Влияние нагрузок различной интенсивности на концентрацию белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа

Шкурников, Максим Юрьевич

Диссертации по медицине → Восстановительная медицина, спортивная медицина, курортология и физиотерапия

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.51) на тему:Влияние нагрузок различной интенсивности на концентрацию белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Шкурников, Максим Юрьевич Москва 2009 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.51

Автореферат диссертации по медицине на тему Влияние нагрузок различной интенсивности на концентрацию белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа

ШКУРНИКОВ МАКСИМ ЮРЬЕВИЧ

ВЛИЯНИЕ НАГРУЗОК РАЗЛИЧНОЙ ИНТЕНСИВНОСТИ НА КОНЦЕНТРАЦИЮ БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА С МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОЙ 70 КДА

14.00.51.- восстановительная медицина, лечебная физкультура и спортивная медицина, курортология и физиотерапия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

с гг- 2::э

МОСКВА-2009

Работа выполнена в лаборатории тестирования физической подготовленности Федерального государственно учреждения ФГУ Всероссийский научно-исследовательский институт физической культуры и спорта.

Научный руководитель:

Арьков Владимир Владимирович заведующий лабораторией тестирования

физической подготовленности ФГУ ВНИИФК, к.м.н.

Официальные оппоненты:

Комолов И.С. доктор медицинских наук,

ФГУ ВНИИФК

Сонькнн В.Д. доктор биологических наук, профессор,

РГУФКСиТ

Ведущая организация:

Московский научно-исследовательский институт медицинской экологии департамента здравоохранения г. Москвы

Защита состоится «30» апреля 2009 г. в 16:30 ч. на заседании Диссертационного совета Д 311.002.01 в ФГУ Всероссийский научно-исследовательский институт физической культуры и спорта по адресу: 105005, Москва, Елизаветинский переулок, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИФК. Автореферат разослан «27» марта 2009 г Ученый секретарь Диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Исследования проведены с целью разработки медико-биологических критериев адаптации к нагрузкам различной интенсивности в ходе учебно-тренировочного процесса высококвалифицированных спортсменов.

Прогрессирующее развитие тренированности спортсмена является результатом того, что следовые реакции, наблюдающиеся в организме после отдельных тренировочных нагрузок, не устраняются полностью, а сохраняются и закрепляются конструктивными изменениями функциональных систем организма спортсменов, возникающими в восстановительном периоде, которые служат основой повышения тренированности. Оптимальное сочетание процессов утомления и восстановления -физиологическая основа постоянной и долговременной адаптации организма к физическим и спортивным нагрузкам.

В настоящее время довольно подробно разработаны биохимические критерии адаптации при нагрузках высокой интенсивности в циклических видах спорта. Остается открытым вопрос поиска биохимического критерия адаптации к нагрузкам не только в циклических, но и в других видах спорта.

АКТУАЛЬНОСТЬ

Актуальность темы определяется как теоретической, так и практической значимостью проблемы оптимизации учебно-тренировочного процесса высококвалифицированных спортсменов с помощью разработки новых критериев адаптации к нагрузкам различной интенсивности.

Особенность адаптации организма к спортивной деятельности в этапности ее формирования на протяжении многолетнего процесса тренировки и участия в соревнованиях. Развитие адаптационных изменений и ускорение периода восстановления сопряжено с применением продолжительных нагрузок различной интенсивности, что значительно повышает вероятность формирования у спортсмена синдрома переутомления. Синдром переутомления - это совокупность симптомов, которые обуславливают неспособность адекватно переносить тренировочный процесс. Спортсмены не способны поддерживать свой тренировочный график или повторять результаты достигнутые ранее. Зачастую диагноз переутомления ставится на основании ретроспективных данных. К сожалению, на сегодняшний день способ реабильтации только один - полноценный (иногда продолжительный) отдых, что отрицательно сказывается на карьере спортсмепа. Общеизвестно, что заболевание легче поддается лечению на начальном этапе. Чтобы определить критическое состояние спортсмена

необходимы объективные показатели физического состояния во время тренировочного процесса.

Одним из актуальных направлений поиска биохимических маркеров утомления и адаптации является исследование роли белка теплового шока (БТШ) 70 в организме человека. Белок БТШ70 является индуцибельным представителем семейства белков теплового шока. БТШ необходимы клетке во всех процессах ее жизнедеятельности, включая адаптацию к огромному числу цитотоксических факторов, как ксенобиотических, так и естественного происхождения.

Одна из функций БТШ70 в клетке заключается в том, что он связываются с поврежденными или вновь синтезированными полипептидами и помогает им принять нативную конформацию. То, что БТШ70 спасает клетки от огромного числа факторов, в том числе, вызывающих апоптоз, было подтверждено в многочисленных опытах in vitro и in vivo с использованием широкого спектра модельных организмов, находящихся на разных ступенях эволюции.

БТШ70 и считается индуцибельным, что означает, что его экспрессия резко возрастает в ответ на стресс, в клетках человека его синтез, хотя и на невысоком уровне, происходит и в нормальных условиях. В частности, было показано, что увеличение экспрессии митохондриального БТШ70 приводит к повышению образования АТФ, то есть улучшает энергообеспечение. Надо отметить, что в разных тканях и клетках организма степень экспрессии БТШ70 различается. Например, она очень высока в тканях сердца, и крайне низка (и не запускается в ответ на стресс) в некоторых типах нейронов головного мозга. Несколько лет тому назад появились данные о том, что БТШ70, ранее считавшийся исключительно цитоплазматическим белком, может находиться во внеклеточном пространстве, в биологических жидкостях человека.

Не смотря на то что, в целом ряде работ показано, что физическая нагрузка является сильным стимулом к внутриклеточной экспрессии БТШ70 клетками иммунной системы, миоцитами скелетной и сердечной мускулатуры, а также такими органами, как печень, селезенка и мозг, исследований, посвященных взаимосвязи уровня БТШ70 в сыворотке крови и специфике физической нагрузки (специальная работоспособность) не проводилось.

Определение БТШ70 может существенно повысить точность методов лабораторного контроля спортивной деятельности, углубить представления о молекулярно-биологических процессах, протекающих в организме высококвалифицированных спортсменов в ходе тренировочной и соревновательной деятельности.

ПРЕДМЕТ ИССЛЕДОВАНИЯ

Биохимические показатели, показатели гормонального статуса, экспрессия БТШ70 в лейкоцитах, концентрация БТШ70 в сыворотке крови при нагрузках различной интенсивности у спортсменов циклических и сложнокоординационных видов спорта.

ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ

Биологические закономерности адаптации организма спортсмена к нагрузкам различной интенсивности.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение влияния нагрузок различной интенсивности на концентрацию БТШ70 в сыворотке крови спортсменов циклических и сложнокоординационных видов спорта, экспрессии мРНК БТШ70 в лейкоцитах; разработка критериев оценки адаптационных резервов организма высококвалифицированных спортсменов циклических и сложнокоординационных видов спорта в процессе тренировочной и соревповательной деятельности основанных на динамике изменения концентрации БТШ70 в сыворотке крови.

ГИПОТЕЗА

Предполагается, что БТШ70 не только защищает миоциты от воздействия факторов острого и хронического физиологического стресса, но и отвечает за повышение эффективности работы митохондрий и их гиперплазию в миоцитах скелетной мускулатуры. Контроль уровня БТШ70 в сыворотке крови может помочь оптимизировать тренировочный процесс высококвалифированных спортсменов различной специализации.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Разработать модификацию иммунохимического метода определения БТШ70 в сыворотке;

2. Исследовать экспрессию БТШ70 в лейкоцитах в ответ на кратковременную нагрузку высокой интенсивности;

3. Исследовать динамику гормональных и биохимических показателей, БТ1П70 у высококвалифицированных спортсменов циклических и сложнокоординационных видов спорта на различных этапах учебно-тренировочной и соревновательной деятельности;

4. Определить базальный уровень БТШ70 для разработки рекомендации по медицинскому контролю за функциональным состоянием высококвалифицированных спортсменов с учетом полученных данных.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для решения задач исследования применялись следующие методы: анализ и обобщение литературных данных, биохимические методы исследования, электрофизиологические методы исследования, гематологические методы исследования, иммунохимические методы исследования, методы педагогического тестирования, методы математической статистики.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые при использовании протокола кратковременных высокоинтенсивных упражнений удалось достичь физиологического стресса, приводящего к достоверному увеличению экспрессии мРНК БТШ70 в лейкоцитах. Показана индивидуальность ответа организма на стресс у подготовленных спортсменов. Выявлены статистически значимые различия в базальном уровне БТШ70 у спортсменов циклических и сложнокоординационных видов спорта. Установлено отсутствие взаимосвязи уровня перекисного окисления липидов и уровня БТШ70 в сыворотке.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Результаты исследования расширяют знания о медико-биологических способах оптимизации учебно-тренировочного процесса спортсменов циклических и сложнокоординационных видов спорта, как методах защиты организма и поддержания здоровья спортсменов и повышения спортивного результата.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Практическая значимость работы определяется разработкой информативного метода оценки срочной адаптации к мышечной нагрузке различной интенсивности на основе концентрации БТШ70 в сыворотке крови, а также созданием тест-системы для определения БТШ70 в биологических жидкостях.

медицины, тренеров, инструкторов ЛФК, врачей команд по видам спорта. Результаты исследований внедрены в работу кафедры спортивной медицины ФГУ РГУФКСиТ и кафедры физического воспитания и спорта МГУ им. М.В. Ломоносова, что подтверждено актами о внедрении.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

• Включение в программу лабораторного контроля тренировочной деятельности такого показателя, как БТШ70 позволяет целенаправленно следить за процессами нейро-мышечной адаптации к широкому спектру нагрузок.

• Диапазон значений уровня БТШ70 в сыворотке крови высококвалифицированных спортсменов сложнокоординационных и циклических видов спорта статистически значимо различается в подготовительный период, и не различается в предсоревновательный.

• Биохимическими исследованиями доказано, что повышение уровня БТШ70 в ответ на нагрузку не связано с повреждением мембран миоцитов и гепатоцитов.

ОРГАНИЗАЦИЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

В соответствие с поставленными задачами исследования проводились на четырех этапах.

Первый этап

Первый этап работы был посвящен разработке иммунохимического метода определения БТШ70 в биологических жидкостях, в частности в сыворотке крови. В ходе этапа были получены полшслональные антитела против белка теплового шока 70кДа, созданы аффинные сорбенты и проведена аффинная очистка антител.

На основе полученных антител была разработана методика определения концентрации БТШ70 методом иммуноферментного анализа.

Второй этап

Целью второго этапа было изучение экспрессии генов БТШ70 в ответ на кратковременную высокоинтенсивную физическую нагрузку и динамики уровня БТШ70 в сыворотке. Для решения этой задачи была отобрана группа из 4 добровольцев-спортсменов, специализирующихся в циклических видах спорта (лыжные гонки). Тест со ступенчатовозрастающей нагрузкой был выбран в качестве модели кратковременного

физического стресса. От каждого участника эксперимента было получено два образца венозной крови. Первый образец - непосредственно перед началом нагрузки, второй -сразу после прекращения нагрузки. Сыворотка крови была использована для определения широкого спектра гормональных и биохимических показателей. Из лейкоцитов была выделена мРНК для оценки изменения экспрессии генов БТШ70 в ответ на нагрузку.

