Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние осмотических диуретиков на водно-электролитный состав тканей почки

На правах рукописи

МАТЬКОВ КОНСТАНТИН ГЕННАДЬЕВИЧ

г

ВЛИЯНИЕ ОСМОТИЧЕСКИХ ДИУРЕТИКОВ НА В ОДНО-ЭЛЕКТР О ЛИТНЫЙ СОСТАВ ТКАНЕЙ ПОЧКИ

14.00.25 - фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г. Волгоград -1996

Работа выполнена на кафедре фармакологии Чувашского государственного университета мм. И.Н. Ульянова г. Чебоксары

Научный руководитель:- доктор медицинских наук,

профессор Г.Д. Аникин

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор И.Н. Тюренков

доктор биологических наук, профессор М.Ф. Минссва

Ведущее учреждение: НИИ фармакологии РАМН

Защита состоится1996 г. в..'.Р.. часов на заседании

диссертационного Совета Д 084.54.01 при Волгоградской медицинской академии (400066. г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии. Автореферат разослан 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доцент

Ю.К. Филимонова

0Б1ДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Осмотические диуретики (ыаннит и мочевина) широко используются в клинических условиях для дегидратирующей терапии, лечения дерматозов, форсированного диуреза и желудочно-кишечного диализа (Могош Г, 1984; Goodman end Gilman's, 1992; Мзшкоеский М.Д., 1S93; Глезер Г.А., 1993; Meyer R, 1993), однако многие аспекты их фармакодинампки остаются невыясненными.

Является общепринятым мнением, что манниг оказывает диуретическое действие вследствие повышения осмотического давления ь просвете тубулярных структур, в то же время изменения, происходящие в почке под влиянием диуретика, во многом не известны. Являются эпизодическими сведения о влиянии маннита на ионный статус тканевых структур различных отделов нефронз (Вепез I.et al., 1986; Law R.O., 1987,1991; Wojnowski L., Oberleithner H., 1991), не проводилось исследований о влиянии ионного состава тканей на эффект действия маннита, о различии или сходстве влиянии диуретика по длине н&фрона.

В налих ранних опытах по инкубации срезов коркового вещества почки е среде Маджа-Таггарта (изоосмолярна и изоионка плазме) мы обнаружили набухание ткани на 48 %., снижение тканевого содержания калия на 50 Z с заменой его на натрий (Матьков К.Г., 1989). Среда Маджа-Таггарта и другие модификации сред Кребса широко используются е модельных опыта;-: со срезами почки и кефрока-ми (Mudge G.H., 19-51; Юрасова Т.О., 1973; Smith G.H.et al., 1982; Welling' L.W. et al., 1S90, и др.) однако авторы, интерпретируя данные опытов, не учитывают изменений водно-электролитного состава тканей, индуцируемых самой средой инкубации, а это может привести к неправильным выводам. Введение в состав инкубационных сред осмотически активных соединений позволило бы создать более физиологичные условия для модельных экспериментов, минимизировать осмотические сдвиги в тканях, сохраняя их водно-электролит-еын батане на уровне ингзктного органа.

В трансплантологии важку-о роль играет сохранение жизнеспособности ткачей в процессе консервации органа. В последнее время ;ля предотвращения меточного отека, неизбежного при хранении лочкп в солевых среда-:, многие авторы предлагает вводить в состав инкубационных сред ыаннит (Kline R. et al., 1991; Simic М.,

Vukovio R., 1931; You Y. et si., _ 1S33), что ■ постулирует| необходимость детального изучения его прямого ьлилния на структуры нефрона.

В последние годы отмечается повышенный интерес к дегидратирующему действию ' мочевины 'не только в ренадьной физиологии и фармакологии, но и в других областях медицины. В частности, обнаружение четко регистрируемого терапевтического эффекта мочевины при "многих видах кожной патологии (Meyer R., 1993; Ruping R.W., Haas P.J., 1993; Planitz Y., Burg1 G., 1993) ставит e повестку дня детальное исследование механизмов тканевой дегидратации, вызываемой этим соединением, изучение елияния дегидратации на ионный состав тканеЕых структур. Комплекс выше перечисленных проблем свидетельствует об актуальности исследований влияния.осмотических диуретиков на водно-электролитный состав тканей почки.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение качественных и количественных параметров елияния осмотических диуретиков (маннит и мочевина) на водно-электролитный состав инкубируемых срезов ткани, Еыделенной из различных зон почки, и расчет, на основе полученных результатов, состава среды инкубации, поддер^шгающэй годно-электролитный состав коркоеого Еещества почки на уровне интактного органа. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Изучить дейстЕие различных концентраций маннита и мочевины на водно-электролитный состав срезов тканей, выделенных из различных зон почки (корковое, наружное мозговое Еещество и сосочек) , инкубируемых в электролитных средах.

2. Изучить влияние катионного состава (натрий и калий) сред инкубации на катионный состаЕ инкубируемых срезоЕ почечных тканей и эффекты, вызываемые осмотическими диуретиками, в зависимости от соотношения натрия и калия в среде инкубации.

S. Исследовать влияние безэлектролитных сред с макнитом и мочэеиной (изоосмоляркых плазме) на водно-электролитный состаЕ почечных срезов.

4. Смоделировать среду инкубации, псддер^-ивадшую еод-но-электролитный состав инкубируемых срезов коркового вещества почки на уровне интактного органа.

5. Сопоставить действие осмотических диуретиков на еод-но-элбтролптный состав почечных тканей с влиянием на него белко-

БЫл КОЫГЮКЭКтОБ ПЛЗЗЫЫ.

лЯ'у'чНдЛ КС5ИЗК5. ~ У СТ ЯН О 5 Л 5 КЗ К0ЛПч9СТБ9ННЗЛ 5аВПСПМОСТЪ между концентрациями маннита и мочевины в среда;-: инкубации и величинами дегидратирующего и деионизирующего аффектов этих соединений на ткани почки.

- Впервые найдена, что среды инкубации, изоосмолярные плазме крови и клубочковому ультрафильтрату, гипотокичны по отношению к тканям коркового вещества почки. Изотоничность этих сред тканевой жидкости коркового вещества почки достигается при увеличении их осмолярности маннитом до 600 мосыоль/л.

