Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Роль полиморфных вариантов генов p53, CCR5, XRCC1 и XPD в патогенезе острого лимфобластного лейкоза у детей

На правах рукописи

Сметанникова Наталья Анатольевна

РОЛЬ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ ГЕНОВ р53, СС115,ХЛСС1 \\XPD В ПАТОГЕНЕЗЕ ОСТРОГО ЛИМФОБЛАСТНОГО ЛЕЙКОЗА У ДЕТЕЙ

14.03.03 — патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

7 ДПР 2011

Томск - 2011

4842053

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Малкова Елена Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Хлусов Игорь Альбертович

доктор медицинских наук Дмитриева Алла Ивановна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-иследовательский институт медицинской генетики Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Защита состоится «о?9 » (ХпУ\с.-(Л. 2011 года в 4С ""часов на заседании

диссертационного совета (Ц 208.096.01 Сибирского государственного медицинского университета (634050, г. Томск, Московский тракт, д. 2)

С диссертацией можно ознакомиться в Научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан » ^кХкщд 2011 г.

т

Ученый секретарь диссертационного совета

И.В. Петрова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) составляет около одной трети всех злокачественных новообразований детского возраста. Несмотря на успехи последних десятилетий (адекватное лечение позволяет добиться пятилетней бессобытийной выживаемости в среднем для 80 % пациентов), общий показатель летальности остается достаточно высоким (в пределах 20 %). У 7-10 % детей при разных вариантах программной терапии возникают рецидивы заболевания [Владимирская Е.Б., 2003; Баранов A.A., 2006]. Изучение механизмов развития и прогрессии острого лимфобластного лейкоза с последующей разработкой диагностических и терапевтических подходов является приоритетным направлением детской онкогематологии и патофизиологии.

Известно, что процесс онкогенеза включает патологические изменения на молекулярном и клеточном уровнях. Для лейкозных клонов характерны нарушения клеточного гомеостаза с дестабилизацией структуры генома и дисбалансом процессов пролиферации/апоптоза [Владимирская Е.Б., 2001; Владимирская Е.Б., 2003; Belson М., 2007; Rowley J.D., 2008].

Предрасположенность к развитию злокачественных новообразований и опухолевая прогрессия модифицируются аллельными вариантами генов, контролирующих деление, апоптоз клеток и эксцизионную репарацию ДНК. В их число включаются однонуклеотидные полиморфизмы (ОНП) dupl6 bp (11951-11966), G12141C и G13494A гена р53, deB2bp (794-825) гена CCR5, G28152A гена XRCC1 и А35931С гена XPD [Цвиренко С.В., 2006; BoluferP., 2006; OsorioA., 2006; Matullo G., 2006; Srivastava A., 2008; LevyN., 2009]. Исследованию названных полиморфизмов при остром лимфолейкозе у детей посвящены единичные работы зарубежных авторов [Joseph Т., 2005; ZhuR., 2005; Pakakasama S., 2007], в России связь полиморфизмов генов р53, CCR5, XRCCI и XPD с лейкозогенезом не изучалась.

Генные полиморфизмы принято считать конститутивными признаками стволовых кроветворных клеток, но прогрессия лейкозных клонов может сопровождаться переходом гетерозиготных генотипов в гомозиготные [Sinclair К., 2004; Irving J.A.E., 2005; CarrL.L., 2008]. Сведения о подобных изменениях генотипического профиля генов р53, CCR5, XRCC1 и XPD при остром лейкозе у детей в литературе не представлены. Кроме того, отсутствуют данные о взаимосвязи полиморфных вариантов этих генов с исходами терапии острого лимфолейкоза детского возраста.

Цель работы: выявить особенности полиморфных вариантов генов р53, CCR5, XRCCI и XPD у детей, больных острым лимфобластным лейкозом, и установить их связь с риском развития, клинической стадией и исходом программной терапии заболевания.

Задачи исследования: 1. Оценить соотношение частот аллелей и генотипов полиморфизмов dupl6bp (11951-11966), G12141C и G13494A гена р53, del32 bp (794-825) гена CCR5, G28152A гена XRCCI, А35931С тешХРО у детей, страдающих острым лимфобластным лейкозом.