Третий этап

Целью третьего этапа стало исследование динамики уровня БТШ70 при нагрузках различной интенсивности у спортсменов различных видов спорта.

Первый подэтап был нацелен на изучение динамики уровня БТШ70 и большого числа гормональных и биохимических показателей у команды по академической гребле в ходе одного тренировочного мезоцшсла. Мезоцикл состоял из 4 микроциклов с различным объемом и направленностью тренировочных нагрузок. С целью большей обоснованности выводов на этом подэтапе исследований помимо оценки лабораторных показателей в динамике осуществлялся контроль за индивидуальной пульсовой стоимостью проделанной работы у спортсменов.

На втором подэтапе было исследовано влияние длительной аэробной нагрузки на концентрацию БТШ70 у спортсменов с различным уровнем тренированности. В качестве модели был выбран шестичасовой ультра-марафон. Шестеро участников марафона дали добровольное согласие на участие в эксперименте. Забор венозной крови был проведен утром за один день до марафона, непосредственно после финиша и через сутки после финиша.

Целью третьего подэтапа было исследование гормональных и биохимических показателей, а также БТШ70 у команды по спортивной гимнастике на тренировочном сборе. Спортивная гимнастика была выбрана в качестве сложнокоординационного вида спорта с низкой циклической составляющей.

Четвертый этап

На четвертом этапе были проанализированы полученные материалы, разработаны практические рекомендации и осуществлено внедрение результатов в практику.

Полученные в работе данные обрабатывали с использованием статистических пакетов STATISTICA 7 (StatSoft) и Sigma Plot 8.0 (SPSS). Для определения достоверности различий между уровнями исследуемых параметров использовали U критерий Манна-Уитни. Различия считали достоверными при р<0.05.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 117 страницах и состоит из введения, литературного обзора, описания методов исследования, 3 глав собственных исследований, итогового заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Последний включает 196 источников, 83 из которых опубликованы в отечественных изданиях, 113 - в иностранных. Диссертация иллюстрирована 12 рисунками и 21 таблицей.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

РАЗРАБОТКА ИММУНОХИМИЧЕСКОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ БТШ70

Для оценки концентрации маркера стресса - БТШ70 в сыворотке, был получен высокоочшценный рекомбинантный БТШ70. Рекомбинантный белок теплового шока 70 кДа получили путем интеграции в Е.соН, трансформированных плазмидой р<ЗЕ30 с интегрированной генетической последовательностью, кодирующей БТШ70 с гексагистидиновым тэгом на И-конце.

БТШ70, кг/ил

(А) (Б)

Рисунок 1. А.: Рекомбинантный БТШ72 (1), маркер молекулярных масс (М) Б.: Калибровочная кривая метода определения БТШ70 в сыворотке крови

Чистота белка по данным ПААГ электрофореза составляла не менее 90% (Рис. 1. А.). Рекомбинантный БТШ70 использовали для иммунизации кроликов и получения поликлональных антител и их аффинной очистки. Поликлональные антитела были

аффинно выделены на сорбенте, содержащем БТШ70 (0,25 мг/мл), который получали с использованием набора AminoLink (Pierce). Активность и чистота аффинно очищенных антител были проверены в ИФА и на ПААГ электрофорезе.

Для определения БТШ70 в сыворотке крови была разработана тест-система ИФА. На планшет для ИФА сорбировали аффинно очищенные поликлональные антитела кролика против БШГ70. После стадий отмывки и блокирования мест неспецифического связывания, на плату наносили исследуемые сыворотки в разведении 1:2 или 1:4, а также стандарты (0-100 нг/мл БТШ70) в растворе ФСБ/Твин-20/БСА и инкубировали в течение часа при +37°С. Затем проводили часовые инкубации с биотинилированными поликлональными антителами кролика против БТШ70 и конъюгатом стрептавидина с пероксидазой хрена. Детекцию проводили раствором ортофенилендиамина/НгОа в цитратно-фосфатном буфере. Развитие окраски останавливали через 10 мин. 50% раствором H2SO4. Данные стандартной кривой аппроксимировали с использованием 4 параметрической функции. Пример калибровочной кривой в диапазоне 0.5 - 35 нг/мл БТШ70 представлен на рис. 1. Б. С использованием разработанного метода были проанализированы сыворотки спортсменов на последующих этапах работы.

Достоверность результатов, получаемых с помощью разработанной тест-системы, была проверена коммерческой тест системой Hsp70 EIA (Stressgen, Victoria, British Columbia, Canada).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ MPHK БТШ70 И КОНЦЕНТРАЦИИ БТП170 В СЫВОРОТКЕ В ОТВЕТ НА МАКСИМАЛЬНУЮ АЭРОБНУЮ НАГРУЗКУ

В исследовании участвовали 4 высококвалифицированных лыжника (мастера спорта): М1-М4. Возраст 19,3±0,7 лет, рост -175,0±7,0 см, вес - 68,0±4,6 кг, максимальное потребление кислорода (МПК/кг) - 59,8±1,5 мл/кг/мин. После получения письменной информации и заполнения анкеты о состоянии здоровья, участники дали добровольное письменное согласие на участие в эксперименте. Проведение эксперимента одобрено этическим комитетом ВНИИФК. Участники исследования подвергались нагрузочному тестированию на беговой дорожке. Начальная скорость ленты 3,0 м/с, угол наклона - 1 градус, длительность ступени - 3 мин, прибавка скорости - 0,5 м/с. Забор венозной крови производился в состоянии покоя до упражнения и сразу после его окончания. Сыворотка была выделена и заморожена при -20°С. Венозная кровь для выделения мРНК забирали в пробирки PAXgene Blood RNA Tube (PreAnaiytiX GmbH).

Тотальную мРШС выделяли согласно протоколу производителя с использованием набора PAXgene Blood RNA Kit (PreAnalytiX GmbH). Для исключения отжига праймеров на геномной ДНК образцы обрабатывали ДНКазой. Качество выделенной мРНК - EIN (RNA Integrity Number) оценивали на биоанализаторе Agilent 2100 Bioanalyzer. Для всех образцов РНК RIN был более 8.

Обратную транскрипцию проводили с использованием набора для обратной транскрипции (ЗАО «НПФ ДНК-Техпология»), В реакцию обратной транскрипции с неспецифичными праймерами вносили 100 нг тотальной РНК. Реакцию проводили при температуре 40°С в течение 1 часа, с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95°С в течение 15 минут. Полученную кДНК разбавляли в 10 раз и использовали в экспериментах ПЦР в реальном времени.

Для специфичной детекции продуктов амплификации использовали комплиментарные олигонуклеотиды меченые флуорофорами и гасителями флуоресценции (Таб. 1)

Таблица 1. Праймеры для HSPA1A, В2М и HPRT

Праймер Последовательность нуклеотидов

HSPAlA-s GTGGGGAGGACTTTGACAACA

HSPAlA-as CCCTGGTGATGGACGTGTAG

HSPA1A-TM (BHQ1 )-5'-ACAAGAAGGACA(FDT)CAGCCAGAAC AAGC-3' P

B2M-S AGCGTACTCCAAAGATTCAGGTT

B2M-as ATGATGCTGCTTACATGTCTCGAT

В2М-ТМ (BHQ 1 )-5 '-'TCCATCCGACATTGAAGTTGACTTACTG -3 'P

HPRT-s CTCAACTTTAACTGGAAAGAATGTC

HPRT-as TCCTTTTCACCAGCAAGCT

HPRT-TM (BHQ 1 )-5 'TTGCTTTCCTTGGTCAGGCAGTATAATC-3 'P

HSPA1A (GenelD 3303) - белок теплового шока 70кДа 1А, В2М (GenelD 567) -бета-2-микроглобулин, HPRT (GenelD 3251)-гипоксантин фосфорибозилтранфераза 1

Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР был применен «горячий старт», который обеспечивался использованием парафина. Амплификацию осуществляли на приборе «ДТ-96» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология») в режиме «реального времени» в объеме 35 мкл по следующей программе: 1 цикл - 80"С 30 сек, 94°С 1 мин; 50 циклов -94°С 10 сек, 64°С 20 сек. Измерение уровня флуоресценции проводили на каждом цикле при температуре 64°С.

Для оценки уровня экспрессии мРНК использовали наборы реагентов HSPA1A (белок теплового шока 70кДа 1А), В2М (бета-2-микроглобулин) и HPRT (гипоксангин фосфорибозилтранфераза 1), которые обеспечивают возможность определения уровня представленности мРНК этих генов на основе метода полуколичественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Исходная РНК была не фрагментирована (RIN>8). Образцы кДНК до и после физической нагрузки после обратной транскрипции анализировали дважды в трех повторениях. Эксперименты ПЦР реального времени проводили с использованием специфичных праймеров к исследуемому гену и двум «housekeeping» генам - В2М, HPRT. Экспрессия В2М и HPRT постоянна в разных типах клеток и не зависит от внешних факторов, но их копийность в клетке различна. В2М является высокопредставленным геном, a HPRT - низкопредставленным. При нормализации на эти два гена возможно количественно оценить экспрессию БТШ70 в лейкоцитах.

В результате экспериментальной нагрузки удалось достичь кратковременного высокоинтенсивного физиологического стресса в группе высококвалифицированных спортсменов. Длительность нагрузки, в результате которой были зафиксированы изменения в биохимических показателях и уровне экспрессии мРНК, составляла около 15 мин, что значительно меньше описанных в литературе нагрузочных тестирований (от 30 до 260 мин). При этом спортсмены находились от 3.30 до 6 минут выше лактатного порога. В образцах сыворотки до и после интенсивной кратковременной нагрузки были определены такие биохимические показатели, как гормон роста, белок теплового шока 70кДа, кортизол, креатинфосфокиназа, аланинаминотрансфераза и аспартатаминотрансфераза, позволяющие определить уровень стресса для организма. Средний уровень ферментов до и после физиологического стресса составлял: КФК -151,2±50 ед/л и 146,0±16 ед/л, АЛТ - 12±3,8 ед/л и 14,5±2,4 ед/л, ACT - 21,5±9,7 ед/л и 26,5±14,9 ед/л. Наблюдалось увеличение активности ферментов, что может свидетельствовать о изменение проницаемости мембран мышечных клеток. Однако, уровень ферментов находился в области референсных значений: до 190 ед/л для КФК и до 41 ед/л для АЛТ и ACT. Существенных отличий между спортсменами по данным показателям не наблюдалось. Концентрация кортизола в крови и слюне у четырех спортсменов после тестирования достоверно увеличивалась (367±87 нМоль/л - 433±33 нМоль/л и 15,9±3,0 нМоль/л - 19,7±4,3 нМоль/л в крови и слюне соответственно), однако была в пределах средне-популяционных значений: 150-700 нМоль/л и 13,8-48,9 нМоль/л.