- Впервые постулировано, что в почечных тканях присутствуют два пула одновалентных катионов:- лабильный и инертный. Первый участвует в обмене с инкубационной средой под влиянием осмотических диуретиков, белков и ионных компонентов среды, Еторой не участвует. Инертный пул одинаков по величине для всех зон почки и не зависит от осмолярности сред инкубации в определенных пределах 0-223 мосыоль/л. Лабильный пул увеличивается от коркового вещества к сосочку, а величина его е отдельных зона;-; варьирует в зависимости от электролитного состава и осмолярности сред инкубации.

- Епергые найдено, что мочевина в относительно низких концентрациях (60 - 260 мМ) существенно снижает содержание натрия в почечных тканях, а при более высоких концентрациях дегидратирующее действие сочетается с менее избирательным деионпзирующим•эффектом.

- Впервые показано, что манннт в зависимости от концентрации может оказывать дегидратирующее действие без изменения ионного статуса ткани пли вызывать дегидратацию в сочетании с деиониза-цией тканевых структур.

- Впервые постулировано, что перемещение воды и покое из просвета канальцев в эпителий может происходить под влиянием осмотических факторов.

Теоретическое и практическое значение работы. Фундаментальные знания пополняются тем, что получены новые данные, расширяющие представления о механизма-; действия осмотических диуретиков (манннт и мочевина) и о влиянии катпонного состава сред инкубации на водно-электролитный состав инкубируемых срезов почки. Введено понятие о лабильном и инертном пулах ионов натрия и калия (наличие которых подтверждено экспериментально), определены

-5-

КеКОхОрЫЭ ЗНК0К0гл9рКиСТл У. У фОрЫИриЕЗККЯ. 11раК±ИЧеСКОе ЗНЗЧвНПе определяется тем, что на основе найденных закономерностей появилась возможность расчета новых сред для инкубации срезов почки с заранее известным воздействием на гидратацию и катионный состав тканей, что позволит экономить время и средства на предварительные испытания. Рассчитан состав инкубационной среды для поддержания водно-электролитного состава коркового вещества почки на уровне ннтактного органа.

Основные положения, выносимые на защиту:

1.Маннит и мочевина обладают не только дегидратирующим, но и деионизирущим действием на инкубируемые срезы тканей почки, зависящим от вида диуретика, его концентрации и зоны почки.

2. Деионизирующее действие мочевины на ткани почки выше, чем для ыаннита при низкой концентрации диуретика в среде (60 ыМ) и заметно ниже, чем для маннита при высоких концентрациях (сЕьпле 760 мМ).

3. Имевшееся в тканях почки одновалентные катионы образуют два основных пула, инертный и лабильный. Инертный пул катионов одинаков для всех зон почки, величина его не зависит от осыоляр-ности сред инкубации. Лабильный пул 'катионов участвует в обмене со средой инкубации, по Ееличпне возрастает от коркового вещества к сосочку и зависит от ионного состава и ссмолярностп сред инкубации, г

4. Электролитные и беззлектролитные среды, изоосмолярные плазме и клубочковому ультрафильтрату, не превентируют набухания инкубируемых срезов почки. Для защиты срезов почки от набухания необходимо повысить осмолярность солевых сред инкубации, лзоос-молярных плазме, ыаннитом до 600 мосмоль/л для коркового и наружного мозгового вещества и до 700 ыосмоль/л для сосочка.

5. Изменение концентрации катионов в среде со 15Э и 6 нМ (натрия и калия соответственно, среда Маджа-Таггарта) до 90 и 50 мМ (натрия и калия соответственно) и введение в состав среды 260 мМ маннита и 50 мМ мочевины поддерживают водно-электролитный состав инкубируемых срезов коркоеого ЕещестЕа на уровне интакт-ной почки.

Апробация. Основные положения работы были доложены на итоговых научных конференциях Чувашского государственного университета им, И.Н.Ульянова (1390 - 1995 годы), 3 и 4 Всероссийских нзучных конференциях по физиологии почек и еодно-солевого обмена

-6-

—...,. ЛГгГ,Г\. ТТ-Й^..«^-.. И-.-.г-А .........--, ..„..А^

i^ljcipnciyЛ, I3dU, ICUUn-Oöyül, i'zl-o; ) • ndynn'w1 lipdrwljl^trorj-'yi Гьип^сусп"

ции "Высшзя школа - народному хозяйству Чувашии" (Чебоксары, 1992), заседании научного общества фармакологов Чувашии, совместна с Чувашскими отделениями Всероссийских обществ физиологов км. И.П.Павлова, биохимиков, патофизиологов, анатомов, эмбриологов п гистологов (Чебоксары, 1996), симпозиуме по физиологии почек и водно-солевого обмена, посЕященном памяти А.Г.Гинецинского (Новосибирск, 1995).

Внедрение. Данные литерзтуры и собственных исследований используются в учебном процессе на кафедре фармакологии Чувашского государственного университета им. И.Н.Ульянова. Разработанный нами состав зшкубзционнон среды для поддержания водно-электролитного гомеостаза инкубируемых срезоЕ коркового вещества почки оформлен рационализаторским предложением (Использование инкубационной среды, поддерживающей еодно-электролитный гомеостаз в среза:-; почки для изучения фармакодкнамики лекарственных препаратов. Удостоверение N 945 от 19.04.95.г., выданное Чувашским гос-униЕерситетом им. И.Н.Ульянова, соавтор Аникин Г.Д.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано S печатных работ.

Объем работы и ее структура. Диссертация изложена на 128 страницах, состоит из вьедения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы (23 отечественных и 118 иностранных источников), иллюстрирована 11 рисунками и 20 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты проводились на тканеЕых среза;-: 0,7' - 0,9 ым толщиной и массой около 10 ыг, выделенных из разных зон почки: коркового вещества (КВ), наружного мозгоеого вещества (НШ) и сосочка (С). Инкубация срезоз велась при 28°С и аэрации Еоздухом в течение 20 мин. Этого Бремени достаточно для стабилизации Еодно-электролит-ного состава инкубируемых срезов почки (Mudg-e G.H.,1951; Law R.O., 1975; Матьков К.Г.,, 19S9). Умеренная гипотермия увеличивает время жизнеспособности клеток (Шумаков В.И. и созет.,1983).

