Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние минимальных доз леспефлана на течение острой почечной недостаточности у белых крыс (экспериментальное исследование)

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВОХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН А КМОЛИНСКПН ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

ГГ5 ОД

На правах рукописи

1 3 лая

МАКАЛКИНА Лариса Геннадиевна

ВЛИЯНИЕ МИНИМАЛЬНЫХ ДОЗ ЛЕСПЕФЛАНА НА ТЕЧЕНИЕ ОСТРОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ У БЕЛЫХ КРЫС

(экспериментальное исследование)

(14.00.25 - фармакология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации иа соискание учено» степени кандидата медицинских наук

Акмола

- 1996

Работа выполнена на кафедре фармакологии Акмолинского Госудаственного Медицинского института

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Доктор медицинских, наук, профессор Д.Д.Мухамбетов

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Доктор медицинских наук, профессор М.Н.Муснн Кандидат медицинских наук Н.К.Куттыбадамов

Ведущее учреждение: Карагандинский государственный медицинский институт

защита состоится " ЛШЯ- 1996г. в часов на заседании специализированного совета К 09.06 01 при Акмолинском государственном медицинском инстнт)те (473029, г.Акмола, ул.Делегатская, 95)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Акмолинского государственного медицинского института (г.Акмола, ул.Делегатская, 95)

Автореферат разослан Л4&&-- 1996г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук,

доцент ' Д.С.ТАЖИБАЕВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На рубеже второго тысячелетия, и пермод сформированного "гемо фармакологпкус" одной из, важнейших проблем медицинской науки является поиск естественных, экологически чистых и эффективных путей оздоровления населения (Ф.З.Меерсон, 1,989). С данной точки зрения, экспериментальное подтверждение эффективности применения минимальных или "физиологических" доз фитопрепаратов в лечении различных патологических состоянии может способствовать определению подходов к разрешению данного вопроса. Так как, с одной стороны, а лекарственных растениях оптимально сочетаются фармакологические эффекты бпофлавоноидов, аптноксидантов, витаминов, микроэлементов и других компонентов, а с другой - применение минимальных доз снижает фармакологическую нагрузку па организм (М.В.Блинков и соапт., 1990, Л.Х.Гаркавп, 1991, Ф.П.Крендаль и соавт.,1993, И.Г.Сокольчик и соапт., 1992, Н.Ю.Фролова и соавт.,1991).

Между тем, разрозненные единичные данные, , посвященные изученшо минимальных доз на организм человека и животных не позволяют отнести э ту область фармакологии к достаточно изученной. Все вышесказанное п определило направление наших исследовании. На модели сулемового нефрозо-нефрита мы изучили влияние минимальных доз леспефлана на функциональную активность почек, морфологические структуры тканей и некоторые механизмы неспешпрической резистентности организма. Выбор препарата обусловлен тем, что согласно литературным данным, препараты из различных видов леспедез("Леспефлан" и "Леспенефрил") обладают, наряду с выравженным гнпоазотемнчеекпм, диуретическим и противовоспалительным действием более широкой фармакологической активностью. В частности, выявлено гнпохолестерннемическое, гипотензивное, анаболическое действие леспедезы (В.Г.Гуляев, 1970-1989, В.Е.Соколоиа, 1979, Eibl J.et а 1., 1992). Исследованиями Е.Н.Амосовой и соавт.(1991) выявлена способность леспедезы двуцветной сдерживать метастазнрование опухолей, а М.В.Блинковым (1990) леспедеза двуцветная отнесена к"неспецнфнческнм стимуляторам метаболических реакций".

Однако, несмотря на существующие подходы к

объяснению механизма действия леспедезы имеется ряд неразрешенных вопросов - не определена тканевая тропность, не раскрыт характер адаптогенного действия, не изучена фармакологическая активность препарата их леспедезы в более высоких разведениях.

Целью настоящего исследования явилось изучение фармаколгической активности минимальных доз леспефлана у животных с острой почечной недостаточностью (ОПН). Для разрешения поставленной цели нам предстояло решить следующие задачи:

- изучить влияние минимальных доз леспефлана на функциональную активность почек и морфологические изменения в тканях у животных с острой почечной недостаточностью;

-определить характер адаптогенной активности биофлавоноидов леспефлана у животных с острой почечной недостаточностью;

-выявить тропность биофлавоноидов леспефлана к различным тканнц (почки, печень, миокард, эритроциты) и определить факторы, влияющие на устойчивость тполдисульфндной системы к действию двухлорнстой ртути.

Научная новизна. В настоящем исследовании впдниле была определена фармакологическая активность минимальных доз леспефлана у животных с острой почечной недостаточностью. Кроме того, нами получены новые данные о характере адаптогенного действия леспефлана, определена его тканевая тропность.

Практическая значимость работы. Полученные-нами данные о высокой гипоазотемической, диуретической и гистопротективной активности минимальных доз леспефлана могут служить экспериментальным"" обоснованием для возможности снижения средней терапевтической дозы и соответственно повышения доступности препарата для населения н снижения затрат на лечение больных с заболеваниями почек. Выявленные нами динамические изменения функционального состояния гуморальной тполдисульфндной системы и лейкоцитарной формулы периферической крови будут способствовать повышению адекватности оценки фармакологического действия леспефлана.Обнаруженное нами адаптогенное действие препарата может бытыгепользовано дая

коррекции стрессорных нарушений при различных патологических состояниях.

Внедрение результатов исследования. На основе полученных нами данных об эффективности минимальных доз леспефлана в лечении почечной недостаточности В.Г.Гуляевым п соавт.(1992) создан и запатентован безалкогольный лечебно-профилактический напиток "Леспп" (N930345.1),который рекомендован к широкому применению. Полученные результаты исследования могут быть использованы в процессе обучения студентов по курсу общей н клинической фармакологии.

Положения выносимые на защиту.