Зависимость концентрации БТШ70 от других биохимических показателей проследить не удалось. Концентрация БТШ70 у Ml практически не изменилась, тогда как

у М2 увеличилась более чем в 2.5 раза. У спортсменов МЗ и М4 содержание БТШ70 увеличилось в 1.5 раза. Конечная концентрация БТШ70 у всех спортсменов была около 10

нг/мл, что говорит о том, что она может быть маркером физиологического стресса.

Таблица 2. Концентрация БТШ70 в сыворотке и экспрессия мРНК в лейкоцитах до и после нагрузки. _

БТШ70 в сыворотке, нг/мл Экспрессия мРНК БТШ70 в лейкоцитах, о.е.

До После Увел. До После Увел.

Ml 10,8 11,8 1,09 1,189 1,866 1,57

М2 4,5 11,9 2,64 1,366 1,569 1,15

МЗ 6,1 9,8 1,61 1,366 2,000 1,46

М4 3,8 6,8 1,78 1,515 2,878 1,90

Mim 6,3±3,2 10,1 ±2,4 1,8±0,б 1,4±0,1 2,1±0,6 1,5±0,3

Выявлено статистически значимое (р<0,05) увеличение экспрессии мРНК БТШ70 (Таб. 2.) в лейкоцитах, которое свидетельствует о запуске в клетке адаптивных процессов в ответ на физиологический стресс. Однако, по всей видимости, оно не объясняет наблюдаемого увеличения концентрации белка в сыворотке. Вероятно, в первые минуты, белок в сыворотку выбрасывается не только из лейкоцитов, но и из других клеток-продуцентов.

Стоит отметить, что у спортсмена Ml не наблюдалось увеличение концентрации БТШ70 в сыворотке и начальный уровень был высок, тогда как экспрессия мРНК увеличилась в 1.6 раза. Тогда как у остальных спортсменов и концентрация БТШ70 и его экспрессия в лейкоцитах росла.

Вместе с тем, отсутствие роста активности ферментов цитоплазмы гепатоцитов и миоцитов (АЛТ, ACT, КФК) в сыворотке говорит о том, что рост концентрации БТШ70 не связан с изменением проницаемости мембран этих клеток. Таким образом, большая концентрация БТШ70 является результатом адаптации организма к стрессу.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗМЕНЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ БТШ70 В СЫВОРОТКЕ В ОТВЕТ НА МАКСИМАЛЬНУЮ АНАЭРОБНУЮ НАГРУЗКУ

В качестве модели максимальной анаэробной нагрузки использовался 30-секундный тест Вингейта на велоэргометре Monark 894е. Тест проводился после 5 минутной низкоинтенсивной разминки с пятью короткими ускорениями. Испытуемый на холостом ходу увеличивает частоту педалирования до 70 об/мин, в этот момент автоматически увеличивается предварительно рассчитанная нагрузка (8,5% от веса тела) и начинается отсчет времени теста. Испытуемый развивает максимальную частоту

педалирования и старается ее удержать в течение 30 с. В течение теста регистрируется максимальная мощность за 5 секунд и средняя мощность за 30 секунд.

В исследование участвовали 8 высококвалифицированных (КМС-МС) борцов вольного стиля мужского пола (21±1,5 год) со спортивным стажем не менее 5 лет, подписавших информированное согласие. Протокол эксперимента одобрен этическим комитетом ВНИИФК.

Образцы капиллярной крови были получены непосредственно перед началом теста (ТО), сразу после окончания теста (Т1), через 4 минуты (Т2) и через 8 минут после окончания теста (ТЗ). Результаты эксперимента представлены в таб. 3.

Таблица 3. Результаты теста и концентрация БТШ70 после 30-

секундного теста Вингейта.

БТШ70, нг/мл МАМ, Вт МАМ, Вт/кг Сред.мощн. за 30 сек, Вт Сред.мощн. за 30 сек, Вт/кг

ТО Т1 Т2 ТЗ

Б1 5,0 4,8 12,5 5,1 1133 16,9 570 8,5

Б2 7,2 8,1 7,0 7,4 1065 15,0 523 7,4

БЗ 8,2 7,8 5,4 17,5 947 14,6 534 8,2

Б4 5,9 5,5 8,0 6,2 1102 17,2 549 8,6

Б5 8,5 8,2 7,4 5,9 1083 16,2 484 7,2

Б6 6,6 6,3 7,8 8,3 1102 16,4 572 8,5

Б7 6,0 5,5 4,3 7,1 1026 13,7 538 7,2

Б8 5,8 6,3 5,7 5,7 942 16,2 487 8,4

М±т 6,7*1,2 6,6±1,3 7,3±2,5 7,9±4,0 1050±72,2 15,8±1,2 532,1±33,3 8,0±0,6

Удалось установить, что базальный уровень (ТО) БТШ70 у борцов вольного стиля составляет 6,7±1,2 нг/мл. Максимальная анаэробная нагрузка не вызвала статистически значимого повышения концентрации БТШ70 в сыворотке ни сразу после тестовой нагрузки, ни через 4 и 8 минут. Несмотря на отсутствие значимых изменений можно отметить полутора и более кратное повышение концентрации БТШ70 у некоторых испытуемых (Б1, БЗ и Б4) с последующим возвращением концентрации к базальным значениям.

ИЗМЕНЕНИЕ УРОВНЯ БТШ70 В ОТВЕТ НА НАГРУЗКУ В РАЗЛИЧНЫХ ВИДАХ СПОРТА

Влияние работы субмаксимальной и большой мощности на концентрацию БТШ70

В исследовании участвовало 11 юношей, специализирующихся в академической гребле более четырех лет и подписавших информированное согласие. Протокол эксперимента одобрен этическим комитетом ВНИИФК. Характеристика обследуемой группы представлена в таб. 4.

Таблица 4. Характеристика обследуемой группы (среднее ± стандартное отклонение). МПК - максимальное потребление кислорода.

Масса (кг) Рост (см) Возраст (лет) МПК (мл/мин/кг)

92,4±11,7 191,4=1:4,5 17,2±0,9 4&.Ш.З

Исследование проходило на протяжении 30 дней (1 мезоцикл, включавший 4 микроцикла, продолжительность каждого 7 дней). За два дня до начала мезоцикла все участники прошли тест со ступенчато повышающейся мощностью на гребном эргометре Concept II (начальная ступень 100 Вт, шаг 50 Вт, длительность ступени 3 мин). Работа выполнялась до невозможности поддерживать заданную мощность. На протяжении теста в конце каждой третьей минуты определяли концентрацию лактата в периферической крови. ЧСС регистрировали непрерывно посредством монитора сердечного ритма Polar S610. По концентрации лактата (4 мМоль/л) определяли порог анаэробного обмена (ПАНО). По результатам данного теста для каждого спортсмена были рассчитаны индивидуальные пульсовые зоны: зона 1 - 60-80 % ПАНО (аэробная); зона 2 - 80-100% ПАНО (смешанная аэробно - анаэробная); зона 3 - 100-130 % ПАНО (анаэробно -гликолитическая).

ТО Т1 Т2 Т4

111 I

V > V J У J ^

Микроцикл 1 Микроцикл 2 Микроцикл 3 Микроцикл 4

■ забор образцов Ж крови

Рисунок 2. Схема проведения эксперимента.

Тренировочный план и нагрузка были одинаковы для всех спортсменов. Вся тренировочная деятельность участников эксперимента контролировалась непрерывной пульсометрией (Suunto Team System).

Перед началом исследования (ТО) и в конце первого, второго и четвертого микроциклов (Т1, Т2, Т4) проводился забор венозной крови (Рис. 2). Первый забор -натощак до тренировки, второй - через 1 час после окончания тренировки. Определение уровня гормонов в сыворотке проводили коммерческими наборами согласно методике производителя: гормон роста (ELA-1787, DRG Instruments GmbH, Germany), общий тестостерон (EIA-1559, DRG Instruments GmbH, Germany), свободный тестостерон (EIA-

2924, DRG Instruments GmbH, Germany), кортизол (EIA-1887, DRG Instruments GmbH, Germany).

На основании данных пульсометрии юноши были разделены на две группы. В первую группу вошли гребцы с долей работы во второй и третьей зоне менее 20% от времени тренировки (п=5). Вторую группу составили юноши с большей долей анаэробной работы (п=6).

Исходный уровень общего тестостерона в обеих группах не отличался и находился

на уровне 19,9±8,3 нмоль/л у группы 1 и 21,7±9,2 нмоль/л у группы 2. Концентрация

базапьного тестостерона достоверно не изменялась в группах на протяжении всего

исследования и к концу четвертой недели составила 18,0±4,9 нмоль/л у группы 1 и

18,9±7,5 нмоль/л у группы 2. В ответ на тренировочную нагрузку концентрация общего

тестостерона снижалась на 10-40% в зависимости от объема тренировки, однако

достоверных различий между группами не наблюдалось (Таб. 5).

Таблица 5. Уровень тестостерона и кортизола до и после нагрузки

(среднее±стандартное отклонение)._

Время ТОдо ТОпосле ТСдо ТСпосле Кдо(нг/мл) Кпосле ГРдо ГРпосле

(нмоль/л) (нмоль/л) (нмоль/л) (пмоль/л) (нг/мл) (нг/мл) (нг/мл)

Группа I (л-5)

то 19,9*8,3 14,3*6,0 0,58*0,28 0,40Ю,11 136,9*14,1 97,0*22.8 0,48*0,32 0,35*0,43

TJ 15,3*5,1 16,8*6,8 0,39*0,20 0,32*0,10 141,9*26,0 66,7*22,7 0,08*0,07 0,25*0,24

Т2 17,5*6,8 15,0±3,5 0,41±0,14 0,31*0,09 159,2*8,2 81,87*23,7 0,05*0,02 0,28*0,28

Т4 14,8*2,8 13,9*3,1 0,42*0,11 0,57*0,15 122,7*19,2 52,5*40,5 0,32*0,37 0,18*0,09

Группа 2 (пя6)

ТО 21,7*9,2 13.8*6,5 0,88*0,25 0,58*0,25 162,2*35,7 78,0*35,5 037*0,50 0,10*0,09

Т1 18,0*7,2 18,3*7,1 0,61*0,12 0,72*0,33 141,9*34,0 58,6*31,9 0,20*0,29 0,34*0,23

Т2 18,047,9 19,2*10,3 0,82±0,22 0,58*0,28 154,5*35,1 71,4*32,0 0,01*0,02 0,15*0,06

Т4 18,9±7,5 14,7*6,0 0,98±0,11 0,63*0,33 124,7*38,6 61,42*20,8 0,06*,09 0,29*0,50

ТО - тестостерон общий; ТС - тестостерон свободный; К - кортизол; ГР - гормон роста; до - до тренировки; после - после тренировки.

В конце первого микроцикла (Т1) на 20% снизился уровень свободного тестостерона в обеих группах. Начиная со второго микроцикла, в группе 1 базальная концентрация свободного тестостерона колебалась незначительно и к концу исследования так и не достигла исходного уровня. Обратная картина наблюдалась в группе 2 -концентрация свободного тестостерона постепенно поднималась и к концу исследования повысилась на 60% относительно Т1 (0,61±0,11 нмоль/л Т1 и 0,98±0,1 нмоль/л Т4) и сравнялась с ТО. Концентрация свободного тестостерона снижалась через час после окончания тренировки в среднем на 20%.

