Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Влияние опухолевых ганглиозидов на пролиферацию Т-лимфоцитов. Определение последовательностей IL-4, способных связывать ганглиозиды

На правах рукописи

Холоденко Ирина Викторовна

ВЛИЯНИЕ ОПУХОЛЕВЫХ ГАНГЛИОЗИДОВ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ Т-ЛИМФОЦИТОВ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ 1Ь4, СПОСОБНЫХ СВЯЗЫВАТЬ ГАНГЛИОЗИДЫ.

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2006

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, РАН

Научный руководитель: Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

кандидат биологических наук И.М. Молотковская доктор биологических наук, профессор H.A. Константинова доктор медицинских наук, профессор A.A. Ярилин

ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Защита диссертации состоится 'У ^ " & ' 2006 г. в_часов на

заседании диссертационного совета Д 208.072.05 в ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, дом 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (117997, Москва, ул. Островитянова, дом 1)

Автореферат разослан " "_2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент

Т.Е, Кузнецова

Актуальность проблемы

Возникновение опухолевого процесса приводит к развитию

иммуносупрессии. Одной из важнейших задач современной иммунологии и медицины является создание эффективных и безопасных средств регуляции иммунитета у опухолевых больных. В настоящее время для этих целей используются рекомбинантные формы интерлейкинов, в основном рекомбинантный интерлейкин-2 (rlL-2). Эффективными оказываются лишь очень высокие дозы интерлейкина, которые являются высокотоксичными и вызывают у больных тяжелые осложнения (Davis C.B., 2003).

Поэтому столь важны все исследования, направленные на поиск новых активных иммуномодуляторов, имеющих свое происхождение от интерлейкинов и способных заменить, хотя бы частично, активности цитокинов, избежав присущих рекомбинантным формам токсичности и осложнений.

Ганглиозиды, универсальные компоненты мембран эукариотических клеток, участвуют в процессах клеточного узнавания, рецепции вирусов, во взаимодействиях типа лиганд-рецептор, клеточной адгезии и контроле клеточного роста, т.е. выполняют важные регуляторные функции (Degroote S., 2004). Однако при развитии патологических процессов их функция меняется на противоположную. Широко известно явление сброса ганглиозидов с поверхности быстроделящихся опухолевых клеток, таких как нейробластома, меланома, лимфома, карцинома молочной железы, гепатома и др. (Hakomori S., 1996). Некоторые ганглиозиды, такие как GM2 и GD2, были определены как клинические маркеры опухолей. В результате шеддинга липидные молекулы попадают в кровоток, и, находясь в свободном виде, воздействуют на клетки иммунной системы, подавляя пролиферацию Т-лимфоцитов. Ранее на большом наборе индивидуальных ганглиозидов было показано, что они подавляют пролиферацию цитокин-зависимых Т-лимфоцитов (Lu Р., Sharom F., 1995). В ряде работ были подробно изучены типы ингибирования для ганглиозидов нормальных, нетрансформированных клеток. Было показано, что ингибирующая активность ганглиозидов убывает в ряду: GT1b>GD1a>GM1>GM3. Кинетический анализ выявил, что ганглиозиды GM3 и GT1b являются

конкурентными ингибиторами пролиферации, a GD1a и GM1 ингибируют пролиферацию как по конкурентному, так и по неконкурентному типам одновременно (Молотковская И.М., 1998).

Молекулярные механизмы подавления пролиферации Т-лимфоцитов связывают, в частности, с их прямым взаимодействием с интерлейкином-2 (IL-2) и интерлейкином-4 (IL-4). Ганглиозиды, таким образом, перехватывают цитокины, необходимые для активации Т-лимфоцитов, тем самым, усугубляя иммуносупрессию, развивающуюся при опухолевой патологии. Поскольку было показано, что ряд ганглиозидов способны образовывать комплексы с IL-2 и IL-4 с высокой константой связывания (Молотковская И.М., 1992), важным представляется определение сайта связывания ганглиозидов на молекуле IL-4, а также определение первичной последовательности фрагментов молекулы IL-4, ответственных за такое связывание. Ранее для решения аналогичных задач применяли фотореактивную пришивку. Так, с помощью фотоаффинного аналога ганглиозида GT1b Shapiro и др. (Shapiro R.E., 1997) установили сайт связывания ганглиозидов на молекуле столбнячного токсина. Поэтому в данной работе была поставлена задача по определению сайтов молекулы IL-4, ответственных за связывание ганглиозидов, и для решения этой задачи был выбран метод фотореактивной пришивки.

Определение сайта связывания ганглиозидов в молекуле IL-4, а также фрагментов молекулы, ответственных за такое связывание, позволит получить новые препараты, способные эффективно перехватывать циркулирующие в крови свободные ганглиозиды, но лишенные недостатков молекул рекомбинантного IL-4. Однако для применения таких пептидов необходимым условием является глубокое понимание механизмов ингибирования иммунокомпетентных клеток ганглиозидами, ассоциированными с развитием опухолевого процесса; такими ганглиозидами являются GM2 и GD3.

Кроме того, экзогенно добавленные ганглиозиды, встраиваясь в плазматическую мембрану клеток, способны вступать во взаимодействие с рецепторами ростовых факторов, как было описано для рецепторов FGF и

EGF, тем самым, модулируя проведение сигнала через эти рецепторы (Rusnati M., 2002; Wang X.Q., 2001). Поэтому была также поставлена задача изучить локализацию ганглиозида GM1 в плазматической мембране относительно различных субъединиц рецепторов IL-2 и IL-4.

Цель исследования: характеристика механизмов иммуносупрессии, вызываемой опухолевыми ганглиозидами GM2 и GD3, а также определение в молекуле IL-4 последовательностей, способных связываться с ганглиозидами.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать типы ингибирования ганглиозидами GM2 и GD3 IL-2- и lL-4-зависимой пролиферации клеток.

2. Изучить влияние сывороточных факторов на тип ингибирования пролиферации цитокин-зависимых клеток, проявляемый опухолевыми ганглиозидами.

3. Определить константы диссоциации комплексов ганглиозид/цитокин.

4. Изучить влияние синтетических пептидов, фрагментов молекулы рекомбинантного человеческого интерлейкина-4, на восстановление пролиферации, ингибированной ганглиозидами GM2 и GD3.

5. Изучить структуру ганглиозид-связывающего сайта молекулы IL-4.

6. Определить те субъединицы рецепторов IL-2 и IL-4, с которыми взаимодействует ганглиозид GM1.

Научная новизна

Впервые определены типы ингибирования пролиферации цитокин-зависимых лимфоцитов опухолевыми ганглиозидами GM2 и GD3. Установлено, что для этих ганглиозидов сохраняется та же закономерность, что и для большинства нормальных ганглиозидов: чем больше остатков сиаловых кислот входит в состав ГСЛ, тем более тип ингибирования приближен к конкурентному.

Впервые было показано, что присутствие экзогенно введенных сывороточных факторов по-разному влияет на тип СМ2-индуцированного

ингибирования пролиферации разных клеточных линий: на И.-2-зависимых клетках линии СТИ.-2 вклад конкурентного ингибирования уменьшается, а на Независимых клетках линии СТ.4Я - усиливается. Присутствие дополнительных сывороточных факторов не влияет на тип 003-индуцированного ингибирования пролиферации обеих клеточных линий.

Впервые определены константы диссоциации комплексов СОЗ/11_-2 и СРЗ/Н-4; установленные константы диссоциации комплексов ганглиозид/цитокин полностью подтверждают результаты, полученные на клетках. Так, конкурентный ингибитор вОЗ формирует с цитокинами 11.-2 и Н-4 комплексы, константы диссоциации которых лежат в области наномолярных концентраций лиганда, тогда как ганглиозид вМ2, проявляющий смешанный тип ингибирования с низким вкладом конкурентного, формирует с цитокинами комплексы, константы диссоциации которых свидетельствуют о низкоспецифическом взаимодействии.

