Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Влияние клеток иммунной системы на гистофизиологию тонкой кишки мыши в условиях органного культивирования IN VITRO

m м

МИ Н ИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОИ ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

НОВОСИБИРСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ФЕДЯНОВ АНДРЕЙ ВИКТОРОВИЧ

ПИЯНИЕ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ НА ГИСТОФИЗИО-10ГИЮ ТОНКОЙ КИШКИ МЫШИ В УСЛОВИЯХ ОРГАННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO.

(экспериментальное исследование)

14.00.23 - гистология, цитология, эмбриология.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск -1996

Работа выполнена в Институте клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

д.м.н., проф., академик РАМН, В.А. Труфакин.

доктор медицинских наук профессор В.Д Новиков, кандидат биологических наук Е.И. Рябчикова

Ведущее учреждение: Институт региональной патологи

и патоморфологии СО РАМН, г. Новосибирск Защита состоится года в

часов на заседании диссертационного совета Д 084.52.02 в Новосибирском медицинском институте (630091, Новосибирск, Красный проспект, 52.)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Новосибирского медицинского института.

Автореферат разослан " сАЮциЯ- 1996 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.м.н. Машак А.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Первые свидетельства иммунотрофизма появились еще в 20-х годах, когда в работах Carel было показано, что периферические лейкоциты, лейкоцитарные экстракты и лейкоцитарные супернатанты способны стимулировать рост фибробластов in vitro. С тех пор было получено множество экспериментальных данных, что лимфоидная система способна не только удалять чужеродные антигены, но и контролировать развитие своих тканей. Интерес к изучению взаимодействия лимфоидной системы с эпителиальны м покровом кишечника обуславливается тесной функциональной и морфологической интеграцией этих систем. Эта связь обеспечивает сохранение целостности эпителия, защиту от вирусной и бактериальной инфекции (Lycke М., Holmgrsn J., 1986; James S.P., 1985), способствует индукции толерантности к пищевым антигенам (Stephen Н., et al., 1990; Mowat А.М.,1987). Однако в ответ на антигенную стимуляцию Т-клетки выделяют и энтеро-патогенные лимфокины, которые не только координируют иммунные функции, но также изменяют нормальную физиологию слизистой кишечника, включая клеточное обновление эпителия (Mowat AM., et al., 1983). На основании имеющихся к настоящему времени данных можно заключить, что "иммунотрофическая" или "морфогене-тическая" способность лимфоцитов является их изначальным свойством.

В работах Апарович Г. Г. и Труфакина В.А. показано уменьшение митотическо-го индекса и числа клоногенных клеток кишечника после внутривенного введения ти-моцитов у голодающих мышей. В то же время, введение тимоцитов вызывало усиление дистрофических изменений слизистой кишечника. Антитимоцитарная сыворотка снижала количество клоногенных клеток и, наоборот, сыворотка против общей популяции лимфоцитов увеличивала количество клоногенных клеток и снижала количество энтероцитов в митозе (Апарович Г.Г. и Труфакина В.А., 1982; 1984). В работе Шмакова А.Н. (Шмаков А.Н. 1987) выявлено, что тимоциты ингибировали митотичес-кую активность эпителия тонкой кишки и увеличивали время общего обновления эпителия кишечника; Т-клетки вызывали локальное снижение индекса метки в крип-тальной колонке; тимэктомия приводила к уменьшению количества быстро проли-ферирующих энтероцитов; введение тимэктомированным животным спленоцитов вызвало увеличение синтеза ДНК в эпителии средней зоны крипты, а введение тимоцитов повышало пролиферативную активности эпителия. Однако не было проведено изучения этих взаимоотношений в условиях культивирования in vitro, когда многообразие воздействий на систему эпителий - лимфоцит было бы ограничено до

минимума Это позволило бы локализовать активные факторы иммунной системы для выяснения причинно - следственных связей лимфоэпителиальных взаимоотношений.

Учитывая вышеизложенное, целью настоящей работы было изучение морфо-функциональных особенностей эксплантатов кишечника мыши в условиях органного культивирования in vitro совместно с лимфоцитами. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Установить сроки адаптации и оптимальную продолжительность органного культивирования эксплантата тонкой кишки мыши in vitro.

2. Изучить изменение пролиферации и структуры слизистой оболочки эксплантатов кишечниха мыши при совместном органном культивировании in vitro с различными популяциями нэактовированных лимфоцитов.