Исходная концентрация БТШ70 в группе 1 была достоверно (р<0,05) выше чем в группе 2 (ТО: 16,7±5,2 нг/мл и 7,4±5,5 нг/мл). Этот разрыв сохранялся вплоть до окончания первого микроцикла (Т1: 8,Ш>1 нг/мл и 4,5±5,8 нг/мл) не смотря на то, что концентрация БТШ70 в группе 1 понизилась в два раза.

Исходный уровень МДА не различался между группами. Четыре недели тренировок привели к статистически значимому (р<0,05) снижению базального уровня МДА в группе 1 (ТО - 6,2±2,0 нмоль/мл и Т4 - 3,5±0,9 нмоль/л). В группе 2 прослеживается та же тенденция, но различия не достоверны (ТО - 4,6±0,9 нмоль/мл и Т4 -3,5±1,2 нмоль/л).

Достоверных различий исходных концентраций утреннего кортизола между группами на протяжении исследования не выявлено (137±14 нг/мл - группа 1 и 162±36 нг/мл - группа 2), хотя прослеживалась тенденция к снижению уровня кортизола к концу исследования (123±19 нг/мл - группа 1 и 125±39 нг/мл - группа 2). В ответ на нагрузку уровень кортизола снижался в обеих группах одинаково (40%). Также не было обнаружено различий в концентрации гормона роста до и после тренировки в двух группах (Таб. 5).

Пульсометрия тренировочного процесса с заданной мощностью 60-80% ПАНО выявила значительную долю анаэробной работы у части спортсменов (более 20% общего времени), что является признаком «стойкой активации» адаптационных систем организма. При этом четыре недели тренировок по единому плану не вызвали значительных изменений уровня кортизола и общего тестостерона как до, так и после тренировки в группах с различной долей анаэробной работы. Известно, что при нагрузках высокой интенсивности наблюдается снижение уровня свободного тестостерона (Maest.ii J е1 а1., 2005). Нами показано повышение уровня свободного тестостерона при работе в смешанной и анаэробной зоне, что связано с особенностями метаболизма энергетических субстратов: истощения запасов глюкозы и гликогена и вовлечение в метаболизм свободных жирных кислот (СЖК) (Уапиег М й а1., 1994). СЖК являются конкурентными ингибиторами связывания тестостерона и триптофана белками-переносчиками (81гш!ег НК е1 а1., 2001). Поэтому повышение концентрации СЖК в крови при длительной анаэробной работе приводит к увеличению его концентрации.

Также стоит отметить более высокий уровень БТШ70 в покое в группе с более высокой степенью кардиоваскулярной адаптации, на фоне отсутствия различий в концентрации маркера перекисного окисления липидов. Это обстоятельство подтверждает гипотезу о том, что высокий уровень БТШ70 связан с эффективностью работы митохондрий.

Влияние работы умерепной мощпости на концентрацию ВТШ70

В качестве модели длительной аэробной нагрузки был выбран ультрамарафон. Шесть спортсменов добровольцев различного уровня тренированности бежали шесть часов в закрытом помещении. Все участники эксперимента подписали информированное согласие. Протокол эксперимента одобрен этическим комитетом ВНИИФК. Отбор венозной крови проводился за одни сутки до начала марафона (ТО), непосредственно после 6 часов бега (Т1) и через сутки после марафона (Т2). В сыворотке был определен широкий спскт биохимических и гормональных параметров. Основные из них представлены в таб. 6.

Таблица 6. Показатели крови марафонцев.

Диет. МДА БТШ70 ACT КФК АЛТ ГГТ Моч. Корт. Тест, общ. Тест, св. Лейк.

Ml 85359 ТО 9,5 7,1 31 136 24 39 8,9 254 17,8 15,0 43

Т1 8,3 14,3 70 SS7 28 38 11,3 1026 4,4 6,9 24,2

Т2 8,5 6,9 28 152 22 38 8,2 218 17,0 14,8 4,5

M2 76257 ТО 9,5 5,4 21 133 16 17 6,4 438 13,9 7,2 12,0

Т1 9,3 25,8 50 823 21 19 8,2 920 8,8 6,1 4,0

Т2 8,0 1.8 38 344 42 22 6,9 397 13.8 7,0 3,7

ш 66948 ТО 7,5 5,4 34 177 31 23 5,8 548 10,8 6,6 5,0

Т1 6,7 23,8 61 985 33 24 6,9 1100 7,8 7,1 16,5

Т2 6.5 5,9 77 467 78 19 4,2 551 11,3 6,9 5,0

М4 5630S ТО 8,3 6,0 40 283 26 30 3 346 15,4 11,2 4,9

Т1 9,7 18,6 75 1660 34 30 5,1 898 5,5 6,8 12,1

Т2 8,4 5,8 39 312 23 31 3,3 318 14,2 11,8 4,7

MS 54141 ТО 8,3 1,8 37 118 39 33 8,3 342 16,2 13.8 6,0

Т1 9,5 7,1 45 451 31 32 5,1 663 4,8 5,4 15,9

Т2 6,9 1,8 32 150 32 32 6,3 362 20,5 14,2 5,6

Мб 51556 ТО 8 Л 4,0 31 152 35 26 6,2 307 13,0 8,3 5,4

Т1 10,6 19,1 112 6300 51 29 7,5 729 7,8 2,2 14,9

Т2 7,4 7,4 400 7460 185 23 6,5 271 10,7 7,5 5,9

М1-М6 - участники исследования. Диет. - результат на финише в метрах. ТО -сутки до марафона, Т1 - сразу после окончания марафона, Т2 - через сетки после окончания марафона. МДА - мадановый диальдегид, нмоль/мл; БТШ70 - белок теплового шока 70кДа, нг/мл; ACT - аспартатаминотрансфераза, Е/л; КФК- креатинфосфокиназа, Е/л; АЛТ - Аланинаминотрансфераза, Е/л; ГГТ - гамма-глютамилтрансфераза, Е/л; Моч. - мочевина, ммоль/л; Корт. - кортизол, нмоль/л; Тест. общ. - общий тестостерон, нмоль/л; Тест. св. - свободный тестостерон, пг/мл; Лейк. - лейкоциты цельной крови, 10л9/л.

Анализ полученных данных позволят заключить, что активность ферментов клеток гепато-билиарного тракта до соревнования и сразу после окончания марафона находилась в пределах среднефизиологических значений у всех испытуемых. Активность КФК после

марафона статистически значимо повышалась (р<0,01), что указывает на значительное изменение проницаемости мембран миоцитов. В то же время, не удалось выявить достоверного повышения концентрации МДА у троих участников эксперимента с наилучшими результатами (М1, М2 и МЗ). Стоит отметить повышение концентрации МДА на 20±8% в группе спортсменов с более низким результатом, что говорит об активации перекисного окисления липидов мембран миоцитов. Концентрация БТШ70 после б часов ультрамарафона повысилась у спортсменов в 2-4 раза с максимальным уровнем 25,8 нг/мл. Корреляции между концентрацией МДА, активностью КФК и уровнем БТШ70 выявить не удалось.

Влияние работы максимальной мощности на концентрацию БТШ70

В качестве модели была выбрана команда по спортивной гимнастике. В исследование участвовало 14 девушек (возраст 14-18 лет) и б юношей (18-24 лет). Спортивный стаж участников эксперимента находился в диапазоне от 8 до 18 лет, а спортивная квалификация от мастера спорта до заслуженного мастера спорта.

Забор капиллярной крови проводился после дня отдыха утром до приема пищи и первой тренировки. Первый забор крови проведен в начале подготовительного периода (Т1), второй - в конце подготовительного периода (Т2), третий (ТЗ) - в предсоревновательный период и четвертый (Т4) - в послесоревновательный период.

При анализе концентрации БТШ70 в сыворотке в динамике учебно-тренировочного процесса у спортсменов мужского и женского пола выявлено статистически значимое снижение уровня БТШ70 (Таб. 7).

Таблица 7. Концентрация БТШ70 у спортивных гимнастов в

дннамике учебно-тренировочных и соревновательных процессов.

БТШ70 (нг/мл)

Т1 | Т2 1 ТЗ | Т4 | Т1-ТЗ Т1-Т4

Девушки (п=14)

24,9±12,9 | 20,9±15,8 | 7,4±2,8 | 9,9±3,7 1 Р<0,05 р<0,05

Юноши (п-6)

64,17±58,9 | 11,0±10,6 | 10,0±5,2 | 20,6±29,9 1 Р<0,05

Также выявлены статистически значимые различия в концентрации БТШ70 в начале подготовительного периода между юношами и девушками (64,2±58,9 нг/мл и 24,9±12,9 нг/мл соответственно; р<0,05).

Таблица 8. Базальный уровень БТШ70 у спортсменов различных специализаций в подготовительный и предсоревновательный период.______

Борьба Гребля Марафон Гимпастпка

Подготовительный 24,7±12,2 11,5±7,0 13,4±5,1 64,2±58,9

Предсоревновательный 6,7±1,2 8,1±3,7 5,0±1,8 8,3±6,5

Сравнение концентрации базального БТШ70 на различных этапах учебно-тренировочного процесса (Таб. 8) позволило выявить следующие закономерности:

• в подготовительный период базальный уровень БТШ70 значимо различается (р<0,05) у спортсменов, специализирующихся в сложнокоординационных (вольная борьба и спортивная гимнастика) и циклических видах спорта (академическая гребля и марафонский бег).

• пребывание спортсменов на пике спортивной формы в предсоревновательный период приводит к тому, что концентрация БТШ70 нормализуется на уровне 7,1±5,3 нг/мл, и различия в уровне показателя между спортсменами различных специализаций исчезают.

Таким образом, можно заключить, что базальный уровень БТШ70 отражает активность адаптационных процессов в организме спортсменов различной специализации, и может быть использован для оптимизации медицинского контроля за функциональным состоянием лиц, занимающихся спортом.

ВЫВОДЫ

1. Разработана тест-система определения концентрации белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа (БТШ70). В ходе разработки тест-системы получен БТШ70 с гексагистидиновым тэгом на Ы-конце, а также аффинно очищенные поликлональные антитела кролика против БТШ70.

2. Показано отсутствие корреляции между экспрессией генов БТШ70 в лейкоцитах и концентрацией БТШ70 в сыворотке при исследовании экспрессии мРНК БТШ70 в ответ на кратковременную нагрузку высокой интенсивности.

3. При анализе изменения уровня БТШ70 и ряда других биохимических и гормональных параметров при нагрузках различной интенсивности в команде по академический гребле и спортивной гимнастике был показан статистически значимо более высокий уровень БТШ70 в начале подготовительного периода у юношей и девушек, специализирующихся в

спортивной гимнастике (64,2±58,9 нг/мл и 24±12,9 нг/мл соответственно) по сравнению с гребцами-академистами (11,5±7,0 нг/мл).