Содержание еоды е ткани определяли по разности елэжного и сухого веса, и выражали в кг/кг сухой массы (кг/кг с.м.). Натрий

и калий определяли методом пламенней фотометрии на ШМ-4,2. Содержание покое е ткани Еырзкали е ыМ/кг с.м., а их концентрацию Е ыМ/л тканевой жидкости.

Основными средами, используемыми в наших опытах, были среды Маджа-Таггарта (Kludge G.H., Taggart J.V., 1950) и "рзЕновесная". Среда Маджа-Таггарта имела следукицлй состав, ыМ: NaCl - 118; КС1 - 5; СзСЬ - 2,25; КН2Р04 - 1,19; Mg-S04 х 7HsO - 1,19; МаНСОз -25; СНзСООМа - 16,6; расчетная осмолярность 338 мосмоль/л. Если среда Маджа-Таггарта по концентрации натрия и калия идентична крысиной плазме, то "равновесная" среда по концентрации этих ионов близка к их концентрациям, найденным нами для PS и НМБ почки крыс е расчете ка тканевуи воду. Она тлела следующий состав, ыМ: NaCl - 40,4; КС1 - 80,81; CaCla - 2,25; КН2РО4 - 1,19; MgS04 X 7НоО - 1,19; МаНСОз - 25; СНзСООМа - 16,6; расчетная осмолярность 335 мосмоль/л. Концентрации ионов натрия и ¡-алия в среде Маджа-Таггарта составили 159,6 и 6,19 мМ соответственно, а е "равновесной" среде по 82 мМ каждого. Модификации среды Маджа-Таггарта проводили за счет изменения соотношения хлоридов натрия и калия, а также заменой натриевых солей калиевыми и наоборот. Осмолярность сред варьировали добавлением как по отдельности езятых маннита и мочевккы, так и их комбинаций. Еезэлект-ролитную инкубацию проводили е дистиллированной годе и 333 мМ водных раствора-: маннита и мочевины. В ряде опытов использовали катиЕную пли диалигнрованную человеческую плазму. Плазму обезво-жиезли (на 20 %) ка гемодиализаторе ДЖ1-2. В 1929 экспериментах использованы почки 264 белых беспородных крыс массой 180-260 гр.

При статистической обработке результатов исследования использовали t-критерии Стьюдента.Функциональную зависимость между исследуемыми параметрами определяли методами регрессионного анализа. Обработка всех результатов и выбор уравнений регрессионного анализа для описания функционально!! зависимости между исследуемыми параметрами и их решение осуществляли с использованием программ статобработки ка базе процессора электронных таблиц Quattro Pro и EXCEL, а также программы STAT6RAPH ка ПК. IEM PC/AT 486DX2.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И Ил ОБСУЖДЕНИЕ

Кезавистга от ионного состзез сред и природы осмолитов (маннит, мочевина, белок), использованных в опыте, все они вызывали как дегидратацию, так к деконизацию инкубируемых срезов почки (табл.1-4). При этом одна и та жэ концентрация осмолита б среде приводила к количественно разному отклику в разных зонах почки. Дегидратирующий и деионизирующий эффекты макнита и мочеЕИ-ны возрастали от коркового вещества к сосочку.

Увеличение гидратации тканей почки в направлении от коркового Еещества к сосочку, сохраняющееся при инкубации в солегых среда-;, вероятно, связано с неравномерным распределением е тканях органических осмолитов, повышением их содержания от коры к папилле (Beck F.X. et al., 1992; Nakanishi Т. et si., 1992). Возможно, что и маннит, и мочевина увеличивают проницаемость мембраны для осмолитое, что и способствует нарастанию дегидратирующего эффекта диуретиков от коры к папилле. Это согласуется с наблюдениями R.O.Law (1991), продемонстрировавшим снижение концентрации нингидрин-положительных соединений в тканях сосочка при повышении осмотичности инкубационной среды за счет мочевины и NaCl.

Дегидратирующий эффект манннтз был выше, чем у мочевины. Так, при добавлении 260 мМ ыаннита к "равновесной" среде гидратация коркового Еещества снижалась на 2 кг/кг с.м., а добавление к этой среде 260 мМ мочевины снижало гидратацию на 0,5 кг/кг с.м. (табл.2 и 3). Это отличие, по-видимому, связано с неодинаковой проницаемостью клеточных структур для маннитз и мочевины.

Считается, что маннит не проникает в метки почечных структур (Benes I. et al., 1986; Wang: X. et al., 1929; Зккерт P. и co-3ET., 1991), а мочевина проникает, хотя проницаемость апикальных и базальных мембран по длиннику нефрона различна (Sands J.M., Knepper М.А., 1987; Sands J.М., ShraderD.C., 1991). Глубокая дегидратация (в дез раза по сравнению с интактной почкой) всех зон почки при 950 мМ маннита (табл.1-2), скорее Есего СЕИдетель-стзует оо осмотическом эффекте, связанном с не поступлением маннита в клетки, тогда как диффундирующая в ткань мочевина при вдвое больших концентрациях (1760 ц\1) сшкала гидратацию срезов лишь до уровня кнтакткого органа (табл.З).

-9-

Таблица 1

Влияние манннта на водно-электролитный состав срезов почки при инкубации б среде Маджа-Таггарта, М± и

Изучаемая функция Корковое вещество Наружное мозговое вещество Сосочек

инт. 0 60 260 960 инт. 0 60 260 960 инт. 0 60 260 960

Н20, 2,9* 4,3 3,7* 3,0* 1,6* 4,1* 5,7 4,9* 4,1* 2,0* 5,6* 9,4 7,8* 6,1* 2,8*

кг/кг с.м. ±0,02 ±0,02 ±0,04 ±0,03 ±0,02 ±0,05 ±0,06 ±0,1 ±0,1 ±0,06 ±0,1 ±0,1 ±0,3 ±0,1 ±0,1

КГа+, 267* 390 434 313* 207* 354* 473 474 418* 237* 876 861 777х 565* 295*

мМ/кг с.м. ±10 ±10 ±19 ±11 ±7 ±13 ±11 ±13 ±14 ±3 ±28 ±20 ±27 ±11 . ±6"