1. Лечебно-профилактическое применение минимальных доз леспефлана оказало положительное влияние на течение острой почечнойнедостаточности. Эта проявилось достоверным снижением уровня мочешшыв плазме кропи, стимуляцией ;щ}реза и клиренса мочевины, снижением количества ртути в почечной ткани и ограничением морфологических нарушений в тканях, вызванных действием двухлористой ртути.

2. Адаптогенная активность леспефлана проявилась в восстановлении функционального состояния тканевой и гуморальной тнолднеульфпднон системы, стабилизации процессов перекисного окисления липидов, нормализацией лейкоцитарной формулы периферической крови и иммуностимулирующей активностью. Обнаружено сдерживание гипертрофии надпочечников и повышение уровня окнелительно-восстановнтельныхреакцнй тиоловых групп в них у животных с ОПН, получивших леспефлан.

3.Биофлавоноиды леспефлана обладают наибольшим сродством к почечной ткани, особенно к проксимальным канальцам нефронов, наименьшим - к эритроцитам. На печень и миокард препарат оказывает умеренное действне.К факторам, повышающим устойчивость тканей к действию двухлористойртути можно отнести высокую буферную емкость тиолдисульфнднон системы (ТДС). • 5

Апробация работы. По материалам диссертации сделаны доклады с публикацией тезисов на конференции молодых ученых

ЦГМИ и железной дорога (Цслшкм-рад, 1991 г.), 2-й всесоюзной копференции"ф<армакологнческая коррекция гипокснческнх состояний" (Гродно, 1991г.), международной конференции "Нейрофармакология на рубеже двухтысячетелетнй" (Санкт-Петербург,! 993 г.), республиканской-научной конференции "Актуальные проблемы технологии производства, переработки лекарственного , растительного сырья и получения фитопрепаратов"(Карагапда,1993 г.), международной научной конференции '"Ученпе.В.И.Вернадского и современная экологическая снтуация"(Акмола-Боровое, 1993г.),

международной научно-практической конференции "Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и сельского хозянства"(Степн.огорск', 1995г.). По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ и запатентовано I изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 146 листах машинописного текста п состоит из введения, обзора литературы,описания методов исследования, 2-х глав собственных исследований,заключения и выводов. Текст1 иллюстрирован 14 таблицами, 14 рисунками и9 мшерофотографнямн. Список литературы содержит 203 автора из них 151 отечественных и 52 зарубежных автора.

Материалы н методы исследования. В настоящей работе былииспользованы 233 белых беспородных крысы, обоего пола, массой 160-200гг. Острую почечную недостаточность вызывали моделированием сулемового нефрозо-нефрита по методу 1.Вегеят1ауе( а1. (1980). Внутрибрюшинно вводили 0,1%раствор двухлористой ртути в дозе 2 мг/кг массы тела.Было применено однократное введение.

Лля лечения животных с ОПН был использован препарат "Леспефлан" в минимальных и средних терапевтических дозах.

Препарат "Леспефлан" представляет собой водно-спиртовой экстракт из леспедезы двуцветному из семейства бобовых. Активной частью леспефлана являются входящие в его состав биофлавоноиды: леспедцн, кемпефрол, кверцетин, робоннн, астрагалин, гиперзид и другие (Гуляев В.Г. 1989).

Режимы дозирования. 1.Ведение минимальных доз. Для скриннннг-исследования, животным с ОПН вводился'раствор

леспефлана в разведениях 1:10, 1:20, 1:50, 1:80, 1:100, 1:200 1 раз в сутки зондовым методом. Для дальнейшего исследования было применено разведение леспефлана 1:100 (суточная доза составила 0,02 мг/кгмассы тела). Для превентивного введения использовали раствор леспефлана в количестве 0,5 мл/ЮОг массы тела,после затравки животных ртутыо количество вводимого препарата было увеличено до 1мл/100г массы тела.

2.Применение средних терапевтических доз проводили согласно данным литературы (Гуляев В.Г,.,1989). Суточная доза составила 2 мг/кг массы тела.

Животным с ОПН, не получавшим лечения .вводили дистиллированную воду в адекватном к применяемой схеме количестве.

Методы исследования.

Оценку влияния минимальных доз леспефлана на функциональную активность почек у животных с ОПН мы проводили с помощью определения уровня мочевины в плазме и моче, клиренса мочевины, диуреза и уровня общих сульфпгндрнльных и днсульфпдпых групп в моче. Кроме того, было определено содержание ртути в обеихпочках у животных с ОПН и в процессе лечения.

Для выявления антнстрессорной активности леспефлана мы изучили функциональное состояние тканевой п гуморальной тнолднсульфидноп системы, динамические изменения лейкоцетарпой формулы периферической крови, уровень малонового днальдегида в плазме крови, массу надпочечников п уровень окислитель-восстановительных реакции тиоловых 1рупп в них. Также было использовано определение уровня Т- п В-лимфоцптов п содержания циркулирующих нммуных комплексов в периферической крови.

Для выявления тканевой тропности бнофлавонопдо» леспефлана мы провели сравнительную оценку изменении функционального состояния тнолднсульфидноп системы, морфологических нарушений в тканях и некоторых физико-химических свойств эритроцитов.

Изучение диуретической способности животных при ОПН и в процессе лечения проводилось нами по методу Ю.И.Иванова (1988). Определите уровня мочевины в плазме п моче проводили стандартизированным методом с помощью наборов "Бно-ла-гест" мочевина (производство ЧСФР) на фотоколориметре

OMKA IV-01. Исследуемые показатели изучались нами у ннтактпых животных, после превентивного введения раствора леспефлана здоровым животным и на 1-е, 3-е, 5-е, 7-е, 9-е ц 11-е сутки течения ОПН.

