регенерирующей соединительной ткани. Это выражается высокими значениями показателя уменьшения площади раны в 3-й экспериментальной группе в 6,6 раза, превышающими таковые в группе контроля и в 1,2 раза в группе с изолированным введением перфторана.

3. Результаты морфологического исследования.

По результатам морфологического исследования процентное содержание фибробластов в 1-й экспериментальной группе было достоверно выше, чем в 3-й и 4-й (табл. 2, рис. 1).

Таблица 2

Процентное содержание фибробластов в группах наблюдения

1-я группа (Ml I + ФР) 67,834 5,44

3,77

Экспериментальные группы

2-я группа (МП + ПФ)

64,5

З/Г

3-я группа (МП+ ПФ + Ц)

41,0

4-я группа (МП + Ц)

1,14

45,9'

Статистические величины М т 1

Примечание. ПФ перфторан, Ц - цефотаксим, МП - магнитное поле, ФР -физиологический расгвор. Надстрочные символы обозначают достоверность отличий с соответствующими группами эксперимента.

7,72

9,15

6,34

16,32

11,30

80 70 60 50 40 30 20 10 О

I I рут

Л груши

3 группа

4 группа

фиоро6л<1С1ы

Рис. 1. Распределение содержания фибробластов в группах наблюдения. Примечание. Заливкой показаны границы доверительного интервала (M±t), вертикальными штрихами разброс значений (М±т).

При этом степень зрелости регенерирующей соединительной ткани 1-й группы значительно ниже, что выражалось меньшим количеством коллагеновых волокон и более рыхлым их расположением. Кроме того, в клеточном составе фибробластического ряда данной группы преобладали юные формы фибробластов, а зрелые фибробласты и фиброциты составляли меньшинство (рис. 2А).

В то же время в 3-й группе (рис. 2Б) грануляционная ткань отличалась высокой степенью зрелости, что проявлялось в большом числе коллагеновых волокон, и упорядоченным их расположением, а также преобладанием фиброцитов и зрелых фибробластов, имеющих веретеновидную форму и овальные, светлые ядра и слабобазофильную цитоплазму.

Различие между 2-й и 3-й группами заключалось в достоверно более низком процентном содержании фибробластов в последней (рис. 1), при этом степень зрелости регенерирующей соединительной ткани была одинаково высока в обеих группах.

• <.. ..- * - ' Л",»' - » I' » V <- I .

и ' • •*,,.» ... I». »7. , ч' ''<• -.4 ', , • д < л г Ч. -Л

1 .'>'••' ^ Ч**' *'.: М, > ^ Г4"' Гч

; <- ; ,ч .л • .. V , , V Д. \.у 1

- • \ ( и.;';. . ч'Л, Л • о 4 ^

, г- «V,« . . ^ , «Л \ Л,-,.4^ ^

- • л* л

2А 2Б

Рис. 2. Клетки грануляционной ткани. Ув. Х400. Примечание:

А - группа исследования № 1. Преобладание в популяции клеток юных фибробластов. Отсутствие организации коллагеновых волокон в пучки. Окраска гематоксилин-эозин.

Б - группа исследования № 3. Клетки грануляционной ткани. Преобладание в популяции клеток зрелых фибробластов и фиброцитов. Параллельно ориентированные слабо оксифильные пучки коллагеновых волокон. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. Х400.

Во 2-й и 3-й группах наблюдения, получавших ПФ, отмечалось наибольшее содержание макрофагов, которое составляло 17,8±8,63% и 11,1±5,87% соответственно. Достоверных отличий между данными группами не выявлено (рис. 3).

30

О ...............

1 групп,! 2ipyiinj 3ipyr:na 4 группа

макрофаги

Рис. 3. Распределение содержания макрофагов в группах наблюдения. Примечание. Заливкой показаны границы доверительного интервала (M±t), вертикальными штрихами - разброс значений (М±ш).

Этот факт, вероятно, был связан с активным фагоцитозом частиц эмульсии ПФ макрофагами с образованием большого числа перфторосом (рис. 4).

« А*

V» ^

. Ч » . V л >

- I , ^ ! - » ^ * >

» л ' 4 ' * ) ~ . ' » " ' ' ' . « * *

. - 4 , ' • •*-' . ■

•- ! Л * • . . • ' • - .

у., > .. ! , ■

Рис. 4. Группа исследования № 2. Клетки грануляционной ткани. Представлены зрелые фибробласты, многочисленные макрофаги с нерфторосомами, гранулопиты, коллагеновые волокна. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. Х400.

