Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Влияние микроокружения на функциональную активность в лимфоцитов



На,

ии» ■

На правах рукописи

ДЬЯКОВ Илья Николаевич

ВЛИЯНИЕ МИКРООКРУЖЕНИЯ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ В ЛИМФОЦИТОВ

14.00.36 — аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 з щР 22:3

Москва

— 2009

003465568

Работа выполнена в ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова

РАМН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор СИДОРОВА Екатерина Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор АПТ Александр Соломонович

доктор медицинских наук, профессор КРАСНОПРОШИНА Людмила Ивановна

Ведущая организация:

ГУ НИИ Эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Защита диссертации стостоится 16 апреля 2009 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 в ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г.Москва, Малый Казенный пер., д. 5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Автореферат разослан « /3 » Ау УЛ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

Яковлева И.В.

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

В лимфоциты — неотъемлемый компонент иммунной системы. Основная функция В клеток — образование антител к разнообразным эндогенным и экзогенным антигенам (Murphy К, 2008). Они также принимают участие в различных межклеточных взаимодействиях: презентации антигена, регуляции активности Т лимфоцитов, формировании структуры вторичных лимфоидных органов. В зависимости от происхождения, преимущественной локализации и спектра экспрессируемых специфичностей В лимфоциты подразделяют на 3 основные субпопуляции, различающиеся по своим свойствам: В-1, В-2 и В клетки маргинальной зоны (MZ-B) (Сидорова Е.В., 2006). В-1 лимфоциты, в свою очередь, подразделяются на CD5+ В-la и CD5" В-lb клетки. В клетки, принадлежащие к разным субпопуляциям, распределены в организме неодинаково. Большинство В-1 лимфоцитов сосредоточено в брюшной полости и lamina propria кишечника. В-2 клетки, напротив, локализованы преимущественно в селезенке, лимфатических узлах и кровотоке.

В настоящее время наиболее полно изучены В клетки селезёнки и брюшной полости. Установлено, что свойства В лимфоцитов селезенки и перитонеальной полости различны. Долгое время считали, что различия обусловлены преобладанием в этих органах той или иной субпопуляции В лимфоцитов. В последние годы, однако, получены данные, свидетельствующие о различиях В клеток одной популяции, локализованных в разных органах. Более того, В лимфоциты, локализованные в одном органе, проявляют сходные свойства независимо от принадлежности к той или иной субпопуляции (Rothstein T.L., 2002; Hastings W.D., 2006).

Между селезенкой и перитонеальной полостью происходит постоянный обмен В клетками. При этом под влиянием разного микроокружения В лимфоциты теряют одни свойства и приобретают другие.

Например, изменяется экспрессия некоторых генов (Stoermann В., 2007; Berberich S., 2007) и способность В клеток отвечать на перекрестное связывание В-клеточного рецептора (Chumley M.J., 2002). Покидая брюшную полость, В клетки перестают экспрессировать поверхностный маркер Мас-1 (Hastings W.D., 2006); микроокружение перитонеальной полости коммитирует В клетки к миграции в лимфоидные ткани кишечника (Berberich S., 2007) и т.д.

Долгое время в научной литературе В спленоциты ассоциировали с В-2 субпопуляцией, а перитонеальные В лимфоциты с В-1; при этом основной упор делали на изучение способности клеток селезенки и брюшной полости восстанавливать у облученных и scid-мышей те или иные субпопуляции В клеток. Функциональная активность В лимфоцитов в различном микроокружении практически не изучалась. В настоящее время опубликовано несколько работ, по исследованию способности перитонеальных В лимфоцитов синтезировать/секретировать

иммуноглобулины (ИГ) in vivo. Хотя по этому вопросу нет однозначного мнения, большинство авторов считают, что в брюшной полости В клетки находятся в неактивном состоянии. Это удивительно, поскольку преобладающие в брюшной полости В-1 клетки являются источником >50% нормального IgM крови и составляют -50% IgA-продуцентов кишечника.

В настоящее время окончательно не установлено, какие факторы микроокружения перитонеальной полости влияют на активность В лимфоцитов. Не определено не меняется ли активность уже образующих ИГ В клеток при попадании их в микроокружение брюшной полости. Неизвестно с чем связано отсутствие ИГ-образующих клеток (ИГОК) в брюшной полости мышей — с неспособностью В клеток к активации или угнетением синтеза/секреции ИГ. Изучение этих вопросов необходимо для расширения наших представлений о межклеточных взаимодействиях и роли микроокружения в функционировании В клеток.

Цель исследования

Определение влияния микроокружения брюшной полости и селезенки на функциональную активность В лимфоцитов мыши.

Задачи исследования

1. Отработка условий внутривенного и внутрибрюшинного переноса клеток селезенки и перитонеальной полости мышей СВА конгенным xid-мышам CBA/N.

2. Выявление распределения перенесенных клеток мышей СВА в селезенке и брюшной полости мышей CBA/N.

3. Определение влияния перитонеального микроокружения селезенки мышей CBA/N на функциональную активность В лимфоцитов селезенки и перитонеальной полости мышей СВА.

4. Определение влияния микроокружения брюшной полости мышей CBA/N на функциональную активность В лимфоцитов селезенки.

5. Определение содержания ИГОК в брюшной полости спленэктомированных мышей CBA/N после внутрибрюшинного введения им спленоцитов СВА.

6. Активация перитонеальных В лимфоцитов путем инкубации их in

vitro.

7. Разработка модели, позволяющей исследовать активность перитонеальных клеток СВА.

8. Определение влияния микроокружения брюшной полости мышей CBA/N на синтез/секрецию IgM преинкубированными in vitro перитонеальными клетками мышей СВА.

Научная новизна

Впервые исследовано распределение в селезенке и брюшной полости мышей CBA/N окрашенных CFDA-SE спленоцитов и перитонеальных клеток мышей СВА при их внутривенном и внутрибрюшинном переносе.

Впервые показано, что спленэктомия не влияет на содержание В и Т лимфоцитов в брюшной полости мышей CBA/N.

Впервые показано, что вводимые в брюшную полость ИГОК селезенки прекращают синтезировать/секретировать ИГ.

Впервые разработана экспериментальная модель, позволяющая исследовать функциональную активность перитонеальных В клеток в микроокружении брюшной полости.

Впервые показано, что при внутрибрюшинном переносе мышам CBA/N активированных in vitro перитонеальных В клеток мышей СВА образование ими ИГ угнетается.

Впервые показано, что после того, как перенесенные внутрибрюшинно перитонеальные ИГОК перестают синтезировать/секретировать ИГ, в брюшной полости реципиентов В клетки, способные продуцировать ИГ in vitro сохраняются.

Таким образом установлено, что микроокружение брюшной полости подавляет образование ИГ В лимфоцитами у мыши.

Практическая значимость

Настоящая работа относится к исследованиям фундаментального характера. Полученные данные о влиянии микроокружения брюшной полости и селезенки на функциональную активность В лимфоцитов расширяют наши представления о механизмах иммунитета. Вместе с тем, поскольку В-1 лимфоциты перитонеальной полости играют важную роль в защите организма от бактериальной инфекции, а также вносят существенный вклад в патогенез аутоиммунных и онкологических заболеваний, изучение влияния перитонеального микроокружения на свойства В клеток необходимо для более полного понимания механизмов регуляции активности В лимфоцитов, что может быть использовано при разработке новых схем лечения упомянутых заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту

В отличие от селезенки, в перитонеальной полости мышей СВА и CBA/N ¡n vivo IgM-образующие клетки отсутствуют.

В лимфоциты мышей СВА при адоптивном переносе конгенным xid-мышам CBA/N в организме реципиентов выживают и функционируют (синтезируют/секретируют ИГ).

При внутривенном введении мышам CBA/N окрашенных CFDA-SE клеток мышей СВА, в селезенке реципиентов удается выявить больше перенесенных клеток, чем в брюшной полости, а при внутрибрюшинном введении наоборот — в перитонеальной полости выявляется больше перенесенных клеток, чем в селезенке.

Неактивные в брюшной полости В лимфоциты мышей СВА образуют ИГ в селезенке мышей CBA/N. В то же время, спленоциты СВА в брюшной полости мышей CBA/N ИГ не образуют.

При внутрибрюшинном введении активированных перитонеальных клеток в брюшной полости реципиентов на 1-е сутки после переноса сохраняется ~30% перенесенных IgM-ИГОК; на 4-е сутки их число уменьшается до фоновых значений.

После «умолкания» перенесенных внутрибрюшинно ИГОК в перитонеальной полости реципиентов клетки, способные продуцировать ИГ сохраняются.