3. Изучить изменение пролиферации и структуры слизистой оболочки эксплантатов кишечника мыши при совместном органном культивировании in vitro с лимфоцитами, у которых блокирован синтоз ДНК, РНК, белка.

4. Изучить изменение пролиферации и структуры слизистой оболочки эксплантатов кишечника мыши при совместном ерганном культивировании in vitro с лимфоцитами, обработанными Т-гхткгином.

5. Изучить изменение пролиферации и структуры слизистой оболочки кишечника мышей при парентеральном введении Т-активина.

НАУЧНАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Впервые описаны изменения биосинтеза ДНК в эпителии и морфология эксплантатов тонкой кишки мыши, под влиянием лимфоцитов в условиях органного культивирования тонкой кишки in vitro. Полученные данные расширяют представление о функции иммунокомпетент-ных клетох, влияющих на пролиферацию и дифференцировку нелимфоидных клеток, в частности, клеток эпителия тонкой кишки. Показано, что Т-активин способен модулировать влияние лимфоидных клеток на включение 3Н-тимидина эксплантатами тонкой кишки мыши in vitro. Применение Т-активина in vivo выявило, что он нормализует измененную голоданием пролиферацию эпителия тонкой кишки. Это позволяет рассматривать Т-активин, как препарат, нормализующий физиологические процессы в эпителии желудочно - кишечногр тракта.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ. 1. Зрелыэ лимфоидные клетки уменьшают включение 3Н-тимидина в эксплантаты тонкой кишки мыши при их совместном культивировании in vitro.

-52. Т-ахтивин является модулятором эффектов лимфоцитов на включение ®Н-тики-

дина эксплантатами тонкой кишки мыши при совместном культивировании эксплантатов и лимфоцитов in vitro.

АПРОБАЦИЯ. Полученные результаты доложены и обсуждены на заседании кафедры гистологии и эмбриологии Новосибирского медицинского института 24 января 1996 года.

ПУБЛИКАЦИИ. По тема диссертации опубликогано 9 печатных работ.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 175 стра- » ницах. Состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы (3 главы), собстзенных данных (4 главы), обсуждения, выводов, раздела "Внедрение в практику". Иллюстрирована 24 фотографиями и 29 графиками. Список литературы включает 31 отечественный и 176 иностранных источников. Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использовали 1500 самцоз мышей F,(CBA/c х C57BL/6) в возрасте 2 - 3 месяцев из питомника Института Клинической Иммунологии СО РАМН. Технику органного культивирования тшочника проводили согласно Browing Т, Trier J.S (1969). Основу среды составляют сухие навэски сред DMEM и NCTC-135. Кишечник нарезали на кусочки размером 3x1мм, помещается в 24 луночные планшеты. Для определения ДНК - синтетической способности эксплантатов в лунку добавляли 2 мкКю/мл 3Н-тимидина с удельнрй радиоактивностью 740 ТБк/Моль. По окончании культивирования 1-2 кусочка из лунки фиксировали. Готовили срезы толщиной 5 мид. В дальнейшем изучали после окраски гематоксилин - эозином или предварительно получали гистоавтографьь Из остальных кусочков лунки выделяли ДНК. В части раствора ДНК определяли ее радиоактивность путем подсчета количества импульсов в сцинтилляционной жидкости, вызываемых ß - частицами, излучаемыми 'Н-тимидином, который включился в состав ДНК. В оставшемся растворе определяли количество ДНК по методике Спирина (Спирин A.C., 1958). Результат выражали в импульсах в минуту на 1 микро грамм ДНК (Имп/мин). Основная концепция экспериментов представлена на схеме:

ПОЛУЧЕНИЕ ЭКСПЛАНТАТА КИШЕЧНИКА

и -

ВНЕСЕНИЕ 3Н-ТИМИДИНА -

И ' : ■

СНЯТИЕ ПРОБЫ

о ~ - •

ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОСИНТЕЗА ДНК БИОХИМИЧЕСКИМ МЕТОДАМ