В группах наблюдения, не получавших Г1Ф, отмечались единичные макрофаги, гак, в 1-й группе исследования данный показатель был равен 2, !•) 0,83%, а в 4-й 5,4 ) 2,44% (рис. 3, табл. 3).

Таблица 3

Процентное содержание макрофагов в группах наблюдении

Экспериментальные группы

П'ИСТИЧССКПС 1-я группа 2-я группа 3-я группа 4-я группа

величиш,I (МП ■!■ ФР) (МП + ПФ) (МП + ПФ + Ц) (МП + Ц)

М 2,1 ?-3-4 17,8 '-4 11.1 : 5,4 '-2

П1 0,83 8,63 5,87 2,44

1 0,58 5,98 4,06 1,69

Примечание. ПФ иерфторан, Ц - нсфотаксим, МП - магнитное поле, ФР -физиологический раствор. Надстрочные символы обозначают достоверность отличий с соответствующими группами эксперимента.

Анализ содержания лимфоцитов в группах наблюдения показал отсутствие достоверных различий между 3-й (37,8±6,76%) и 4-й (35,0±14,17%) группами, н которых регистрировалось максимальное их количество, статистически достоверно превышающее значения в 1-й и 2-й группах (рис. 5, табл. 4).

Самый низкий процент содержания лимфоцитов регистрировался во 2-й группе, что, вероятно, связано с временным подавлением цитокинпродуцирующей функции макрофагов в связи с усиленным

фагоцитозом частиц ПФ. Вследствие этого возникает недостаток цитокинов, привлекающих в очаг лимфоциты (табл. 4)

60

50 1 ............гп......

..............................................IP 1 .

30

20 1É1........ 1

10 H.......................................

0 1 fpynriû 2 группа 3 группа лимфоциты 4ipynn<3

Рис. 5. Распределение содержания лимфоцитов в группах наблюдения. Примечание. Заливкой показаны границы доверительного интервала (M±t), вертикальными штрихами - разброс значений (М±ш).

Таблица 4

Процентное соотношение различных типов клеток в грануляционной ткани в сравниваемых группах экспериментальных животных на 15-е сутки после моделирования раны

Экспериментальные группы

Тип клеток 1-я группа (МП + ФР) М±т 2-я группа (МП + ПФ) М±ш 3-я группа (МП + ПФ + Ц) М±ш 4-я группа (МП + Ц) М±ш

Лимфоциты 20,8±4,49 8,5±2,14 1Л4 37,8±6,76 35,0±14,17 ''z

Нейтрофилы 2,1±1,35 1,2±0,88 2,5±1,30 2,2±1,60

Плазмоциты 5,3±2,25 4,1±2,75 7,0±1,77 8,0±4,16

Эозинофилы 1,7±1,83 3,8±4,79 0,6±0,51 4 3,4±1,61 J

Примечание. ПФ - перфторан, Ц - цефотаксим, МП - магнитное поле, ФР -физиологический раствор. Надстрочные символы обозначают достоверность отличий с соответствующими группами эксперимента.

Аналогично относительному содержанию лимфоцитов в грануляционной ткани распределялись и плазмоциты. Их максимальное значение установлено в 3-й (7,0±1,77%) и 4-й (8,0±4,16%) группах исследования, однако это превышение было недостоверно в сравнении с 1-й и 2-й группами (рис. 6, табл. 4).

2 груш

Рис. 6. Распределение содержания плазмоцитов в группах наблюдения. Примечание. Заливкой показаны границы доверительного интервала (M±t), вертикальными штрихами — разброс значений (М±т).

Но показателю содержания нейтрофильных гранулоцитов достоверных отличий в группах наблюдения выявлено не было. Так, в 1-й группе этот показатель составил 2,Ш,35%, во 2-й - 1,2±0,88%, а в 3-й и 4-й - 2,5±1,30% и 2,2:i:!,60% соответственно. Кроме того, во 2-й группе также отмечено наименьшее их содержание (рис. 7, табл. 4).

1 I pyüfl.t <! фуип.'| .iipyniu'i 4fpVHfld

пей!рофияы

Рис. 7. Распределение содержания нейтрофилов в группах наблюдения. Примечание. Заливкой показаны границы доверительного интервала (M±t), вертикальными штрихами -- разброс значений (М±т).