Микроокружение брюшной полости угнетает образование ИГ В лимфоцитами.

Апробация материалов диссертации и публикации

Материалы диссертации доложены и обсуждены на XI Всероссийском научном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007), Международном иммунологическом конгрессе (Рио-де-Жанейро, 2007), Объединённом иммунологическом форуме 2008 (Санкт-Петербург,

2008), конференции молодых ученых, посвященной 100-летию получения И.И. Мечниковым Нобелевской премии (Москва, 2008).

По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 138 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 4 таблицами и 13 рисунками. Библиография включает 129 отечественных и зарубежных источников.

Содержание работы Материалы и методы

Животные. В опытах использовали самок мышей СВА и СВА/Ы массой 16-18 г. Мышей СВА получали из питомника РАМН "Андреевка" (Москва, Россия). СВА/Ы мыши были были любезно предоставлены ГУ ЦНИИ туберкулеза РАМН (за что приносим глубокую благодарность сотрудникам «Лаборатории экспериментальной иммуногенетики») и содержались в виварии ГУ НИИ ВС им. И.И. Мечникова.

Антиген и иммунизация. Для иммунизации использовали синтетический тимус-независимый антиген 2-го рода (ТН-2 антиген) поливинилпирролидон (ПВПзбо). Мышам вводили по 2 мкг ПВП внутривенно (в подглазничный синус) или внутрибрюшинно. Ответ определяли по числу антитело-образующих клеток (АОК) в селезенке на 4-е сутки после введения антигена.

Спленэктомия. При удалении селезенки для ингаляционной анестезии использовали диэтиловый эфир. Брюшную полость вскрывали и удаляли селезнку, предварительно наложив лигатуру на сосуды. Для профилактики послеоперационных инфекционных осложнений применяли сульфаниламид

и спиртовой раствор бриллиантового зеленого. В опытах использовали животных спустя 4-6 недель после операции.

Получение клеточных суспензий. Моноклеточную суспензию спленоцитов получали, гомогенизируя селезенку в 5 мл среды ЯРМ1 1640 (01Ьсо). Клетки осаждали центрифугированием при +4°С, на 200 д в течение 7-10 мин. Эритроциты удаляли гипотоническим шоком с использованием дистиллированной Н20 и 10-кратного раствора Хэнкса с феноловым красным. После лизиса эритроцитов спленоциты осаждали и дважды отмывали средой ЯРМ1-1640. Перитонеальные клетки получали, вымывая содержимое брюшной полости 10 мл среды ЯРМ1 1640; клетки осаждали и дважды отмывали средой. В полученных суспензиях определяли число живых и мертвых клеток.

Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Расчёт проводили по

формуле: с = т-т'>

Ь* к

где: С — концентрация клеток (млн/мл); х — число просчитанных клеток; а — разведение; Ь — число просчитанных «больших» квадратов в камере Горяева; к — коэффициент равный 4.

Выделение В-1 и В-2 клеток. В-1 лимфоциты выделяли из суспензии

перитонеальных клеток. Сначала удаляли макрофаги инкубацией в среде ЯРМ1-1640 с 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) при +37°С и 5% С02. Затем удаляли Т клетки методом негативной иммуномагнитной сепарации. Для этого использовали магнитные бусы, покрытые антителами к пан-Т клеточному маркеру ТЬу-1.2 (Оупа1). И, наконец, удаляли В-2 лимфоциты и оставшиеся макрофаги, используя смесь крысиных антител (к макрофагальному маркеру Е4/80 и поверхностному антигену В-2 лимфоцитов СЭ23) и магнитные бусы, покрытые антителами барана против ^С крысы. Выделенные клетки содержали 85% В-1 лимфоцитов.

В-2 лимфоциты выделяли из суспензии клеток селезёнки. Спленоциты получали как описано ранее. Макрофаги удаляли инкубацией в среде ЯРМ1-

1640 с 7% ЭТС в течение 1,5 ч на пластиковых чашках Петри при +37°С и 5% С02. В-2 клетки получали с помощью набора для негативного выделения В-2 лимфоцитов (Dynal), согласно прилагаемой инструкции. Полученная суспензия клеток содержала 86% В-2 клеток. Эта часть работы была проведена совместно с сотрудником нашей лаборатории Гавриловой MB.

Адоптивный перенос клеток. Клетки вводили внутривенно (в подглазничный синус) в 150 мкл среды RPMI-1640 или внутрибрюшинно в 200-500 мкл среды. Число переносимых клеток варьировало в зависимости от цели опыта.

Витальное окрашивание клеток. Для окрашивания клеток использовали витальный флуоресцентный краситель карбоксифлуоресцеин диацетат сукцинимидиловый эфир — CFDA-SE (Дьяков И.Н., 2008). Окрашенные клетки вводили мышам внутривенно и внутрибрюшинно. Число окрашенных клеток в селезенке и брюшной полости реципиентов определяли методом люминесцентной микроскопии на микроскопе ЛЮМАМ (с использованием 10-ти или 12-ти луночных мультитестовых стекол) и методом проточной цитофлуориметрии с помощью проточного цитофлуориметра (Beckman Coulter EPICS XL). Для выявления В-1 лимфоцитов клетки помимо CD 19 окрашивали по CD43, а для выявления В-la — по CD5. Данная часть работы была выполнена совместно с сотрудниками нашей лаборатории Гавриловой М.В. и Григорьевым И.В.

Окрашивание клеток флуоресцентными антителами. Для фенотипической характеристики клеток использовали меченые флуоресцентными красителями антитела к поверхностным маркерам В клеток (CD 19) и Т лимфоцитов (CD3). Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток проводили в растворе или после фиксации на стеклах.

Культивирование клеток. В опытах использовали пулы клеток селезенки или брюшной полости от 2-10 мышей СВА или CBA/N. Клетки культивировали в 96-луночных плоскодонных планшетах в полной среде

11РМ1-1640 с 10% ЭТС (С1Ьсо) и всеми необходимыми добавками при +37°С и 5% С02 в течение 4-х дней. В лунки вносили по 1х106 клеток селезенки или по 0,8x106 клеток брюшной полости. По окончании инкубации клетки собирали, отмывали и определяли число ИГОК с помощью Е1Л8РОТ.

Определение числа антитело-образующих клеток (АОК) и ИГОК. Для выявления АОК и ^М-ИГОК использовали нитроцеллюлозные планшеты (МППроге), которые обрабатывали ПВП (для выявления АОК) или козьими антителами к ИГ мыши (для выявления ИГОК). Поскольку планировалось изучать ответ мышей на ТН-2 антиген ПВП, при выявлении АОК и ИГОК определяли содержание 1§М-продуцентов. Для определения АОК на фильтры наносили по ЮОхЮ3 клеток, а для выявления ИГОК — по ЮхЮ3 клеток. Клетки культивировали в среде ЛРМ1-1640 с 1% ЭТС в течение 18-24 ч при +37°С и 5% С02. По окончании инкубации клетки удаляли, фильтры отмывали, добавляли поэтапно усиливающую кроличью антисыворотку к ц-цепям мыши и пероксидазный конъюгат антител к кролика. Для проявления реакции использовали субстратный буфер (рН 7,8), содержащий 1,4-хлорнафтол и Н202, Число образовавшихся окрашенных комплексов (плаков) подсчитывали под микроскопом и пересчитывали на 106 клеток.

Результаты собственных исследований и обсуждения

Для изучения влияния микроокружения на функциональную активность В лимфоцитов использовали модель адоптивного переноса клеток от мышей СВА, мышам конгенной линии СВА/Ы (Рис. 1). Мыши СВА/1М несут х1с1-мутацию в гене Брутон-тирозинкиназы (В(к), что обусловливает развитие у них иммунодефицита: у таких мышей отсутствуют СБ5+ В-1а лимфоциты, в связи с чем они не отвечают на ТН-2 антигены; у них снижено как общее число клеток в селезенке и брюшной полости, так и содержание в них В лимфоцитов (Таблица 1); наконец, у х!с1-мышей резко снижено число

СБА

Клетки брюшной

Рис. 1. Схема адоптивного переноса клеток мышей СВА мышам коигеиной линии

CBA/N: в/в — внутривенно; в/б — внутрибрюшинно.

полости и сниженная иммунореактивность иммунодефицитных мышей CBA/N позволяет более четко выявлять функциональную активность перенесенных им клеток нормальных мышей СВА. Отсутствие у CBA/N мышей способности к иммунному ответу на ТН-2 антигены позволяет также судить о функциональной активности перенесенных им клеток СВА мышей по образованию антител к ТН-2 антигенам.