-6В прецзссо культискрсггння к оксплснтзтсм дсбезляли ли«фо!1дн^а клетки,

T-E:cr«;siiH, скетра:оы и супернатанты л::г.фоэд;1ЫХ клеток. Для этого производили раадолвниэ кпзтск сслззанл! на Т- и В- лимфоциты либо на пластиковых чашках, л;,со на колонка с синтотмчоской ватой. Зкстра;сгы клеток получали многократные заглсргсхквйнжм - оттадаснясы. Прэдзгрнтельно для этой процедуры клзтки доводилась до необходимой концентрации, чтобы определенный объем полученных экстрактов соотеэтствовал определенному количеству клеток. В некоторых вкспорн-иентах бксз;:нтез ДНК б лимфоцитах ингибирозали мытомиц'.жом "С" в дозз 40 v.:s!;:j-,\ биосинтез РНК - аюткожцкном "Д" в доза 2 мхг/мл; белка - циклогексем-дс;.! о дого 5 ил1-:.п или 5С0 ыхт/шп. Концентрация Т-ахткскна испсльзсзалась в со. отсотстаии с кнетрухцгшй, прылггсгс.сЛ к стандартной упаковке: 0.0143 ¡¿кг/г л). В игкотсрых случаях испгльзогалась доза о 100 раз меньшая - 0.000143 "лкг/г (кэт/ил). Дг:л кзддого аиспврьжзнта пол/ча-ii свои контрольный цифру. Пер-ашчиэ результата обрабатывались на пзрсональнсы компьютера ДЗК-З. Дальнейшие расчеты прободались на tBM-PC по программе Sigma Plat Для выявления различи." фу,!г,.г:.-,:1! кспояазззалгя Истерий Стьюдзнта для парных и непарных з.-ичон;:";. (Знакам - * по-

ПОЛУЧЕНИЕ ЭКСПЛАНТАТА КИШЕЧНИКА U

КУЛЬТИБИРОЗЛИИЕ В Т£Ч£НИН 5 члеез

а

DHECEKiiE 'Н-ТПУИД'.Н.'А И 1;ССЛсДУЕ?.".УХ SiflETCK " ИЛИ ФАКТОРОВ

1й'ПЬТИ2ЯР02АН'ЛЕ В ТЕЧЕНИЕ 15 ЧАСОВ (05'J!=E ВРЕМЯ КУЛЬТИВИРОВАН ИЛ 20 ЧАСОВ)

У

ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОСИНТЕЗА ДНК БИОХИМИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

на граф^^а;: значения с уровнем достоверности Р<0.0£). Дс.;:-н^о пр;:зздсиы а е::дз -сроднзо с»к.чз;!,;з ка срсднс»; (*«1;Ьт)). Нрад-стаслзна каиСолза часто /.спользуег.;гл в денной работа сха^л с»гпсри-мал'оз.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРИ ОРГАННОМ КУЛЬТИВИРОВАНИИ ТОНКОЙ КИШКИ. При культивировании в теченно 25 часов на срезах тонкой кишки ворсины становятся короче и шире, в некоторых эксплантатах полностью отсутствуют. Количество поперечных ерэзоз крипт увеличивается по сравнению с интактным кишечником. В продольном разрезе крипты расширены. В просвете многих крипт видны погибшие клетки. Эпителий цилиндрический, со щеточной кай-

;,:ой, бокалозидиых клаток нэ наблюдается, тех как кх содержимое высвобюедаетсг; о культ>ргльну!о среду. Бмзльмая мгглбргна согрзн^на в области ворсин и з области крипт. В ткгни собственной плгетеиы слизистоЗ оболочки видны кровеносные « лимфатичеекмэ сосуды, ориентированные вдоль ворсинки. Наблюдаются плззго тичесгиз клетки, макрофаги, лимфоциты и эозкнофилы. Крипты выстланы недкф-фаренцироогнныи пр!<зчат1'.чзс!«м эпителиги. Эпителий в криптах и в hîwwsû часта осрсин г-гкзняэт cdoïo кср:.;аль ную ориентацию и приобретает боле э плосху.з форму. В основании крипт отдельные клэткн Панэта слущизе:отся в просвет. Остео-шиеся клот!С1 Пакета лишаются гранул, содерхииоэ которых высзсЗоадагатся я просвот. В отдельных криптах нижняя часть оголена примерно до 4-5 позиции. Эпителий крипт несколько ниже эпителия сор-син, с более тонкой исчерченной каемкой и с бззофильной цитоплазмой. С помощью метода as-торадиографии выявлено, что 3Н-тимидин включается преимущественно эпителиальными клетками. Лишь 2% - 5% от общего количества меченых клеток составляют лимфоциты и фиб-робласты стромы. В ряде работ также показано преимущественное накопление 3Н-тимидина в эпителиальных клетках (Alpers D.H., Philpott W„ 1975; Alpers D.H. et al„ 1980).