Для морфологического изучения фармакологической активности минимальных доз леспефлана в отношении органной и тканевой структуры почек,печени и миокарда животных на 14-е сутки течения ОПН выводили из эксперимента декапптацпен под легким эфирным наркозом. Кусочки тканей фиксировали в 12% нейтральном формалине, ^жидкостях Буэна и Карнуа. Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм. окрашивали гематокенлнн-эозпном и исследовали с помощью светового микроскопа "Loboval - 4"(Андреев В.П.,1984, Шпманко И.И.,1977).

Определение ртути в тканях проводили на 14-е сутки течения ОПН по методу А.Н.Крыловой (1975). Метод основан на разрушении форменных элементов тканей - деструкцией п определения содержания ртути экстракцнопно-к'олорнметрическнм методом по днтпзонату ртути. Исследование было проведено на фотоколориметре ФЭК-56М."

Определение уровня сульфгндрильных и днеульфндных групп в белковых и небелковых фракциях биологических субстратов проводили непрямым амперометрическнм титрованием по методу В.В.Соколовского и соавт.(1977).'В нашей работе изучались паказатели ТДС тканей (почки,печень, миокард, надпочечники), крови ( гемолнзат крови и взвеси эритроцитов), мочи. Функциональное состояние ТДС крови и мочи изучали после превентивного введения препарата и на 1-е, 3-е, 5-е, 7-е, 9-е и 11-е сутки течения ОПН. Определение содержания тиолов и дисульфидов в тканях проводили в течении II суток ОПН, выводя животных из эксперимента путем декапитацип.

В качестве маркера интенсивности перекненого окисления липидов (ПОЛ), было использовано определение уровня малонового диальдегида (МДА) а плазме крови. Определение уровня МДА проводилось в модификации Л.И.Андреевои и Л.Б.Кожемякина (1988) на спектрофотометре СФ-46.

Подсчет общего количества лейкоцитов проводили унифицированным способом по методу И.А.Грибовой (1979) с

использованием микроскопа и камеры Горяева. Лейкоцетарную

N

формулу подсчитывали в окрашенных по Романовскому-Гимзе мазках крови по методу Р.П.Золотницкой (1983).Данные показатели были изучены на 3-й, 7-е и 14-е сутки течения ОПН.

Определение "содержания Т- и В- лимфоцитов в периферической крови проводили с помощью реакции Е-РОК и ЕАС-РОК по методу Eggers У.Дгизе Н., 1979 е! Рпеше1 Н., 1987, Количество циркулирующих иммунных комплексов определяли в модификации Ю.А.Грнневнча и А.Н.Алдярова (1981).

Осмотическую резистентность эритроцитов определяли с использованием модификации Л.И.Идельсона (1974). После построения варнционных кривых гемолиза эритроцитов, определяли следующие показатели: среднюю клеточную хрупкость, амплитуду резистентности и золу резистентности эритроцитов. 4

Определение типа адаптационных реакции по степени напряжения окнслшельно-восстаношггельныхреакннй тноловых групп основано на концепции В.В.Соколовского (1988) о роли тноловых групп в механизмах ¡[«специфической резистентности организма: и запантентован намн.Сущностьспособа: при значениях тиол-дисульфидного коэффициента ТДК меньше 2,4 реакция адаптации расценивается как стрессовая, при колебаниях ТДК в биологических жидкостях от 2,5 до 6,0 - нормальная реакция адаптации, при преобладании значений ТДК выше 6,1 отмечается реакция переактивации, отражающая высокое напряжение окислитель-восстановительных процессов в организме.

Статистическая обработка данных проводилась по специальным программам на микрокалькуляторе "Электроника МК-56" (Иванов Ю.И.., Погорешок О.Н., 1990) И на ЭВМ "Искра 1031". Изучались следующие показатели: средняя арифметическая величина и ее стандартная "ошибка, оценивалась достоверность различий показателей с помощью коэффициента Стыодента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В результате скриннинг-исследования растворов леспефлана вразведеннях 1:10, 1:20,1:50, 1:80, 1:100 и 1:200 было обнаружено, что на 3-й сутан течения ОПН у животных опытной группы большенство исследуемых показателей были достоверно различны в сравнении с контролем - снижались смертность и

уровень мочевины в плазме крови, повышался диурез и уровень общих сульфгидрильных групп в крови. Однако, формакологическая активность используемых разведения оказалась не одинаковой. Наибольшей активностью обладали растворы леспефлана вразведениях 1:10, 1:80, 1:100. Для дальнейшего изучения нами было выбрано разведение 1:100, т.к. в данном разведении смертность животных снижалась до 10 % (при ОПН - 30 %), повышался диурез до 1,68± 0,15 мл. за 4 часа (100 г массы тела ) при ОПН - 0,86 ±0,14), снижался уровень мочевины в плазме крови до 3,44 ±0,15 мкМ/л - при ОПН 5,50 ±мкМ/л, а содержание сульфгндрильных групп в крови составило 18,11± 0,87 мМ/л -при ОПН 13,00+ 1,23 мМ/л.

Превенитвное, в течении 2-х недель введение раствора леспефлана в разведешш 1:100 не оказало значительного влияния на функциональную активность почек здоровых животных. Тнолдисульфндная система крови реагировала на введение раствора леспефлана повышением уровня белковых и небелковых сульфгидрильных групп и коэффициента БН/БЗ. Между'тем, повышение функциональной активности гуморальной тнолдисульфидной системы может оказать двоякое действие на течение ОПН. Так как, с одной стороны, повышение буферной емкости ТДС может повысить устойчивость животных к действию двухлористой ртути, а с другой - стимуляция окислительно-восстановительных процессов тиоловых групп может явиться фактором усугубляющим течение ОПН. Так, исследованиями Н.Д.Воробьевой (1990) было выявлено, что предварительная стимуляция синтетических процессов в клетках путем введения метплш[дростепдиода усугубляло ншемические нарушения в почках и полностью устраняло защитное действие преднизалона.