4. Установлен базальный уровень БТШ70 у высококвалифицированных спортсменов циклических и сложнокоординационных видов спорта на различных этапах учебно-тренировочного и соревновательного процесса.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Врачам команд циклических и сложнокоординационных видов спорта необходимо контролировать концентрацию БТШ70, так как повышение базального уровня БТШ70 в сыворотке крови выше концентрации 14-15 нг/мл в восстановительный период является признаком перенапряжения адаптационных систем организма спортсмена.

2. При интерпретации уровня БТШ70 врачам команд необходимо учитывать, что в начале тренировочного этапа базальный уровень этого показателя может достигать значений 64,2±58,9 нг/мл в сложнокоординационных видах спорта и уровня 11,5±7,0 нг/мл в циклических. При этом в процессе адаптации к нагрузкам концентрация БТШ70 снижается и стабилизируется на уровне 7,1±3,3 нг/мл.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шкурников М.Ю., Донников А.Е., Акимов Е.Б., Сахаров Д.А., Тоневицкий А.Г. Свободный тестостерон как маркер адаптации к нагрузкам средней интенсивности. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Том 146. - №9. - С. 330— 332.

2. Шкурников М.Ю., Донников А.Е., Акимов Е.Б., Тоневицкий А.Г. Связь между степенью кардиоваскулярной адаптации и поляризацией иммунного ответа по Th 1 /ТЪ2-механизму. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. -Том 146. - №10. - С. 442-446.

3. Шкурников М.Ю., Сахаров Д.А., Степанов А.В., Тоневицкий А.Г.. Кратковременный высокоинтенсивный физиологический стресс вызывает увеличение экспрессии белка теплового шока в лейкоцитах человека. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. -Т.147. -№3 -С.335-340

4. Шкурников М.Ю., Тоневицкий А.Г., Абрамова Т.Ф., Арьков В.В. Создание технологий фото- и электростимуляции для диагностики и реабилитации поражений нейро-мышечной системы и опорно-двигательного аппарата человека, выпуск опытных образцов аппаратуры. // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технического комплекса россии на 2007-2012 годы». Сборник тезисов. 8-10 декабря 2008 г., г. Москва. - Москва, 2008.-С. 232-233.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РАЗРАБОТКИ

Шкурников М.Ю., Абрамова Т.Ф., Арьков В.В. Исследование, тренировка и восстановление сенсомоторной системы человека: Метод, рекомендации. - М.: ВНИИФК, 2008. -50 с.

Подписано в печать 25.03.2009 Формат бумаги 60x90/16 Усл.ггеч.л. 0,8 Тираж 100

Сдано в производство 26.04.2009 Бум.офсетная Усл.-изд.л. 0,9 Заказ № 7-И

Отпечатано в ООО «Петроруш». г.Москва, ул.Палиха-2а, тел.250-92-06 www.postator.ru

Оглавление диссертации Шкурников, Максим Юрьевич :: 2009 :: Москва

Введение.:.

Глава I. Современное состояние проблемы оценки адаптации к нагрузкам различной интенсивности.

Биохимические и гормональные показатели адаптации к нагрузкам различной интенсивности.

Белки теплового шока, как показатель адаптации к физическим нагрузкам.

Глава II. Методы исследования.

Организация исследования.

Определение концентрации БТШ70 методом ИФА.

Определение биохимических и гормональных показателей.

Определение концентрации малонового диальдегида.

Статистическая обработка.

Глава III. Разработка иммунохимического метода определения БТШ

Глава IV. Влияние нагрузок максимальной интенсивности на концентрацию БТШ70.

Определение изменения экспрессии мРНК БТШ70 и концентрации БТШ70 в сыворотке в ответ на максимальную аэробную нагрузку.

Определение изменения концентрации БТШ70 в сыворотке в ответ на максимальную анаэробную нагрузку.

Глава V. Изменение уровня БТШ70 в ответ на нагрузку в различных видах спорта.

Глава VI. Обсуждение результатов.

Выводы.

Введение диссертации по теме "Восстановительная медицина, спортивная медицина, курортология и физиотерапия", Шкурников, Максим Юрьевич, автореферат

Исследования проведены с целью разработки медико-биологических " критериев адаптации к нагрузкам различной интенсивности в ходе учебно-тренировочного процесса высококвалифицированных спортсменов.

Прогрессирующее развитие тренированности спортсмена является результатом того, что следовые реакции, наблюдающиеся в организме после отдельных тренировочных нагрузок, не устраняются полностью, а сохраняются и закрепляются конструктивными изменениями функциональных систем организма спортсменов, возникающими в восстановительном периоде, которые служат основой повышения тренированности. Оптимальное сочетание процессов утомления и восстановления - физиологическая основа постоянной и долговременной адаптации организма к физическим и спортивным нагрузкам.

Актуальность

Особенность адаптации организма к спортивной деятельности заключается в этапности ее формирования на протяжении многолетнего процесса тренировки и участия в соревнованиях. Развитие адаптационных изменений и ускорение периода восстановления сопряжено с применением продолжительных нагрузок различной интенсивности, что значительно повышает вероятность формирования у спортсмена синдрома переутомления. Синдром переутомления — это совокупность симптомов, которые обуславливают неспособность адекватно переносить тренировочный процесс. Спортсмены не способны поддерживать свой тренировочный график или повторять результаты достигнутые ранее. Зачастую диагноз переутомления ставится на основании ретроспективных данных. К сожалению, на сегодняшний день способ реабилитации только один — полноценный (иногда продолжительный) отдых, что отрицательно сказывается на карьере спортсмена. Общеизвестно, что заболевание легче поддается лечению на начальном этапе. Чтобы определить критическое состояние спортсмена необходимы объективные показатели физического состояния во время тренировочного процесса.

Одним из актуальных направлений поиска биохимических маркеров утомления и адаптации является исследование роли белка теплового шока (БТШ) 70 в организме человека. Белок БТШ70 является индуцибельным представителем семейства белков теплового шока. БТШ необходимы клетке во всех процессах ее жизнедеятельности, включая адаптацию к огромному числу цитотоксических факторов, как ксенобиотического, так и естественного происхождения.

Одна из функций БТШ70 в клетке заключается в том, что он связывается с поврежденными или вновь синтезированными полипептидами и помогает им принять нативную конформацию. То, что БТШ70 спасает клетки от огромного числа факторов, в том числе, вызывающих апоптоз, было подтверждено в многочисленных опытах in vitro и in vivo с использованием широкого спектра модельных организмов, находящихся на разных ступенях эволюции.

Не смотря на то, что в целом ряде работ показано, что физическая нагрузка является сильным стимулом к внутриклеточной экспрессии БТШ70 клетками иммунной системы, миоцитами скелетной и сердечной мускулатуры, а также такими органами, как печень, селезенка и мозг, исследований, посвященных взаимосвязи уровня БТШ70 в сыворотке крови и специфике физической нагрузки (специальная работоспособность) не проводилось.

Не смотря на то, что в целом ряде работ показана зависимость стимуляции внутриклеточной экспрессии БТШ70 при возрастании физической нагрузки клетками иммунной системы миоцитами скелетной и сердечной мускулатуры, печенью, селезенкой и мозгом, исследований, посвященных взаимосвязи уровня БТШ70 в сыворотке крови и спецификой физической нагрузки (специальная работоспособность) не проводилось.

Определение БТШ70 сыворотке крови может существенно повысить точность методов лабораторного контроля спортивной деятельности, углубить представления о молекулярно-биологических процессах, протекающих в организме высококвалифицированных спортсменов в ходе тренировочной и соревновательной деятельности.

Предмет исследования

Биохимические показатели, показатели гормонального статуса, t экспрессия БТШ70 в лейкоцитах, концентрация БТШ70 в сыворотке крови при нагрузках различной интенсивности у спортсменов циклических и сложнокоординационных видов спорта.

Объект исследования

Биологические закономерности адаптации организма спортсмена к нагрузкам различной интенсивности.

Цель исследования

Изучение влияния нагрузок различной интенсивности на концентрацию БТШ70 в сыворотке крови спортсменов циклических и сложнокоординационных видов спорта, экспрессии мРНК БТШ70 в лейкоцитах; разработка критериев оценки адаптационных резервов организма высококвалифицированных спортсменов циклических и сложнокоординационных видов спорта в процессе тренировочной и соревновательной деятельности основанных на динамике изменения концентрации БТШ70 в сыворотке крови.

Гипотеза

Задачи исследования

1. Разработать модификацию иммунохимического метода определения БТ1П70 в сыворотке.

2. Исследовать экспрессию БТШ70 в лейкоцитах в ответ на кратковременную нагрузку высокой интенсивности.

3. Исследовать динамику гормональных и биохимических показателей, БТШ70 у высококвалифицированных спортсменов циклических и сложнокоординационных видов спорта на различных этапах учебно-тренировочной и соревновательной деятельности.

4. Определить базальный уровень БТШ70 для разработки рекомендаций по медицинскому контролю над функциональным состоянием высококвалифицированных спортсменов с учетом полученных данных.

Методы исследования

Научная новизна

Теоретическая значимость

Практическая значимость

Результаты работы могут использоваться для коррекции учебно-тренировочной работы в процессе подготовки спортсменов. Материалы исследования могут быть использованы в преподавании медико-биологических дисциплин в высших учебных заведениях, на семинарах и курсах повышения квалификации врачей спортивной медицины, тренеров, инструкторов ЛФК, врачей команд по видам спорта. Результаты исследований внедрены в работу кафедры спортивной медицины ФГУ РГУФКСиТ и кафедры физического воспитания и спорта МГУ им. М.В. Ломоносова, что подтверждено актами о внедрении.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

• Работа максимальной аэробной мощности повышает концентрацию БТШ70 в сыворотке и увеличивает экспрессию его мРНК в лейкоцитах.

• Работа максимальной анаэробной мощности не вызывает повышения концентрации БТШ70 в сыворотке крови.

Заключение диссертационного исследования на тему "Влияние нагрузок различной интенсивности на концентрацию белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа"

102 ~ ВЫВОДЫ

1. Разработана тест-система определения концентрации белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа (БТШ70). В ходе разработки тест—системы получен БТШ70 с гексагистидиновым тэгом на N-конце, а также аффинно очищенные поликлональные антитела кролика против БТШ70.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Врачам команд циклических и сложнокоординационных видов спорта необходимо контролировать концентрацию БТШ70, так как повышение базального уровня БТП170 в сыворотке крови выше концентрации 14-15 нг/мл в восстановительный период является признаком перенапряжения адаптационных систем организма спортсмена.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Шкурников, Максим Юрьевич

1. Андреева Л.И. Теоретическое и прикладное значение белков теплового шока 70 кДа; возможность практического применения и фармакологической коррекции // Обз. Клин. Фармакол. Лек. Тер. —2002.-№1.-С. 2-18.

2. Астратенкова И.В. и Чайковский B.C. Метаболизм аспартатаминотрансферазы при физических нагрузках // Укр. биохим. журн. 1990. - Т. 62 - С. 98-101.