При изучении динамики индекса метки (авторадиография) и биохимического определения биосинтеза ДНК в эксплантатах ЗНтмд вносили в лунки либо за 1 час до снятия проб (в 0, 5, 9, 14, 19, 24 час от нача-

Дкнамигэ индекса матки при

3-1 - V различных сроках внесения 3Нтмд

20 - tî \ т

24- Ii 1- сз \ — î

2 \ I'

10 8 \ А

14 - g

0 s

А _

Время гультавкрозанкя

1ч 6ч 10ч 20ч 25ч

а Внэсениа ЗНтмд за 1 час до

окончания культнаировання

- о - Внасгкно ЗНтмд на 5 часу

Рис.1 культивирования

Врвмя культивирования 1ч 6ч 10ч 15ч 20ч 25ч —•—Внесения ЗНтмд за 1 час до окончания

культивирования ■ о» внесение ЗНтмд на 5 часу

Рис.2 культивирования

ла культивирования), либо однократно, во все лунки, на 5-м часу от начала культивирования (лрн этом ЗНтмд постоянно присутствовал в среде до снятия проб). Пробы снимали на 1-м, 6, 10,15, 20, 25-м часу культивирования. Авторадиографическим (Рис. 1) и.Смохимичссюм методами (Рис. 2) показана одинаковая динамика включения *Н-тиа(нДкна в эксплантаты тонкого кишечника мыши. Выявлена фаза стабилизации включения 3Н-тикидина, начиная с 5-го часа и по 20-й час культивирования. Тшнм образом, в процессе культивирования происходят морфофизиологические изменения эксплантата. Степень этих изменений зависит от сроков культивирования.

Получанныа результаты показывают, что оптимальный срок для изучения пролиферации ешгталмя эксплантата не болэе 24 часов. В отличие от других авторов нами обнаружена фаза стабилизации включения 3Н-тимидина в эксплантаты ки-шочнкха с 5-го по 20-й час. Показана корреляция между авторадиографической и биохимической методикам определения биосинтеза ДНК. В дальнейших экспериментах использовался биохимический метод. 3Нтмд и клетки вносили на 5-м часу культивирования, пробы снимали на 20-м часу культивирования.

ВЛИЯНИЕ КЛЕТОК ЛИМФОИДНОЙ СИСТЕМЫ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ НА МОРФООУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ ЭКСПЛАНТАТОВ ТОНКОЙ КИШКИ МЫШИ. Методом гзтераднографии выявлено, что в процессе культивирована лдофгидныо клетки, вносимые в культуру кишечника, не проникают ни в строму, ни о иежворсинчатоа или в межкриптапьное пространство. Следовательно, взаимодействие лимфоцитов и кишечного эксплантата, в данных экспериментальных условиях, возможно происходит преимущественно через цитокины, Бзделяеше клетками (как лим-фоидными, так и клетками эксплантата) в культур апьную среДУ-

Чтобы определить специфичность действия лимфоидных клеток в культуру кишечного эксплантата вносили клетки селезенки (Сц), Т- (Тл) и В-лимфоци-ты (Вл) из селезенки, тимоциты (Тц) и эритроциты (Эц) мыши. Исследовались также и половые

Динамика включения 3Нтмд при гшянии различных типоислеток

различия. Выявлено (Рис.3, самцы), что достоверный ингибирую-щий эффект на включение 3Н-ти-мидина оказывают спленоциты, Т-лимфоциты и В-лимфоциты, то есть, зрелые клетки иммунной системы. Тимоциты и эритроциты не изменяли уровень пролиферации. Аналогичные результаты были получены в эксперименте на самках

Динамика включения 'Н-тимидина в эксплантаты под влиянием тимоцитов в дозах 20, 5 и 1 млн. клеток на лунку была практически одинаковой. На рис.4 представлены данные изменения биосинтеза ДНК в эксплантатах тонкой кишки при внесении 20 млн. клеток на лунку.