2. Провести сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов р53, ССЯ5, ХКСС1 и ХРО у пациентов с дебютом и полной клинико-гематологической ремиссией острого лимфобластного лейкоза.

3. Охарактеризовать изменения полиморфного профиля генов р53, ССК5, ХВ.СС1 и ХРО у больных острым лимфобластным лейкозом, связанные с потерей гетерозиготности.

4. Исследовать влияние мутационного статуса экзона 7 гена-онкосупрессорар53 на развитие острого лимфобластного лейкоза у детей.

5. Установить механизмы формирования острого лимфобластного лейкоза в детском возрасте в зависимости от полиморфизмов генов р53, ССК5, ХИСС1 и ХРО,

6. Оценить влияние генетических маркеров рЗЗ, ССК5, ХКСС1 и ХРй на результаты полихимиотерапии острого лимфобластного лейкоза.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное исследование полиморфизмов аир 16 Ьр (11951-11966), 012141С. 013494А (ген р53), с!е!32 Ьр (794-825, ген С СЛ.5), 028152А (ген ХКСС1) и А35931С (ген ХРО) у детей, страдающих острым лимфобластным лейкозом, в различные периоды заболевания.

Получены новые фундаментальные данные о роли полиморфных вариантов генов р53, ССЯ5, ХКСС1 и ХРО в патогенезе острого лимфобластного лейкоза в детском возрасте.

Показано, что в формирование индивидуального риска развития острого лимфобластного лейкоза у детей вовлечены минорные аллели генов эксцизионной репарации ДНК ХЯСС1 (А28152) и ХРО (С35931), а также делецированный вариант гена хемокинового рецептора ССЯ5 (<М32 Ьр).

Впервые выявлена потеря аллельных копий гетерозиготных локусов Зр21.3 (ген ССП5) и \9ql33 (гены ХКСС1 и ХРО) при остром лимфобластном лейкозе в детском возрасте, которая может выступать как молекулярный фактор промоции и прогрессии лейкозогенеза.

Установлено, что редкие варианты с!ир16 Ьр в интроне 3, С12141 в экзоне 4 и А13494 в экзоне 6 гена р53 являются неблагоприятными прогностическими критериями в отношении рецидивирования острого лимфобластного лейкоза. В то же время иосительство гомозиготных диких генотипов рЗЗ в сочетании с вариантными генотипами ХЯСС1 и ХРО ассоциируется с положительными результатами ангилейкемической терапии у детей.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты, полученные при исследовании полиморфизмов с1ир 16 Ьр (11951-11966), 012141С и в 13494А гена р53, с!е132 Ьр (79Ф-825) гена ССК5, 028152А гена ШСС1 и А35931С гена ХРО у детей, больных острым лимфобластным лейкозом, развивают современные представления о роли генетических изменений в патогенезе злокачественных заболеваний системы кроветворения.

Данные о наличии минорных аллелей генов ССИ5 (с!е132 Ьр), ХКСС1 (А28152) и ХРО (С35931), в особенности при сочетанном обнаружении, могут

использоваться в качестве дополнительных критериев индивидуального риска развития острого лимфобластного лейкоза у детей.

По локусам генов CCR5, XRCC1 и XPD у некоторых первичных больных острым лимфобластным лейкозом зафиксирована потеря гетерозиготности, восстановление которой по достижении ремиссии заболевания может отражать редукцию опухолевого клона.

Изучение комбинаций полиморфизмов генов р53, CCR5, XRCC1 и XPD, определяющих соотношение проапоптотической и антиапоптотической регуляции, целесообразно при выборе протокола антилейкемической терапии.

Обнаруженные ассоциации минорных вариантов гена р53 (duplöbp, С12141, А13494) с возникновением рецидивов острого лимфобластного лейкоза у детей позволяют рассматривать их в качестве дополнительных факторов прогноза заболевания.

. Показана необходимость дальнейшего изучения генетических полиморфизмов р53, CCR5, XRCC1 и XPD у больных детей для уточнения их функциональной роли в инициации и прогрессии острого лимфобластного лейкоза.