Для разрешения данного вопроса, животным, предварительно получавшим раствор леспефлана, была введена дву,хлористая ртуть и на фоне продолжавшегося лечения были изучены показатели функциональной активности почек на 1-е, 3-е, 5-е, 7-е, 9-е н 11-е сутки течения ОПН.Даиные представлены в таблице 1. В результате исследования было выявлено, что во все исследуемые сроки достоверно снижался уровень мочевины в плазме крови, стимулировался диурез и выведение мочевины с мочой, снизился уровень общих сульфгидрильных групп в моче. Причем, наибольшая стимуляция диуретической способности

Л О

животных наблюдалась на 1-е сутки течения ОПН, диурез опытных животных составил 2,02 ±0,34 мл за 4 часа/100 г массы тела. Снизилось содержание ртути в почечной ткани с 0,16 ±0,02 мг/100 г в контроле до 0,07 ±0, 001 мг/ 100 г массы почек ( р < 0,001) у опытных животных.

Также была обнаружена значительная гистопроективная активность раствора леспефлана у животных с ОПН. Исследуемые ткани были взяты на 14-е сутки течения ОПН. Так, в почках, на фоне токсического некроза, вызванного двухлорнстой ртутью, явтения интерстицнального отека и венозного полнокровия выражены в значительно меньшей степени в сравнении с контролем. В особенности, протективное действие раствора леспефлана проявилось по отношению к эпителию проксимальных отделов нефрона, избирательно поражающихся при ртутных интоксикациях и пребывающих в состоянии экскреторного повреждения ( Шнманко И.И., 1977, Пермяков Н.К. и соавт., 1982, Андреев В.П., 1984 ).

Кроме того, в неповрежденных канальцах нефронов были обнаружены митотнческие клетки, клетки с гигантскими ядрами и даже'подобня многоядерных образований, что можно расценивать как проявление адаптационно-приспособительных н регенераторных механизмов канальцевого эпителия (Саркисов Д.С. и соавт.,. 1990). Полученные результаты согласуются с исследованиями Z.Pushalsky et.al.( 1966), которыми было обнаружено, что свое лечебное действие леспедеза оказывает только при наличии соответствующего обьма активной почечной паренхимы.

В печени п миокарде опытных крыс признаки острой токсической дистрофии выражены значительно слабее в сравнении с контролем. Отмечены также явления, свидетельствующие об активности регенераторных процессов в данных тканях.

При сравнительной оценке влияния леспефлана на тканевую тнолднсульфндную систему было выявлено, что он оказывает универсальное защитное влияние на тканевые тнолы ( данные представлены в табл.2). Это действие проявилось повышением уровня белковых н небелковых сульфгндрильных групп почек, печени, миокарда и эритроцитов. Эритроциты были включены в тканевую ТДС в связи с тем, что кровь является по существу "жидкой тканыо ". Кроме того, некоторые

исследователи ( Голиков С.Н. и соавт., 1986, Жмуров В.А. И СОАВТ., 1987) предлагают использовать эритроциты в качестве "мембранной" модели для оценки действия различных препаратов.

Повышение уровня сульфгпдрпльных групп в крови и тканях у животных с ОПН под влиянием леспефлана может быть объяснено рядом свойств, присущих бпофлавоиоидам, " входящнхм в состав препарата. -

Во- первых, обнаруженное нами снижение количества ртути в почечной ткани опытных животных, будет являться важным патогенетическим фактором в течении сулемовой модели ОПН, т.к. общепризнанно мнение о ртути как "тиоловым" яде (Борнсенко Н.Ф., 1984, Трахтепбнрг И.М., 1989 и др.).

Во-вторых, стимуляция раствором леспефлана диуретической и гипоазотемической функций почек вызывает снижение в крови продукт он белкового метаболизма, фенолов, "средних молекул" и других веществ, оказывающих общее токсическое действие на организм при ОПН ( Гуляев В.Г.,1989, Соколова В.Е.,1979, Ненмарк А.И., 1992, Hudson В. et al., 1983, Cameron I., 1986 и др.)

В-третьих, антиоксидантные н антнгппоксптныесвойства, присущие биофлавоноидам, благодаря наличию активного протона водорода в их структуре, будут способствовать -очищению крови и тканей от свободных радикалов и эндоперекисей. Тем самым обеспечивается восстановление активности тноловых групп (Кухта В.К., 1992, Мелышчук Г.В., 1988,Пашинский В.Г и соавт., 1991, Скакун Н.П., 1991, Adanasev . I.B., 1990, Bast A.elal., 1991, Middlielon E., 1984, SpeishyH.et. a!. 1991 и др.).

^В-четвертых, повышение уровня белковых сульфгпдрпльных групп в тканях может быть связано с перераспределением энергии в клетке в сторону мембранных структур н активацией генетического аппарата клеток. Так, работами К.В.Катаева (1977), Д.А.Рыкова и соавт.(1992) обнаружена взаимосвязь между уровнем сульфгидрильных групп и содержанием АТФ, а об анаболическом эффекте леспедезы известно из работ В.Е.Соколовой (1979).

Межу тем, положительное влияние раствора леспефлана на ТДС животных с ОПН, не ограничивается повышением уровня сульфгидрильных групп. Нами было обнаружено повышение

уровня дисульфидных групп и тиол-дисульфидного коэффициента в белковой и небелковой фракциях крови, почек, печени, миокарда опытных животных (см. таб.2). Это является немаловажным фактом, т.к. согласно литературным данным, достаточный пул дисульфидных групп повышает буферную емкость ТДС, являясь субстратом для восстановления тиоловых групп в биологических субстратах (Войткевич В.Т. и соавт., 1992, Воскресенский О.Н.'и соавт., 1982). С другой стороны, дасульфидные группы выполняют роль связывающих "мостиков" в структуре белков, некоторых гормонов (инсулин, СТГ и др.), в связи, с чем, компенсаторное снижение их уровня при экстремальном воздействии будет являться "ценой адаптации" ( Айрапетянц М.Т. Исоавт., 1988, Меерсон Ф.3.,1988,Торчинский Ю.М.,1977 и др.).