Использование экстрактов различных тканей или клеточных культур млекопитающих применяется в экспериментальных исследованиях при изучении процессов связанных с пролиферацией и дифференцировкой (Шадрин Б.П., и др., 1981; Елецкий Ю.К., и др., 1984).

Нагди обнаружено, что при внесении экстрактов тимоцитов на 5-м часу культивирования через 1 час (на 6-м часу культивирования) достоверно уменьшается включение 3Н-тимидина в эксплантаты при дозе экстрактов, соответствующей 5 и 20 млн. клеток на лунку. Однако на 10 и 20 часах влияния экстрактов не выявлялось (Рис.5).

Мезентериальные лимфо-

Вхлюченмэ *Нтад э гкеллзнтаты под влиянием тимоцитовгг

ПКонтероль ; У Опыт

2Е0 200 150 100 50 0

Время культнзмрозанкл Рис.4 в час 10 час 20 час

350 -|

300 2 - 3

250 - С 3

200 -

150 -

100 - ^ I

50

0 - |

Включение 'Нтмд под влиянием экстрактов тимоцитов

1 Л

к

1

* ^

а

I

5 20

6 час культксирогания

Рис.5

ДозаклэтокХЮ* К 1 5 20 20 тс культ*гиро-сгния

zca

200 -

1E0 -

100

SO

Включение 'Нтим □ г.ссплактаты под влияни&м мозмтернальных линфоцмтоз

ПИ^М

■Я-

ПКонтроль 1_10пыт

<

1*

Рис.6

1

Доза клеток Х1 О* 20

цнты отлича;этся от тимоци-тоа степенью зрелости, обладают выргжзнныи тропизиои к слизигтоЯ кишочкиха (Brsndtzaeg Р., et г!., 1939). В наших экспериментах изучали дозо- и врокя- эавксккыЯ оф-фо;а «озонтернальных лкм-фоцитоз. Выявлено, что чарео 20 4SCOQ культкзирозания ке-зантеризльныо лимфоциты в дозах 5 и 20 (¿т.н. клэтох на луу'ку достоверно ингибируют биосинтез ДНК в эксплантатах (Рис.6).

Т-клотки селезенки таюко, как и мезентериальныэ лимфоциты, являются дифференцированными клетками. Кроме того, в селезенке находится много лимфоид-ных клеток мигрирующих в слизистые, в тон числе и в кишечник (Brandtzaeg Р., et г!., 1939; Ernst Р.В., et а!., 1935). При мучении в течение 20 часов дозо - зависимого эффекта Т-лимфоцитов селезенки обнаружено, что с увеличением дозы клеток уменьшается включение 3Н-тимидина в эксплантаты. В контроле - 308.03 ± 27.97; при дозе Т-лимфоцитов 5 млн. -211.28 ±13.22 имп/мин; при дозе 10 млн. - 167.20 ± 12.85 имп/мин; при дозе 20 млн. и -150.14 ± 10.09 имп/мин. Морфологических особенностей эксплантата при воздействии Т-клеток не обнаружено. Таким образом, к 20-му часу ингиби-рующий эффект Т-лимфоцитов усиливается более, чем в два раза, по сравнению с контролем.

В серии экспериментов была поставлена задача олре-

250Т

200

150--

100 •■

50- •

о-и

Рис.7 К

Включение 9Нтмд в эксплантаты под влиянием лимфоцитов с бло-Т кированными процессами

биосинтеза

Тл БЛ РНК ДНК УБ

деления способности Т-Ш'.гфоцитсз, в которых С.-с:-.<?с~г.м Сиесмнтез белка, Pf'!', ДНК, а тах я:э, нвжшнвспосс5ныя кпэтох, уСптых кпф^г.гасм. г:«еиять включен',io 'Н-тиглндина з гкеплгнтаты. Псхззгнэ (Р-:с.7), что Слокгрсззниэ синтеза Gon:a (5'С), РНК (РНК), ДИК (ДЬЯС) в Т-ликфоцнтгя я уЗитыэ клетки (УБ) на лзменнот сяссй способности угнзтзть сточоике п зкеплентаты тонкой кмшх». Усетег-пкмэ дегч кнгг-битерп богха - цккле-гетссеища с 5 r.arhtn до 200 «хг/мл чзсткчко откчняяо кнт-бицию биесютггэ ДНК (Контроль: 102.4 ± 7.4; Т-Л№-фоцм-ти: <3.3 ± 3.3; 1'кйлогвкссм1«д: G3.S ± 5.0). Удало:ргцепто-рсс с пезерхнеети Т-ли'.г';сц!1-тез, и ус\т-:.к ся Т-кпзтох, с поиощыэ гр'.:пси-

слоссииссти на с.4л>очскго ®Н-

г"; '' y-i;'^"

K'UJKH.