3. Владимиров Ю.А. и Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука. - 1972. - 252 с.

4. Гужова И.В., Ласунская Е.Б., Нильссон К. и др. Влияние теплового шока на процессы дифференцировки и апоптоза в клетках U-937 // Цитология. 2000. - Т. 42. - 7. - С. 653-8.

5. Гужова И.В., Новоселова Т.В., Вербова М.В., Маргулис Б.А. Шаперон Hsp70 и перспективы его использования противоопухолевой терапии // Цитология. 2005. - Т. 47. - С. 210-27.

6. Зезеров А.Е., Ивонова С.М. и Ушаков Л.С. Перекисное окисление липидов в тканях крыс при антиортостатической гипокинезии, действии физической нагрузки и иммобилизационного стресса // Косм, биол. авиакосм. мед. 1987. - Т. 21. - С. 39-43.

7. Маргулис Б.А., Гужова И.В. Белки стресса в эукариотической клетке // Цитология. 2000. - №42. - С. 323-342.

8. Меерсон Ф.З. и Пшенникова М.Г. Адаптация к стрессовым ситуациям и физическим нагрузкам. М.: Медицина. — 1988. — 256 с.

9. Ю.Морозов В.И. и Петрова Т.Н. Выявление протеиназ нейтрофилов в скелетных мышцах крыс после мышечной деятельности. // Укр. биохим. журн. 1993. - Т. 65. - С. 40-44.

10. П.Пастухов Ю.Ф., Максимов А.Д., Хаскин В.В. Адаптация к холоду и условиям субарктики: проблемы термофизиологии. Т. 1. Магадан: МЦИК "Арктика". - 2003. - 373 с.

11. Скулачев В.П. Эволюция, митохондрии и кислород // Соросовский образовательный журнал. №9 - 1999. - С. 4-10.

12. Чаговец Н.Р. Биохимический анализ компенсаторных процессов в скелетных мышцах после функциональной деятельности. Автореф. дисс докт. биол. наук.Л. - 1974. — 36 с.

13. Чайковский B.C., Башарина О.Б., Шаляпина И.В. и Рогозкин В.А. Физические нагрузки и содержание миоглобина и тропомиозина в мышцах и миоглобина в крови крыс // Вопр. мед. Химии — 1987. — Т. 33 -№ 4. — С.79-83.

14. Шаляпина И.В., Чайковский B.C. и Рогозкин В.А. Метаболизм тропомиозина в мышцах и его содержание в крови при физических нагрузках // Укр. биохим. журн. № 4. - 1987 - С. 14-18.

15. Яковлев Н.Н. Биохимия спорта. М.: ФиС. - 1974. - 288 с.

16. Position of The American Dietetic Association: nutrition for physical fitness and athletic performance for adults // J Am Diet Assoc. 1987. - Vol. 87. -N7.-P. 933-9.

17. Position of the American Dietetic Association and the Canadian Dietetic Association: nutrition for physical fitness and athletic performance for adults //J Am Diet Assoc. 1993.-Vol. 93.-N6.-P. 691-6.

18. Adlercreutz H., Harkonen M., Kuoppasalmi K. et al. Effect of training on plasma anabolic and catabolic steroid hormones and their response during physical exercise // Int J Sports Med. 1986. - Vol. 7 Suppl 1. P. 27-8.

19. Alessio Н.М. and Goldfarb А.Н. Lipid peroxidation and scavenger enzymes during exercise: adaptive response to training // J Appl Physiol. 1988. — Vol. 64.-N4,-P. 1333-6.

20. Arrigo A.P. In search of the molecular mechanism by which small stress proteins counteract apoptosis during cellular differentiation // J Cell Biochem. 2005. - Vol. 94. - N2.- P. 241-6.

21. Asea A. Stress proteins and initiation of immune response: chaperokine activity of hsp72 // Exerc Immunol Rev. 2005. - Vol. 11. P. 34^15.

22. Avula С .P., Muthukumar A.R., Zaman K. et al. Inhibitory effects of voluntary wheel exercise on apoptosis in splenic lymphocyte subsets of C57BL/6 mice // J Appl Physiol. 2001. - Vol. 91. - N6,- P. 2546-52.

23. Baler R., Zou J. and Voellmy R. Evidence for a role of Hsp70 in the regulation of the heat shock response in mammalian cells // Cell Stress Chaperones. 1996. - Vol. 1. - N1.- P. 33-9.

24. Banfi G. and Dolci A. Free testosterone/cortisol ratio in soccer: usefulness of a categorization of values // J Sports Med Phys Fitness. 2006. - Vol. 46. -N4.-P. 611-6.

25. Banfi G., Marinelli M., Roi G.S. et al. Usefulness of free testosterone/cortisol ratio during a season of elite speed skating athletes // Int J Sports Med. 1993. - Vol. 14. - N7,- P. 373-9.

26. Bardwell J.C. and Craig E.A. Major heat shock gene of Drosophila and the Escherichia coli heat-inducible dnaK gene are homologous // Proc Natl Acad Sci USA.- 1984. Vol. 81.-N3- P. 848-52.

27. Basu S., Binder R.J., Suto R. et al Necrotic but not apoptotic cell death releases heat shock proteins, which deliver a partial maturation signal to dendritic cells and activate the NF-kappa В pathway // Int Immunol. 2000. -Vol. 12.-Nil.-P. 1539^16.

28. Blanchard R.J., Yudko E.B., Rodgers R.J. et al. Defense system psychopharmacology: an ethological approach to the pharmacology of fear and anxiety // Behav Brain Res. 1993. - Vol. 58. - N1-2,- P. 155-65.

29. Bohen S.P. The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones Book., 1994.

30. Вогк P., Sander C. and Valencia A. An ATPase domain common to prokaryotic cell cycle proteins, sugar kinases, actin, and hsp70 heat shock proteins // Proc Natl Acad Sci USA.- 1992. Vol. 89. - N16.- P. 7290-4.

31. Brouns F., Saris W.H., Stroecken J. et al. Eating, drinking, and cycling. A controlled Tour de France simulation study, Part I // Int J Sports Med. — 1989a. Vol. 10 Suppl 1. P. S32-40.

32. Brouns F., Saris W.H., Stroecken J. et al. Eating, drinking, and cycling. A controlled Tour de France simulation study, Part II. Effect of diet manipulation // Int J Sports Med. 1989b. - Vol. 10 Suppl 1. P. S41-8.

33. Brown M.D., Jeal S., Bryant J. et al. Modifications of microvascular filtration capacity in human limbs by training and electrical stimulation // Acta Physiol Scand. 2001. - Vol. 173.-N4.-P. 359-68.

34. Buchner J. Supervising the fold: functional principles of molecular chaperones//FASEB J. 1996.-Vol. 10.-N1.-P. 10-9.

35. Buchner J. Hsp90 & Co. a holding for folding // Trends Biochem Sci. -1999.-Vol. 24.-N4.-P. 136^11.

36. Butterfield G.E. Whole-body protein utilization in humans // Med Sci Sports Exerc. 1987. - Vol. 19. -N5 Suppl.-P. SI57-65.

37. Buttner P., Mosig S., Lechtermann A. et al. Exercise affects the gene expression profiles of human white blood cells // J Appl Physiol. — 2007. — Vol. 102. -Nl.- P. 26-36.

38. Cahill C.M., Waterman W.R., Xie Y. et al. Transcriptional repression of the prointerleukin lbeta gene by heat shock factor 1 // J Biol Chem. — 1996. — Vol. 271. -N40,-P. 24874-9.

39. Campisi J., Leem Т.Н. and Fleshner M. Stress-induced extracellular Hsp72 is a functionally significant danger signal to the immune system // Cell Stress Chaperones. 2003a. - Vol. 8. - N3.- P. 272-86.

40. Campisi J., Leem Т.Н., Greenwood B.N. et al. Habitual physical activity facilitates stress-induced HSP72 induction in brain, peripheral, and immune tissues // Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2003b. - Vol. 284. -N2.-P. R520-30.

41. Caplan A.J., Cyr D.M. and Douglas M.G. Eukaryotic homologues of Escherichia coli dnaJ: a diverse protein family that functions with hsp70 stress proteins // Mol Biol Cell. 1993. - Vol. 4. - N6.- P. 555-63.

42. Cardile V., Scifo C., Russo A. et al. Involvement of HSP70 in resveratrol-induced apoptosis of human prostate cancer // Anticancer Res. 2003. — Vol. 23. -N6C.-P. 4921-6.

43. Chang R.T., Lambert G.P., Moseley P.L. et al. Effect of estrogen supplementation on exercise thermoregulation in premenopausal women // J Appl Physiol. 1998. - Vol. 85. - N6,- P. 2082-8.

44. Chappell T.G., Konforti B.B., Schmid S.L. et al. The ATPase core of a clathrin uncoating protein // J Biol Chem. 1987. - Vol. 262. - N2.- P. 746-51.

45. Clark N. Nutrition support programs for young adult athletes // Int J Sport Nutr. 1998. - Vol. 8. -N4.-P. 416-25.

46. Connolly P.H., Caiozzo V.J., Zaldivar F. et al. Effects of exercise on gene expression in human peripheral blood mononuclear cells // J Appl Physiol. — 2004. Vol. 97. - N4,- P. 1461-9.

47. Constable S.H., Favier R.J., McLane J.A. et al Energy metabolism in contracting rat skeletal muscle: adaptation to exercise training // Am J Physiol.-1987.-Vol. 253.-N2 Pt l.-P. C316-22.

48. Craig E.A. The heat shock response // CRC Crit Rev Biochem. 1985. — Vol. 18.-N3.-P. 239-80.

49. Cvoro A. and Matic G. Hyperthermic stress stimulates the association of both constitutive and inducible isoforms of 70 kDa heat shock protein with rat liver glucocorticoid receptor // Int J Biochem Cell Biol. 2002. — Vol. 34.-N3.-P. 279-85.

50. Dall'Era M.A., Oudes A., Martin D.B. et al HSP27 and HSP70 interact with CD 10 in C4-2 prostate cancer cells // Prostate. 2007. - Vol. 67. - N7.- P. 714-21.

51. Davies M.J. Direct detection of radical production in the ischaemic and reperfused myocardium: current status // Free Radic Res Commun. 1989.- Vol. 7. N3-6.-P. 275-84.

52. Deak Т., Meriwether J.L., Fleshner M. et al Evidence that brief stress may induce the acute phase response in rats // Am J Physiol. — 1997. — Vol. 273.- N6 Pt 2.- P. R1998-2004.

53. Diamond D.M. and Park C.R. Predator exposure produces retrograde amnesia and blocks synaptic plasticity. Progress toward understanding how the hippocampus is affected by stress // Ann N Y Acad Sci. 2000. — Vol. 911. P. 453-5.

54. Dishman R.K., Dunn A.L., Youngstedt S.D. et al Increased open field locomotion and decreased striatal GABAA binding after activity wheel running // Physiol Behav. 1996. - Vol. 60. - N3.- P. 699-705.

55. Dohm G.L., Israel R.G., Breedlove R.L. et al Biphasic changes in 3— methylhistidine excretion in humans after exercise // Am J Physiol. 1985.- Vol. 248. N5 Pt 1.- P. E588-92.