Впервые установлены пространственно сближенные последовательности молекулы Н-4, формирующие сайт связывания ганглиозидов в молекуле 11.-4. Определены аминокислотные последовательности этих фрагментов молекулы Н-4. Это участки 19-25 (ОКТЬСТЕ) и 103-113 (АМ08ТЪЕЫР1-Е).

Впервые установлено, что ганглиозид ОМ1 непосредственно взаимодействует с 3-субъединицей 11--2Р? (на клетках линии СТ1-1--2).

Практическая значимость работы Результаты исследования позволяют расширить существующие представления о молекулярных механизмах иммуносупрессии, вызываемой опухолью; получены новые подходы для создания систем диагностики онкозаболеваний. Полученные пептиды, связывающие ганглиозиды, а также конструкции на их основе могут быть успешно использованы в противораковой цитокинотерапии. Современные методы биотехнологии позволяют создать относительно дешевые конструкции на основе олигопептидов, что существенно расширяет возможности их практического применения.

Таким образом, результаты диссертации целесообразно использовать для создания новых подходов к иммунотерапии и диагностики онкологических заболеваний.

Результатом применения фотореактивного зондирования клеток явились методические рекомендации, которые позволят расширить применение этого важного, но пока редко используемого подхода для изучения как лиганд-рецепторного взаимодействия, так и изменения окружения рецепторных молекул клетки в ходе проведения сигнала.

Внедрение в практику Методические рекомендации по проведению фотореактивной пришивки радиоактивномеченых зондов и анализу продуктов пришивки внедрены в практику работы лаборатории оксилипинов и лаборатории белков гормональной регуляции Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Апробация диссертации Материалы диссертации доложены на VII и IX Всероссийском научном Форуме с меяедународным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003, 2005), на XV и XVII зимних международных молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2003, 2005), на VII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2004), а также на XVIII международном симпозиуме по гликоконъюгатам (Италия, 2005).

Публикации

По материалам работы опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и библиографического указателя. Работа изложена на 154 страницах машинописного текста, включая 10 таблиц и 36 рисунков. Список литературы содержит 250 работ отечественных и иностранных авторов.

Собственные исследования Материалы и методы Культивирование клеток. Клетки IL-2-зависимой цитотоксической Т-клеточной мышиной линии CTLL-2 культивировали в среде RPMI-1640 ("ICN Biomedicals", США) с добавлением 5% или 10% FCS ("Bioclot", Германия), 2 мМ L-глутамина, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, гентамицина (50 мкг/мл), 1 мМ пирувата натрия (все - "Sigma", США) (полной среде, ПС), дополненной 20100 ед.акт./мл rlL-2 (ЗАО «Пол-Пола») в С02-инкубаторе с пересевом один раз в 2 сут. Исходная концентрация клеток составляла 5x104 /мл. Клетки IL-4-зависимой Т-клеточной мышиной линии получали по методу Hu-Li J. (1989). Вкратце, 2*10® клеток линии CTLL-2 помещали в лунку 24-луночного планшета ("Nunc", США) в ПС, содержащей rlL-4 (любезно предоставлен В.М. Абрамовым, ОАО «Институт инженерной биотехнологии» РАО «Биопрепарат») (1000 ед.акг./мл), и инкубировали в С02-инкубаторе в течение месяца со сменой среды один раз в 3 сут. В основной своей массе клетки погибали, но через 2 недели образовался кластер адгезионных (в отличие от суспензионных CTLL-2) живых клеток. Эти клетки (CT.4R) могут расти в присутствии как rlL-2, так и rlL-4 и отличаются от исходной линии (CTLL-2) по морфологии и по плотности рецепторов IL-2Ra (р55) (Hu-Li J., 1989).

Для определения плотности IL-2Ra (р55) лимфоциты дважды отмывали раствором PBS, содержащим 1% FCS и 0.02% NaN3 ("Serva", США); 100 мкл суспензии клеток (2*105 кл.) в PBS, дополненном NaN3 (0.02%) (буфер 1), инкубировали с 704-антителами ("PharMingen", США) 30 мин при 4°С и дважды отмывали буфером 1. Клетки суспендировали в 100 мкп того же буфера и добавляли FITC-меченые конъюгаты F(ab')2 ("Sigma", США). Процедуру инкубации и отмывок повторяли (все - при 4°С), затем клетки анализировали на проточном цитофлуориметре Epics Elite ("Coulter", США) (длины волн на возбуждении и испускании 488 нм и 525 нм соответственно). Регистрировали флуоресценцию не менее 1x10* клеток; полученные гистограммы анализировали с помощью программы WinMDI.

Определение активности rlL-2(4). Клетки отмывали 2 раза средой RPMI-1640 без добавок, затем инкубировали в ПС в течение 4 ч в СОг-инкубаторе, тем самым синхронизировали их в фазе Gi клеточного цикла (за счет депривации цитокинов, Ahmed N.N., 1997). Для измерения активности rlL-2 или r!L-4 клетки линии CTLL-2 или CT.4R соответственно (1*104/лунку 96-луночного U-образного планшета ("Titertek", Flow Lab., Великобритания)) культивировали в 0.2 мл среды с последовательными разведениями rlL-2 или rlL-4. Для каждой точки проводили 4 параллельных пробы. Клетки инкубировали 36 ч, осаждали при 300 g и добавляли по 30 мкл/лунку раствора МТТ ("Sigma", США) (исходная концентрация 5 мг/мл) для определения пролиферации клеток колориметрическим способом (Mosmann Т., 1983). После завершения инкубации (2-4 ч) добавляли 100 мкл DMSO/лунку для растворения кристаллов формазана. Оптическое поглощение измеряли через 15 мин после полного растворения кристаллов на приборе Multiscan ("Titertek", Швейцария) при длине волны 540 нм. Оценка ингибирования IL-2 или IL-4-зависимой пролиферации клеток ганглиозидами. При изучении влияния ганглиозидов на IL-2 или Независимую пролиферацию клеток линии CTLL-2 или CT.4R соответственно, исследуемый ганглиозид добавляли в среду для культивирования одновременно с rlL-2 или rlL-4 и инкубировали 30 мин при 37 °С, затем добавляли клетки и культивировали 2 или 3 сут (для клеток линии CTLL-2 или CT.4R соответственно) в С02-инкубаторе при 37 °С. Анализ пролиферации клеток проводили колориметрическим способом в МТТ тесте (как описано выше).

Степень специфичности ингибиторного действия ганглиозидов на IL-2 или IL-4-зависимую пролиферацию оценивали с помощью модели, основанной на уравнениях ферментативной кинетики (Webb J.L., 1963). Аналогом субстрата является rlL-2(4), аналогом фермента - рецептор IL-2(4), локализованный в плазматической мембране клетки, аналогом ингибитора - ганглиозид. Для построения модели тестировали действие ганглиозидов на 11.-2(4)-зависимую пролиферацию с серийными разведениями rlL-2(4) в широком диапазоне концентраций. Анализ данных

проводили с помощью уравнения Лайнуивера-Берка при использовании программы Inhibit, написанной специально для решения данной задачи (Svirshchevskaya E.V., 1993). По экспериментальным данным вычисляли Kei-константу образования двойного комплекса фермент-ингибитор (либо субстрат-ингибитор) и - константу образования тройного комплекса фермент-субстрат-ингибитор. Параметр W, описывающий совокупное образование комплексов, рассчитывали по формуле: W = Kei / KeS[. В этом случае, если W = 0, ингибирование является строго конкурентным, если же W > 1 - неконкурентным. При 0 < W £ 1 ингибирование происходит одновременно как по конкурентному, так и по неконкурентному типу. Определение констант диссоциации комплексов гангпиозид/1Ь-2 или ганглиозид/11_-4.