Внедрение в практику. Результаты исследования внедрены в работу Областного детского онкогематологического центра Новосибирска.

Положения, выносимые на защиту: 1. Минорные аллели генов CCR5 (del32 Ър), XRCC1 (А28152) и XPD (С35931) формируют риск развития острого лимфобластного лейкоза в детском возрасте, поскольку доля вариантных генотипов у заболевших детей статистически значимо превышает таковую у здоровых доноров.

2. У первичных больных острым лимфобластным лейкозом (преимущественно носителей аллеля А28152 гена XRCC1) опухолевые клетки утрачивают гетерозиготность по генетическим локусам CCR5, XRCC1 и XPD (соответственно в 66,7 %, 20,0 % и 29,4 % случаев), что подтверждает патогенетическую значимость данных маркеров.

3. Частота встречаемости минорных аллелей duplö bp (интрон 3), С12141 (экзон 4) и А13494 (интрон 6) гена р53 при рецидивах острого лимфобластного лейкоза значительно выше, чем при безрецидивном течении заболевания, что отражает их влияние на прогрессию лейкозогенеза в детском возрасте.

Апробация материалов диссертации. Материалы исследования были представлены на Российской научно-практической конференции «Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2004); VI Всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы фундаментальной и прикладной медицины» (Новосибирск, 2006); Российской научно-практической конференции с международным участием «Современные методы лечения онкологических больных: достижения и неудачи» (Барнаул, 2006); Российской конференции «Фундаментальная онкология - Петровские чтения» имени проф. H.H. Петрова (С.-Петербург, 2005, 2006, 2007, 2010); Российском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2005,2006, 2007,2008,2009,2010).

Реализация результатов исследования. По материалам исследования опубликовано шесть статей, отражающих основные положения диссертации, в журналах рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 144 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, глав, представляющих полученные результаты и их обсуждение, заключения, выводов, списка литературы. Работа содержит 26 таблиц и 13 рисунков. Список литературы включает 273 источника (31 отечественный и 242 зарубежных).

Вклад автора в диссертационную работу. Автором проведены анализ историй болезни пациентов, генотипирование групп больных и здоровых детей методом ПЦР-ПДРФ по полиморфизмам генов р53, CCR5, XRCCi и XFD (включая определение гаплотигюв и SSCP-анализ экзона 7 гена р53), а также статистическая обработка, описание и интерпретация полученных результатов.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Общая характеристика клинических групп Проведены анализ историй болезни, обследование и генотипирование по полиморфизмам генов р53, CCR5, XRCCI и XPD 103 детей с подтвержденным диагнозом ОЛЛ, в 2002-2007 гг. получавших лечение но протоколу ALL МВ-2002 в Новосибирском областном детском онкогематологическом центре (рис. 1). Источником ДНК для модекулярно-генетического анализа служили образцы периферической крови и мазки костного мозга больных детей, полученные при установлении диагноза ОЛЛ до начала полихимиотерапии (ПХТ) и в фиксированные временные точки протокола лечения (переданы из областного детского онкогематологического центра Новосибирска (заведующая - заслуженный врач РФ В.Д. Злобина)).

Для обозначения аллельных вариантов генов р53, CCR5, XRCC1 и XPD в настоящей работе была использована номенклатура, учитывающая их ереднепопуляционную частоту встречаемости у европеоидов (Wu X., 2002). Символом W (wild) обозначены более распространенные (дикие) алдельные варианты, М (minor) - редкие (табл. 1).

Поиск генетических вариантов, ассоциированных с развитием ОЛЛ, осуществляли путем сравнения частотного распределения исследуемых полиморфизмов у больных и здоровых детей. На начальной стадии заболевания полиморфизмы генов рЗЗ, CCR5, XRCC1 и XPD были проанализированы у 93 пациентов (45 мальчиков и 48 девочек) в возрасте от 7 мес. до 16 лет (средний возраст 6,32 + 0,39 лет, s = 3,76). Группу сравнения составили 110 мальчиков и 110 девочек (средний возраст 15,5+0,07 лет, s = 1,52) без признаков острых заболеваний, не страдавших онкологическими и системными заболеваниями и не получавших гормональных препаратов. Образцы ДНК здоровых детей предоставлены НИИ терапии СО РАМН в рамках проекта МНТЦ №2311 (руководитель - академик РАМН, проф. М.И. Воевода)).