к*, 216* 96 108 75* 63* 291* 137 138 96* 71* 316* 203 202 161* 75*

мМ/кг с.м ±5 ±3 ±5 ±5 ±2 ±6 ±4 ±7 ±3 ±3 ±9 ±5 ±5 ±6 ±3

КТа+ + К"1", 453 486 542 388* 270* 645 610 612* 514* 308* 1182* 1064 979* 726* 370*

мМ/кг с.м ±11 ±12 ±24 ±15 ±8 ±18 ±14 ±20 ±18 ±5 ±31 ±24 ±37 ±17 ±9

Ма+, 90 89 116* 105* 129* 86 81 96х 101* 118* 157* 92 99 93 104

мМ/л ±3 ±2 ±5 ±3 ±4 ±3 ±2 ±4 ±2 ±4 ±6 • ±3 ±5 ±3 ±4

К4", мМ/л 73* 22 29* 24 39* 71* 24 27 23 35* 56* 22 25 26* 26*

±2 ±1 ±1 ±2 ±1 ±2 ±1 ±1 ±1 ±1 ±2 ±1 ±1 ±1 ±1

+ 163* •111 145* 129х 168* 157* 105 ИЗ 124 153* 213* 114 124 119 130*

мМ/л ±4 ±3 ±7 ±4 ±5 ±5 ±8 ±5 ±3 ±5 ±7 ±3 ±6 ±7 ±5

п 150 150 9 9 9 150 150 9 9 9 150 150 9 9 9

Примечание: шгг. - ингактпая псань, 0, 60, 260, 960 - концентрация машшта в среде, мМ, знаками х

(Р £ 0,01), * (Р £ 0,001) отмечена достоверность относительно ткани, инкубированной в среде без маннига, п - количество опытов.

. Таблица 2

Влияние маннита на водно-электролитный состав срезов почки при инкубации в "равновесной" среде, М + т

Изучаемая функция Корковое вещество Наружное мозговое вещество Сосочек

ИНТ. 0 60 260 960 ннт. 0 60 260 960 ннт 0 60 260 960

н2о, 2,9* 4,8 3,9* 2,8* 1,6* 4,1* 6,5 5,6* 4,0* 2,1* 5,6* 9,9 8,5* 6,1* 2,9*

кг/кг с.м. ±0,03 ±0,06 ±0,02 ±0,06 ±0,02 ±0,05 .±0,10 ±0,10 ±0,10 ±0,02 ±0,10 ±0,20 ±0,10 ±0,10 ±0,10

Ыа+, 267* 326 293 263* ' 122* 354 363 345 313 154* 876* 585 517 422* 171*

мМ/кг с.м. ±10 ±18 +8 ±12 ±11 ±13 ±18 ±5 ±23 ±7 ±28 ±25 ±23 ±20 ±6

к+, 216* 382 357 315* 137* 291* 551 506 417* 191* 316* 835 857 582* 238*

мМ/кг с.м. +5 ±11 ±14 ±8 ±6 ±6 ±16 ±22 ±25 ±5 ' +9 ±20 ±28 ±11 ±9

№+ + К+, 483* 708 650 578* 259* 645* 914 851 730* 345* 1182 1420 1247 1004 409*

мМ/кг с.м. ±11 ±28 ±23 ±19 ±17 ±18 ±27 ±27 ±49 ±11 ±31 ±43 ±51 ±31 ±15

, 90* 68 73 92* 66 86* 56 61 78* 73* 157* 60 61 70 58

мМ/л ±3 ±3 ±2 ±4 ±4 ±3 ±2 ±1 ±5 ±3 ±6 ±6 ±3 ±3 ±3

к+, 73 79 91х 110* 84 71* 84 89 104* 91 56* 84 89 95х 81

мМ/л ±2 ±2 +4 ±3 ±4 ±2 ±2 ±3 ±5 ±2 ±2 ±2 ±3 ±2 ±3

На+ + К+, 163 147 164 202* 150 157х 140 150 182* 164х 213* 144 150 165х 139

мМ/л ±4 ±7 ±5 ±4 ±8 ±5 ±5 ±4 ±5 ±5 ±7 +5 ±5 ±4 ±5

п 150 36 9 9 9 150 36 9 9 9 150 36 9 9 9

Примечание: ннт- интактная ткань, (О, СО, 260, 960) - концентрация маниита в среде, мМ, остальные обозначения, как в таблице 1.

Влияние мочевины на водно-электролитный состав срезов почки при инкубации в равновесной среде, М ± m

Корковое вещество

Наружное мозговое вещество

Сосочек

функция инт. 0 60 260 1760 инт. 0 60 260 1760 инт. 0 60 260 1760

н2о, 2,9* 4,8 4,5* 4,3* 3,0* 4,1* 6,5 5,6* 5,1* 3,8* 5,6* 9,9 9,1* 8,3* 5,9*

кг/кг с.м. ±0,03 ±0,10 ±0,10 ±0,10 ±0,10 ±0,10 ±0,10 ±0,10 ±0,10 ±0,10 ±0,10 ±0,20 ±0,30 ±0,30 ±0,10

Na+ , 267* 326 150* 192* 132* 354 363 197* 201* 174* 876* 585 311* 254* 230*

мМ/кг с.м. ±10 ±18 ±9 ±5 ±6 ±13 ±18 ±5 ±14 ±9 ±28 ±25 ±32 ±26 ±9

к+, 216* 382 370 328х 232* 291* 551 437* 395* 302* • 316* 835 762 582* 435*

мМ/кг с.м. ±5 ±11 ±10 ±8 ±5 ±6 ±11 ±12 ±16 ±10 ±9 ±20 ±36 .±42 ±13

Na+ + IC+, 483* 708 520* 520* 364* 645* 914 634* 596* 476* 1182* 1420 1073* 836* 665*

мМ/кг с.м. ±11 ±28 ±19 ±19 ±11 ±18 ±27 ±17 ±30 ±19 ±3.1 ±43 ±37 ±37 ±22

Na+, 90* 68 33* 46* 44* 86* 56 35* 39* 46х 157* 60 34* 30* 39*

мМ/л ±3 ±3 ±2 ±2 ±2 ±3 ±3 ±1 ±3 ±3 ±6 ±6 ±3 ±3 ±3

к+, 73 79 82 75 77 71х 84 77 77 80 56* 84 84 70 74*

мМ/л ±2 ±2 ±3 ±1 ±2 ±2 ±2 ±2 ±3 ±2 ±2 ±2 ±3 ±5 ±1

Na+ + К+, 163 147 115* 121х 121х 157х 140 112* 116х 126 213* 144 118* 100* 113*

мМ/л ±4 ±7 ±5 ±4 ±4 ±5 ±5 ±3 ±6 ±5 ±7 ±4 ±5 ±8 ±2

п 150 36 9 9 9 150 36 9 9 9 150 36 9 9 9

ГО I

Примечание: (0, 60, 260, 1760) - концентрация мочевины в среде, мМ, остальные обозначения как в табл. 1.