Чтобы гыхичть, "сгут ял :-ч без их сокульт.-,смгог«.»~.ч с п:ш«чк :—и cwmcirr.mrni, клетки с?лес; нш, Т-л:««-фэцчты а т1:!~зциты рлздепьно •ультнегрогаяи а Tr-,:ir.:o сутсс Супермзтснты собирали. На 5-м чесу от начала культизкрозаная околлеитатоо, чззть ¡^льтург-ъной сряды о лункях з?.'.'си;лл:1 на 25% или 50% супер-юганто!.'. Покэгано, что сулсрна-тгнты зрелых клеток и'лчунной системы - сплзноцятсэ (Сц25%, Сц30%) и Т-л:'?.:фо-цитов (Тл25%, Тл50%) утнчтеют включение 3Н-т1^.глг,«на 9 эксплантаты к*шечт«ка в 32rixiivosTH от дозы. А супернатемты из ногрегых клзтех - тк:«оцитов (Тц25%, Тц50%)- не оказывают достоверного влияния (Р::с.8).

Тгход образом, нсг.м зылзлеио, что взашлодйПствиэл.г'фоцчтоз и кишгчного э^елл штата происходит черзз цитсхины, секротируемыо кт.откан.1 (гак ламфэздкьь r.v.i, тах и клэтхами эксплантата) а культур альную среду. Рожающим для максимального эффекта лимфоцитов является степень их зрелости. По-сидй'ло"/.у, еднич из основных гпмфекккоз, претендующих на роль регулятора клоточкоЛ пролиферации и дифференцировхи эпителия кишечника является гам-ла-интерферон (Cerf-Bensussan N. et al., 1934). Так же в состав факторов, продуцирующимися Т-клетка-

203 - *

1СЭ-

100 •

143 •

1~Э - •1

1СЗ- • S

со-

гэ - ' 1

= 40-

"!

й о-

Экяяжгпкэ ®Нтая s с!гея.~:нтяты ^г.-'л супсрнзтсктез

т, ГП т

X fr

Р V-.3

-А

г у

р I-

r.:rr;vii'L-:2 лч^фс^гы css-рот: .регпть-л яч^фоцитп-

ми, могут вхлючаться компоненты Т-клеточного рецептора (TCR), которые обладают супрессивными свойствами (Chen Y., et al!., 1994). IL-6 также может быть регулятором клеточной пролиферации опосредовано через другие цитокины (Levi B.Z 1996). Возможно влиянма IL-S и трмптазы - протеингзы секретируемой тучными клетками (BifflW.l. etall, 1696).

ВЛИЯНИЯ Т-АКГИВИНА НА БИОСИНТЕЗ ДНК В ЭКСПЛАНТАТАХ ТОНКОЙ КИШКИ. Т-активин применяется в клинической практике при разнообразных патологиях, связанных с нарушениями иммунитета (Лопухин Ю.М., 1982). Показано, что Т-ахтивин способен изменять пролиферативные процессы в эпителиальных тканях, при взедении in vivo (Мамонтов С.Г., и др., 1985). В связи с этим, влияние данного препарата представляет интерес в изучении взаимоотношений лимфоидной системы со слизистой хселудочно - кишечного тракта как in vitro, так и in vivo.

Обработка Т-лимфоци-тоз Т-активином (Тл+Та) достоверно отменяла их ингибирую-щий эффект (Рис.9). Голодание в течение 3-х суток приводит к значительным изменениям в состоянии желудочно - кишечного тракта, в том числе, вызывает существенные сдвиги пролиферации эпителиальных клеток тонкой кишки (Апарович Г.Г., Труфакин В.А., 1984). Поэтому, вероятна разница в реакции кишечника, полученного от интактных и голодавших животных, как на Т-активин, так и на Т-клетки. Нами показано, что при культивировании эксплантатов от интактных и голодавших животных с Т-активином изменения биосинтеза ДНК в эпителии не наблюдалось. Из литературы известно, что Т-активин способствует созреванию мало-дифференцированных клеток иммунной системы (Михна М.Г., и др., 1988; Маркова Т.П., 1990), в том числе, тимоцитов (Арион В.Я., и др., 1984; Ковальская Н.Л, и др., 1984). Можно ожидать, что обработка Т-активином тимоцитов вызовет их созревание, и это проявится при совместном культивировании с эксплантатами кишечника. Однако нами не найдено различий влияния между интакгными тимоцитами (Тц) и тимоцитами, обработанными Т-активином (Тц+Та) (Рис. 9).