Как было отмечено выше, минимальные дозы леспефлана оказывают нормализующее влияние на функциональное состояние тканевой ТДС животных с ОПН. Между тем, сила защитного эффекта на тканевыетиола неравнозначна - в почках после введения препарата уровень белковых сульфгидрильных групп оказался даже выше исходного на 58,22%, в печени - на 16,67°о, а в эритроцитах была отмечена лишь тенденция к восстановлению уровня сульфгидрильных групп.

Неполное восстановление функционального состояния ТДС эритроцитов сопровождалась снижением осмотической • резистентности эритроцитов на 14-е супси течения ОПН - средняя клеточная хрупкость составила 0,49 +-0,01% МаСЬ, исходное состояние - 0,42+-0,01% ИаСЬ (р<0,05), увеличилась амплитуда резистентности и уменьшилась зона резистентности в сравнении с исходным состоянием. Однако, достоверное, в сравнении с контролем, сдерживание снижения осмотической резистентности эритроцитов на 1-е сутки течения ОПН и отсутствие 2-го пика гемолиза на 14-е сутки течения ОПН у животных, опытной группы свидетельствуют об умеренной протективной акивности раствора леспефлана на мембраны эритроцитов. Вероятно, недостаточное действие леспефлана на эритроциты является общей тенденцией в действии биофлавоноидов. Исследованиями Л.В.Иванова и соавт.(1987) в результате изучения ряда флавоноидов растительного происхождения на структурное состояние биомембран артерией, вен и эритроцитов было обнаружено избирательное действие на сосуды и незначительное их влияние

13 г

на эритроциты.

Таким образом, резюмируя полученные нами данные о влиянии леспефлана на морфологические структуры тканей: функциональное состояние ТДС почек, печени, миокарда, эритроцитов; осмотическую резистентность эритроцитов у животных с ОПН, можно отметить, что наибольшей тропносгыо бнофлавоноиды леспефлана обладают к почечной ткани, наименьшей к эритроцитам. На печень и миокард препарат оказывает умеренное действие.

В связи с тем, что леспедеза двуцветная, по данным Амосовой и соавт.(1991), И.Л. Блинкова и соавт. (1990) обладает способностью стимулировать адаптационные реакции организма мы изучили влияние минимальных доз леспефлана на некоторые -механизмы антнстрессорной защиты организма у животных с ОПН. Изучение динамических изменений функционального состояния гуморальной ТДС показало, что у животных с ОПН, получавших минимальные дозы леспефлана наблюдались волнообразные изменения показателей на 1-е, 3-е, 5-е, 7-е, 9-е и 11-е сутки ОПН. Причем, конфигурация графического изображения колебаний уровня белковых сульфгндгндрнльных П)упп коэффициента БНЛЗЗ повторяла таковую у животных с ОПН. Отличительными особенностями явились достоверно более высокий уровень сульгцдрлльпых групп во все исследуемые сроки н смещение реакции переактивации окислительно-восстановительных процессов с 3-х суток ( у животных с ОПН) на 1-е сутки течения ОПН. Кроме того, повышение напряжения окислнтелыю-восстановнтельпых процессов ( коэффициент БН^Б составил 6,49±0,47) на 1-е сутки течения ОПН у животных опытной группы сменилось повышением уровня сульгндрильных групп, а у животных с ОПН явления перенапряжения окислительно-восстановительных процессов на 3-сутки течения ОПН (коэффициент 8Н\Б8 составил 7,20±1,01) сменилось истощением компенсаторных возможностей ТДС на 5-е сутки течения ОПН-рсзко снизился уровень белковых сульгндрильных группл

Динамика изменений гуморальной ТДС у животных с ОПН, получавших средине терапевтические дозы была несколько иной - наблюдалась стабильная активация окислительно-восстановительных процессов во все исследуемые сроки. Однако, более оптимальным, по нашему мнешно, является применение

именно минимальных доз, так как, во-первых, волнообразное действие минимальных доз наслаиваясь на "колебательную" систему патологического процесса не угнетает собственных приспособительных механизмов организма, а наоборот, повышает их, и, во-вторых, энергетически более экономными являются реакции организма на минимальные радражнтели (Гаркави JI.X. 1969-1991, Квакина Е.Б., Уколова М.А., 1990, и др.).

Учитывая работы Г.Селье (1960) и его школы, общепризнанными "маркерами" стресса являются эозино- и лнмфопшия периферической крови. В связи с чем, изменения ленкоцнтарнойформулы у животных с ОПН, получавших леспефлан в минимальной и средней терапевтической дозе оказались, на первый взгляд, неблагоприятными. Так, у животных с ОПН, получавших раствор леспефлана на 3-е сутки течения ОПН, потенцннровалась лпмфо- и эозннопения в сравнении с контрольной группой, 7-е сутки течения ОПН, характеризовались лпмфоцитозом, а к 14-м суткам наблюдалось восстановление лейкоцитарной формулы. При использовании сродней терапевтической дозы наблюдалась та же тенденция, но в несколько меньшей степени (табл.3) Казалось бы, парадоксальная ситуация - введение лекарственного средства, обладающего адаптогенными свойствами, вызывает более выраженную стресс-реакцию в сравнении с животными, не получавшими лечения. Между тем, целенаправленное изучение литературных данных показало, что подобными свойствами обладают хорошо известные ядаптогены. В частности, A.B. Лупандпным (1991) выявлено, что экстракт лимонника китайского усиливал у крыс эозпнопс'ншо, возникшую на введении адреналина и стрессе, вызванном иммобилизацией. Результаты нашего исследования согласуются с данными В.Псткова (1986), согласно которым введение белым крысам жены пеня перед прессовым воздействием также потеицннровало у животных эозниопенпю и повышение экскреции глюкокортикопдов при незначительной их гипертрофии и повышения в них холестерина и аскорбиновой кислоты.