Ь>ыло отмечено значи тельное увеличение содержания эозинофилов во 2-й труппе наблюдения (3,8:1.4,79%), что, вероятно, свидетельствует о нсспсцифичсской реакции организма на частицы эмульсии (рис. 8, 9, табл. 4).

10

1 : ру ¡И 1()

Рис. 8. Распределение содержания эозинофилов в группах наолюдения. Примечание. Заливкой показаны границы доверительного интервала вертикальными штрихами - разброс значений (М-1 т).

1

Ч) \

\ -

% • • 1. „ -г" : л

* (

1»- „*» \ ... " 1,

Рис. 9. Группа исследования № 2. Пространственная реорганизация и упорядочивание фибробластов. Представлены зрелые фибробласты, многочисленные эозинофилы, плазмоциты, лимфоциты, коллагеновые волокна. Окраска гематоксилин-эозин. Ув. Х400.

Таким образом, местное изолированное и сочстанное с цефотаксимом введение эмульсии «Перфторан» приводит к активации пролиферации клеток фибробластического ряда, что выражается увеличением содержания фиброцитов и зрелых форм фибробластов и уменьшением доли юных форм в популяции клеточных элементов соединительной ткани. Данные изменения обусловливают более быстрое образование и созревание регенерирующей соединительной ткани.

Местное введение перфторана приводит к активному поглощению капель эмульсии тканевыми макрофагами. Последнее запускает процессы хемоаттракции активированными макрофагами, в том числе и перфторофагами нерезидентных клеток соединительной ткани. Дополнительный приток нейтрофилов и моноцитов, дифференцирующихся в макрофаги, может объяснить более быстрое очищение раны от гнойно-некротических масс. В дальнейшем, практически в абактериальной среде, активный фагоцитоз частиц эмульсии не может способствовать усилению цитокинпродуцирующей функции макрофагов вследствие биологической инертности перфторана и отсутствия на нем антигенных эпитопов. Это подтверждается снижением содержания гранулоцитов в грануляционной ткани.

4. Результаты иммунологического исследования.

При оценке функциональной активности нейтрофилов периферической крови было выявлено, что наибольшие значения ФП отмечаются во 2-й и 3-й группах исследования и составляют 58,7±9,29% и 69,6±8,68% соответственно, что достоверно выше чем в 1-й и 4-й группах (табл. 5). Кроме того, в 3-й экспериментальной группе наблюдаются наивысшие значения ФЧ и ИАФ. Достоверные отличия по показателю ФЧ присутствуют между 3-й и 4-й группами; по показателю ИАФ - между 3-й и 4-й, 3-й и 1-й группами (табл. 5)

Таблица 5

Функциональная активность нейтрофилов периферической крови

Показатель Экспериментальные группы

1 -я группа (МП + ФР) М±т 2-я группа (МП + ПФ) М±т 3-я группа (МП + ПФ +Ц) М±т 4-я группа (МП + Ц) М±т

ФП 39,0±2,45 2'3'4 58,7±9,29 '-4 69,6±8,68 46,0±2,16 w

ФЧ 2,1±0,80 2,5±0,85 2,9±0,55 4 1,8±0,43 3

ИАФ 0,8±0,3б 3 1,5±0,64 2,1±0,47 '-4 0,8±0,21 3

Примечание. ПФ - перфторан, Ц - цефотаксим, МП - магнитное поле, ФР -физиологический раствор. Надстрочные символы обозначают достоверность отличий с соответствующими группами эксперимента.

Наивысшие показатели метаболической активности нейтрофилов периферической крови были выявлены у 4-й группы исследования, так, HCT о/з и HCT н/з составили 1,9±0,20 и 1,5±0,25 соответственно, а показатель НС'Г-сп. был равен 1,1±0,29 (табл. 6). Наименьшие же значения по данным показателям наблюдались в 3-й экспериментальной группе, так, НСТ-сп. составил 0,9±0,12, HCT н/з - 1,2±0,09, HCT о/з - 1,3±0,11 (табл. 6). Статистически значимые отличия были обнаружены по показателям HCT н/з у

3-й с 1 -й и 4-й, HCT о/з у 1 -й и 4-й со 2-й и 3-й группами, а также по КО между

4-й со 2-й и 3-й экспериментальными группами (табл. 6).