300 т

Вхлючсннс 3Нт«д эксплантатами

под влиянием лиыфоцитос z обработанных Т-активинфм

Put, g

Показано, что экстракты Т-лимфоцитоз (140.1 ± 18.8), обработанных Т-аетизи-ном, по сравнению с контролем (161.6 ± 13.7) нэ влияют (экстракты Т-лимфоцитоз не обработанных Т-активином: 153.6 ±20.9). Экстракты тимоцитсв, обработанных Т-активином (115.6 ± 18.0) достоверно угнэтают включение 'Н-тимндина о эксплантаты тонкой кишки мыши, по сравнению с экстрактами тимоцитоз, не обработанных Т-активином, (140.4121.6).

Различная последовательность обработки Т-лимфо-цитов Т-активином, циклогексе-мидом (ингибитором синтеза белка) и трипсином показала (Рис.10), что Т-аетивин отменяет ингибицию биосинтеза ДНК в эксплантатах как нормальными Т-клетками, так и Т-клетками, предварительно обработанными циклогексемидом (БЛ+Та) или трипсином (ТП+Та). Но он не отменял нгибицию биосинто-за ДНК в эксплантатах тонкой кишки мыши Т-клетками, при предварительной обработка клеток Т-активином, с последующей обработкой их циклогексемидом (Та+БЛ) или трипсином (Та+ТП).

Интерпретировать данные, полученные in vitro на процессы, которые происходят в организме, не всегда корректно. Поэтому, был поставлен эксперимент с изучением влияния Т-активина in vivo, при его внутрибрюшинном введении, на биосинтез ДНК в тонкой и толстой кишка интакт-ных и дестабилизированных го-

160 т i 140+|

120 100 + SOCO--

40 20

Включения 'Нтэд о эксплантаты под влиянием лммфоцитсэ обработанных Т-активинсм, циклоггя-самидом и трипсином

L

А

л

ñ

Рис.10

£

Е £ Р Í É

Включение ®Нтмд в аксплантаты

под влиянием Т-гктивина у интактнь!Х ti голодавших мышой

1001

Тактиа Кент

Рис.11

Р

х 5

ч о с; о

Тонкая кишка

X

S

!t O

о

Толстая кишка

лоданием мышей. Выявлено (Рис.11), что голодание снижает пролиферацию в тонкой кишке. Т-активин у голодавших животных достоверно повышал средние значения включения ®Н-тимцдина в тонкой кишке. В толстой кишке голодание не изменяло включение аН-тимидина, Т-активин, наоборот, несколько понижал пролиферацию у интактных, а у голодавших животных также вызывал достоверное увеличение биосинтеза ДНК. Таким образом, влияние Т-активина при введении его in vivo значительно отличалось от его применения in vitro. Следовательно, Т-активин может служить как фактором стабилизирующим пролиферативные процессы в кишечнике, так и адаптогенньш фактором при изменении физиологического состояния.

ВЫВОДЫ.

1. 'Н-тимидин включается преимущественно эпителиальными клетками тонкой кишки. Процессы биосинтеза в эпителии продолжаются на протяжении всего срока культивирования. Жизнеспособность большинства эпителиальных клеток сохраняется Показано наличие фазы стабилизации биосинтеза ДНК в эксплантатах с 5-го по 20-й час от культивирования.

2. Зрелые клетки иммунной системы и их супернатанты оказывают ингибирующее влияние на включение 'Н-тимидина в эксплантаты тонкой кишки мыши in vitro. При этом их влияние прямо зависит от дозы, вносимых клеток. Незрелые клетки иммунной системы • тимоциты не изменяют исходный уровень биосинтеза ДНК.

3. Действие лимфоцитов при сокультивировании с эксплантатами опосредуется через продуцируемые ими лимфокины. Ингибирующая способность лимфоцитов обуславливается фактором, изначально присутствующим в клетках.