Приготовление липосом методом экструкции. Липосомы получали продавливанием суспензии пальмитоилолеоилфосфатидилхолина (РОРС) ("Sigma", США) через поликарбонатную мембрану ("Nucleopore", США) с порами диаметром 0.1 мкм. Липосомы использовали в течение 1 сут, при этом их гомогенность по размерам сохранялась неизменной. Конечная концентрация липосом составляла 0.25 мг/мл (по фосфору). Встраивание зондов в липосомы. Раствор антрилвинилмеченого флуоресцентного зонда AV-GD3 или AV-GM2 (0.1%) (лаб. Химии липидов, ИБХ РАН) в МеОН добавляли к раствору РОРС в хлороформе так, чтобы соотношение веществ по липиду составило 0.5% AV-GD3 (AV-GM2) и 99.5% РОРС. Раствор липидов в круглодонной колбе упаривали на роторном испарителе, затем полученную липидную пленку дополнительно высушивали при вакууме 0.1 - 0.01 мм. рт. ст. в течение 30 мин и переводили в водную суспензию, встряхивая в течение 5 мин. Липосомы получали из полученной липидной суспензии методом экструкции как описано выше.

Параметры связывания рассчитывали, регистрируя изменения анизотропии флуоресценции при добавлении rlL-2 или rlL-4 к суспензии липосом, содержащих встроенные в мембрану зонды. В качестве флуоресцентно-меченых зондов были выбраны ганглиозиды GD3 и GM2,

несущие в области жирнокислотных остатков флуорофор, антрилвинильную группировку. Анизотропию флуоресценции регистрировали на спектрофлуориметре Сагу Eclipse (Varían) в кварцевых полумикрокюветах (5*5 мм) с перемешиванием и термостатированием при температуре 37 °С. Регистрировали анизотропию флуоресценции при длинах волн возбуждения и испускания 370 и 440 нм соответственно, ширина щелей монохроматоров -по 10 нм. Значение анизотропии каждой точки получали усреднением не менее 5 показателей.

Изучение влияния синтетических пептидов молекулы IL-4 на индуцированное ганглиозидами ингибирование пролиферации клеток.

При изучении влияния синтетических пептидов-фрагментов IL-4 на ингибирование пролиферации, индуцированное ганглиозидами GM2 и GD3, исследуемый пептид в концентрации 1500 нг/мл добавляли в среду для культивирования одновременно с ганглиозидом (40 мкг/мл) и инкубировали 30 мин при 37 °С, затем добавляли клетки линии CT.4R и культивировали 3 сут в С02-инкубаторе при 37 °С. Анализ пролиферации клеток проводили колориметрическим способом в МТТ-тесте (как описано выше). Проведение фотореактивной пришивки (125l)-Dcp-GM1 к rlL-4. Определение места пришивки зонда (ограниченный протеолиз, масс-спектрометрия пептидов). Фотореактивную пришивку проводили по следующей схеме: 10 нмоль rlL-4 инкубировали с 10 нмоль (125l)-Dcp-GM1 (конечный объем реакционной смеси 500 мкл) в темноте, в PBS (60 мин, 37 °С), при легком потряхивании. Затем проводили фотолиз с помощью облучения ртутной лампой среднего давления (370 Вт, максимум испускания 365 нм) на расстоянии 7 см, отсекая с помощью фильтра из медного купороса излучение короче 320 нм, в течение 5 мин при комнатной температуре и перемешивании. Белок осаждали центрифугированием на ультрацентрифуге Beckman TL-100 (ротор TLA-100.2, 4 °С, 4 ч). Осадок, содержащий белок, переводили в буфер для протеолиза (0.05 M NH4HC03, рН 7.8, 2 мМ EDTA и 0.01% SDS). Протеолиз проводили эндопротеиназой Glu-C, растворенной в буфере, содержащем 0.05 M NH4HC03, рН 7.8 и 2 мМ EDTA, при соотношении фермент/субстрат, 1:100, М/М, (18 ч, 37 °С) при

мягком покачивании. Процесс протеолиза заканчивали быстрым замораживанием реакционной смеси до температуры -196°С. MALDl-TOF-масс-спектрометрический анализ проводили на времяпролетном масс-спектрометре «UltraFlex» ("Bruker Daitonics", Германия) с ионным источником MALDI в линейном или отраженном режимах; использованы матрицы: насыщенные растворы а-циано-5-гидроксикоричной, гидроксипиколиновой или 2,5-дигидрокисибензойной кислоты в 30% растворе ацетонитрила, содержащем 0.1 %ТФУ. ESI-масс-спектрометрический анализ проводили на ионопролетном масс-спектрометре (Bruker esquire 3000 plus, "Bruker", Германия). Образцы растворяли в 50% водном растворе метанола, содержащем 0.1 % муравьиной кислоты и затем вводили в масс-спектрометр; напряжение в капилляре составляло 450 В.

Выделение плазматических мембран в двухфазной системе декстран/полиэтиленгликоль. Приготовление двухфазной системы для выделения мембран проводили согласно методу (Brunette D.M., 1971). Декстран Т-500 (4 г) доводили до 20 г дистиллированной водой. Полиэтиленгликоль (3.09 г, PEG 6000, "Serva", США) доводили до 10.3 г дистиллированной водой. Полимеры растворяли, переводили в делительную воронку и добавляли 33.3 мл фосфатного буфера (0.22 М, рН 6.5) и 18 мл воды. Смесь оставляли на ночь при 4 °С, затем собирали нижнюю и верхнюю фазы.

Плазматические мембраны выделяли согласно Gruber M.Y., 1984. Клетки линии CTLL-2 или CT.4R (по 50*106) отмывали 2 раза в PBS, 1 раз в гипотоническом буфере (30 мМ NaHC03, рН 7.0, 1 мМ PMSF, буфер 2), затем инкубировали 20 мин (50 мкл буфера 2 на 1x10е клеток, 20°С) при легком покачивании. Клетки помещали в пробирку и инкубировали 5 мин на ледяной бане. Дальнейшие операции проводили при 4 °С. Суспензию клеток гомогенизировали и центрифугировали (15 мин, 600 д). Осадок суспендировали в 7 мл верхней фазы и добавляли 7 мл нижней фазы, затем еще раз суспендировали и встряхивали на шейкере 20-30 с, затем центрифугировали 25 мин при 12500 д на центрифуге Beckman J2-21 (ротор

JS-13.1). Фракцию плазматических мембран, сконцентрированную на границе раздела фаз, собирали и дважды отмывали дистиллированной водой (25 мин, 13000 д на центрифуге Beckman J2-21, ротор JA-20). Мембранную фракцию хранили в осадке при -70°С.

Фотолиз (12sl)-Dcp-GM1-l в клетках линии CTLL-2. Раствор GM1 (100 нмоль) в МеОН добавляли к предварительно высушенному зонду (125l)-Dcp-GM1-I (10 нмоль). Смесь упаривали досуха, липидную пленку растворяли в МеОН (20 мкл), затем добавляли PBS (180 мкп) и обрабатывали на ультразвуковой бане (15 мин при комнатной температуре). Мицеллярную суспензию ганглиозидов (0.2 мл) добавляли к лиофильно высушенной суспензии плазматических мембран (0.1 мг по белку) либо к суспензии клеток линии CTLL-2 (2.5*10б/мл; в эксперимент было взято 5*107 клеток) в PBS, дополненном NaN3 (0.02%). Инкубацию суспензии ганглиозидов проводили с мембранной фракцией 3 ч при 37 °С, с суспензией клеток 40 мин при комнатной температуре и мягком покачивании. Фотолиз фрагментов плазматических мембран (0.1 мг по белку в 200 мкл PBS) и суспензии клеток (2.5 * 10®/мл в 10 мл буфера) проводили как описано выше. В некоторых отдельно обозначенных случаях выделенные фрагменты плазматических мембран подвергали делипидизации тремя объемами смеси СНС1з-МеОН, 1:3 (для более полной делипидизации к образцу добавляли SDS в соотношении 40 мг SDS/1 мг белка мембранной фракции, инкубировали 15 мин перед добавлением органических растворителей), получали белковый преципитат (центрифугирование при 2000 д). Его высушивали в вакууме, затем переводили в буфер для SDS-PAG-электрофореза. Отдельно собирали супернатант, его также высушивали и готовили для электрофореза.