Влияние безэлектролитных сред инкубации на водно-электролитнын состав _инкубируемых срезов почки, М ± т _

Изучаемая функция Корковое вещество Наружное мозговое вещество Сосочек

инт, вода маннит мочевина инт, вода маннит мочевина инт, вода маннит мочевина

н2о, 2,9 9,4* 3,4* 5,9* 4,1 10,9* 4,8* 7,2* 5,6 20,1* 7,5* 13,3*

кг/кг с.м. ±0,03 ±0,3 ±0,04 ±0,10 ±0,10 ±0,30 ±0,10 ±0,50 ±0,10 ±1,00 ±0,20 ±0,60

Кта+, 267 120* 89* .96*- 354 122* 89*. 101* 876 175* 88* 129*

мМ/кг с.м. ±10 ±6 ±5 ±4 ±13 ±10 ±2 ±5 ±28 ±14 ±3 ±14

к+, 216 93* 115* 117* 291 108* 105* 110* : 316 64* 74* 109*

мМ/кг с.м. ±5 ±5 ±8 ±6 ±6 ±5 ±4 ±6 ±9 ±6 ±6 ±9

+ К\ 483 213* 204* 213* 645 230* 194* 211* 1182 239* 162* 238*

мМ/кг с.м. ±11 ±11 ±13 ±10 ±18 ±15 ±5 ±11 ±31 ±19 ±9 ±23

Ка+, 90 13* 25* 16* 86 И* 18* 14* 157 9* 12* 10*

мМ/л ±3 ±1 ±1 ±1 ±3 ±1 ±1 ±1 ±6 ±1 ±1 ±1

к\ 73 10* 33* 20* 71 10* 22* 15* 56 3* 10* 8*

мМ/л ±2 ±1 ±2 ±1 ±2 ±1 ±1 ±1 ±2 ±1 ±1 ±1

N3+ + К+, 163 23* 58* 36* 157 21* 40* 29* 213 12* 22* 18*

мМ/л ±4 ±1 ±3 ±2 ±5 ±1 ±2 +2 ±7 ±1 ±2 ±1

п 150 36 18 18 150 36 18 18 150 36 18 18

Примечание: ннт. - интактная ткань, маннит - 338 мМ, мочевина - 338 мМ, остальные обозначения, как в табл. 1.

Инкубация срезов коркового Беществз е среде Мзджз-Таггарта и "равновесной" среда-; (изоосмолярны плазме крови) сопровождалась набуханием ткани на 48 и 62 % соответственно (табл.1 - 2). Однако это набухание лревентировалось при добавлении к средам 260 мМ маннита, т.е. -повышении осмолярности до 600 мосмоль/л, хотя расчетная осмолярность тканеЕОЙ жидкости в этой зоне 220 ыосмоль/л (Law R.O., 1987'). Данные этих экспериментов свидетельствуют о том, что изоосмотичные (по расчету) плазме и клубочко-вому ультрафильтрату среды фактически гипотоничны по отношению к. тканевым структурам коркового Ееществз. Это подтверждается и результатами наших опытов по безэлектролитной инкубации в изоосмотичных плазме 338 ММ растворах маанита и мочевины, где отмечалось набухание коркового Еещества на 17 и 103 Z соответственно по сравнению с интзктной тканью (табл.4).

Набухание инкубируемых срезов наружного мозгового Еещества и сосочка лревентировалось при добавлении к средам Маджз-Таггар-та и "равновесной" 260 и 360 ММ манкита соответственно (табл.1 и 2). При этом расчетная осмолярность сред составила 600 и 700 ыосмоль/л, что соответствовало значениям осмолярности тканевой жидкости этих зон почки, найденным R.O. Low (1987) - 540 и 730 мосмоль/л.

Характер изменения гидратации тканей б зависимости от ионного состава сред и действия осмотических диуретиков показал, что как приток, так и отток воды может идти независимо от потока коков е одних случаях, и параллельно с ним - в других. Та?:, инкубация срезов в Еоде или изоосмотичных плазме 338 мМ растЕОрах маннита или мочевины сопровождалась одинаковыми изменениями кз-тионного состава (суммарное содержание натрия и калия становилась одинаковым для всех зон почки), тогда как гидратация тканей резко отличалась (табл.4). Это свидетельствует о независимом движении воды и ионов. Независимое от ионов движение еоды отмечалось и е случае инкубации в солевых средах с добавлением 60 мМ маннита или 2 7* белка (достоверное снижение гидратации без достоверных изменений ионного состава, табл. 1,2 и 5). По-видимому, в этих случаях приток или отток воды осуществлялся по водным каналам. Канаты для еоды найдены в меточных мембрана-: различных структур почта (Agre Р. et al., 1993; Nielsen S. et al., 1993; Sabolic I., Brown D., 1995).

В то же Еремя, при повышении концентрации маннита свыше 60

-14-

мМ отмечались зависимые друг от друга потоки воды н ионов, что подтверждалось синхронностью в потерях тканями воды и катионов (табл.1 и 2).

Например, при максимальной из исследованных концентраций маннита (960) мМ дегидратирующий и деионизирующпй эффект в среде Мзджа-Таггарта в % от уровня кнтактной почки составлял 45 и 44 а, 51 и 52 %, 50 и 59 % для коркового, наружного мозгового вещества и сосочка соответственно (по табл.1). Такая синхронность, на нза взгляд, свидетельствует об осмотическом движении воды в составе гидратных оболочек ионов (вероятно, по ионным каналам).