Больные OJIJI, n=103

т

дети, обследованные только в дебюте ОЛЛ, п=56

дети, обследованные как в дебюте, так и в ремиссии OJIJ1, п=37

дети, обследованные только в ремиссии ОЛЛ, п=10

Первичные больные ОЛЛ (ПБ), п=93

Клинические методы

т

^ Анамнестические

Клиническое наблюдение Лабораторные и инструментальные (OAK, ОАМ, биохимический анализ крови, стернальная и люмбальная пункция, рентгенография органов грудной клетки, УЗИ органов брюшной полости, ЭКГ)

Пациенты с ремиссией ОЛЛ (Р), п=47

ПЦР-ПДРФ-анализ полиморфизмов генов р53, CCR5, XRCC1 uXPD: S dup 16 bp (11951-11966) в интроне 3 генар53: п(ПБ)=92, п(Р)=47, п(ЗД)=217 ^ G12141C (Arg72Pro) в экзоне 4 гена р53:

п(ПБ)=93, п(Р)=47, п(ЗД)=220 S G13494А в интроне 6 генар53: п(ПБ)=92, п(Р)=47, п(ЗД)=220 del 32 bp в экзоне 3 гена CCR5: п(ПБ)=92, п(Р)=47, п(ЗД)=216 ^ G28152A (Arg399Gln) в экзоне 10 rem XRCCI: п(ПБ)=92, п(Р)=47, п(ЗД)=202 ^ А35931С (Lys751Gln) в экзоне 23 гена XPD: п(ПБ)=90, п(Р)=47, л(3д)=203

Здоровые дети (ЗД), п=220

Молекулярио-генетнческие методы

(для каждой группы сравнения указано число информативных результатов)

SSCP-анализ экзона 7 генар53: п(ПБ)=40

Секвенирование экзона 7 гена р53: п(ПБ)=4

Исследование потери гетерозиготности локусов генов р53, CCR5, XRCC1 и XPD: п(ПБ)=36, п(Р)=36

Анализ комбинаций полиморфизмов генов р53, ССИ5. ХЯСС1 иХРй:

^ Комбинации генотипов р53: п(ПБ)=92, п(Р)=47, п(ЗД)=216

^ Гаплотипы р53:

п(ПБ)=92, п(Р)=47, п(ЗД)=216

✓ Генотипы/?53-ССЯ5: п(ПБ)=91, п(Р)=46, п(ЗД)=210

✓ Генотипы р53-ХЯСС1\ п(ПБ)=91, п(Р)=47, п(ЗД)=197

✓ Генотипы р53-ХРй: п(ПБ)=89, п(Р)=47, п(ЗД)=202

✓ Генотипы ХИСа-ХРО: п(ПБ)=90, п(Р)=44, п(ЗД)=185

Рис. 1. Дизайн исследования.

Таблица 1

Обозначение аллельных вариантов генов р53, CCR5, XRCC1 и XPD

Ген/маркер Аллельный вариант

р53 (интрон 3) W отсутствие дупликации 16 п.н.:- Лф16 Ьр

М дупликация 16 п.н. (позиции 11951-11966): <1ир16 Ьр

р53 (экзон 4) W 012141 (соответствует А^72)

м С12141 (кодирует Рго72)

р53 (интрон 6) W 013494

м А13494

CCR5 W отсутствие делеции 32 п.н.: - (1е132 Ьр

м делеция 32 п.н. (позиции 794-825): ёе132 Ьр

XRCC1 W 028152 (соответствует А^399)

м А28152 (кодирует С1п399)

XPD W А35931 (соответствует Ьуз751)

. м С35931 (кодирует ®п751)