Таким образом, динамические изменения лейкоцитарной формулы под влиянием леспефлана можно трактовать как первоначальное стимулирование стресс-реакции и соответственно гппоталамо-гипофпзарно-падпочечнпковоп

системы, с последующей активацией и нормализацией адаптационныхпроцессов(ГаркавнЛ.Х., 1991 Горизонтов П.Д. исоав., лупандин А.Ъ., 1УУ1, меерсон Ф.З., 1989.).

Это также подтверждается достоверно меньшей гипертрофией надпочечников у животных, получавших леспефлан в сравнении с контрольной группой - 27,81±1,56 мг/ 100 г массы тела (опытные животные), 38,30±2,38 мг/100 г массы тела (животные с ОПН), 13,20± 1,15 мг/100 г массы тела (интактные животные). Кроме того, в надпочечниках увеличилось колическтво белковых и небелковых сульгидрильных групп (р<0,05), увеличился коэффициент ЗН/ББ. Полученные нами данные согласуются с исследованиями А.Г.Шлейкина и соавт. (1990), подтверждающими тесную взаимосвязь функционального состояния ТДС и уровня аскорбиновой кислоты с функциональной активностью надпочечников.

Проявлением стимуляции адаптационных процессов явилось обнаруженное нами повышение количества Т- и В-лимфоцитов на 7-е и 14-е супси течения у животных с ОПН, полу чавших раствор леспефлана. Причем уровень В-лимфоцнтов на 14-е сутки течения ОПН даже превышал исходный (р<0,001) -6,15+ 0,61 х109/л (опытная группа), 4,39± 0,25 х10'/л (животные с ОПН) и 2,38±0,ЗВх10'/л (интактные животные). Между тем, снижение количества циркулирующих иммунных комплексов более чем в 2 раза у опытных животных, в сравнении с контрольной группой , где наблюдалась обратная тенденция, является признаком снижения антигенной стимуляции активности Е- иммунной системы (• Борисенко Н.Ф., "1973, ^ Ситникова В.П и соавт., 1991, Чекановская Л.А. и соавт., 1991 и ДР-)

Согласно временным представлениям, ведущим моментом в лимитировании активноститипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой и иммунной систем является состояние клеточного метаболизма и мембранных систем клетки. В связи с чем, обнаруженная нами мембранностабилизирующая и гистопротективная активность биофлавоноидов леспефлана вносит значительный вклад в стабилизацию стресс-лимнтирующих систем организма животных с ОПН. Проявлением мембранностабилнзируюшей активности леспефлана, наряду с повышением уровня сульгидрильныхгрупп

в тканях явилось и снижение продукта перекисного окисления липидов - малонового днальдегнда в плазме крови на 14-сутки течения ОПН, ввиду общепризнанного мнения о ведущей роли активации ПОЛ в мембраннодестабилнзирующих процессах (Анрапетянц М.Г. н соавт., 1988, Бнленко М.В. н соавт., 1983, Бобырев В.Н.н соавт., Денисенко П.П., 1993, Жмуров В.А., 1988, Bast A. et.al. 1991, Bastians Н.М. ct.al. 1990, Halliwell В., 1991 и др)

Между тем, некоторыми авторами (Kichore B.K.et.al.,1983) МДА расцентвается как уремический токсин и снижение его уровня связано с восстановлением функциональной активности почек.

Таким образом, минимальные дозы бнофлавонондов леспефлана оказали значительное влияние на течение острой почечной недостаточности, вызывая как специфическое влияние на мочсвыделнтельпуго систему, так и модулируя стрессовые повреждения, вызванные двухлорнстой ртутыо.

Таблица 1

Влияние мшшмальных доз леепефлана на функциональную активность почек при ОПН,

Исследуемые показатели И-(Ю) К-(ЗЗ) 0-(34)

Мочевина мМ/л плазма 3,58±0,Ю 6,70+0,30 * 3,73+0,08*

моча 457,20±38,5 432,52±41,5? 582,77+36,42 Ые

клиренс мл/мин 47,38±7,31 22,81+2,82* .56,32+3,18"

диурез мл/4 ч. 100 г массы тела 1,13±0,28 0,61+0,06 * 1,43+0,21.*

Общие тиоловые группы мочи мМ/л

БН-группы 0,15+0,03 0,31+0,12* 0,13+0,02*

ЗЭ-группы 0,09±0,02 0,21 ±0,09 * 0,09+0,02*

коэффициент БН/ББ 1,86±0,21 - 4,21±1,19* 2,18+0,21 *

Примечание:

И-шггактные животные

К-контрольная группа, животные с ОПН.

О-опытная группа, животные с ОПН, полу чавшие раствор

леепефлана в разведепшI 1:100 в количестве .1 мл/100 г массы

тела *-р<0,05, **-р<0,001

Таблица 2

Влияние леспефлана на тканевую тиолднеульфидиуго систему при экзотокснческон форме ОПН.

исслед. группы бел ковая Ч асть небе. жовая ч асть

БН- -БЗ- -ЗН/ББ БН- -ББ- ' БН/ББ

почки мМ/100 г

И- 21,3611,61 8.0211.13 3,2210,52 9,1311.57 2.34Ю.83 7,2512,78

К- 19,85±1,42 4,8511.29 6,5511,62 ' 4,63±1,11 * 1,1710,34 5,61±1,43

0- 33.75t3.72 ' 10,6212,28 • 4,0410.65 7,3711,50 ' 2,3810,61 5.43И.22

печень мМЛОО г X

И- 30,0913,66 7,35±1.16 4,7910.56 11,6512,81 1,4210,25 8,1812,62

К- 27,2812,01 9,5112,42 4,11±1,01 3,7810,89 • 0,7110,05 • , 5.62И.48 •

0- 35,00±1,47 ' 9,0611,37 4,3810,56 6,9511,17 ' 2,8110,76 • 3,0810,57

миокард мМ/100 г

И- 17.00t1.32 8,1911,24 3,0610,71 6,3512,23 2,2510,67 4,0210,78

к- 14.51iO.S5 5,0011,20 5,4512,16 2,6110,54 0,87±0,31 3,8310,53

0- 17.37t1.85 6,0310,78 3,1010,37 3,3610,61 1,5110.58 4,13±1,06

эритроциты мМ/л

и- 54,6042,23 8.4111,14 9,3112,24 9.9813,15 1,3310,23 7,7912,21

к- 36,50±1,80 " 6,9912,14 • 3,31 ±0,91 • 1,1210,14 • 0,7910,15 2,9310,55 '