С другой стороны, при низких концентрациях мочевины (60-250 мМ) мы наблюдали изменение ионного статуса тканей почки без выраженного дегидратирующего эффекта. Так, в "разновесной" среде при 60 Ш диуретика потерн катионов составили 27. 31 и 25 % от уровня преинкубпрованной ткани коркового, наружного мозгового вещества и сосочка при снижении гидратации лишь на 6, 14 и 8 Z. Причем мочевина избирательно способствовала мобилизации тканевого натрия, содержание которого снижалось до 46, 54 и 53 % от контрольного уровня (табл.3).

Из таблиц 1 и 2 видно, что при маннитной инкубации (60-250 Mi vi) в разных среда;-: уровень гидратации тканей был одинаков, тогда как содержание электролитов в срезах в "равновесной" среде было на 20-40 % больше, чем в среде Маджз-Таггарта. Соответственно и концентрации катионов, рассчитанные на тканевую воду, в "равновесной" среде были выше в 1,2-1,4 раза. Однако поскольку суммарные концентрации натрия и калия в обеих средах не различались, то они при одинаковой гидратации срезов не должны быть различными и в ткакегой жидкости. Это выявленное противоречие между реальны},in и теоретическими параметрами можно понять только в том случае, если допустить, что часть одновалентных катионов в тканях хелатируется и выводится из осмотического пула.

Экспериментальным подтверждением этого можно считать опыты с беззлектролитной инкубацией (табл.4): в раствора;-: макнпта и мочевины, изоосмотичных плазме, ко не содержащих исков, и даже в условиях осмотического шока (инкубация в воде) часть катионов остается в тканях, не диффундируя в среду инкубации. Этот пул одновалентных катионов мы обозначили как инертный. Он был одинаков для всех зон почки: 213 ± 11, 230 ± 15 и 233 ± 19 для коркоЕого, наружного мозгоеого вещества и сосочка соответственно

-15-

при инкубации в Еоде, и не изменялся при увеличении внешней ос-ыотичности ■ маннитом или мочеЕиной от О до 223 мосмоль/л (табл.4).

Разность между общей сушой тканевых катионов и инертным пулом мы обозначили как лабильный пул натрия и калия. В отличие от инертного, лабильный пул увеличивался от коркового вещества к сосочку и варьировал е зависимости как от электролитного состава сред инкубации, так и от наличия или отсутствия в них различных концентраций осмотических диуретиков.

Так, при инкубации в среде Маджа-Таггарта его величина была 273, 378 и 825 мМ/кг с.м., а при инкубации в "равновесной" среде - 435, 684 и 1182 г.;т/кг с.м. для коркового, наружного мозгового вещества к сосочка соответственно (по данным табл.1 и 2).

В присутствие осмотического диуретика во внешней среде лабильный пул тканевых катионов снижается под влиянием осмотических сил. Например, при действии 260 ыМ маннита он уменьшался в корковом, наружном мозговом ЕещестЕе и сосочке до 175 ± 10, 284 ±11 и 487 ±15 мМ/кг с.м. в среде Маджа-Таггарта и до 365 ± 17, 500 ± 27 и 765 ± 19 в "равновесной". Инкубация же при 960 мМ маннита снизила его соответственно до 57 ± 6, 78 ± 5 и 121 ± 11 в среде Маджа-Таггарта и до 45 ± 2, 115 ± 4 и 170 ± 7 ыМ/кг с.м. в "равновесной". В последи- случае суммарное содержание натрия и калия в тканях было практически одинаковым в обеих средах и приближалось к уровню инертного пула, что свидетельствует о почти полной мобилизации лабильного пула.

Наличие мочевины в инкубационной среде вызывало перемещение ионов лабильного пула из ткани в среду, не столь тесно коррелирующее с наружной концентрацией диуретика как при макните. При зтом отмечался более избирательный эффект в отношении типа катиона. Так, уже при 60 ыМ мочевины в "разновесной" среде из срезов в среду инкубации переместилось (в Ш/кг с.м.) 176 ± 8, 166 ± 4 а 274 ± 20 катионов лабильного пула из коркового, наружного мозгового вещества и сосочка соответственно. При увеличении кон-;ентрации мочевины до 260-760 Ш эти показатели практически не ¡вменялись, ко отмечался выход в среду тканевого калия. Однако ;аже при 1760 мМ мочевины лабильный пул катионов уменьшался лишь ;о 151 ± 21, 246 ± 15, 427 ± 23 мМ/кг с.м. в корковом, наружном юзговом веществе и сосочке соответственно (при 960 мМ маннита, :ак отмечено ьыше, эти показатели были 46, 115 и 170 ы,\1/кг

-16-

с.M.).

Очевидно, не проникающий в клетки маннит действует нз еод-но-электролитныи статус ткани косвенно (через осмотический аффект) , а легко диффундирующая в ткань мочевина вызывает дегидратацию и депонпзацию тканей, взаимодействуя с цитоплазмзтическими структура}.!!!.

¡n vivo с безбелковым фильтратом контактируют лишь апикальные мембраны тубулярных структур, тогда как базальные мембраны находятся в контакте с содержащей около 7,2-8,9 ?» белка плазмой крови. Поэтому представляло интерес сопоставить наши данные о действии осмотически;-: диуретиков ка водно-электролитный состав, тканей почки с влиянием на него белок-содержалшх растворов. В специальной серии экспериментов было установлено, что наличие белка в инкубационной среде уменьшает уровень гидратации почечных срезов (табл.5).

В процессе ультоафильтрацки крови з почечных клубочках из нее удаляется около 20 Т, безбелковой жидкости, что приводит к увеличению концентрации белка в крови, оттекающей от клубочка по Еыносящей артерколе, п повышению в ней коллоидно-осмотического давления. Используя диалпзированкую плазму как модель крови после фильтрации в клубочках, мы навит, что она вызывает дополнительную дегидратацию по сравнению с натизной плазмой на 11, 16 к 21 X в корковом, нзружкоь; мозгозом веществе и сосочке соответственно (табл.5), уровень гидратации коркового вещества при зто.м приближается к уровню иктактноп почки.