При интерпретации результатов исследования учитывали гетерогенность лейкоцитарного пула у больных OJIJI: доля циркулирующих бластов составила в среднем 69,4 %+8,7 % (s = 24,6), их содержание в миелограмме - в среднем 76,7 %±5,4 % (s = 14,3). В связи с этим была сформирована дополнительная группа сравнения из пациентов, достигших полной клинико-гематологической ремиссии OJIJI. На данной стадии периферическую кровь принято считать свободной от опухолевых клеток, а их содержание в костном мозге не превышает 5% [Алексеев H.A., 1998]. В данную группу вошли 47 детей (18 мальчиков и 29 девочек, средний возраст 6,56 ± 0,53 лет, s = 3,64), включая 37 больных, обследованных и в дебюте, и в ремиссии заболевания. Исследование проводили в соответствии с «Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан» (Указ Президента РФ от 24.12.93 №2288) под контролем этического комитета Новосибирской центральной районной больницы.

Методы исследования

Генотипирование групп сравнения проведено методом полимеразной цепной реакции - полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ). Анализ ОНП гена р53 был дополнен определением гаплотипов (аллельных сочетаний обеих хромосом) и поиском миссенс-мутаций в экзоне 7 методами SSCP и секвенирования (секвенирование выполнено заведующим лабораторией молекулярной диагностики ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» к.б.н. В.А. Терновым) (табл. 2).

Исследование потери гетерозиготности локусов р53, CCR5, XRCC1 и XPD у детей с OJIJI проводили путем генотипирования 37 парных ДНК-образцов, полученных при установлении диагноза и достижении полной клинико-гематологической ремиссии. Выводы об утрате аллельных копий делали на основании редукции числа продуктов ПЦР (ген CCR5) либо гидролиза (гены XRCC1 и XPD) в образцах первичных больных.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ Microsoft Excel ХР и Statistica v.6.0. При анализе частотного распределения аллелей, генотипов (включая сравнение полученных значений с ожидаемыми в соответствии с равновесием Харди-Вайнберга), генотипических и гаплотипических комбинаций в исследуемых группах, а также при сравнении показателей выживаемости больных использовали стандартный критерий % с поправкой Йетса на непрерывность. В случаях, если хотя бы одно из значений в четырехпольной таблице было меньше или равно пяти, применяли точный критерий Фишера в двустороннем варианте. Для отклонения нулевой гипотезы принимался уровень значимости р < 0,05 (при сравнении с помощью критерия Х ) либо Р<0,05 (при сравнении с помощью точного критерия Фишера). Характер ассоциативной связи вариантов генов и их сочетаний с риском развития OJTJI оценивался, исходя из расчета отношения шансов OR (odds ratio) с 95% доверительным интервалом (CI) (Реброва О.Ю., 2002; http://www.statsoft.ru/ home/textbook).

_Таблица 2

Анализ гаплотипических сочетаний полиморфизмов генар53 [Wu X., 2002]

Парный гаплотип Структура праймеров Ампликон, п.н. Рестриктаза, фрагменты гидролиза, п.н.

шггронЗ/ экзон4 F 5' ATGGGACTGACTTTCTGCTCTT 3' R 5' TCAAATCATCCATTGCTTGG 3' 430+446 Bi/FNl; WW/ММ -446,231,199 WM/MW-430,247, 199

экзон 4/ интрон 6 I раунд. F 5' TTCCTGAAAAACAACGTTCTGG 3' R 5' CCCCCCTACTGCTCACCC 3'* 1618 -

П раунд. F 5' CTGGTAAGGACAAGGGTTGG 3' R 5' ACTGACCGTGCAAGTCACAG 3' 396 SsiFNl; WW/MM-231, 165 WM/MW-396

интронЗ/ интрон 6 I раунд. F 5' TTCCTGAAAAACAACGTTCTGG 3' R 5' CCCCCCTACTGCTCACCC 3'* 1618 -

П раунд. F 5' TTCCGTAAAAACAACGTTCTGG 3' R 5' TCAAATCATCCATTGCTTGG 3' WW/MM-147 WM/MW-163 -

Анализ мутационного статуса генар53 [Бартновский А.Э., 2003]

Область гена Структура праймеров Ампликон, п.н.

экзон 7-интрон7 F 5' GCCTCATCTTGGGCCTGTGTTATC 3' R 5' AAATGTGATGAGAGGTGGATGGGTAGTAG 3' 266

Примечание. *- аллель-специфичный праймер.