Фотолиз (125l)-Dcp-GM1-s в клетках линии CTLL-2. Эксперимент с фотореактивной пришивкой (125l)-Dcp-GM1-s к рецепторам IL-2 и IL-4 проводили по схеме, описанной для пришивки (125l)-Dcp-GM1-l. В эксперимент было взято 1,5x10е клеток. Фотолиз суспензии клеток (3*106/мл в 10 мл буфера) проводили как описано выше. На этой стадии гомогенат разделяли на две части, из первой части (1x10е клеток) выделяли

плазматические мембраны (в двухфазной системе, как описано выше), а из второй (5*107 клеток) выделяли a-, ß- и у-субъединицы рецептора IL-2 (IL-2R), а также рецептор IL-4 методом иммунопреципитации (см. ниже). Иммунопреципитация. Клетки линии CTLL-2 (2,5хЮ7) отмывали два раза в PBS, осадок ресуспендировали в 0.5 мл лизирующего буфера (0.01 М трис-HCI, pH 8.0, 0.14 М NaCI, 0.025% NaN3, 1% Triton Х-100, 1 мМ иодацетамид, 1 мкг/мл апротинин, 1 мМ PMSF), инкубировали 1 ч при 4 °С на шейкере. Лизат центрифугировали 10 мин при 3000 д для удаления ядер. Надосадочную жидкость собирали и центрифугировали 30 мин при 10000 д. К супернатанту добавляли 10 мкл антител к IL-2Ra, -ß или -у, или IL-4Ra (все - "Santa Cruz Biotechnology Inc." США), инкубировали 1 ч при 4 °С при мягком покачивании на шейкере. Затем к суспензии добавляли 30 мкл протеин-С-сефарозы ("Sigma", США) и инкубировали ночь при 4°С при мягком покачивании. Иммунопреципитат центрифугировали 1-2 мин при 100 д. Супернатант удаляли, к осадку добавляли буфер, содержащий 0.01 М трис-HCI, pH 8.0, 0.14 М NaCI, 0.025% NaN3, 0.1% Triton Х-100, и повторяли центрифугирование. Осадок отмывали два раза в растворе, содержащем 0.01 М трис-HCI, pH 8.0, 0.14 М NaCI, 0.025% NaN3, и один раз в буфере состава 0.05 М трис-HCI. pH 6.8.

Регистрация связывания. SDS-PAG-электрофорез. Для проведения электрофореза пробы растворяли в буфере для образцов, содержащем 1% дитиотриетола, инкубировали на водяной бане 20 мин при 56°С. Электрофорез проводили в 10% полиакриламидном геле при силе тока 25-35 мА и напряжении 180 В (Laemmli U.K., 1970). В каждую лунку наносили по 60 мкг белка. Гели окрашивали по белку серебром по методу (Heukeshoven J., 1988) с некоторыми модификациями. Полиакриламидный гель фиксировали в этаноле (40%) и СН3СООН (10%), инкубировали с 0.4% AgN03 и обрабатывали 1% раствором лимонной кислоты. Процесс останавливали СН3СООН (5%), гель уравновешивали в 10% растворе глицерина и высушивали (1 сут, комнатная температура).

Измерение радиоактивности в SDS-PAG-электрофореграммах проводили с помощью авторадиографии. Высушенную пластину полиакриламидного геля

экспонировали с рентгеновской пленкой (Kodak, X-Omat AR Film, XAR-5, "Sigma", США) при -70°C в течение 14 сут (в отдельно указанных случаях: 2 мес).

Результаты

Определение параметров ингибирования пролиферации клеток линии CTLL-2 и CT.4R под влиянием ганглиозидов GM2 и GD3. Для клеток линии CTLL-2 было показано, что GM2 проявляет как конкурентный, так и неконкурентный типы ингибирования одновременно (W= 0.49), в то время как влияние дисиалированного ганглиозида GD3 близко к конкурентному типу ингибирования; для него значение параметра ингибирования приближено к 0 (Табл. 1).

Таблица 1. Зависимость величины параметра ингибирования И-2-зависимой пролиферации клеток линии СТИ.-2 ганглиозидами СМ1, СМ2, СРЗ и ОТ1Ь.

Ганглиозиды W=Ke/Kesl

10% FCS 5% FCS

GM1 0.20 ± 0.02 0.33 ± 0.04

GM2 0.49 ± 0.04 0.25 ± 0.03

GD3 0.04 ± 0.01 0.11+0.03

GT1b 0.06 ± 0.02 0.08 ± 0.02

Для клеток И-4-отвечающей сублинии СТ^ сохранялись те же закономерности влияния ганглиозидов, что и в случае с 11,-2-зависимой клеточной линией (Табл. 2): дисиалированный ганглиозид вОЗ проявлял конкурентный тип ингибирования (IV = 0.09), тогда как моносиалированный ганглиозид СМ2 ингибировал пролиферацию клеток по конкурентному и неконкурентному типам одновременно {\Л/= 0.26).

Таблица 2. Зависимость величины параметра ингибирования Н.-4-зависимой пролиферации клеток линии СТ^ ганглиозидами вШ, СМ2, вОЗ и вТ1Ь от концентрации РСЭ в среде

Ганглиозиды W = К«Жю/

10% FCS б% FCS

GM1 0.32 ± 0.04 0.51 ± 0.05

GM2 0.26 ± 0.03 0.38 ± 0.04

GD3 0.09 ± 0.02 0.11 ±0.02

GT1b 0.08 ± 0.01 0.09 ± 0.02

Влияние сывороточных факторов на механизмы ингибирования пролиферации клеток линий CTLL-2 и CT.4R ганглиозидами GD3 и GM2.

Значения параметра ингибирования полученные для ганглиозида GD3 на клетках линии CTLL-2, оказались близкими к 0 при различном содержании экзогенно введенных белков и липидов. Тем не менее, при увеличении содержания FCS в среде для культивирования клеток было зарегистрировано небольшое увеличение вклада конкурентного типа ингибирования: при 5% FCS W = 0.11, а при 10% FCS W= 0.04 (Табл. 1). Для клеток IL-4-зависимой линии CT.4R для ганглиозида GD3 получены аналогичные результаты (Табл. 2), то есть количество добавленных внешних факторов практически не влияло на значения параметра ингибирования (для 5% FCS W = 0.11, для 10% FCS — И/= 0.09).

Для ганглиозида GM2 при проведении тестирования в ПС, содержащей как 5%, так и 10% FCS, были получены значения W, находящиеся в интервале между 0 и 1, значительно отличающиеся от 0. Если для клеток IL-4-зависимой клеточной линии для данного ганглиозида наблюдается та же зависимость," что и для остальных ганглиозидов, то есть увеличение количества внешних факторов вызывает усиление вклада конкурентного типа ингибирования (как, например, для ганглиозида GM1, Табл. 2), то для клеток линии CTLL-2 наблюдается обратная зависимость (Табл. 1). То есть увеличение количества сывороточных факторов (с 5% до 10% FCS) приводит к уменьшению вклада конкурентного ингибирования (при 5% FCS W = 0,25 и при 10% FCS W = 0,49).