56. Dybdahl В., Wahba A., Lien Е. et al. Inflammatory response after open heart surgery: release of heat-shock protein 70 and signaling through tolllike receptor-4 // Circulation. 2002. - Vol. 105. - N6.- P. 685-90.

57. Fabian Т.К., Gaspar J., Fejerdy L. et al. Hsp70 is present in human saliva // Med Sci Monit. 2003. - Vol. 9. -Nl.-P. BR62-5.

58. Febbraio M.A. and Koukoulas I. HSP72 gene expression progressively increases in human skeletal muscle during prolonged, exhaustive exercise // J Appl Physiol. 2000. - Vol. 89. -N3.-P. 1055-60.

59. Fehrenbach E. and Niess A.M. Role of heat shock proteins in the exercise response // Exerc Immunol Rev. 1999. — Vol. 5. P. 57-77.

60. Fehrenbach E., Niess A.M., Schlotz E. et al. Transcriptional and translational regulation of heat shock proteins in leukocytes of endurance runners // J Appl Physiol. 2000. - Vol. 89. - N2.- P. 704-10.

61. Flaherty K.M., DeLuca-Flaherty C. and McKay D.B. Three-dimensional structure of the ATPase fragment of a 70K heat-shock cognate protein // Nature. 1990. - Vol. 346. - N6285.-P. 623-8.

62. Fleshner M. Exercise and neuroendocrine regulation of antibody production: protective effect of physical activity on stress-induced suppression of the specific antibody response // Int J Sports Med. 2000. — Vol. 21 Suppl 1. P. S14-9.

63. Fleshner M., Campisi J., Amiri L. et al. Cat exposure induces both intra-and extracellular Hsp72: the role of adrenal hormones // Psychoneuroendocrinology. 2004. - Vol. 29. - N9,- P. 1142-52.

64. Garrido С. Size matters: of the small HSP27 and its large oligomers // Cell Death Differ. 2002. - Vol. 9. - N5.- P. 483-5.

65. Glatz J.F., Van der Vusse G.J., Maessen J.G. et al. Fatty acid-binding protein as marker of muscle injury: experimental findings and clinical application // Acta Anaesthesiol Scand Suppl. 1997. - Vol. 111. P. 292^1.

66. Goldberg A.L. and Chang T.W. Regulation and significance of amino acid metabolism in skeletal muscle // Fed Proc. 1978. — Vol. 37. — N9.— P. 2301-7.

67. Gontzea I., Sutzesco P. and Dumitrache S. Reasearch on the influence of muscular activity on nitrogen metabolism and on the protein requirement of man. // Ann Nutr Aliment. 1968. - Vol. 22. - N4.- P. 183-236.

68. Gonzalez В., Hernando R. and Manso R. Stress proteins of 70 kDa in chronically exercised skeletal muscle // Pflugers Arch. — 2000. — Vol. 440. — Nl.-P. 42-9.

69. Gonzalez B. and Manso R. Induction, modification and accumulation of HSP70s in the rat liver after acute exercise: early and late responses // J Physiol. 2004. - Vol. 556. - NPt 2.- P. 369-85.

70. Gosslau A., Ruoff P., Mohsenzadeh S. et al. Heat shock and oxidative stress-induced exposure of hydrophobic protein domains as common signal in the induction of hsp68 // J Biol Chem. 2001. - Vol. 276. - N3.- P. 1814-21.

71. Granger D.N. and Korthuis R.J. Physiologic mechanisms of postischemic tissue injury // Annu Rev Physiol. 1995. - Vol. 57. P. 311-32.

72. Grisham M.B., Hernandez L.A. and Granger D.N. Adenosine inhibits ischemia-reperfusion-induced leukocyte adherence and extravasation // Am J Physiol. 1989. - Vol. 257. - N5 Pt 2,- P. H1334-9.

73. Guidon P.T., Jr. and Hightower L.E. Purification and initial characterization of the 71-kilodalton rat heat-shock protein and its cognate as fatty acid binding proteins // Biochemistry. 1986. - Vol. 25. - N11.- P. 3231-9.

74. Gurbuxani S., Bruey J.M., Fromentin A. et al. Selective depletion of inducible HSP70 enhances immunogenicity of rat colon cancer cells // Oncogene.-2001.-Vol. 20.-N51.-P. 7478-85.

75. Gusev N.B., Bogatcheva N.V. and Marston S.B. Structure and properties of small heat shock proteins (sHsp) and their interaction with cyto skeleton proteins // Biochemistry (Mosc). 2002. - Vol. 67. - N5.- P. 511-9.

76. Guzhova I.V., Arnholdt A.C., Darieva Z.A. et al. Effects of exogenous stress protein 70 on the functional properties of human promonocytes through binding to cell surface and internalization // Cell Stress Chaperones. 1998. -Vol. 3.-N1.-P. 67-77.

77. Hikida R.S., Staron R.S., Hagerman F.C. et al. Muscle fiber necrosis associated with human marathon runners // J Neurol Sci. — 1983. — Vol. 59. -N2.-P. 185-203.

78. Hoppeler H. and Desplanches D. Muscle structural modifications in hypoxia // Int J Sports Med. 1992. - Vol. 13 Suppl 1. P. SI66-8.

79. Iiboshi A., Tokuda S., Nishimura T. et al. Biphasic changes of blood myoglobin level in weight training // J Sports Med Phys Fitness. 1982. — Vol. 22.-N3.-P. 284-94.

80. Jakob U. and Buchner J. Assisting spontaneity: the role of Hsp90 and small Hsps as molecular chaperones // Trends Biochem Sci. 1994. — Vol. 19. -N5.-P. 205-11.

81. Jerome S.N., Akimitsu Т., Gute D.C. et al. Ischemic preconditioning attenuates capillary no-reflow induced by prolonged ischemia and reperfusion // Am J Physiol. 1995. - Vol. 268. - N5 Pt 2.- P. H2063-7.

82. Kaman R.L., Goheen В., Patton R. et al. The effects of near maximum exercise of serum enzymes: the exercise profile versus the cardiac profile // Clin Chim Acta. 1977. - Vol. 81. -N2.-P. 145-52.

83. Kanter M.M., Lesmes G.R., Kaminsky L.A. et al. Serum creatine kinase and lactate dehydrogenase changes following an eighty kilometer race. Relationship to lipid peroxidation // Eur J Appl Physiol Occup Physiol. -1988. Vol. 57. - N1.- P. 60-3.

84. Khassaf M., Child R.B., McArdle A. et al. Time course of responses of human skeletal muscle to oxidative stress induced by nondamaging exercise // J Appl Physiol. 2001. - Vol. 90. -N3.- P. 1031-5.

85. Korthuis R.J., Smith J.K. and Carden D.L. Hypoxic reperfusion attenuates postischemic microvascular injury // Am J Physiol. 1989. — Vol. 256. - N1 Pt 2 — P. H315-9.

86. Kuhl N.M. and Rensing L. Heat shock effects on cell cycle progression // Cell Mol Life Sci. 2000. - Vol. 57. - N3.- P. 450-63.

87. Lindquist S. The heat-shock response // Annu Rev Biochem. 1986. — Vol. 55. P. 1151-91.

88. Lippi G., Franchini M., Guidi G.C. et al. Non-steroidal anti-inflammatory drugs in athletes // Br J Sports Med. 2006. - Vol. 40. - N8.- P. 661-2; discussion 662—3.

89. Liu Y., Mayr S., Opitz-Gress A. et al. Human skeletal muscle HSP70 response to training in highly trained rowers // J Appl Physiol. — 1999. — Vol. 86. — N1- P. 101-4.

90. Mackinnon L.T., Hooper S.L., Jones S. et al. Hormonal, immunological, and hematological responses to intensified training in elite swimmers // Med Sci Sports Exerc. 1997. - Vol. 29. - N12.- P. 1637-45.

91. MacRae Т.Н. Structure and function of small heat shock/alpha-crystallin proteins: established concepts and emerging ideas // Cell Mol Life Sci.-2000.-Vol. 57.-N6.-P. 899-913.

92. Maestu J., Jurimae J. and Jurimae T. Hormonal response to maximal rowing before and after heavy increase in training volume in highly trained male rowers // J Sports Med Phys Fitness. 2005a. - Vol. 45. - N1- P. 121-6.

93. Maestu J., Jurimae J. and Jurimae T. Monitoring of performance and training in rowing // Sports Med. 2005b. - Vol. 35. - N7.- P. 597-617.

94. Maloyan A. and Horowitz M. beta-Adrenergic signaling and thyroid hormones affect HSP72 expression during heat acclimation // J Appl Physiol. 2002. - Vol. 93. - N1.- P. 107-15.

95. Mesches M.H., Fleshner M., Heman K.L. et al. Exposing rats to a predator blocks primed burst potentiation in the hippocampus in vitro // J Neurosci. 1999. - Vol. 19. -N14,- P. RC18.

96. Miyazaki M., Nakatsura Т., Yokomine K. et al. DNA vaccination of HSP105 leads to tumor rejection of colorectal cancer and melanoma in mice through activation of both CD4 T cells and CD8 T cells // Cancer Sci. -2005. Vol. 96. - N10,- P. 695-705.

97. Moraska A. and Fleshner M. Voluntary physical activity prevents stress-induced behavioral depression and anti-KLH antibody suppression //

98. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2001. - Vol. 281. - N2 - P. R484-9.

99. Morimoto R.I. Regulation of the heat shock transcriptional response: cross talk between a family of heat shock factors, molecular chaperones, and negative regulators // Genes Dev. 1998. - Vol. 12. -N24,- P. 3788-96.

100. Morozov V.I., Pryatkin S.A., Kalinski M.I. et al. Effect of exercise to exhaustion on myeloperoxidase and lysozyme release from blood neutrophils // Eur J Appl Physiol. 2003. - Vol. 89. - N3-4.- P. 257-62.

101. Morozov V.I., Tsyplenkov P.V., Golberg N.D. et al. The effects of high-intensity exercise on skeletal muscle neutrophil myeloperoxidase in untrained and trained rats // Eur J Appl Physiol. 2006. — Vol. 97. - N6.- P. 716-22.

102. Morozov V.I., Usenko T.N. and Rogozkin V.A. Neutrophil antiserum response to decrease in proteolytic activity in loaded rat muscle // Eur J Appl Physiol.-2001.-Vol. 84.-N3.-P. 195-200.

103. Morshauser R.C., Wang H., Flynn G.C. et al. The peptide-binding domain of the chaperone protein Hsc70 has an unusual secondary structure topology //Biochemistry. 1995. - Vol. 34. -N19-P. 6261-6.

104. Narasimhan P., Swanson R.A., Sagar S.M. et al. Astrocyte survival and HSP70 heat shock protein induction following heat shock and acidosis // Glia.- 1996,-Vol. 17.-N2,-P. 147-59.

105. Palmer G., Louvion J.F., Tibbetts R.S. et al. Trypanosoma cruzi heat-shock protein 90 can functionally complement yeast // Mol Biochem Parasitol. 1995. - Vol. 70. - N1-2.- P. 199-202.