Таблица 6

Метаболическая активность нейтрофилов периферической крови

Показатель Экспериментальные группы

1-я группа (МП + ФР) М±т 2-я группа (МП + ПФ) М±т 3-я группа (МП + ПФ + Ц) М±т 4-я группа (МП + Ц) М±т

НСТ-сп. 1,1±0,09 1,1±0,14 0,9±0,12 1,1±0,29

HCT н/з 1,3±0,07 J 1,3±0,11 1,2±0,09 1,4 1,5±0,25 J

HCT о/з 1,6±0,06 ^ 1,4±0,12 ''4 1,3±0,11 1,4 1,9±0,20 z's

КАо 1,4±0,14 1,4±0,13 1,4±0,10 1,7±0,31

КАн 1,2±0,06 1,2±0,08 1,2±0,09 1,3±0,20

КО 1,2±0,09 1,1 ±0,06 4 1,1±0,04 4 1,3±0,07 2'J

Примечание. ПФ - перфторан, Ц - цефотаксим, МП - магнитное поле, фр -физиологический раствор. Надстрочные символы обозначают достоверность отличий с соответствующими группами эксперимента.

При оценке структурно-функциональных свойств эритроцитов наибольшее значение показателя ССЭ было выявлено у 4-й группы исследования и составило 57,7±2,92. При этом достоверные различия между всеми четырьмя группами отсутствовали (табл. 7).

По показателю СЕГ наибольшие значения были выявлены в 1-й экспериментальной группе (3,5±0,31). Статистически достоверные различия присутствовали между 2-й и 3-й с 1-й и 4-й группами, а также между 1-й и 4-й группами исследования (табл. 7).

Таблица 7

Показатели структурно-функциональных свойств эритроцитов

Экспериментальные группы

Показатель 1-я группа (МП + ФР) М±ш 2-я группа (МП + ПФ) М±т 3-я группа (МП + ПФ + Ц) М±т 4-я группа (МП + Ц) М±т

Сорбционная способность эритроцитов 52,8±7,31 54,3±5,25 51,9±7,81 57,7±2,92

Сорбционная ёмкость гликокаликса 3,5±0,31 4,2,3 2,6±0,27 м 2,4±0,321,4 3,1±0,13''2'3

Примечание. ПФ - перфторан, Ц - цефотаксим, МП - магнитное поле, ФК -физиологический раствор. Надстрочные символы обозначают достоверность отличий с соответствующими группами эксперимента.

Установлено, что вследствие уменьшения количества вводимой эмульсии «Перфторан» при местном введении не выявляется прямая иммунотропная активность и отсутствуют изменения фагоцитарной активности нейтрофилов

периферической крови. Данный факт подтверждается достоверно наибольшими значениями фагоцитарного показателя у групп, получавших перфторан. По всей видимости, при местном введении перфторана происходит нормализация кислородного режима в очаге воспаления, что ведет к угнетению кислородзависимых функций нейтрофилов и проявляется минимальными значениями НСТ-сп. Местное введение перфторана приводит к достоверному уменьшению сорбционной ёмкости гликокаликса эритроцитов, что подтверждает его сорбционные способности.

ВЫВОДЫ

1. Местное использование кровезаменителя с газотранспортной функцией перфторана в условиях моделирования инфицированного раневого процесса способствует более интенсивной пролиферации клеток фибробластического ряда по сравнению с использованием цефотаксима или же сочетанного применения перфторана и цефотаксима (в 1,4 и 1,57 раза соответственно).

2. Местное введение кровезаменителя с газотранспортной функцией перфторан и цефотаксима в 6,6 раза (в сравнении с контролем) ускоряет течение репаративной регенерации тканей кожи в области экспериментальной инфицированной раны. Это подтверждалось динамикой уменьшения площади раневого дефекта по сравнению с исходной на 63,2% (перфторан), 40,3% (цефотаксим) и 73,8% (сочетанное применение).

3. При сочеганном местном применении кровезаменителя с газотранспортной функцией перфторана и цефотаксима обнаружен синергетический эффект, проявляющийся 1,5-кратным ускорением смены экссудативных проявлений воспаления пролиферативными процессами.

4. При местном применении кровезаменителя с газотранспортной функцией перфторана в условиях моделирования инфицированного раневого процесса происходит ускоренная рекрутизация в очаг воспаления моноцитов с их последующей дифференцировкой в макрофаги. Это проявлялось увеличением количества макрофагов в грануляционной ткани дна раны по сравнению с сериями исследования с сочетанным введением перфторана и цефотаксима или же с изолированным введением цефотаксима (в 1,6 и 3,3 раза соответственно), что способствовало более быстрой утилизации некротизированных тканей и снижению концентрации хемоаттрактантов в очаге воспаления. Последнее также подтверждалось более низкими значениями процентного содержания нейтрофилов в грануляционной ткани на 15-е сутки после моделирования инфицированной раны в серии с местным использованием перфторана по сравнению с другими сериями исследования.