Изучение взаимодействия рекомбинантных форм интерлейкинов (rlL-2 и rlL-4) с флуоресцентно-мечеными ганглиозидами AV-GD3 и AV-GM2, встроенными в липосомы. Мы поставили перед собой задачу сравнить константы диссоциации, полученные в модельных мембранных системах, липосомах, используя меченые ганглиозиды, с функциональными результатами, полученными на клетках. К липосомам, приготовленным из РОРС и содержащим встроенный AV-GD3, добавляли интерлейкин-2 или -4, и определяли зависимость изменения анизотропии флуоресценции (л) от концентрации соответствующего цитокйна. Показано, что с повышением

концентрации лиганда наблюдается монотонное возрастание значений г, которое выходит на плато в области высоких концентраций цитокина (данные не представлены). Обработка полученных экспериментальных данных в соответствии с уравнением Хилла (Молотковская И.М., 1992) привела к линейным зависимостям (Рис. 1); рассчитанные значения Кл для комплексов СОЗ/11_-2 и 003/11.-4 составляют 1.1Ю"11 М и 4.5-Ю"10 М соответственно.

А в

Рис. 1. Зависимости &гтаУАг зонда АУ-СОЗ от концентрации г 11.-2 (А) или г 11.-4 (В) (в логарифмических координатах) в липосомах, состоящих из 99.5% РОРС и 0.5% АУ-ООЗ.

Аналогичные эксперименты, проведенные с зондом АУ-ОМ2, встроенным в липосомы, не позволили рассчитать константы диссоциации комплексов А\ЛСМ2/гИ-2 и А\ЛСМ2/гИ-4. Так при увеличении концентрации г11_-4 значения анизотропии флуоресценции изменялись лишь в области концентраций лиганда 10~6М, что свидетельствует о низкоспецифическом взаимодействии между СМ2 и цитокином (данные не представлены).

Влияние синтетических пептидов 11.-4 на ингибирование пролиферации, индуцированное ганглиозидами. Для определения тех участков цитокиновых молекул, которые взаимодействуют с ганглиозидами, основным методом является фотореактивная пришивка меченого производного ганглиозида. Однако, поскольку в условиях выбранной методики, ганглиозид может взаимодействовать с цитокином и неспецифически, перед проведением основного эксперимента была проанализирована пространственная структура молекулы г11_-4 и были выбраны наиболее вероятные для взаимодействия с ганглиозидом участки.

Было . предположено, что ганглиозид-связывающие фрагменты полипептидной молекулы должны обладать следующими свойствами:

• располагаться на гибких структурах молекулы;

• нести положительный заряд.

На основании этих предпосылок были выбраны и синтезированы 4 структуры: фрагмент 1 (11.-4 БР 22-37, Т1_СТЕ1_Т\/Т01РАА5К), фрагмент 2 (11.-4 БР 55-68, РУБННЕКОТИСиЗА), фрагмент 3 (11.-4 БР 95-109, ^ЫБСРХ/КЕАМОЗИ), а также получена рекомбинантная форма интерлейкина-4, 11_-4б2 - полноразмерный 11.-4, лишенный последовательности 22-37. Все 4 структуры были получены в Институте инженерной иммунологии (РАО «Биопрепарат»), Три пептида из четырех были изучены по их способности индуцировать пролиферацию клеток линии СТ.4Р. Оказалось, что ни один из пептидов не стимулировал деления клеток в широком диапазоне концентраций (данные не представлены).

Кроме того, все фрагменты 11.-4 были проанализированы по способности восстанавливать СОЗ- или ОМ2-ингибированную пролиферацию клеток линии СТ.4Р. Показано, что для восстановления пролиферации клеток, ингибированной обоими ганглиозидами, максимальным эффектом обладали фрагмент 1 (22-37, "П.СТЕ1Д\ГГ01РААЗК) и фрагмент 4 (11.-452). Так, при внесении в культуральную среду фрагмента гИ-4 ЭР 22-37 отмечается достоверное восстановление ОМ2- или СОЗ-ингибированной пролиферации (Рис. 2, А или В соответственно).

0.5 OD 0.«

0.3 0.2 0.1 0.0

0 200 400 SOO 800 1000 1200 1400 1000 1000 Q 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1000

rlL-4 «д лкгТмл «и«лг.ш

Рис. 2. Влияние фрагмента 22-37 (1500 нг/мл) и опухолеассоциированных ганглиозидов GM2 (А) и GD3 (В) на пролиферацию клеток линии CT.4R, выраженную в OD (инкубация в течение 48 час). Контроль • - клеткам добавлен rlL-4 в разных концентрациях, ■ - клетки инкубировали в присутствии GM2 или GD3 (40 мкг/мл); А - клетки инкубировали в присутствии GM2 или GD3 (40 мкг/мл) и IL-4 SP 22-37 (1500 нг/мл) одновременно.

При внесении в среду для культивирования IL-482 отмечается достоверное восстановление пролиферации "клеток относительно пролиферации, ингибированной ганглиозидом GM2 (Рис. 3 А) или ганглиозидом GD3 (Рис. 3 В) до уровня, близкого к пролиферации контрольных клеток.

- 0.5 00

0.4 0.3 0.2 0.1

0.0......

О 200 400 ООО 800 1000 1200 1400 1800 1800 ' и0 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

rlL-4 вд.4КГ/мл

rlL-4 ед.акг./мл

Рис. 3. Влияние IL-482 (1500 нг/мл) и опухолеассоциированных ганглиозидов GM2 (А) и GD3 (В) на пролиферацию клеток линии CT.4R, выраженную в OD. Контроль • - клеткам добавлен rlL-4 в разных концентрациях, ■ - клетки инкубировали в присутствии GM2 или GD3 (40 мкг/мл); ▲ - клетки инкубировали в присутствии GM2 или GD3 (40 мкг/мл) и IL-452 (1500 нг/мл) одновременно.

0.8

0.1

Определение фрагментов молекулы 11.-4, участвующих во взаимодействии с ганглиозидами. В предварительных экспериментах мы провели полный масс-спектрометрический анализ белка и его фрагментов, получившихся после протеолиза гИ~4 эндопротеиназой С1и-С. В Табл. 3 представлены теоретически возможные и обнаруженные в результате масс-спектрометрического анализа молекулы гЫ1.-4 после ее протеолитической обработки.

Таблица 3. Теоритически возможные и обнаруженные масс-спектрометрически фрагменты молекулы г1Ь4, образующиеся после протеолиза эндопротеазой С1и-С.

Мазз Мг Реу. Sequence

275.15 КЕ

521.25

*761.36 -0.88 АИОвТЬЕ

*80.1.37 0.180 КУЭКСЗБ

*821.4 0.176 СЖТ1-СТЕ

948.46 КС01Т1.С1Е

«1045.61 0.192 ^КУНИРЕ

•1130.66 0.174 НКТ1-Ы31-ТЕ

•1264.6 0.247 ANQSTLENFLE

'1548.85 0.150

•1609.82 0.162 1-ТУТ01РААЗКМТТЕ

1828.97 КЬКПМНЕКУЗКСЗЭ

•1866.96 0.161 1ЛЛ/Т01РААЗКМТТЕКЕ

1934.04 11КТ1Л31-ТЕСЖТ1-СТЕ

2061.1 КС01Т1-(2Е11КТ1_№1-ТЕ

•2064.99 0.139 ТРСКААТУЬРОРУЗННЕ

•2292.19 0.154 АМ<23Т1_ЕМР1_ЕР1.КТ1А^Е

•2322.13 0.139 КЕТРСКААТУЬКОРУвННЕ

•2332.20 0.156 ЫР1^1_КТ1ШЕКУЗКСЗЗ

2413.21 QKTLCTELTVTDIFAASKNTTE

•2670.34 0.214 QKTLCTELTVTDIFAASKNTTEKE

2864.50 КС01ТИаЕ|1КТ1_М31-ТЕ(2КТ1-СТЕ

3525.85 11КТ1-М31-ТЕС»КТ1.СТЕ1-ТУТ01РААЗКМТТЕ

•3913.94 0.215 LTVTDIFAASKNTTEKETFCRAATVLRQFYSHHE

5016.70 KDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRDLRNLWGLAGLNSCPVKE

5760.05 KDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRDLRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLE

6263.29 KDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRDLRNLWGLAGLNSCPVKEANQSTLENFLE

7063.69 ТРСНААТУЬКаРУ8ННЕК0ТРСЬ0АТАааРНРНКС}1-1КР1-КН01^Г41.Ига1-АС1-М

7320.83 KETFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRDLRNLWGLAG

7807.03 TFCRAATVLRQFYSHHEKDTRCLGATAQQFHRHKQLIRFLKRDLRNLWGLAGLN

"Звездочкой в таблице обозначены МАШЬТОР-МЭ обнаруженные фрагменты г11_-4 после протеолиза.