Следует отметить, что в отличие от спленоцитов, функциональная активность В лимфоцитов перитонеальной полости in vivo изучена недостаточно. В известной нам литературе не существует и единого мнения о наличии ИГОК в брюшной полости мышей. В связи с этим нами был Таблица 1. Клеточный состав селезенки и брюшной полости мышей СВА и CBA/N.

Орган Число клеток, xl О6 Содержание CD19+ В клеток, % Содержание CD3+ Т клеток, %

Селезенка мышей СВА 58,2±3,36 44,5±1,2 35,7±1,7б

Селезенка мышей СВАЛЧ 35±5,34 16,6±0,9 48,9±7,24

Брюшная полость мышей СВА 4,58±0,56 50,1 ±1,92 1 8,6±0,92

Брюшная полость мышей СВА/Ы 0,89±0,23 5,28±0,34 20,6±1,08

поставлен ряд экспериментов, по определению числа ИГОК в селезенке и брюшной полости мышей СВА и CBA/N. В результате было установлено, что в селезенке мышей СВА содержится 3041±230 IgM-ИГОК на 106 клеток, а у мышей CBA/N — 50б±157 IgM-ИГОК на 106 клеток. В брюшной полости мышей СВА число IgM-ИГОК составляло 20±13 на 106 клеток, а у мышей CBA/N IgM-ИГОК в перитонеальной полости вообще отсутствовали. Таким образом, количество IgM-ИГОК в селезенке мышей CBA/N было существенно меньше, чем у мышей СВА; в брюшной полости IgM-ИГОК практически отсутствовали. Полученные результаты соответствуют большинству данных, представленных в литературе.

Распределение спленоцитов и перитонеальных клеток мышей СВА в селезенке и брюшной полости мышей CBA/N. Для изучения влияния микроокружения селезенки и брюшной полости мышей CBA/N на функциональную активность В лимфоцитов мышей СВА, прежде всего следовало отработать условия переноса и изучить распределение переносимых клеток между селезенкой и брюшной полостью реципиентов. Для этого клетки мышей СВА окрашивали витальным красителем CFDA-SE и переносили мышам CBA/N: спленоциты вводили внутривенно по 15x106 клеток или внутрибрюшинно по 5x106 клеток; перитонеальные клетки и внутривенно и внутрибрюшинно вводили в одной дозе —- по 3x106 клеток. Процент окрашенных клеток в селезенке и перитонеальной полости реципиентов определяли на 1-е и 4-е сутки после переноса.

При внутривенном введении как спленоцитов, так и перитонеальных клеток мышей СВА, в селезенке CBA/N реципиентов удавалось выявить больше окрашенных клеток, чем брюшной полости (5,6 % и 0,04 % на 4-е сутки после переноса спленоцитов и 2,5% и 0,4% на 4-е сутки после переноса перитонеальных клеток, соответственно). При внутрибрюшинном введении наоборот ■— в брюшной полости реципиентов выявлялось больше перенесенных клеток, чем в селезенке: после переноса спленоцитов в

брюшной полости выявлялось 20% от введенных клеток на 1-е сутки и 8% на 4-е, а в селезенке и на 1-е, и на 4-е сутки не больше 1,2% от числа введенных клеток. При переносе перитонеальных клеток разница была еще больше — на 4 сутки после переноса в брюшной полости содержалось ~52% от перенесенных клеток, в то время как в селезенке окрашенные клетки практически отсутствовали. Следует отметить, что нам удавалось выявить сравнительно небольшую часть введенных клеток, особенно при внутривенном введении. Большая часть переносимых клеток вероятно попадала в другие органы или погибала. На это указывают полученные ранее данные о том, что при переносе лимфоцитов взрослым нормальным мышам многие введенные клетки погибают. Показано, также, что часть перенесенных клеток может «уходить» в печень (Ц)'аИеИ1 М., 2003). В наших опытах сколько-нибудь существенного увеличения содержания мертвых клеток в суспензиях спленоцитов или клеток брюшной полости мышей СВА/Ы после переноса им клеток СВА не наблюдалось, поэтому более вероятным представляется «уход» клеток в другие органы. Выявление переносимых клеток СВА в организме реципиентов свидетельствовало о том, что внутривенный путь переноса можно использовать для «доставки» клеток в селезенку, а внутрибрюшинный — в брюшную полость. Это позволяло перейти к определению функциональной активности клеток СВА в разном микроокружении.

Функциональная активность В клеток селезенки мышей СВА в селезенке мышей СВА/Ы. На первом этапе выясняли, сохраняют ли спленоциты СВА мышей способность к образованию ИГ в микроокружении селезенки мышей СВА/Ы. Для этого мышам СВА/Ы внутривенно вводили 15x106 спленоцитов мышей СВА, содержащих 2700 ^М-ИГОК на 106 клеток (т.е. всего ~ 40x103 1§М-ИГОК). Спленоциты интактных СВА/Ы мышей

Рис. 2. Число ИГОК в селезенке мышей. 1—интактные мыши СВА; 2 — интактные мыши CBA/N; 3 — мыши CBA/N на 4-е сутки после внутривенного переноса им спленоцитов СВА.

содержали 553±1б IgM-ИГОК на Ю6 клеток. На 4-е сутки после переноса число IgM-ИГОК в селезенке CBA/N реципиентов возрастало до 2417±87 на 106 клеток, то есть практически до уровня, характерного для нормальных мышей СВА (Рис. 2). Поскольку внутривенное введение мышам CBA/N спленоцитов мышей той же линии к возрастанию числа IgM-ИГОК в селезенке реципиентов не приводило, очевидно, что отмеченное возрастание было обусловлено перенесенными СВА клетками. Таким образом, спленоциты мышей СВА, в норме содержащие IgM-ИГОК, сохраняют свою функциональную активность в селезенке мышей CBA/N.

Функциональная активность В клеток брюшной полости мышей СВА в селезенке мышей CBA/N. Для изучения «поведения» перитонеальных В лимфоцитов мышей СВА, не секретирующих ИГ in vivo, в микроокружении селезенки, мышам CBA/N внутривенно переносили по 3x106 клеток брюшной полости мышей СВА. Исходно в селезенке мышей CBA/N содержалось 738±45 IgM-ИГОК на 106 спленоцитов. После переноса число IgM-ИГОК в селезенке реципиентов постепенно возрастало и на 4-е сутки достигало в среднем 3232±265 на 106 спленоцитов, что соответствовало значениям, характерным для нормальных мышей СВА (рис. 3).

4000

О 3500 -

3000 -

л:

2 2500 -

X 2000 -

О

L_ s: 1500 -

5 1000 -

500 -

0 -

1'ис. 3. Число ИГОК в суспензиях клеток мышей: 1—спленоциты интактных мышей CBA/N; 2. — клетки брюшной полости мышей СВА (переносимые клетки); 3 — спленоциты мышей CBA/N на 4-е сутки после внутривенного переноса им перитонеальных клеток СВА. 4 — спленоциты интактных мышей СВА (контроль)

Следовательно, «молчащие» в брюшной полости В лимфоциты в микроокружении селезенки начинали синтезировать/секретировать ИГ. Следует отметить, что для восстановления числа IgM-ИГОК в селезенке мышей CBA/N до уровня, характерного для мышей СВА потребовалось перенести в 5 раз меньше клеток брюшной полости, чем спленоцитов мышей СВА. Эти данные подтверждают результаты Riggs et al., полученные на нормальных и xid мышах BALB/C (Prior L., 2004).

Функциональная активность В-1 и В-2 клеток мышей СВА в селезенке мышей CBA/N. Проведенные исследования показали, что при внутривенном переносе спленоцитов или перитонеальных клеток мышей СВА мышам CBA/N, перенесены В клетки синтезируют/секретируют IgM в микроокружении селезенки реципиентов. В этих опытах переносили тотальные клетки селезенки и брюшной полости. Представлялось интересным определить, как будут вести себя при внутривенном переносе мышам CBA/N В-1 и В-2 клетки мышей СВА. С этой целью мышам CBA/N внутривенно переносили по 5x106 В-2 клеток, выделенных из селезенки и по 1,5x106 В-1 клеток, выделенных из брюшной полости мышей СВА. В селезенке интактных мышей CBA/N содержалось 575±27 IgM-ИГОК на 106

спленоцитов. На 4-е сутки после переноса В-2 клеток число ^М-ИГОК в селезенке реципиентов возрастало до 1138±61 на 106 спленоцитов, а после введения В-1 клеток — до 1082±110 на 106 спленоцитов. Это говорит о том, что и В-1 и В-2 клетки мышей СВА сохраняют свою функциональную активность в организме мышей СВА/Ы, что еще раз подтверждает данные, полученные в опытах с переносом тотальных клеток селезенки и брюшной полости.