Данные, полученные в каш:::-: экспериментах с маннитом и дуализированной плазмой. позволяют сделать определенные предположения о механизмах проксимальной реабсорбции в нефроке, ее связи с ксллгпдно-осмотическим давлением. Значение этого фактора, постулированного еще К.Людвигом, в дальнейшем было детализировано е ряде работ (Eresler Е., 1950; 1551; 1957), ко не является общепризнанны;,: из-за отсутствия прямы:-: доказательств (Наточи:-: В.В., 1522). Поскольку в наших опыта:-: с маннитом было установлено, что пэоогмотпчно:"! для коркового аешесгва является среда с осмоляр-ностью 500 моемо ль .'л, то реабгорбипя ультрафпльтрата (ссшляр-ность 330-340 мосмоль-'л) в клетки проксимальных канальцев должна осуществляться за счет этого градиента осмолярности. Вторь::.: этапом может быть переход воды п, вероятно, части ионов из эпителия в постглсмерулярные капилляры с повышенным после ультраоильтра-

-17-

Влияние белковых сред на водпо-электролитпый состав инкубируемых срезов почкп, М ± т_

Изучаемая

Корковое вещество

Наружное мозговое вещество

Сосочек

функция 0 2 7,2 пл. пл. .д 0 2 7,2 пл. пл,д. 0 2 7,2 пл. пл,д.

•н2о, 4,3 4,1* 3,7* 3,7* 3,3* 5,7 5,4* 5,1* 5,1* 4,3* 9,4 8,8* 7,8* 7,6* 6,0*

кг/кг С.М. ±0,02 ±0,03 ±0,02 ±0,04 ±0,04 ±0,10 ±0,10 ±0,10 ±0,10 ±0,10 ±0,10 ±0,20 ±0,10 ±0,10 ±0,10

390 403 277* 303* 290* 473 462 368* 388* 325* 861 813 635* 642* 535*

мМ/кг с.м. ±10 ±18 ±8 ±6 ±5 ±11 ±22 ±10 ±11 ±8 ±20 ±47 ±30 ±24 ±10

к*, 96 139* IIIх 99 84 137 183* 130 143 122* 203 366* 197 193 170*

мМ/кг с.м. ±3 ±7 ±4 ±4 ±2 ±4 ±7 ±7 ±4 ±3 ±5 ±12 ±9 ±5 ±3

Ыа++ К+, т 542х 398* 40211 374* 610 645 498* 521* 447* 1064 1179 832* 835* 705*

мМ/кг с.м. ±12 ±24 ±10 ±9 ±7 ±14 ±29 ±19 ±15 ±13 ±24 ±59 ±38 ±28 ±14

89 98 11х 81 87 81 85 72 74 75 92 92 81 85 88

мМ/л ±2 ±4 ±2 ±1 ±2 ±2 ±4 ±3 ±2 ±2 ±3 ±5 ±3 ±3 ±2

v*- 22 34* 29* 27х 26х 24 34* 25 28 28 22 41* 25 25 27

мМ/л ±1 ±2 ±1 ±1 ±1 ±1 ±1 ±1 ±1 ±1 ±1 ±1 ±1 ±1 ±1

Ка+ 4- К+, 111 132х 106 108 113 105 119 97 102 103 114 133 106 110 115

мМ/л ±3 ±6 ±2 ±2 ±3 ±3 ±5 ±4 ±3 ±2 ±2 ±7 ±4 ±4 ±2

п 150 9 18 27 36 150 9 18 27 36 150 9 18 27 36

Примечание: 0 - среда М ад жа-Т а гта р г л, 2 и 7,2 концентрация альбумина в среде Маджа-Таггарта, %, пл.-плазма, пл.д. - дуализированная плазма (удалено 20% жидкости), остальные обозначения ,как в таблице 1.

цш коллоидно-осмотическим давлением (в наших опытах только диа-лизированкал плазма нормализовала тканевое содержание воды в КБ, табл.5). Сказанное, 'конечно, не отрицает участия в процессе проксимальной реабсорбции активного ионного транспорта (и связанного с ним потока еоды), но, надо полагать, последний не обеспечивает все 100 % объема реабсорбции, о чем свидетельствуют инкубационные опыты с маннптом и диаллзпрозанкой плазмой.

Дискутируемый вариант участия физико-химических механизмов в процесса;-: проксимальной реабсорбции предполагает и более рациональную утилизацию энергетических затрат в мочеобразовакии. Энергия гидростатического давления, расходуемая на образование бег-белкового фильтрата, частично переходит в потенциальную энергию повышенного онкотического давления в капиллярах вторичной сети, которая в дальнейшем используется ка осмотическое перемещение воды и части ионов из просвета канальцев во внутрисосудис-тое пространство коркового вещества почки.

Моделирование сред. В серии опытов со средами с различным соотношением натрия и ¡-алия нами было определено, что между концентрациями катионов б среде инкубации и и:-; содержанием в корковом веществе имеют место определенные зависимости. Методами регрессионного анализа с использованием программ статобработки ка базе процессора электронных таблиц Quattro Pro и EXCEL, мы определили, что эти зависимости выражаются следующими уравнениями:

у = 2,45;-: -i- 57 (1)

для натрия и

у = 2,8х + 103 (2) для калия, где "у"- содержание нона в ткани, а ";-:"- концентрация того же иона в среде инкубации. В опытах с "равновесной" средой было найдено, что она превентирует потерю тканями калия, а при добавлении к среде маннита - набухание тканей. -Зависимость между осмоляркостью среды, содержанием воды, натрия и калия в KB определялась следующими уравнениями:

lg- ух = 2,551 - 0,755 х (3), где "у" - содержание годы (кг/кг с.м.), ";-:" - осмолярность среды (мосмоль/л),

у = - 0,19х + 367 (4), где "у"- содержание натрия (мМ/кг с.м.), ":-:"- осмолярность среды,

у = - 0,24>: + 447 (5), -19-

где "у"' содержание калия., ">:"- осмолярность среды инкубации.

•Используя уравнения 1-5 и их преобразования, мы нашли, что для поддержания пнтзктного уровня воды и катионов в корковом веществе инкубационная среда должна иметь" следующий состав, мМ: Ма+-105; К+-59; . Са7"+-2,25; СГ-125,71; Н2Р04~-1,19;

5042-- 1,19; КС0з~-25; СНзС00~~1б,6; маннит-251. Расчетная осмолярность среды составит 584 мосмоль/л.