Для установления сайтов связывания ганглиозида вМ1 на молекуле И-4 была проведена фотореактивная пришивка (1251)-Оср-СМ1 к 11.-4. После инкубации И-4 с (1251)-Оср-СМ1, фотолиза и ультрацентрифугирования, белок, ковалентно сшитый с производным СМ1, подвергали протеолизу эндопротеиназой С1и-С. Полученные фрагменты разделяли с помощью ВЭЖХ, регистрируя при этом два параметра: поглощение пептидной связи и радиоактивность (данные не представлены). Фракции, несущие максимальную радиоактивность и эффективно поглощающие в области пептидных связей одновременно, анализировали с помощью МАШ1-ТОР МБ.

Расчет масс полученных пептидов, сшитых с Оср-СМ1, проводили по следующей схеме. В процессе десорбции-ионизации фотореактивная молекула зонда фрагментируется, расщепляясь по пептидной связи Оср-+сиалильная группа или по связи сиалил—»остальная часть ганглиозида (Табл. 4).

Таблица 4. Массы фрагментов Оср-меченого ганглиозида, ожидаемых в составе комплексов фрагмент И-4 - фрагмент Оср-СМ1 (фрагментация производного ганглиозида в процессе масс-спектрометрического анализа

MALDI-TOF).

Фрагмент Прибавка массы

«К» + Н* 94

«К» + Na* 116

«К» + К* 132

«К» + Sial + Н* 343

«К» + Sial + Na* 365

«К» + Sial + К+ 381

«К» + Sial + О + Н+ 359

«К» + Sial + О + Na* 381

«К» + Sial + О + К* 397

«К» - производное группы Dcp, представляющее собой циклопентадиенильный остаток.

Таким образом, к фрагментам белка, обработанного протеазой,

обеспечивающей расщепление по Glu-C (Табл. 3), добавляются фрагменты

Dcp-GM1 (Табл. 4). Результаты этих расчетов представлены в Табл. 5.

Используя такой подход, нам удалось выявить несколько фрагментов,

которые были ковалентно связаны с фрагментами Dcp-GM1. Были выявлены

2 концевых фрагмента 1-8 (KCDITLQE) и 122-128 (KYSKCSS), а также

фрагменты 19-25 (QKTLCTE), 41-42 (КЕ), 103-109 (ANQSTLE) и 110-113

(NFLE).

Таблица 5. Сравнение расчетных и экспериментальных масс пиков

Расчет, Да Экспери -мент, т/г, Да Отнесение

1042.48 1064.46 1080.44 1066.05 1082.03 Фрагмент (1-8) + («К» + Н+) + («К» + №*) + («К» + К+)

915.41 937.39 953.37 937.17 953.24 Фрагмент (19-25) + («К» + Ю + («К» + №+) + («К» + К*)

3051.34 3050.43 Фрагмент (19-42) + («К» + 81а1-0 + N8*)

618.17 640.15 656.13 617.29 639.20 655.20 Фрагмент (41-42) + («К» + в1а1 + Н+) + («К» + Э1а1 + + («К» + Э1а1 + К*)

634.17 656.15 672.13 634.08 656.01 673.00 Фрагмент (41-42) + («К» + Э1а1-0 + Н+) + («К» + 81а1-0 + Ыа+) + («К» + ЭЫ-О + К*)

2416.15 2438.13 2454.11 2413.18 2435.30 2451.17 Фрагмент (41-59) + («К» + Н+) + («К» + Ыа+) + («К» + К+)

855.38 877.36 893.34 854.93 876.87 892.86 Фрагмент (103-109) + («К» + н-) + («К» + N8*) + («К» + К*)

864.27 886.25 903.23 887.17 903.27 Фрагмент (110-113) + («К» + Эш! + Н*) + («К» + в1а1 + №*) + («К» + ЭЫ + К+)

880.27 902.25 918.23 881.06 903.27 919.28 Фрагмент (110-113) + («К» + ЭюМЭ + Н+) + («К» + 81а!-0 + Ыа+) + («К» + БЫ-О + К+)

2426.22 2448.20 2464.18 2450.16 2466.18 Фрагмент (110-128) + («К» + н*> + («К» + N8*) + («К» + К+)

2187.99 2209.97 2225.95 2187.98 2209.97 2226.02 Фрагмент (113-128) + («К» + Б1а1-0 + Н+) + («К» + 3'|а1-0 + + («К» + Э|а1-0 + К*)

895.39 917.37 933.35 919.26 935.11 Фрагмент (122-128) + («К» + Ю + («К» + №*) + («К» + К*)

Фотореактивная пришивка 0ср-ЭМ1 к субъединицам рецепторов 11.-2 и 11.-4. Для фотореактивной пришивки нами были выбраны два типа зондов: производное ганглиозида СМ1 с фотоафинной йср-группой на конце длинной (С11, (1251)-Рср-ОМ1-1) и короткой (С2, (1251)-Оср-СМ1-5) ацильной цепи.

После проведения иммунопреципитации субъединиц 11_-2Р и И-41Ч из клеток линии СТИ--2, подвергшихся инкубации с (1251)-Оср-СМ1-1 и фотолизу, на авторадиограмме отчетливо видна полоса р-субъединицы 11_-21Ч (Рис. 4).

150i

100

75 ,

1 2 3 4 5

2 3 4 5

Рис. 4. SDS-PAG-апектрофорез белков мембран активированных Т-лимфоцитов после зондирования ганглиозидом (125l)-Dcp-GM1-l и иммунопреципитации (а) и результаты авторадиографии (экспозиция 2 мес) (Ь). 1 - Высокомолекулярные белковые стандарты, Sigma; 2 - белки клеток линии CTLL-2, инкубированных со смесью (125])-Оср-СМ1-1/природный GM1, 1:100 (м/м) и подвергнутых фотолизу с последующей иммунопреципитацией с антителами к а-субъединице IL-2R; 3 - то же, но после иммунопреципитации с антителами к р-субъединице IL-2R; 4 - то же, но после иммунопреципитации с антителами к у-субъединице IL-2R; 5 - то же, но после иммунопреципитации с антителами к IL-4R. На все дорожки нанесено 60 мкг по белку, окрашивание серебром.

Исследование, аналогичное описанному выше для зонда (,25I)-Dcp-GM1-I, было проведено также для меченого ганглиозида GM1, несущего Dcp-группировку на конце короткой ацильной цепи, (125l)-Dcp-GM1-s. Иммунопреципитаты, полученные после фотореактивной пришивки этого

зонда, не выявили на авторадиограмме полосы ни для одного из использованных антител (данные не представлены). В то же время, на электрофореграмме белкового содержимого мембран клеток линии СТИ_-2 после 40-мин инкубации клеток со смесью (1251)-Оср-СМ1-з/природный СМ1, 1:100 (м/м) и последующим фотолизом без или с делипидизацией (экстракция смесью хлороформ/метанол, 1:3) четко видна полоса, соответствующая (3-субъединице по молекулярному весу (Рис. 5а, 2, 3); на авторадиограмме (Рис. 5Ь) отчетливо определяется полоса белка с массой 75 кДа, соответствующая этой субъединице рецептора (Рис. 5Ь, 2).