Способность спленоцитов н клеток брюшной полости мышей СВА восстанавливать у мышей СВАЛЧ ответ на поливинилпирролидон. Как

уже отмечалось, мыши СВА/Ы не отвечают на ТН-2 антигены: в селезенке интактных мышей СВАЛЧ содержалось 38±13 АОК к ПВП на 10б клеток селезенки; через 7 дней после внутривенного введения ПВП число АОК составляло не более 48±10 на 10б спленоцитов (Рис.4, Б). В то же время у мышей СВА в норме спленоциты содержали 248±12 АОК к ПВП на 10б клеток, а через 7 дней после введения ПВП число АОК в их селезенке возрастало до 626±31 на 10б клеток (Рис.4, А). Чтобы определить способность клеток мышей СВА восстанавливать у мышей СВА/Ы ответ на ТН-2 антигены, мышам СВА/Ы внутривенно переносили по 15x106 спленоцитов или по 3x106 клеток брюшной полости мышей СВА и внутривенно вводили им ПВП одновременно или через 7 сут после переноса клеток. Как видно из данных, представленных на рис. 4 (В, Г), внутривенный перенос клеток СВА приводил к возрастанию числа АОК к ПВП в селезенке мышей СВА/Ы, однако при последующем внутривенном введении ПВП увеличения числа АОК, обусловленного иммунизацией, не наблюдалось (не зависимо от времени введения антигена). Возможно, для получения ответа на ПВП у СВА/Ы реципиентов требуется изменить условия иммунизации.

Полученные нами результаты противоречат данным И^в е! а1., показавших, что перенос клеток мышей ВАЬВ/с восстанавливает у мышей х1с1-ВАЬВ/с способность отвечать на ТН-2 антиген тринитрофенил фиколл.

700 |--

А Б В Г

□ Норма ■ Иммунные

Рис. 4. Содержание АОК в сплепоцитах мышей в норме и на 4-е сутки после внутривенного введения поливинилпирролидона: А — мыши СВА; Б— мыши СВА/Ы; В— СВА/Ы реципиенты спленоцитов мышей СВА; Г— СВАЛ\1 реципиенты клеток брюшной полости мышей СВА.

Различия между нашими данными и результатами й а1. могут быть

связаны с использованием других линий мышей и другого антигена. Кроме того, Riggs й а1. не учитывали, что перенос сам по себе приводит к возрастанию числа АОК в селезенке х1с]-реципиентов («фоновые» АОК). Этот вопрос требует дальнейшего изучения.

Функциональная активность В клеток селезенки мышей СВА в брюшной полости мышей СВА/1Ч. В микроокружении селезенки мышей СВА/Ы продуцируют ИГ не только В клетки селезенки, но и «молчащие» в норме В лимфоциты брюшной полости мышей СВА. В связи с этим возникло предположение, что отсутствие ИГОК в брюшной полости у мышей является результатом негативного влияния на В клетки перитонеального микроокружения. Чтобы проверить это предположение было решено определить, изменится ли функциональная активность спленоцитов СВА (уже содержащих ИГОК) под влиянием микроокружения брюшной полости мышей СВА/К Для этого мышам СВА/Ы внутрибрюшинно переносили по 5х 106 интактных спленоцитов мышей СВА, содержащих 3500 ^М-ИГОК/Ю6 клеток (т.е. по 17500 ^М-ИГОК на мышь) и определяли число ^М-ИГОК в

брюшной полости реципиентов на 1-е и 4-е сутки после переноса. Поскольку ранее мы показали, что на 1-е сутки в брюшной полости СВА/Ы реципиентов сохраняется до 20% перенесенных спленоцитов, можно было ожидать появления в ней 3500 ^М-продуцентов. Однако, на 1-е сутки после переноса в брюшной полости реципиентов выявлялось только 338±41 ^М-ИГОК (на всю полость), а на 4-е сутки— всего 151±16 ^М-ИГОК. При этом в брюшной полости реципиентов возрастало как общее число клеток (с ~0,7х 106 живых клеток в норме до ~3,3х 106 живых клеток на 1-е сутки и ~2,5х 106 живых клеток на 4-е сутки после переноса), так и содержание СЭ19+ В клеток (с 5,28±0,34% у интактных мышей СВА/Ы, до 10,4±0,64% на 1-е сутки и 12,62±0,54% на 4-е сутки после переноса). Таким образом, несмотря на то, что перенесенные В клетки в брюшной полости реципиентов сохранялись, появления ожидаемого числа 1§М-ИГОК в ней не происходило.

Отсутствие ИГОК в брюшной полости реципиентов после переноса им «работающих» спленоцитов могло быть обусловлено несколькими причинами: перенесенные клетки могли погибнуть, покинуть брюшную полость и, наконец, перестать продуцировать ИГ под влиянием перитонеального микроокружения. Содержание мертвых клеток в смыве из брюшной полости у реципиентов на 1-е сутки после переноса составляло не более 10%, т.е. было даже ниже, чем в норме (-29%). Таким образом предположение о массовой гибели перенесенных спленоцитов в брюшной полости реципиентов представлялось нам маловероятным. (Следует оговориться, однако, что отсутствие большого количества мертвых клеток в брюшной полости реципиентов не позволяет исключить избирательной гибели перенесенных ИГОК. Этот вопрос пока остается открытым.)

Более правдоподобным представлялось предположение об «уходе» перенесенных клеток из перитонеальной полости. Поскольку микроокружение брюшной полости не является «родным» для В лимфоцитов селезёнки, перенесенные В-спленоциты (в том числе ^М-продуценты) могли

покидать брюшную полость и мигрировать в селезенку («хоминг»). Чтобы проверить это предположение, у мышей CBA/N удаляли селезенку, а затем внутрибрюшинно переносили им по 5x106 интактных спленоцитов мышей СВА, содержащих 3500 IgM-ИГОК/Ю6 клеток, т.е. по 17500 IgM-ИГОК на мышь. Ни на 1-е, ни на 4-е сутки после переноса возрастания числа IgM-ИГОК в брюшной полости спленэктомированных CBA/N реципиентов не происходило: на 1-е сутки выявлялось 220± 16 IgM-ИГОК на всю полость, а на 4-е — 113±28 IgM-ИГОК. При этом, как и в опытах на мышах с интактной селезенкой, в брюшной полости спленэктомированных CBA/N реципиентов возрастало как общее число клеток, так и содержание CD19+ В лимфоцитов, т.е. переносимые В клетки в ней сохранялись. Таким образом, если перенесенные IgM-продуценты и покидали брюшную полость реципиентов, наличие или отсутствие интактной селезенки на этот процесс не влияло. Возможно перенесенные В клетки «уходили» в какие-либо другие органы, например в печень или lamina propria кишечника. Этот вопрос требует дальнейшего исследования.

Функциональная активность пре-ннкубированных клеток брюшной полости и селезенки мышей СВА перенесенных внутрибрюшинно мышам CBA/N. Перитонеальное микроокружение для спленоцитов является «чужим», поэтому отсутствие IgM-ИГОК в брюшной полости реципиентов могло быть связано именно с тем, что В спленоциты попадали в «непривычное». Чтобы исключить фактор «чужеродности» следовало переносить в брюшную полость мышей CBA/N не спленоциты, а перитонеальные клетки мышей СВА. Однако, в норме перитонеальные клетки мышей ИГ не образуют, поэтому внутрибрюшинный перенос мышам CBA/N 3х 10б интактных клеток брюшной полости мышей СВА к появлению IgM-ИГОК в брюшной полости реципиентов не приводил. Было необходимо «запустить» перитонеальные В лимфоциты к продукции ИГ. Для этого можно было использовать липополисахарид, однако при этом значительная

часть активированных В клеток брюшную полость покидает. С нашей точки зрения, более физиологичным способом «активации» перитонеальных клеток являлось культивирование их in vitro. При инкубации клеток брюшной полости мышей СВА in vitro в суспензии появлялось значительное число ИГОК: в различных экспериментах оно колебалось от 4360 до 6930 IgM-ИГОК на 10б клеток. Причиной активации «молчащих» перитонеальных В лимфоцитов могло быть как отсутствие влияния микроокружения брюшной полости, так стимулирующее воздействие факторов ЭТС содержащейся в культуральной среде.