106. Parcellier A., Schmitt E., Gurbuxani S. et al. HSP27 is a ubiquitin-binding protein involved in I-kappaBalpha proteasomal degradation // Mol Cell Biol. 2003. - Vol. 23. - N16,- P. 5790-802.

107. Parks D.A. and Granger D.N. Xanthine oxidase: biochemistry, distribution and physiology // Acta Physiol Scand Suppl. 1986. - Vol. 548. P. 87-99.

108. Pelham H.R. Speculations on the functions of the major heat shock and glucose-regulated proteins // Cell. 1986. - Vol. 46. - N7 - P. 959-61.

109. Pirkkala L., Nykanen P. and Sistonen L. Roles of the heat shock transcription factors in regulation of the heat shock response and beyond // FASEB J.-2001.-Vol. 15,-N7,-P. 1118-31.

110. Puntschart A., Vogt M., Widmer H.R. et al. Hsp70 expression in human skeletal muscle after exercise // Acta Physiol Scand. 1996. — Vol. 157,-N4.-P. 411-7.

111. Rico-Sanz J., Frontera W.R., Mole P.A. et al. Dietary and performance assessment of elite soccer players during a period of intense training // Int J Sport Nutr. 1998. - Vol. 8. - N3,- P. 230-40.

112. Roti S., Iori E., Guiducci U. et al. Serum concentrations of myoglobin, creatine phosphokinase and lactic dehydrogenase after exercise in trained and untrained athletes // J Sports Med Phys Fitness. 1981. — Vol. 21. — N2,-P. 113-8.

113. Ryan A.J., Gisolfi C.V. and Moseley P.L. Synthesis of 70K stress protein by human leukocytes: effect of exercise in the heat // J Appl Physiol. 1991.-Vol. 70.-N1.-P. 466-71.

114. Salo D.C., Donovan C.M. and Davies K.J. HSP70 and other possible heat shock or oxidative stress proteins are induced in skeletal muscle, heart, and liver during exercise // Free Radic Biol Med. — 1991. — Vol. 11. N3,-P. 239-46.

115. Schlesinger M.J. Heat shock proteins: the search for functions // J Cell Biol. 1986.-Vol. 103,-N2,-P. 321-5.

116. Sharp F.R., Massa S.M. and Swanson R.A. Heat-shock protein protection // Trends Neurosci. 1999. - Vol. 22. - N3.- P. 97-9.

117. Shastry S., Toft D.O. and Joyner M.J. HSP70 and HSP90 expression in leucocytes after exercise in moderately trained humans // Acta Physiol Scand. 2002. - Vol. 175. - N2.- P. 139^6.

118. Shi Y., Mosser D.D. and Morimoto R.I. Molecular chaperones as HSFl-specific transcriptional repressors // Genes Dev. 1998. - Vol. 12. -N5.-P. 654-66.

119. Skidmore R, Gutierrez J.A., Guerriero V., Jr. et al. HSP70 induction during exercise and heat stress in rats: role of internal temperature // Am J Physiol. 1995. - Vol. 268. - N1 Pt 2,- P. R92-7.

120. Smith L.L. Acute inflammation: the underlying mechanism in delayed onset muscle soreness? // Med Sci Sports Exerc. — 1991. — Vol. 23. — N5.— P. 542-51.

121. Sondermann H., Becker Т., Mayhew M. et al. Characterization of a receptor for heat shock protein 70 on macrophages and monocytes // Biol Chem. 2000. - Vol. 381. - N12,- P. 1165-74.

122. Sonna L.A., Fujita J., Gaffin S.L. et al. Invited review: Effects of heat and cold stress on mammalian gene expression // J Appl Physiol. 2002. — Vol. 92.-N4.-P. 1725—42.

123. Sorichter S., Puschendorf B. and Mair J. .Skeletal muscle injury induced by eccentric muscle action: muscle proteins as markers of muscle fiber injury // Exerc Immunol Rev. — 1999. — Vol. 5. P. 5—21.

124. Sotiriadou S., Kyparos A., Mougios V. et al. Estrogen effect on some enzymes in female rats after downhill running // Physiol Res. 2003. — Vol. 52.-N6.-P. 743-8.

125. Srivastava P.K., Menoret A., Basu S. et al. Heat shock proteins come of age: primitive functions acquire new roles in an adaptive world // Immunity. 1998. - Vol. 8. - N6.- P. 657-65.

126. Struder H.K. and Weicker H. Physiology and pathophysiology of the serotonergic system and its implications on mental and physical performance. Part I // Int J Sports Med. 2001a. - Vol. 22. - N7.- P. 46781.

127. Struder H.K. and Weicker H. Physiology and pathophysiology of the serotonergic system and its implications on mental and physical performance. Part II // Int J Sports Med. 2001b. - Vol. 22. - N7.- P. 48297.

128. Sudhakar H.H. and Venkatesh D. Predator induced stress and its analgesic potential on estrous and anestrus albino rats // Indian J Physiol Pharmacol. 2001. - Vol. 45. - N2,- P. 227-32.

129. Tissieres A., Mitchell H.K. and Tracy U.M. Protein synthesis in salivary glands of Drosophila melanogaster: relation to chromosome puffs // J Mol Biol. 1974. - Vol. 84. - N3.- P. 389-98.

130. Tremblay M.S., Copeland J.L. and Van Helder W. Effect of training status and exercise mode on endogenous steroid hormones in men // J Appl Physiol. 2004. - Vol. 96. - N2,- P. 531-9.

131. Tsivitse S.K., McLoughlin T.J., Peterson J.M. et al. Downhill running in rats: influence on neutrophils, macrophages, and MyoD+ cells in skeletal muscle // Eur J Appl Physiol. 2003. - Vol. 90. - N5-6.- P. 633-8.

132. Udelsman R., Blake M.J., Stagg C.A. et al. Endocrine control of stress-induced heat shock protein 70 expression in vivo // Surgery. 1994. — Vol. 115.-N5.-P. 611-6.

133. Van Montfort R., Slingsby C. and Vierling E. Structure and function of the small heat shock protein/alpha-crystallin family of molecular chaperones // Adv Protein Chem. 2001. - Vol. 59. P. 105-56.

134. Varnier M., Sarto P., Martines D. et al. Effect of infusing branched-chain amino acid during incremental,exercise with reduced muscle glycogen content // Eur J Appl Physiol Occup Physiol. 1994. - Vol. 69. - N1- P. 26-31.

135. Venetianer A., Pirity M. and Hever-Szabo A. The function of heat-shock proteins in stress tolerance // Cell Biol Int. — 1994. — Vol. 18. N6.-P. 605-15.

136. Walsh R.C., Koukoulas I., Garnham A. et al. Exercise increases serum Hsp72 in humans // Cell Stress Chaperones. 2001. - Vol. 6. - N4.- P. 386-93.

137. Walters T.J., Ryan K.L., Tehrany M.R. et al. HSP70 expression in the CNS in response to exercise and heat stress in rats // J Appl Physiol. — 1998. -Vol. 84.-N4.-P. 1269-77.

138. Warden S.J. Prophylactic abuse and recommended use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) by athletes // Br J Sports Med.- 2009. Vol. -.

139. Wegele H., Muller L. and Buchner J. Hsp70 and Hsp90—a relay team for protein folding // Rev Physiol Biochem Pharmacol. 2004. — Vol. 151. P. 1—44.

140. Wegele H., Wandinger S.K., Schmid A.B. et al. Substrate transfer from the chaperone Hsp70 to Hsp90 // J Mol Biol. 2006. - Vol. 356. -N3.-P. 802-11.

141. Weiss S.J. Tissue destruction by neutrophils // N Engl J Med. 1989.- Vol. 320. N6.- P. 365-76.

142. Welch W.J. and Feramisco J.R. Purification of the major mammalian heat shock proteins // J Biol Chem. 1982. - Vol. 257. - N24.- P. 1494959.

143. Welsh F.A., Moyer D.J. and Harris V.A. Regional expression of heat shock protein-70 mRNA and c-fos mRNA following focal ischemia in rat brain// J Cereb Blood Flow Metab. 1992. - Vol. 12. -N2.-P. 204-12.

144. White C.N., Hightower L.E. and Schultz R.J. Variation in heat-shock proteins among species of desert fishes (Poeciliidae, Poeciliopsis) // Mol Biol Evol.- 1994. -Vol. 11.-N1.-P. 106-19.

145. Whitham M., Laing S.J., Jackson A. et al. Effect of exercise with and without a thermal clamp on the plasma heat shock protein 72 response // J Appl Physiol.-2007.-Vol. 103,-N4,-P. 1251-6.

146. Wolfe R.R., Wolfe M.H., Nadel E.R. et al. Isotopic determination of amino acid-urea interactions in exercise in humans // J Appl Physiol. — 1984.-Vol. 56.-N1.-P. 221-9.

147. Woodson J.C., Macintosh D., Fleshner M. et al. Emotion-induced amnesia in rats: working memory—specific impairment, corticosterone— memory correlation, and fear versus arousal effects on memory // Learn Mem. 2003. - Vol. 10. -N5.-P. 326-36.

148. Wright J.G., Fox D., Kerr J.C. et al. Rate of reperfusion blood flow modulates reperfusion injury in skeletal muscle // J Surg Res. 1988. — Vol. 44.-N6,-P. 754-63.

149. Xu Y. and Lindquist S. Heat-shock protein hsp90 governs the activity of pp60v-src kinase // Proc Natl Acad Sci USA.- 1993. Vol. 90. -N15,-P. 7074-8.

150. Yasuda K., Nakai A., Hatayama T. et al. Cloning and expression of murine high molecular mass heat shock proteins, HSP105 // J Biol Chem. — 1995. Vol. 270. - N50,- P. 29718-23.

151. Zhang X.S., Lue Y.H., Guo S.H. et al. Expression of HSP105 and HSP60 during germ cell apoptosis in the heat-treated testes of adult cynomolgus monkeys (macaca fascicularis) // Front Biosci. 2005. — Vol. 10. P. 3110-21.

152. Zou J., Salminen W.F., Roberts S.M. et al. Correlation between glutathione oxidation and trimerization of heat shock factor 1, an early step in stress induction of the Hsp response // Cell Stress Chaperones. 1998. — Vol.3.-N2.-P. 130-41.1.s1. Акт

153. Внедрения результатов научно-исследовательской работы» 200 £ г.

154. Внедрение результатов данной диссертационной работы позволило более точно оценить переносимость нагрузок средней интенсивности учащимися кафедры.

155. Зам. Заведующего кафедрой физического воспитания и спорта МГУ

156. Преподаватель кафедры физического воспитания и спорта МГУ1. Акт

157. Внедрения результатов научно-исследовательской работы2. ,г » A-o^S Cyajb200 g г.

158. Результаты данной работы позволили точнее оценить влияние нагрузок на антиоксидантную систему митохондрий.

159. Зав. кафедрой физиологии РГУФКСиТ доктор биологических наук, профессор1. Сонькин В.Д.y^f/^-c^S 0Ш