5. Кровезаменитель с газотранспортной функцией перфторан не обладает прямым иммунотропным эффектом. При его местном введении в условиях моделирования инфицированного раневого процесса на

15-е сутки после моделирования раневого процесса в грануляционной ткани обнаруживалось статистически достоверное 2- и более -кратное уменьшение содержания лимфоцитов по сравнению с контрольной серией и сериями с применением цефотаксима (изолированно и в сочетании с перфтораном), а также плазмоцитов.

Практические рекомендации

Продолжить доклиническое изучение влияния перфторана на течение раневого процесса с целью возможного расширения показаний к его применению и создания новой лекарственной формы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Особенности динамики морфологической картины заживления экспериментальной инфицированной раны при воздействии постоянного магнитного поля и применении эмульсии «Перфторан» и цефотаксима / Е.В. Зюзя, Ю.С. Волчкова, П.В. Калуцкий [и др.] // Курский научно-практическнн вестник «Человек и его здоровье». -2012. - № 4. - С. 10-14.

2. Зюзя Е.В., Волчкова Ю.С., Калуцкий П.В., Иванов Д.А., Пашин E.H. Особенности планиметрических показателей репаратизной регенерации тканей кожи в условиях моделирования инфицированной раны при воздействии на организм постоянного магнитного поля и на фоне местного введения эмульсии «Перфторан» и антибиотика «Цефотаксим» // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». -2013.-№ 1.-С. 11-14.

3. Морфологические особенности репаративной регенерации тканей кожи в условиях моделирования инфицированной раны на фоне воздействия постоянного магнитного поля и местного введения эмульсии «Перфторан» и антибиотика «Цефотаксим» / Е.В. Зюзя, Ю.С. Волчкова, E.H. Пашин, A.B. Иванов // Материалы итоговой научной конференции, посвященной 78-летию КГМУ. - 2013. -Т. 2. - С. 204-206.

4. Зюзя Е.В., Калуцкий П.В., Иванов A.B. Влияние сочетанного применения кровезаменителя перфторан и антибиотика цефотаксим на состояние иммунологических показателей периферической крови в условиях моделирования инфицированной раны и воздействия на организм постоянного магнитного поля // Вестник новых медицинских технологий [Электронный журнал]. - 2013. - № 1.

Патенты

1. Патент на изобретение 2367332 Российская Федерация, МПК51 А61В1/00. Способ оценки эффективности лечения трофической язвы / Лазаренко В.А., Хруслов М.В., Хруслов К.В., Перьков М.В., Зюзя Е.В., Волчкова Ю.С.; заявитель и патентообладатель Курский гос. мед. ун-т. -№ 2008122176/14; заявл. 02.06.2008; опубл. 20.09.2009.

2. Патент на полезную модель 79701 Российская Федерация, МПК51 G09B23/28. Устройство для моделирования раневой поверхности заданных размеров у лабораторных животных / Хруслов М.В., Калуцкий П.В., Иванов A.B., Зюзя Е.В.; заявители и патентообладатели Хруслов М.В., Калуцкий П.В. - № 2008125641/22; заявл. 24.06.2008; опубл. 10.01.2009.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГМП - геомагнитное поле

ИАФ - индекс активности фагоцитоза

КАо - коэффициент активации на опсонизированный зимозан КАн - коэффициент активации на неопсонизированный зимозан КО - коэффициент опсонизации МП - магнитное поле

НСТ-тест - тест восстановления нитросинего тетразолия

НСТ-сп. - спонтанный тест восстановления нитросинего тетразолия

НС'Г о/з - тест восстановления нитросинего тетразолия опсонизированным

зимозаном

НСТ н/з - тест восстановления нитросинего тетразолия неопсонизированным зимозаном

ПМП - постоянное магнитное поле

ПУП - показатель уменьшения площади раны

ПФ — перфторан

ССЭ - сорбционная способность эритроцитов СЕГ - сорбционная емкость гликокаликса ФП - фагоцитарный показатель ФЧ - фагоцитарное число Ц - цефотаксим

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 13.11.2013 г. Подписано в печать 15.11.2013 г. Формат 30х42'/8. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 256"А" Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.