Было поставлено 4 эксперимента. Во всех проведенных опытах были получены сходные результаты. Ниже приведены данные одного из таких экспериментов. После 4 суток инкубации перитонеальных клеток мышей СВА in vitro в них выявлялось 6930 IgM-ИГОК на 10б клеток. По 1,5х10б таких клеток внутрибрюшинно перенесли мышам CBA/N (т.е. по 10 395 IgM-ИГОК). На 1-е сутки после переноса в брюшной полости реципиентов выявилось 3266±143 IgM-ИГОК или -1432 IgM-ИГОК на 106 клеток (т.е. -31,5% от числа перенесенных IgM-ИГОК), а на 4-е сутки — 337±36 IgM-ИГОК или -169 IgM-ИГОК на 10б клеток (т.е. -3% от числа перенесенных IgM-ИГОК) (Рис. 5). Большое число ИГОК на 1-е сутки после переноса клеток не характерно для брюшной полости, поэтому возникло предположение, что это могло быть вызвано кардинальным изменением свойств клеток при культивировании их in vitro. Для проверки этого предположения было решено ввести в брюшную полость CBA/N мышей пре-инкубированные in vitro спленоциты мышей СВА.

Было поставлено 3 опыта. Во всех проведенных экспериментах были получены сходные результаты. Ниже приведены данные одного из таких экспериментов. В интактных спленоцитах мышей СВА содержалось 2767 IgM-ИГОК на 10s клеток; после инкубации in vitro их число возросло до 9161

8000

7000 ■

ь

ц * 6Ü00 ■

г с 5000 •

i

Г 4000 -

SÉ

о 3000 -

X

о 2000 ■

■ т 1000 ■

А йяв Б

fill

шш

ill

||§§

Í1H¡

i 2 3 4

Рис. 5. А. Содержание ИГОК в суспензиях клеток брюшной полости мышей СВА:

1 — in vivo, 2— па 4-е сутки инкубации in vitro. Б. Содержание ИГОК в суспензиях клеток брюшной полости мышей CBA/N после внутрибрюшинного введения им пре-инкубированных перитонеальных клеток мышей СВА: 3— на 1-е сутки, 4— на 4-е сутки.

на 106 клеток. Мышам CBA/N внутрибрюшинно ввели по 5x106 пре-инкубированных спленоцитов (т.е. по 45805 ИГОК на мышь). На 1-е сутки после переноса в брюшной полости реципиентов выявлялось 178±24 IgM-ИГОК или ~51 IgM-ИГОК на 10s клеток (т.е. 0,4% от числа перенесенных IgM-ИГОК), а на 4 сутки — 104±16 IgM-ИГОК или -45 IgM-ИГОК на 106 клеток (т.е. 0,2% от числа перенесенных) (Рис. 6). Таким образом, перенос СВА спленоцитов, инкубированных in vitro в тех же условиях, что и перитонеалъные клетки, к появлению в брюшной полости мышей CBA/N сколько-нибудь значительного числа ИГОК не приводил. Это значит, что культивирование переносимых клеток само по себе на число ИГОК, выявляемое в брюшной полости реципиентов не влияет.

При внутрибрюшинном введении мышам CBA/N пре-инкубированных in vitro перитонеальных клеток СВА на 1-е сутки в брюшной полости реципиентов выявляется -30% введенных IgM-ИГОК, которые на 4-е сутки «исчезают». Как уже говорилось, перенесенные IgM-ИГОК могли погибнуть, «уйти» из брюшной полости или перестать синтезировать/секретировать IgM под влиянием перитонеального микроокружения. Наиболее интересным нам представлялось последнее

10000 9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 юоо о

iч

А ь

фх.'

Рис. 6. А. Содержание ИГОК в суспензиях клеток селезенки мышей СВА: I — in vivo, 2 — на 4-е сутки инкубации in vitro. Б. Содержание ИГОК в суспензиях клеток брюшной полости мышей CBA/N после внутрибрюшинного введения им пре-инкубированных спленоцитов мышей СВА: 3 — на 1-е сутки, 4 — на 4-е сутки.

предположение, поэтому было решено проверить, остаются ли в брюшной полости реципиентов после «умолкания» перенесенных IgM-ИГОК В клетки, способные синтезровать/секретировать ИГ?

Выявление клеток, способных синтезировать ИГ, в брюшной полости CBA/N реципиентов после умолкания перенесенных ИГОК. Для решения поставленной задачи была разработана схема «двойного» переноса клеток, согласно которой перитонеальные клетки CBA/N реципиентов, на 4-е сутки после внутрибрюшинного введения им пре-инкубированных in vitro перитонеальных клеток СВА, т.е. после «исчезновения» перенесенных IgM-ИГОК, вновь помещали в систему in vitro.

Проведено 3 опыта, давшие сходные результаты. Ниже приведены данные одного из таких экспериментов. Мышам CBA/N внутрибрюшинно вводили по 1,6x106 пре-инкубированных in vitro перитонеальных клеток мышей СВА, содержащих 4360 IgM-ИГОК на 106 клеток таких клеток, т.е. по 6976 IgM-ИГОК (Рис. 7, А). На следующие сутки после переноса в брюшной полости реципиентов выявлялось 1233±69 IgM-ИГОК на 10° клеток

Д

500 О 4500 4000 3500 3000 2500 2000 -1500 1000 500 0

Рис. 7. Число ИГОК в брюшной полости мышей CBA/N, получивших пре-иикубированные in vitro перитонеальные клетки мышей СБА. Подписи см. в тексте.

(Рис. 7, Б) (2319 IgM-ИГОК на всю полость или 33,2% от числа перенесенных IgM-ИГОК), а на 4-е сутки — 238±18 IgM-ИГОК на 106 клеток (Рис. 7, В) (3,3% от числа перенесенных IgM-ИГОК). Как видно из рисунка, описываемый эксперимент повторил выявленную ранее закономерность. Далее, перитонеальные клетки реципиентов на 4-е сутки после переноса (т.е. после исчезновения перенесенных ИГОК) повторно помещали в систему in vitro и снова культивировали в течение 4-х суток. В результате в культуре вновь появились IgM-ИГОК — 1268/106 клеток (Рис. 7, Г). Поскольку при инкубации in vitro клеток брюшной полости интактных мышей CBA/N IgM-ИГОК в них практически не выявлялись (Рис. 7, Д), очевидно, что наблюдаемый прирост числа ИГОК происходил за счет перенесенных клеток мышей СВА. Таким образом, после «умолкания» перенесенных клеток, в брюшной полости реципиентов сохраняются В лимфоциты, потенциально способные продуцировать IgM. Анализируя данные, представленные на рисунке (Рис. 7, Б-Г) легко увидеть, что число IgM-ИГОК в клетках брюшной полости реципиентов после повторной инкубации in vitro (Рис. 7, Г) соответствует числу IgM-ИГОК, сохраняющихся в брюшной полости реципиентов на 1-е сутки после переноса (Рис.7, Б). Полученные данные позволяют утверждать, что микроокружение перитонеальной полости

подавляет синтез/секрецию IgM В лимфоцитами у мыши in vivo. Очевидно, что подавляется активность как В-1, так и В-2 клеток.

Причины и механизм подавления функциональной активности В клеток в брюшной полости до конца не ясны. Определенный вклад в это могут вносить факторы, продуцируемые активированными макрофагами — простагландин Е2 и ганглиозиды (Berenson C.S., 1991; Chace J.Н., 1995). Другими источниками негативных сигналов могут быть перитонеальные стромальные клетки, клетки оментума (Pinho M.F., 2004) или мезотелиальные перитонеальные клетки (ParkJ.H., 2007; Balabanian К., 2002), однако экспериментальных данных, подтверждающих те или иные предположения в данный момент нет. Значение такого подавления до конца неясно. Возможно оно необходимо для поддержания в неактивном состоянии аутореактивных В клеток.

Следует подчеркнуть, однако, что микроокружение перитонеальной полости не только угнетает активность В лимфоцитов, но и обеспечивает их жизнеспособность (Hardin J.А., 1995), т.е. как бы поддерживает их в «законсервированном состоянии». Создание модели, позволяющей следить за функциональной активностью перитонеальных В лимфоцитов, существенно для выяснения механизмов, ограничивающих деятельность этих клеток в перитонеальной полости.

Полученные данные свидетельствуют о ведущей роли микроокружения в функциональной активности В лимфоцитов.

Выводы

1. При адоптивном переносе клеток селезенки мышей СВА мышам CBA/N переносимые В клетки сохраняют свою функциональную активность в организме реципиентов.