0- 42,37±3,63 11.5111,17 4,04 ±0,81 1,9910,77 0,89Ю,18 2,2510,51

Примечание: И-ингактные, К-животные с ОПН,

О-жнвотные с ОПН, получавшие леспефлан в" дозе 0,02 мг/кг массы тела *-р<0,05, **-р<0,001

Таблица 3

Влияние лсспсфлаиа на динамику изменений лейкоцитарном формулы периферической крови при ОПН

иссл. групп п исслед. пок-ль Ф зрменн ые эле! ¿енты ( И) Общее количество

П с э м Л лейкоцитов хЮ/л

и- 10 М±м 1,5±0,5 30.67±3.58 4,6710,66 2.7110,99 62.56l3.69 8,5110,09

к- 8 М1м .1.0 38,7414,70 3,33±0,64 2,4010,67 56.22i4.63 10,5910,85'

.01- 9 М±м .2.0 62.75±2,12" 2,5010,56 2,8810,36 36,5514,50* 10,1211,54'

.011- 9 М1М - 43,1215,86* 2,28±0,52 2.2510,36 48,8613,08' 9,5810,96'

к- 7 М1м ' 31.11*3,41 2,2410,48 3,3310,83 65.6613,12 9.6710,14*

.01- 9 М1м 3,00И,5 23,7712,84 3,7110,36 2,0010,41 69,7512,91 10,0110,08*

.011- 9 М1м 1,8010,3 26.00i2.20 4,5010,26 3,5710,75 66,4512.99 9,7310,15*

к- 7 М±м - 26,2211,65 1.16*0,17* 1.33Ю.21 72,8811,83* 9,5310,15*

01- 9 М1м 1,5010.5 29.22t1.07! 5,6611,35" 3,1110,35* 61.12i1.91* 8,5910,08

.011- 9 М±м 2.00±1,0 31,0013.30! 4,0010,бо- 2,2110,73 63,1113,21* 8,6510,14

Примечание:

п-палочкоядерные нейтроф!шы, с- сегментояддшыенейтрофнлы, э-эозинофилы, л-лимфоцнты. И-нсходное состояние, К-контролымя группа,

01- животные с ОПН, получавшие раствор леспефлана в количестве 1 мл/100 г массы тела,

011 - животные с ОПН, получавшие леспефлаи в дозе 2 мг/кг массы тела *-р< 0,05, **- р< 0,001

выводы

1. Профилактическое применение минимальных доз леспефлана

здоровым животным не оказало дестабилизирующего влияния на функциональную активность почек и гуморальную тполднсульфидную систему. Положительным моментом превентивной фармакологической подготовки животных явилось повышение буферной емкости тиолдисульфндиой системы крови: повысился тнолднсульфндный коэффициент и уровень белковых и небелковых сульгидрильных пэупп.

2. Применение минимальных доз леспефлана способствовало восстановлению функционирования почек: усилился диурез и выведение мочевины с мочой, снизился уровень мочевины в плазме крови и количество общих сульгндрнльных групп в моче. Снизилось соддэжлиие ртути в почечной ткани опытных животных, что явилось важным патогенетическим фактором в реализации фармакологического действия минимальных доз леспефлана.

3. Раствор леспефлана в разведении 1:100 проявил значительную

гистопротектнвную активность у животных с острой почечной недостаточностью. Уменьшились явления токсического некроза, пнтерстицнального отека и венозного полнокровия в почках, в неповрежденных канальцах нефронов активизировались адаптационно-приспособнтельные и регенераторные процессы. Морфолгнческая картина печени и почек также характеризовалась более сохранной гистологической структурой и стимуляцией репаративных процессов в сравнении с контролем.

4. Тканевые и гуморальные тнолы животных с острой почечной

недостаточностью реагировали на введение минимальных доз ' леспефлана повышением уровня белковых и небелковых сульгндрнльных групп и нормализацией тнол-днеулъфндаого коэффициента.

5. Антнстрессорна и мембраностабилнзирутощая активность

леспефлана проявляется в нормализации функционального состояния" тиолодисульфидной системы, состава лейкоцитарной формулы периферической крови, уровня малонового диальдегида в плазме крови; сдерживанием гипертрофии надпочечников у животных с острой почечной недостаточностью. Кроме того, нами была обнаружена

умеренная иммуностимулирующая активность аппарата. 6. Наибольшей тропностью биофлавоноиды леспефлана

обладают к почечной ткани, особенно к проксимальным канальцам нефронов, наименьшей - к эритроцитам. Неполное восстановленне пула эритроцитарных тнолов под влиянием леспефлана сопровождалось снижением осмотической резистентности эритроцитов. На печень и миокард препарат оказывает умеренное действие. К факторам, повышающим устойчивость животных к действию двухлористой ртути можно отнести высокую емкость тиолднсульфидной системы.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Гуляев В.Г., Макалкина Л.Г., Задонцев В.Ф., Зубович Л.А., Тканевой тиолднсульфпдный обмен при острой недостаточности и его коррекция бпофлавоноидом леспефланом/ /Сб."Терминальные и экстремальные состояния в эксперименте п клинике", Алма-Ата, 1991, с.68-74.