а

150 «¡м ЗВ9 II

100 ¿и! Р ш

75

50

37

.25

1

Рис. 5. SDS-PAG-электрофорез белков мембран клеток линии CTLL-2 после зондирования ганглиозидом (1?sl)-Dcp-GM1-s (а) и результаты авторадиографии (экспозиция 2 мес) (Ь). 1 - Высокомолекулярные белковые стандарты, Bio-Rad; 2 - белки плазматических мембран клеток линии CTLL-2, инкубированных со смесью (1251)-0ср-СМ1-5/природный GM1, 1:100 (м/м) и подвергнутых фотолизу; 3 - то же, но после делипидизации в растворе хлороформ/метанол, 1:3 (v/v); 4 - фракция веществ, извлеченных при делипидизации белков для,дорожки 3. На все дорожки нанесено 60 мкг по белку, окрашивание серебром.

Выводы

1. Опухолевые ганглиозиды ОМ2 и в03 ингибируют пролиферацию цитокин-зависимых клеточных линий СТ1.1-2 и СТ.4К. Ганглиозид вОЗ проявляет конкурентный тип ингибирования, ганглиозид вМ2 - как конкурентный, так и неконкурентный типы ингибирования одновременно.

2. Присутствие экзогенно введенных сывороточных факторов по-разному влияет на тип ингибирования ганглиозидом ЭМ2 пролиферации разных клеточных линий: для клеток линии СТ1_1_-2 уменьшался вклад конкурентного ингибирования, а для клеток линии СТ.4Р наблюдалось усиление вклада конкурентного ингибирования. В то же время, присутствие дополнительных сывороточных факторов практически не влияет на тип ингибирования ганглиозидом СЭЗ пролиферации клеток.

3. Определены значения для комплексов 003/11.-2 и С03/И-4, которые равны 1.1-10 " М и 4.5 Ю"10М соответственно. Взаимодействие вМ2 с исследуемыми цитокинами характеризуется низкой специфичностью, значения Ка исследуемых комплексов достоверно рассчитать не удалось.

4. Синтетический пептид - фрагмент молекулы 11.-4 (11.-4 БР 22-37) и рекомбинантный 11.-452 восстанавливают пролиферацию Т-лимфоцитов, ингибированную ганглиозидами вОЗ и вМ2 на 25-30 %.

5. Сайт связывания ганглиозидов в молекуле И-4 формируется пространственно сближенными последовательностями 19-25 (ОКТ1_СТЕ) и 103-113 (АМОЗЛЕЫРЬЕ).

6. Фотоаффинное Оср-производное ганглиозида вМ1, встраиваясь в плазматическую мембрану клеток линии СТ1-1_-2, взаимодействует с р-субъединицей 11_-2Р1.

Практические рекомендации

1. Радиоактивномеченый фотоаффинный зонд (1251)-Оср-СМ1 требует мягких восстанавливающих условий для проведения электрофореза;

2. Для выявления пришивки к 11_-2Я необходима инкубация мицелл, содержащих молекулы зонда (смесью фотоаффинномеченый СМ1/

природный GM1, 1:100) с клетками лимфоидной линии, но не с фрагментами плазматической мембраны;

3. Фотолиз зонда Dcp-GM1-I, несущего фотоаффинную группировку на конце длинной ацильной цепи, приводит к интенсивной межбелковой сшивке молекул, а при фотолизе Dcp-GM1-s выше доля зонда, прореагировавшего с молекулами воды.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Холоденко И.В., Якухина H.A., Лущекина C.B., Холоденко Р.В. "Типы ингибирования пролиферации цитокин-зависимых Т-лимфоцитов опухолеассоциированными ганглиозидами". XV зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва. 10-14 февраля 2003. Тезисы докладов и стендовых сообщений. С. 15.

2. Молотковская И.М., Холоденко Р.В., Якухина H.A., Холоденко И.В. "Механизмы иммуносупрессии, вызываемой ганглиозидами - маркерами опухолевого процесса". Мед. Иммунология, 2003, Т. 5, № 3-4, С. 208.

3. Холоденко И.В., Яшунская Я.Ю., Якухина H.A., Холоденко Р.В., Молотковская И.М. "Молекулярные механизмы иммуносупрессии Т-лимфоцитов, вызываемой опухолевыми ганглиозидами GM2 и GD3". Иммунология, 2004, Т. 25, № 3, С. 132-135.

4. Холоденко И.В., Водовозова Е.Л., Холоденко Р.В., Молотковская И.М. "Взаимодействие ганглиозида GM2 с субъединицами рецептора IL-2". VII чтения, посвященные памяти академика Ю.А. Овчинникова. Москва. 4-7 октября 2004. Тезисы докладов и стендовых сообщений. С. 50-51.

5. Романова H.A., Холоденко И.В., Молотковская И.М. "Исследование ганглиозид-связывающей активности пептидов — фрагментов интерлейкина-4". XVII зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва. 7-10 февраля 2005 г. Тезисы докладов и стендовых сообщений. С. 78.

6. Романова Н.А., Холоденко И.В., Молотковская И.М. "Определение фрагментов интерлейкина-4, обладающих противоопухолевой активностью". Мед. Иммунология, 2005, Т. 7, № 2-3, С. 208.

7. Molotkovskaya I., Oleynikov V., Kholodenko I., Vodovozova E. "Ganglioside binding sites in interleukin-4 molecule: a photoaffinity study". Glycoconj. J., 2005, V. 22, № 4-6, P. 281-282.

8. Холоденко И.В., Водовозова Е.Л., Молотковский Юл.Г., Холоденко Р.В., Василенко Р.Н., Михалев И.И., Молотковская ИМ. "Взаимодействие различных субъединиц рецептора интерлейкинов-2 и -4 с ганглиозидом GM1 в активированных Т-лимфоцитах". Биол. Мембраны, 2006, Т. 23, № 1, С. 27-33.

Принято к исполнению 20/04/2006 Исполнено 24/04/2006

Заказ №311 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www.autoreferat.ru