2. Неактивные in vivo В клетки брюшной полости мышей СВА начинают синтезировать/секретировать ИГ в микроокружении селезенки мышей CBA/N.

3. Спленоциты мышей СВА в микроокружении брюшной полости мышей CBA/N IgM не продуцируют.

4. Разработана модель, позволяющая исследовать функциональную активность перитонеальных клеток мышей СВА в микроокружении брюшной полости мышей CBA/N.

5. Активированные in vitro перитонеальные клетки мышей СВА перестают продуцировать IgM в микроокружении брюшной полости мышей CBA/N, при этом в брюшной полости реципиентов В клетки, способные образовывать IgM in vitro сохраняются.

6. Микроокружение брюшной полости угнетает образование IgM В лимфоцитами мыши.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1.Dyakov I.N., Gavrilova M.V., Chernyshova I.N., Sidorova E.V. Effect of Microenvironment on Functional Activity of Murine B-Lymphocytes // Biochemistry (Moscow) Supplement Series A: Membrane and Cell Biology. — 2008. — Vol. 2. — N 4. — P. 312-317.

2. Дьяков И.Н., Гаврилова M.B., Чернышева И.Н., Сидорова Е.В. Влияние микроокружения на функциональную активность В-лимфоцитов мыши // Биологические мембраны. — 2008. — Т. 25 — № 5. — С. 360-366.

3. Дьяков И.Н., Григорьев И.В., Сидорова Е.В., Чернышова И.Н. Функциональная активность В-клеток мыши. Роль микроокружения // Медицинская иммунология. — 2008. — Т. 10,— № 1— С. 51-58.

4. Роль микроокружения в образовании иммуноглобулинов В-лимфоцитами мыши // Медицинская иммунология. — 2007. — Т. 9. — № 2-3. — С. 136.

5. Функциональная активность В лимфоцитов в перитонеальном микроокружении // Российский иммунологический журнал. — 2008. — 2(11). — № 2-3. — С. 120.

6. Sidorova E.V., Dyakov I.N., Grigoriev I.V. Role of microenvironment in the IgM formation by mouse lymphocytes // Abstracts of 13-th International congress of immunology 2007, Rio-de-Janeiro, Brazil, August 21-25, 2007.

Заказ № 45/03/09 Подписано в печать 11.03.2009 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,5

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:1гф)@ср'.ги

Цели и задачи.10

Научная новизна.12

Практическая значимость.13

Основные положения, выносимые на защиту.15

Часть 1. Обзор литературы.17

117 Выводы

1. При адоптивном переносе клеток селезенки мышей СВА мышам CBA/N переносимые В клетки сохраняют свою функциональную активность в организме реципиентов.

2. Неактивные in vivo В клетки брюшной полости мышей СВА начинают синтезировать/секретировать ИГ в микроокружении селезенки мышей CBA/N.

3. Спленоциты мышей СВА в микроокружении брюшной полости мышей CBA/N IgM не продуцируют,

4. Разработана модель, позволяющая исследовать функциональную активность перитонеальных клеток мышей СВА в микроокружении брюшной полости мышей CBA/N.

5. Активированные in vitro перитонеальные клетки мышей СВА перестают продуцировать IgM в микроокружении брюшной полости мышей CBA/N, при этом в брюшной полости реципиентов В клетки, способные образовывать IgM in vitro сохраняются.

6. Микроокружение брюшной полости угнетает образование IgM В лимфоцитами мыши.

2.7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Приведенные в обзоре данные свидетельствуют о том, что В лимфоциты представляют сложно организованную систему клеток с разными свойствами. В клетки представлены в различных органах: костном мозге, селезенке, лимфатических узлах, крови, мукозальных лимфоидных тканях, оментуме, полостях тела (перитонеальной и плевральной) и даже в тимусе. Между этими органами в большинстве случаев идет постоянный обмен лимфоцитами. Разные субпопуляции В клеток распределены неодинаково: В-2 преобладают в селезенке и лимфоузлах, В-1 — в брюшной полости, a MZ-B клетки у мышей представлены только в селезенке. Локализация В лимфоцитов во многом определяет их свойства и функциональную активность. Микроокружение влияет на фенотип В клеток, их хоминг, профиль генной экпрессии, способность отвечать на стимулы разного происхождения. Различия выявлены в свойствах В лимфоцитов одной субпопуляции, но разной локализации. И наоборот, В клетки разных субпопуляций, локализованные в одном органе становятся похожими по некоторым своим свойствам.

В перитонеальной полости В клетки находятся в угнетенном состоянии, но при этом сохраняют свою жизнеспособность. Они не продуцируют Ig in vivo, но приобретают эту способность при инкубации in vitro или в другом микроокружении. Для проявления своей функциональной активности В клетки должны покинуть перитонеальную полость и мигрировать в эффекторные сайты. Вместе с тем влияние микроокружения на функциональную активность изучено не достаточно. Неясно, различен ли ответ В-1 и В-2 клеток селезенки и брюшной полости на ТЗ и ТН антигены; влияет ли удаление селезенки на спектр антител к ТЗ и ТН антигенам; возникают ли в брюшной полости и селезенке «новые» В-1 лимфоциты с BCR к экзогенным антигенам; почему В лимфоциты селезенки продуцируют антитела in vivo, а лимфоциты перитонеальной полости — нет; участвуют ли В-2 клетки селезенки в образовании нормальных антител; изменяются ли свойства В клеток при переносе их из одного микроокружения в другое; что определяет образование В клетками слизистых оболочек в основном IgA; неизвестно как микроокружение брюшной полости повлияет на функциональную активность уже продуцирующих Ig В лимфоцитов и т.д.

В связи с этим целью нашего исследования являлось определение влияния микроокружения брюшной полости и селезенки на функциональную активность В лимфоцитов разной локализации. В задачи исследования входили:

•S Отработка условий внутривенного и внутрибрюшинного переноса клеток селезенки и перитонеальной полости мышей СВА конгенным xid-мышам CBA/N.

•S Выявление распределения перенесенных клеток мышей СВА в селезенке и брюшной полости мышей CBA/N.

•S Определение влияния перитонеального микроокружения селезенки мышей CBA/N на функциональную активность В лимфоцитов селезенки и перитонеальной полости мышей СВА.

•S Определение влияния микроокружения брюшной полости мышей CBA/N на функциональную активность В лимфоцитов селезенки. •S Определение содержания ИГОК в брюшной полости спленэктомированных мышей CBA/N после внутрибрюшинного введения им спленоцитов СВА.

•S Активация перитонеальных В лимфоцитов путем инкубации их in vitro, •f Разработка модели, позволяющей исследовать активность перитонеальных клеток СВА.

V Определение влияния микроокружения брюшной полости мышей CBA/N на синтез/секрецию IgM преинкубированными in vitro перитонеальными клетками мышей СВА.

ЧАСТЬ 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3. Материалы и методы исследования

3.1. ЖИВОТНЫЕ

В опытах использовали самок мышей СВА и CBA/N массой 16-18 г. Мыши СВА были полученных из питомника РАМН "Андреевка" (Москва, Россия). CBA/N мыши были любезно предоставлены ГУ ЦНИИ туберкулеза РАМН (за что мы приносим глубокую благодарность сотрудникам «Лаборатории экспериментальной иммуногенетики») и размножены в виварии ГУ НИИ ВС им. И.И. Мечникова.

3.2. АНТИГЕН И ИММУНИЗАЦИЯ

Для иммунизации использовали синтетический ТН-2 антиген поливинилпирролидон (ПВП36о). Мышам вводили по 2 мкг ПВП в 100 мкл фосфатного солевого буфера (ФСБ) внутривенно (в подглазничный синус) или внутрибрюшинно. Ответ определяли по числу антитело-образующих клеток (АОК) в селезенке на 4-е сутки после введения антигена.

3.3. СПЛЕНЭКТОМИЯ

Спленэктомию мышей CBA/N проводили, используя для ингаляционной анестезии диэтиловый эфир. В качестве шовного материала применяли POLYSORB UL-204 (3-0) и полигликолид PGA (3/0). Мышей фиксировали на препаративном столике, разрезали кожу и вскрывали брюшную полость. Селезенку удаляли, предварительно наложив лигатуру на сосуды. После спленэктомии поэтапно закрывали перитонеальную полость и кожу. Для профилактики послеоперационных инфекционных осложнений применяли сульфаниламид и спиртовой раствор бриллиантового зеленого. В опытах использовали животных спустя 4-6 недель после операции.