4. Т-активин способен блокировать выделение Т-лимфоцитами фактора, ингибирую-щего пролиферацию эпителия тонкой кишки. При этом его активность зависит от поверхностных рецепторов и биосинтеза белка в лимфоцитах.

5. Т-активин корригирует функциональные изменения биосинтеза ДНК в кишечнике являясь, таким образом, адаптаогеном. Это позволяет рассматривать Т-активин как возможное средство для коррекции функциональных изменений кишечника, связанных с изменением пролиферации эпителия.

Внедрение результатов в практику.

Результаты и метод изучения структурно-функциональных особенностей эксплантатов кишечного эпителия культивированного in vitro и его изменения под влиянием различных факторов, используются для изучения влияния энтеросорбентов при патологических состояниях в экспериментальных исследованиях клиники Института клинической и экспериментально лимфологии.

СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ: Груфакин В.А., Апарович Г.Г., Соболева И.Н., Шмаков А.Н., Федянов А.В. ТИМОЦИТЫ В РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КИЛЕЧНОГО ЭПИТЕЛИЯ" // Бюллетень СО АМН СССР, 1987, No 6, стр. 100105.

Федянов А.В. "ВЛИЯНИЕ ТИМОЦИТОВ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК КИШЕЧНИКА В КУЛЬТУРЕ" И "Молодые ученые-медики --гауке и практическому здравоохранению". Тезисы докладов конференции молодых ученых СО АМН СССР, Новосибирск, 1989, стр. 55-56. Bhmakov A.N., Fedjanov A.V., Aparovich G.G., Trufakin V.A. "LIMPHOCYTES AS REGULATOR OF CELL PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION IN THE Dl-/ERSE TISSUE SYSTEM CONTAINING STEM CELLS" // Symposium. Molecular 'actors of hematopoiesis wed stem cell. Abstracts, Moscow, 1990, p. 80. Shmakov A.N., Panteleeva N.G., Fedjanov A.V., Trufakin V.A. "THE ROLE OF LYMPHOEPITHELIAL INTERACTION IN THE REGULATION OF SMALL NTESTINAL EPITHELIUM PROLIFERATION" // "7th International Congress of Mucosal Immunology. Abstract Book. Edited by Czechoslovac Immunological Society. Prague", 1992, p. 216.

Федянов А.В. "ВЛИЯНИЕ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЭКСПЛАНТАТА ТОНКОЙ КИШКИ IN i/ITRO" // Тезисы докладов. I съезд иммунологов России, Новосибирск, 1992, :тр. 495.

Груфакин В .А., Шмаков А.Н., Федянов А.В., Апарович Г.Г., Логинов В.А., Пантелеева Н.Г. "ЛИМФОИДНАЯ СИСТЕМА: РОЛЬ РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КИШЕЧНОГО ЭПИТЕЛИЯ" // Тезисы докладов на XI съезде анатомов, гистологов, эмбриологов. Полтава, 1992, стр. 50. Федянов А.В. "ПРОЛИФЕРАЦИЯ ЭПИТЕЛИЯ ЭКСПЛАНТАТА ТОНКОГО КИШЕЧНИКА МЫШИ IN VITRO ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ КЛЕТОК И ГОРМОНОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ" // Тезисы на конференции молодых ученых. Москва, 1993, стр. 75.

Федянов А.В., Труфакин В.А. "БИОСИНТЕЗ ДНК В ЭКСПЛАНТАТАХ КИШЕЧНОГО ЭПИТЕЛИЯ МЫШИ IN VITRO" // Бюллетень Сибирского отделения РАМН, 1995, No 2. с 69-72.

Fedyanov A.V. and Trufakin V.A. "IMMUNE MECHANISMS INVOLVED IN THE PROLIFERATION OF EPITHELIAL CELLS OF SMALL INTESTINE." // Abstract, 27th Scandinavian Society for Immunlogy Meeting, Turku, May 24-27, 1996.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. БЛ - белок, Вл - В-лимфоциты, Имп/мин - импульс в минуту на 1 рограмм ДНК, К - контроль, Сц - спленоциты, Та - Т-актавин, Тл - Т-лимфо-ы, ТП - трипсин, Тц - тимоциты, УБ - убитые, 3Нтмд- 3Н-тимидин.