При изучении влияния ионного состава сред и диуретиков на водно-электролитный состав срезов почки мы получили предварительные данные, которые использевали для создания сред превенти-рующих изменения того или иного показателя е ткзни. Инкубация коркового вещества в этих средах показала, что наиболее эффективной в поддержании водно- электролитного гомеостаза была среда

/Уа'Ч 1С

7

6 5

Ц 4 о

и

М Г

о

к

ч>

//а"*

1С

(Уа'1") (К+) (//д++ К+)

Ш ГЪШ

700 *

600 1

500 § »•_'

400' -а

300 о Рч

200

100 мо я

Рис. I. Водно-электролптинй состав коркового вещества почки. Примечание: I интактная ткань;"2---инкубации в среде-Мадяа-Таггарта',- 3'-ишеубация'в "равновесной"'среде, 4 - шпеубация" в-модифихзрровашюГг сродс Мадаа-Таггарта; эе (Р — 0 ,001) - достоверность относительно интактиой ткани.

| содержавшая 90 мМ Ма+, 50" мМ К+, 260 мМ маннита и 50 мочевины I (концентрации остальных ионов, как в среде Маджа-Таггарта). Эта среда по составу была наиболее близка к рассчитанной выше, что доказывает правильность"'расчетов (рис.1).

Результаты приведенных исследовании выявили"основные зако-номеркости дегидратирующего и деиокизирующэго действия макнита и |мочевины, формирования катионного состава тканей почки от усло-' еш инкубации, дали нагл ключ к моделированию сред инкубации с прогнозируемым влиянием на водно-электролитный состав почечных срезов.

ВЫВОДЫ

1. Маннит, в низких концентрациях (до 60 мМ) вызывает дегидратацию тграней Есех гон почет без изменения их ионного статуса, а е Солее высоких - дегидрзтацию, сопровождающуюся деиониза-цией, степень которых"пропорциональна концентрации осмотического диуретика.

2. Мочевина б низких концентрациях (60-250 мМ) вызывает де-иокизацию тграней всех зон почки с минимальным дегидратирующим -эффектом, о увеличением концентрации диуретика дегидратирующее действие возрастает, ко Еыражено меньше, чем у макнита.

3. Изоосмогичная и изоионная плазме крови электролитная среда гипотонична для тканей коркового Еещества почки, набухание ткани презентируется добавлением к ней 260 1/2»! маннита.

4. Наличие белка в солевых среда:-: снижает набухание тканей почет, при инкубации срезов коркового Еещества в обезвоженной на 20 % плазме гидратация ткани максимально приближена к уровню ин-тактного органа.

5. Инкубация срезов почет в беззлектролитных средах с ман-нитом и мочевиной выявляет наличие инертного пула тканевых катионов натрия и калия, одинакового для всех зон почки независимо от внешней осмотичности в интервале 0-323 ыосмоль/л.

6. Инкубация срезов почки в электролитных среда-: с маннитом или мочевиной выявляет наличие'тканевых катионов натрия и калия, участвующих в обмене со средой (лабильный пул). Величина лабильного пула возрастает от коркового вещества к сосочку и варьирует в зависимости от природы диуретика и его концентрации.

тп-i А г/ттгттт-п:^ттгг глт.'гл /"Т ттт лттт.пг

iiTMr^ij'i'uitorvi'ic, г с.г.ишс. пДмц)'.ь'1

1. При провэдении модельных опытов со срезали почки, чтобы исключить набухание и резкие сдеиги катионного состава инкубируемых срезоЕ коркового вещества, рекомендуется повышение осмоляр-ности солевых сред маннитом до 584 мосмоль/л, снижение концентрации натрия до 105 ММ и увеличение концентрация калия в среде до 59 мМ, при сохранении концентрации других ионое на уровне плазменных.

2. Рекомендуется использование среды, поддерживающей вод-но-электролктный гоыеостаз инкубируемы:-; срезоЕ коркового вещества почки, как ооноеы для разработки составов используемы;-; для длительной консервации почечных трансплантатов.

3. Найденные в представленной работе основные закономерности между осыоляркостью сред инкубации и их ионным составом с одной стороны, и Еодно-злектролитным составом различны;-; морфологических структур почки с другой (выражены соответствующими уравнениями) могут быть рекомендованы для расчета сред с прогнозируемым влиянием на содержание еоды и одновалентных катионов е модельных опыта:-; по исследованию елиякия лекарственных и биологически активных веществ на водно-злектролигныи состав и метаболизм инкубируемых срезоЕ почки.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Матьков К.Г., Аникин Г.Д., Воробьева Н.Д. Изменения водно-электролитного состава почки при ишемии // Фармакология почек, Барнаул.- 1990. - С.76.

2. Матьков К.Г., Аникин Г.Д., Макова З.С. Действие альбумина на набухание коркового Еещества почки // Высшая школа - народному хозяйству Чувашии, Чебоксары. - 1992. - С.50.

3. Матьков К.Г., Аникин Г.Д. Влияние осмотического диуретика мзннита на водно-электролитный состав коркового вещества почки // Фармакология водно-солевого обмена, Чебоксары.- 1уЭЗ.-С. 90-91.

4. Клейменов Д.Я., Матьков К.Г. Сравнительная характеристика дегидратирующего эффекта маннита и мочевины на инкубируемые срезы наружного ыозгоеого вещества почки // Фармакология водно-солевого обмена, Чебоксары. - - С. 69.

о. rtkiiküik Г. Д. , Матьков К.Г. Действие мочевины ка еодно-электролитный состав почечного сосочка // Фармакология есд-но-солевого обмена, Чебоксары. - 1993.- C.1Q-11.

5. Матьков К.Г., Аникин Г.Д. Влияние гипотонического шока на еодно-электролитный состав инкубируемых срезов почки крысы // Медицинский журнал Чувашии. - 1994, N 1. - С.80-82.

7. Матьков К.Г., Аникин Г.Д. Влияние безэлектролитных и резко гилертоничных сред инкубации на еодно-электролитный состав инкубируемых срезов почки крысы // Медицинский журнал Чувашии. -1995, N1.-2. - С.111 - 115.

8. Аникин Г.Д., Матьков К.Г. Лзоосмотпчна ли реабсорбция в структурах коркового вещества ? // Физиология почки и водно-солевого обмена, Новосибирск. - 1935. - С.7.

Подписано в печать 18. 09. 96 г. Усл. печ. л. 1.0. Тира;* 100 экз..