2. Макалкина Л.Г., Гуляев П.В. Влияние антигипоксантов па функцию почек при острой почечной нсдостаточностп//Тезисы материалов 2-й всесоюзной конференции "Фармакологическая коррекция гнпоксических состояний ", Гродно, 1991, ч.2, с.251

3. Гуляев В.Г., Макалкина Л.Г., Гуляева С.Ф., Зубович Л.А. Влияние минимальных доз леспефлана па течении экзотокснчсской нефропатпп//Сб. "Физиология и патология экстремальных и терминальных состояний ", Алма-Ата, 1992, с.33-37

4. Гуляев В.Г,, Денисенко П.П., Гуляева С.Ф., Макалкина Л.Г., Гуляев П.В. К механизму действия нового отечественного препарата леспефлана при лечении почечных заболеваний в эксперименте н клинике // Тезисы международной конф. "Нспрофармакологня на рубеже двух тясячелетнй", Санкт-Петербург, 1992, с.46

5. Мухамбетов Д.Д, Макалкина Л.Г., Афпян А.Г., Косткж A.B. Лсспедеза двуцветная : фармаклогнческне свойства, применение в медицине// Тезисы материалов республ. научно-практической конф."Актуальные проблемы технологии производства, переработки лекарственного сырья н получения фитопрепаратов", Караганда, 1993,с.54-55

о о

6. Макалкйна Л.Г., Мухамбетов Д.Д., Гуляев П.В., Зуева

0.М.,-Задонцев В.Ф. Влияние бнофлавонопдов на некоторые нммунологнчскпе показатели периферической крови при экспернментной почечной недостаточности// Сб."Термннальные и экстремальные состояния", Алматы, 1993, с.41-44

7. Макалкйна Л.Г., Мухамбетов Д.Д., Гуляева С.Ф., Махамбетов К.О., Кутыбадамов Н.К. Некоторые подхода к коррекции нарушений иммунитета в условиях неблагоприятной экологической обстановки//тезисы материалов международной научной конференции "Учение В.И. Вернадского и современная экологическая ситуация", Акмола-Боровое, 1993, с. 154-155

8. Макалкйна Л.Г. Влияние напитка "Леспп" и препарата "Леспефлан" на лейкоцитарную формулу периферической крови при острой почечной недостатокюсти//Сб. "Экспериментальные нклшшческне аспектытq)Mlшaлы^ыx состояний Акмола, 1995, с. 79-83

9. Мухамбетов Д.Д., Таргакова М.З., Макалкйна Л.Г. Гомеопатическая направленность действия фптопрепарауов// Тезисы конф. "Перспективы развития производства биопрепаратов для медицины и сельского хозяйства", Степиогорск, 1995, ч. 2, с.49

По теме диссертации запатентовано 1 изобретение:

1. Гуляева С.Ф., Гуляев В.Г., Макалкйна Л.Г., Гуляев П.В., Ландышева И.В. Способ определения типа адаптационных

- реакций... // N 5012242/ 14 /072453/ от 18.02.93 Госпатент Российской Федерации.

МАЗМ¥НЫ

Авторы: Макалкнна Лариса Геннадьевна Мамандагы: фармакология - 14.00.25

Диссертацияныц так,ирыбы: "Тежел буйректщ жепспеушЫгппц барысына лсспсфлааиыц оте аз молшерипц ocepi" (эксперпмеиталдык, зерттсу).

Эксперимент 233 кре жынысты а к, егеук,уйрык,к,а крйылган. Зерттеудщ нотижесшде тежел буйректщ жст1спеушмш бар жануарлардыц леспефланныц вте аз молшермиц едоу^р шпоазотекалык,, зор отюзетш жэне гистопротектшгпк белсецдшп анык,талды. Леспефланныц фармакологнялык, ecepiii жузеп асыруында оныц аса мацызды адаптогеидш occpi оте коп болды. Жануарлардыц ТБЖ емдеген кезде ткандердщ жопе гуморальдж тиолсульфндт1К жунееппц функцночалды жагдайымеп перифернялык, к,аш1ыц'к,урлмыныц лейкоцнтарды формуласы 6ip к,алыпк,а келдь Лнпядтыц тотыгуыиьщ аск,ын тотык, процес^тер! турак,талды.

Т жэне В лимфоцнттардыц саны кебейдь пернфернялык, к,андагы иммундык, айналысуы комгГлектершщ болушылыгы томендедь Сонымен к,атар леспефланныц e3i буйрект^к, TKaiiiiie аса сэйкес келед1, ал эрнтроцпттарга аз келедь Бауырга жопе журек \ erine б1рк,алыпты эсер ет1лген. Herisri зерттеу фармакология жэне -нефрология у™»1 теоретнкалык, жэне практнкалык, мацызы вте коп.

SUMMARY

Author: Makalkina Larisa Gennadicvna Speciality:. Pharmacology - 14.00.25

Themcrof the thesis: "Lespeflan Minimum Dose Effect on Acute Renal Insufficiency Course" (experimental study)

The experiments were performed on 233 white non-bred rats of both sex. The results of the study revealed a considerable hypoazotemic, diuretic and histoprotective activity of lespeflan minimum doses in animals with acute renal insufficiency'. Lespeflan adaptfogenic effect discovered by us makes a great influense on realization of its pharmacological activity. Thus, in the process of treating animals suffering from acute renal insufficiency functional state of tissue and humoral

thioldysulfide system returned to normal as well as the peripheric -differential blood count, the processes of lipid peroxide oxidation became stable, T- and B- lymphocyte count increased and the content of circulating immune complexes decreased in the peripheric blood. Besides it was determined that lespeflan bioflavonoids possessed the highest tropism to the renal tissue and the lowest one to erythrocytes. The preparation made a moderate effect on the liver and myocardium.

The present investigation is of a certain theoretical and practical value for pharmacology and nephrology.

Отпечатано в МКП "Акпол" г.Акмола, ул.Первомайская, 7 Заказ N4/86, тираж 100 экз.