Актуальность Возникновение опухолевого процесса приводит к развитию иммуносупрессии. Одной из важнейших задач современной биологии и медицины является создание эффективных и безопасных средств регуляции иммунитета у опухолевых больных. В настоящее время для этих целей рекомбинантные формы интерлеикинов, в основном используются рекомбинантный интерлейкин-2 (rIL-2). Эффективными оказываются лишь очень высокие дозы интерлейкина, которые являются высокотоксичными и вызывают у больных тяжелые осложнения [1]. Поэтому столь важны все исследования, направленные на поиск новых активных иммуномодуляторов, имеющих свое происхождение от интерлеикинов и способных заменить, хотя бы частично, активности цитокинов, избежав присущих рекомбинантным формам токсичности и осложнений. Ганглиозиды, универсальные компоненты мембран эукариотических клеток, участвуют в процессах клеточного узнавания, рецепции вирусов, во взаимодействиях типа лиганд-рецептор, клеточной адгезии и контроле клеточного роста, т.е. выполняют важные регуляторные функции [2]. Однако при развитии патологических процессов их функция меняется на противоположную. Широко известно явление сброса ганглиозидов с поверхности быстроделящихся опухолевых клеток, таких как нейробластома, меланома, лимфома, карцинома молочной железы, гепатома и др [3]. Некоторые ганглиозиды, такие как GM2 и GD2, были определены как клинические маркеры опухолей. В результате шеддинга липидные молекулы попадают в кровоток, и, находясь в свободном виде, воздействуют на клетки иммунной системы, подавляя пролиферацию Т- лимфоцитов. Ранее на большом наборе индивидуальных ганглиозидов было показано, что они подавляют пролиферацию цитокин-зависимых Т-лимфоцитов [4]. В ряде работ были подробно изучены типы ингибирования и определены механизмы ингибирования для ганглиозидов нормальных, нетрансформированных клеток. Было показано, что ингибирующая активность ганглиозидов убывает в ряду: GTlb>GDla>GMl>GM3. Кинетический анализ выявил, что ганглиозиды GM3 и GTlb являются конкурентными ингибиторами пролиферации, а GDI а и GM1 ингибируют пролиферацию как по конкурентному, так и по неконкурентному типам одновременно [5]. Молекулярные ганглиозидами механизмы подавления пролиферации Т-лимфоцитов с связывают, в частности, с их прямым взаимодействием интерлейкином-2 (IL-2) и интерлейкином-4 (IL-4). Ганглиозиды, таким образом, перехватывают цитокины, необходимые для активации Т-лимфоцитов, тем самым усугубляя Поскольку иммуносупрессию, было развивающуюся ряд при опухолевой способны патологии. образовывать показано, что ганглиозидов комплексы с IL-2 и IL-4 с высокой константой связывания [6], важным представляется определение сайта связывания ганглиозидов на молекуле IL-4, а также определение первичной последовательности фрагментов молекулы IL-4, ответственных за такое связывание. Ранее для решения аналогичных задач применяли фотореактивную пришивку. Так, с помощью фотоаффинного аналога ганглиозида GTlb Shapiro и др. [7] установили сайт связывания ганглиозидов на молекуле столбнячного токсина. Поэтому в данной работе была поставлена задача по определению сайтов молекулы IL-4, ответственных за связывание ганглиозидов, и для решения этой задачи был выбран метод фотореактивной пришивки. Определение сайта связывания ганглиозидов на молекуле IL-4, а также фрагментов молекулы, ответственных за такое связывание, позволит получить новые препараты, способные эффективно перехватывать циркулирующие в крови свободные ганглиозиды, но лишенные недостатков молекул рекомбинантного IL-4. Однако для применения таких пептидов необходимым условием является глубокое понимание механизмов ингибирования иммунокомпетентных клеток ганглиозидами, особенно ассоциированными с развитием опухолевого процесса; такими ганглиозидами являются GM2 и GD3. Кроме того, экзогенно добавленные ганглиозиды, встраиваясь в плазматическую мембрану клеток, способны вступать во взаимодействие с рецепторами ростовых факторов, как было описано для рецепторов FGF и EGF, тем самым модулируя проведение сигнала через эти рецепторы [8, 9]. Поэтому была также поставлена задача изучить локализацию ганглиозида GM1 в плазматической мембране относительно различных субъединиц рецепторов IL-2 и IL-4, Цель исследования: характеристика механизмов иммуносупрессии, вызываемой опухолевыми ганглиозидами GM2 и GD3, а также определение в молекуле IL-4 последовательностей, способных связываться с ганглиозидами. Задачи исследования: 1. Охарактеризовать типы ингибирования ганглиозидами GM2 и GD3 IL-2- и IL-4-зависимой пролиферации клеток. 2. Изучить влияние сывороточных факторов на тип ингибирования опухолевыми пролиферации цитокин-зависимых клеток, проявляемый ганглиозидами. 3. 4. Определить константы диссоциации комплексов ганглиозид/цитокин. Изучить влияние синтетических человеческого пептидов, фрагментов на молекулы рекомбинантного интерлейкина-4, восстановление пролиферации, ингибированной ганглиозидами GM2 и GD3. 5. 6. Изучить структуру ганглиозид-связывающего сайта молекулы IL-4. Определить те субъединицы рецепторов IL-2 и IL-4, с которыми взаимодействует ганглиозид GM1. Научная иовизна Впервые определены типы ингибирования пролиферации цитокип- зависимых лимфоцитов опухолевыми ганглиозидами GM2 и GD3. Установлено, что для этих ганглиозидов сохраняется та же закономерность, что и для большинства нормальных ганглиозидов, то есть: чем больше остатков сиаловых кислот входит в состав ГСЛ, тем более тип ингибирования приближен к конкурентному. Впервые сывороточных было показано, что присутствие экзогенно введенных факторов по-разному влияет на тип GM2-индyциpoвaннoгo ингибирования пролиферации разных клеточных линий: на IL-2-зависимых клетках линии CTLL-2 вклад конкурентного ингибирования уменьшается, а на IL- •зависимых клетках линии CT.4R усиливается. Присутствие дополнительных сывороточных факторов не влияет на тип СОЗ-индуцированного ингибирования пролиферации обеих клеточных линий. Впервые определены константы диссоциации комплексов GD3/IL-2 и GD3/IL-4; установленные константы диссоциации комплексов ганглиозид/цитокин полностью подтверждают результаты, полученные на клетках: Так, конкурентный ингибитор GD3 формирует с цитокинами IL-2 и IL-4 комплексы, константы диссоциации которых лежат в области наномолярных концентраций лиганда, тогда как ганглиозид GM2, проявляющий смешанный тип ингибирования с низким вкладом конкурентного, формирует с цитокинами комплексы, константы диссоциации которых свидетельствуют о низкоспецифическом взаимодействии. Впервые установлены пространственно сближенные последовательности молекулы IL-4, формирующие сайт связывания ганглиозидов в молекуле IL-4. Определены аминокислотные последовательности этих фрагментов молекулы IL-4. Это: 19-25 (QKTLCTE), 103-113 (ANQSTLENFLE). Впервые установлено, что ганглиозид GM1 непосредственно взаимодействует с Р-субъединицей IL-2R (на клетках линии CTLL-2). Практическая значимость Результаты представления опухолью; исследования позволяют механизмах расширить сушествуюшие вызываемой диагностики о молекулярных новые иммуносупрессии, систем получены подходы для создания онкозаболеваний. Полученные пептиды, связываюшие ганглиозиды, а также конструкции на их основе могут быть успешно использованы в противораковой цитокинотерапии. Современные методы биотехнологии позволяют создать относительно дешевые конструкции на основе олигопептидов, что существенно расширяет возможности их практического применения. Таким образом, результаты диссертации целесообразно использовать для создания новых подходов к иммунотерапии онкологических и аутоиммунных заболеваний. Результатом применения фотореактивного зондирования клеток явились методические рекомендации, которые позволят расширить применение этого 10 важного, но пока редко иснользуемого подхода для изучения как лигандреценторного взаимодействия, так и изменения окружения рецепторных молекул клетки в ходе сигнализации. 11

выводы

1. Опухолевые ганглиозиды GM2 и GD3 ингибируют пролиферацию цитокин-зависимых клеточных линий CTLL-2 и CT.4R. Ганглиозид GD3 проявляет конкурентный тип ингибирования, ганглиозид GM2 - как конкурентный, так и неконкурентный типы ингибирования одновременно.

2. Присутствие экзогенно введенных сывороточных факторов по-разному влияет на тип ингибирования ганглиозидом GM2 пролиферации разных клеточных линий: для клеток линии CTLL-2 уменьшался вклад конкурентного ингибирования, а для клеток линии CT.4R наблюдалось усиление вклада конкурентного ингибирования. В то же время, присутствие дополнительных сывороточных факторов практически не влияет на тип ингибирования ганглиозидом GD3 пролиферации клеток.

3. Определены значения Кд для комплексов GD3/IL-2 и GD3/IL-4, которые равны 1.Ы0'ПМ и 4.5-Ю"|0М соответственно. Взаимодействие GM2 с исследуемыми цитокинами характеризуется низкой специфичностью, значения К^ исследуемых комплексов 0.1-1 мМ) достоверно рассчитать не удалось.

4. Синтетический пептид - фрагмент молекулы IL-4 (IL-4 SP 22-37) и рекомбинантный IL-452 восстанавливают пролиферацию Т-лимфоцитов, ингибированную ганглиозидами GD3 и GM2 на 25-30 %.

5. Сайт связывания ганглиозидов в молекуле IL-4 формируется пространственно сближенными последовательностями 19-25 (QKTLCTE) и 103-113 (ANQSTLENFLE).

6. Фотоаффинное Dcp-производное ганглиозида GM1, встраиваясь в плазматическую мембрану клеток линии CTLL-2, взаимодействует с субъединицей IL-2R.