3.4. ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ СУСПЕНЗИЙ

Моноклеточную суспензию спленоцитов получали, гомогенизируя селезенку в 5 мл среды RPMI 1640 (Gibco). Клетки осаждали центрифугированием при +4°С, на 200 g в течение 7-10 мин. Осадок ресуспендировали и удаляли эритроциты гипотоническим шоком: к осадку добавляли 900 мкл дистиллированной Н20 и перемешивали 10 с, затем добавляли 100 мкл 10-кратного раствора Хэнкса с феноловым красным (МПБП, Россия). После лизиса эритроцитов спленоциты осаждали и дважды отмывали средой RPMI-1640.

Перитонеальные клетки получали, вымывая содержимое брюшной полости 7-10 мл среды RPMI 1640: брюшную полость вскрывали, вводили 23 мл среды, аккуратно суспендировали и отбирали среду; процедуру повторяли 2-3 раза. Затем клетки осаждали и дважды отмывали средой. В полученных суспензиях определяли число живых и мертвых клеток.

3.5. ПОДСЧЕТ ЧИСЛА ЖИВЫХ И МЕРТВЫХ КЛЕТОК

Подсчет живых и мертвых клеток проводили в камере Горяева, используя 0,1% раствор трипанового синего (Trypan blue stain 0,4%, Gibco) в

0,9% растворе NaCl. Расчет проводили по формуле: с х*а Ъ*к где: С — концентрация клеток (млн/мл); х — число просчитанных клеток; а — разведение; b — число просчитанных «больших» квадратов в камере Горяева; к — коэффициент равный 4.

3.6. ПОЛУЧЕНИЕ В-1 ЛИМФОЦИТОВ

В-1 лимфоциты выделяли из суспензии перитонеальных клеток. Для этого проводили смыв из брюшной полости как описано выше. Для удаления макрофагов отмытые средой перитонеальные клетки переводили в «полную» среду: RPMI-1640 с 5% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Gibco), 2% хепеса (Gibco), 1% пирувата натрия (Sodium pyruvate lOOmM, Sigma), 1% антибиотиков (Gibco), 1,5% глютамина (L-Glutamine 200mM, Gibco) и 5x10" n

M 2-меркаптоэтанола (Sigma), и инкубировали в 25 мл культуральном матрасике (Nunc) в течение 12-18 ч при температуре +37°С и 5% С02 в инкубационной камере (Flow). После инкубации неприкрепившиеся клетки собирали, отмывали и переводили в ФСБ, содержащий 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА). На следующем этапе из суспензии удаляли Т клетки методом негативной иммуномагнитной сепарации (эта часть работы была проведена совместно сотрудником нашей лаборатории Гавриловой М.В., за что приношу ей глубокую благодарность). Для удаления Т лимфоцитов использовали магнитные бусы, покрытые антителами к пан-Т клеточному маркеру Thy-1.2 (Dynabead Mouse pan-T (Thy 1.2), Dynal Biotech ASA, Norway). Работу проводили согласно инструкции фирмы. Собранные с культуральных флаконов клетки инкубировали с шариками (из расчета 48 шариков на клетку) в течение 30 мин при +4°С на ротаторе. Присоединившие бусы клетки осаждали на магните, надосадочную жидкость собирали и находящиеся в ней клетки осаждали центрифугированием. Из полученной суспензии удаляли В-2 лимфоциты и оставшиеся макрофаги методом негативной иммуномагнитной сепарации. Для этого использовали крысиные антитела к макрофагальному маркеру F4/80 (Purified anti-mouse F4/80-like receptor (FG12), BD Pharmingen) и поверхностному антигену В-2 лимфоцитов CD23 (Purified rat anti-mouse CD23 (FcsRII)(B3B4), BD Pharmingen) мыши. Для удаления провзаимодействовавших с антителами клеток использовали магнитные бусы, покрытые антителами барана против IgG крысы (Dyanbead М450 Sheep anti Rat IgG, Dynal Biotech ASA). Связавшие шарики клетки осаждали при помощи магнита. Надосадочную жидкость, содержащую выделенные В-1 лимфоциты отбирали.

Содержащиеся в ней клетки отмывали, доводили до необходимой концентрации и использовали в дальнейших экспериментах. Выделенные клетки содержали 85% В-1 лимфоцитов.

3.7. ПОЛУЧЕНИЕ В-2 ЛИМФОЦИТОВ

В-2 клетки выделяли из суспензии клеток селезенки. Спленоциты получали как описано ранее. Для удаления макрофагов спленоциты инкубировали в среде RPMI-1640 (RPMI-1640, Gibco), содержащей 7% ЭТС (Gibco), 1,5 ч на пластиковых чашках Петри (Ленмедполимер, Россия) при +37°С и 5% СОг в инкубационной камере (Flow). Не прикрепившиеся клетки собирали, отмывали и ресуспендировали в концентрации 100х10б/мл в ФСБ, содержащем 0,1% БСА. В-2 клетки получали с помошью фирменного набора для негативного выделения В-2 лимфоцитов (Dynal Mouse В cell negative isolation kit, Invitrogen Dynal AS) согласно прилагаемой инструкции. К 100 мкл суспензии клеток концентрацией 100х10б/мл добавляли 20 мкл коктейля антител из набора и 20 мкл ЭТС (Gibco), инкубировали 20 мин при +4°С, один раз отмывали в 2 мл ФСБ с 0,1% БСА, ресуспендировали в 800 мкл ФСБ с 0,1% БСА и добавляли 200 мкл суспензии магнитных бус из набора. Клетки инкубировали с шариками 20 мин при комнатной температуре на ротаторе (). Покрытые шариками клетки осаждали на магните. Надосадочную жидкость, содержащую выделяемые В-2 лимфоциты отбирали. В-2 клетки отмывали и использовали в дальнейших экспериментах. Полученная суспензия клеток содержала 86% В-2 клеток.

3.8. ВИТАЛЬНОЕ ОКРАШИВАНИЕ КЛЕТОК CFDA-SE

Для окрашивания клеток использовали витальный флуоресцентный краситель карбоксифлуоресцеин диацетат сукцинимидиловым эфиром — CFDA-SE (Invitrogen). Суспензию клеток 50х106/мл в ФСБ с 0,1% БСА, смешивали 1:1 с рабочим раствором красителя (40 мкМ) и инкубировали 10 мин при +37°С. (Рабочий раствор CFDA-SE готовили непосредственно перед использованием из 2 мМ сток раствора в диметилсульфоксиде, хранящегося при -20°С). Окрашивание останавливали, добавляя холодную среду RPMI-1640 с 10% ЭТС. Затем клетки дважды отмывали средой без ЭТС, подсчитывали и вводили мышам. Число окрашенных клеток в селезенке и брюшной полости реципиентов определяли при помощи люминесцентной микроскопии на микроскопе ЛЮМАМ (ЛОМО, Россия) и методом проточной цитофлуориметрии с помощью проточного цитофлуориметра (Beckman Coulter EPICS XL).

При люминесцентной микроскопии использовали стекла двух типов: 10-ти луночные мультитестовые стекла (10-well Multitest Slide Fragile, ICN) и 12-ти луночные стекла с адгезионным покрытием (Adhesion slide (Superior), Marinefield). Клетки, окрашенные CFSE (50-100x103), вносили в лунки на стеклах, давали им осесть в течение 30 минут и фиксировали 4% раствором параформальдегида в 0,9% NaCl. После фиксации клеток стекла отмывали ФСБ от формалина и подсчитывали число светящихся клеток в поле зрения микроскопа (просчитывали не менее 5 полей).

При проточной цитофлуориметрии клетки, окрашенные CFSE, фиксировали 1% раствором параформальдегида в 0,9% растворе NaCl и определяли число окрашенных клеток на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter EPICS XL. Результаты обрабатывали с помощью программы SYSTEM II (Beckman Coulter).

Данная часть работы была выполнена совместно с сотрудниками нашей лаборатории Гавриловой М.В. и Григорьевым И.В.

3.9. ОКРАШИВАНИЕ КЛЕТОК ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМИ АНТИТЕЛАМИ

Для фенотипической характеристики клеток использовали меченые флуоресцентными красителями антитела: РЕ anti-mouse CD19 (1D3) (BD Pharmingen) и FITC anti-mouse CD3 molecular complex (17A2) (BD Pharmingen) . Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток проводили в растворе или после фиксации на стеклах.

При окрашивании флуоресцентными антителами на стеклах, клетки (50-100x103) вносили в лунки 10 луночных мультитестовых стекол (ICN), давали им осесть в течение 30 минут и фиксировали 4% раствором параформальдегида в 0,9% NaCl. После фиксации клеток, стекла отмывали от параформальдегида в ФСБ. В лунки вносили растворы меченых флуоресцентным красителем антител в разведении 1/200 в ФСБ и выдерживали 30 минут при +20°С в темной влажной камере. Затем клетки 2 раза отмывали ФСБ от непрореагировавших антител. Число светящихся клеток подсчитывали на люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ (JIOMO, Россия).

При окрашивании флуоресцентными антителами в растворе, отмытые средой клетки (200-500x103) ресуспендировали в ФСБ с 0,1% БСА и осаждали. Надосадочною жидкость сливали, осадок ресуспендировали, добавляли к нему по 20 мкл меченых флуоресцентным красителем антител в разведении 1/200 в ФСБ с 1% БСА и инкубировали 30 мин при +4 °С. После инкубации клетки отмывали ФСБ с 0,1% БСА и фиксировали 1% раствором параформальдегида в 0,9% растворе NaCl. Подсчет фиксированных окрашенных клеток проводили на проточном цитофлуориметре Beckman Coulter EPICS XL. Результаты обрабатывали с помощью программы SYSTEM II (Beckman Coulter).

3.10. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК IN VITRO

Для культивирования in vitro в разных опытах использовали пулы клеток от 2-10 мышей СВА или CBA/N. Клетки культивировали в 96-луночных плашках (Nunc) в 200 мкл полной среды при +37°С и 5% СОг в инкубационной камере (Flow) в течение 4-х дней. В качестве полной среды для культивирования клеток использовали среду RPMI-1640 (Gibco) с 10% ЭТС (Gibco) и добавлением 2% хепеса (Gibco), 1% пирувата натрия (Gibco), 1% антибиотиков (Gibco), 1,5% глютамина (L-Glutamine 200mM, Gibco) и п

5x10 М 2-меркаптоэтанола (Sigma). Среду готовили непосредственно перед получением клеток. В лунки вносили по 1x106 клеток селезенки или по 0,8x106 клеток брюшной полости. По окончании инкубации клетки собирали, отмывали, определяли число Ig-образующих клеток (ИГОК) с помощью ELISPOT. Число пересчитывали на 106 клеток.

3.11. АДОПТИВНЫЙ ПЕРЕНОС КЛЕТОК

Клетки вводили внутривенно (в подглазничный синус) в 150 мкл среды RPMI-1640 (Gibco) и внутрибрюшинно в 200-500 мкл среды RPMI-1640 (Gibco). Число переносимых клеток варьировало в зависимости от цели опыта. Интактные спленоциты мышам вводили внутривенно по 15х10б клеток или внутрибрюшинно по 5x106 клеток. Интактные клетки брюшной полости вводили по ЗхЮ6 внутривенно или по 1,5-3x10б внутрибрюшинно.

В-2 лимфоциты вводили внутривенно по ЗхЮ6. В-1 лимфоциты вводили внутривенно по 1x10б.

После инкубации in vitro клетки переносили только внутрибрюшинно: спленоциты — по 5x10б клеток; клетки брюшной полости — по 1,5-2x10б клеток.

3.12. КЛЕТОЧНЫЙ ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ELISPOT)

Для выявления АОК и IgM-ИГОК использовали нитроцеллюлозные планшеты (Millipore), которые сенсибилизировали ПВП (для выявления АОК) или козьими антителами к Ig мыши (Sigma, USA) (для выявления ИГОК). Сайты неспецифической сорбции на нитроцеллюлозе, оставшиеся свободными после сенсибилизации, забивали БСА (в лунки вносили 1% раствор БСА в ФСБ). Поскольку планировалось изучать ответ мышей на ТН-2 антиген ПВП, при выявлении АОК и ИГОК определяли содержание IgM-продуцентов. На сенсибилизированные и отмытые ФСБ нитроцеллюлозные диски наносили клетки селезенки или брюшной полости мышей (по 100x103 для определения АОК и по 10x10 для определения ИГОК) и культивировали их в среде RPMI-1640 с 1% ЭТС в течение 18-24 ч при +37°С и 5% С02 в инкубационной камере (Flow). По окончании инкубации клетки удаляли, диски отмывали, поэтапно добавляли усиливающую кроличью антисыворотку к ц-цепям мыши (инкубация один час при +37°С с последующей отмывкой), пероксидазный конъюгат антител к IgG кролика (инкубация один час при +37°С с последующей отмывкой) и субстратный буфер, содержащий 1,4-хлорнафтол и Н202 (инкубация 20 мин при комнатной температуре в темноте). Реакцию останавливали дистиллированной Н20. После высушивания фильтров число образовавшихся окрашенных комплексов (плаков) подсчитывали под микроскопом и пересчитывали на 106 клеток.

Глава 4. Результаты исследования

Как говорилось выше, В-1, В-2 и MZ-B клетки распределены в организме неодинаково. Так в селезенке преобладают В-2 лимфоциты, а в брюшной полости — В-1. Свойства В лимфоцитов в значительной степени зависят от их локализации. В первую очередь следовало охарактеризовать клетки селезенки и брюшной полости мышей СВА и CBA/N.

4.1. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СЛЕТОК СЕЛЕЗЕНКИ И БРЮШНОЙ ПОЛОСТИ МЫШЕЙ СВА И CBA/N

4.1.1. Определение общего числа клеток в селезенке и брюшной полости мышей СВА и CBA/N

Суспензии клеток селезенки и брюшной полости получали, как описано в материалах и методах. Для подсчета числа живых и мертвых клеток использовали камеру Горяева. Из селезенки мышей СВА удавалось получить (58,2±3,36)х10б клеток, из них живые составляли 98,1±1,32%, а мертвые не более 1,9±1,32%. Из брюшной полости мышей СВА вымывали (4,58±0,56)х10б клеток, из них 80,7±2,56% живых и 19,3±2,56% мертвых, т.е. порядка 3,7x106 живых клеток. Из селезенки мышей CBA/N удавалось выделить (35±5,34)х10б клеток, из них живые составляли 97,76±0,79%, а мертвые 2,24±0,79%. Из брюшной полости мышей CBA/N получали (0,89±0,23)х106 клеток, в том числе 69,7±2,24% живых и 30,3±2,24% мертвых, т.е. в среднем 0,7x106 живых клеток. Таким образом, в селезенке мышей CBA/N в целом содержалось в 1,7 раза меньше клеток, чем в селезенке мышей СВА. Число клеток в брюшной полости отличалось еще больше — из перитонеальной полости у мышей CBA/N удавалось выделить в 4,6 раз меньше клеток, чем у мышей СВА.

4.1.2. Определение числа В и Т лимфоцитов в селезенке и брюшной полости мышей СВА и CBA/N

Поскольку мыши CBA/N иммунодефицитны, можно было предполагать, что клеточный состав селезенки и перитонеальной полости мышей СВА и CBA/N неодинаков. Для определения содержания В и Т лимфоцитов в селезенке мышей СВА и CBA/N клетки окрашивали флуоресцентными конъюгатами антител, специфичных к поверхностным маркерам, характеризующим В и Т лимфоциты (CD 19 и CD3 соответственно) и определяли процент окрашенных клеток методом цитофлуориметрии, как описано в материалах и методах. В селезенке мышей СВА В лимфоциты (CD19+) составляли 44,5*1,2%, а Т лимфоциты (CD3+) — 35,7±1,76%. В брюшной полости мышей этой линии содержалось 50,1±1,92% В клеток и 17,6±0,92% Т лимфоцитов. У мышей CBA/N в селезенке содержалось не больше 16,6±0,9% В лимфоцитов и 48,9±7,24% Т клеток. В брюшной полости В клетки составляли не более 5,28±0,34%, а Т клетки — 20,6±1,08%.

Таким образом, процентное содержание В лимфоцитов как в селезенке, так и в брюшной полости мышей CBA/N было значительно снижено по сравнению с таковым у мышей СВА: в селезенке почти в 2,7 раза, а в брюшной полости — в 5 раз. При этом содержание Т клеток было примерно одинаковым или у мышей CBA/N даже превышало таковое у мышей СВА (табл. 4).

4.1.3. Функциональная активность В лимфоцитов селезенки и брюшной полости мышей СВА и CBA/N

На следующем этапе следовало выяснить функциональную активность В лимфоцитов селезенки и перитонеальной полости мышей СВА и CBA/N, определямую по числу IgM-ИГОК, выявляемых методом ELISPOT. Содержание ИГОК в спленоцитах интактных мышей СВА в различных опытах варьировало и составляло 3041±230 IgM-ИГОК на 10б клеток; в брюшной полости при этом удавалось выявить 20±13 IgM-ИГОКхЮ6 клеток,