Продолжение таблицы 2

ПЦР-ПДРФ-анализ полиморфизмов генов р53, CCR5,XRCC1 и XPD

Ген, полиморфизм Позиции GeneBank № / rs no. Структура праймеров Ампликон, п.н'. Рестриктаза, фрагменты гидролиза, п.н. Источник литературы

р53 интрон 3 dupl6 bp 1195111966 Х54156/ 17878362 F 5* TTCCTGAAAAACAACGTTCTGG 3 R 5' TCAAATCATCCATTGCTTGG 3' W- 147 M-163 Wu X., 2002

р53 экзон 4 G>C (Arg72Pro) 12141 Х54156/ 1042522 F 5' CTGGTAAGGACAAGGGTTGG 3 '; R 5' ACTGACCGTGCAAGTCACAG 3' 396 Äs/FNl; W-231, 165 M-396

р53 интрон 6 (G>A) 13494 Х54156/ 1625895 F 5' TGGCCATCTACAAGCAGTCA 3'; R 5' TTGCACATCTCATGGGGTTA 3' 404 Mspl; W-336,68 M-404

CCR5 экзон 3 del32 bp 724-825 Х91492/ 333 F 5' CAATGTGTCAACTCTTGACAGG 3'; R 5' ACCTGCATAGCTTGGTCCAACC 3' W- 548 M-516 - Romano J.W., 1999

F 5' GAAGGTCTTCATTACACCTG 3'; R 5' AGAGTTCCTGGAAGGTGTTC 3' W-277 M-245 - Yudin N., 1998

XRCC1 экзон 10 G>A (Arg399Gln) 28152 AF512504/ 25487 F 5' TTGTGCTTTCTCTGTGTCCA 3' R 5' TCCTCCAGCCTTTTCTGATA 3' 615 Msp 1; W - 376,239 M-615 Casse C., 2003

F 5' CCCCCAAGTACAGCCAGOTC 3' R 5' TGCCCCGCTCCCTCTCAAGTAG 3' 242 Msp I; W-148,94 M-242 Duell ER., 2000

XPD экзон 23 A>C (Lys751Gln) 35931 L47234/ 3181 F 5' CAGGTGAGGGGGACATCTG 3' R 5' CTTTCCCTTTCCTCTGTTC У 737 Pstl; W-708,29 M-645, 63, 29 Rybicki В.A., 2004

F 5' TCTGCAGGAGGATCAGCTG 3' R 5' GCAAGACTCAGGAGTCAC 3' 149 Pstl; W - 143,6 M-80,63,6 Mechanic L.E, 2005

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Анализ частотного распределения индивидуальных полиморфизмов генов р53, ССК5, ХЯСС1 и ХРИ в группах сравнения

Полиморфизмы гена р53

При генотипировании парных ДНК-образцов больных изменений полиморфных маркеров гена р53 в зависимости от стадии ОЛЛ не выявлено. Сопоставление частот встречаемости ОНП экзона4 в группах больных и здоровых детей также оказалось неинформативным. Пациенты как с дебютом, так и с ремиссией ОЛЛ отличались от здоровых доноров более высокой частотой встречаемости генотипов интронаЗ (-<1ир16 Ьр/-с1ир16 Ьр) и

интрона 6 (0013494) (рис. 2).

100% 80% 60% 40% 20% 0%

W M WW WM мм

W M WW WM мм

А Б

Рис. 2. Частотное распределение полиморфизмов duplô Ьр (А) и G13494A (Б) генар53 у больных острым лимфобластным лейкозом и здоровых детей. Примечания: 1.И- первичные больные, п=92; И- пациенты с ремиссией, п=47; □здоровые дети, п=220.

2. Указаны значимые различия с группой здоровых детей для первичных больных (*) и пациентов с ремиссией (**) (р <0,05 для рис. 2, А; р <0,01 для рис. 2, Б).

Доли носителей генотипа WW интрона 3 составили соответственно 90,2 % и 91,5 % против 75,6 % (р <0,05), генотипа WW интрона 6 - 94,6% и 95,7% против 63,2 % (р <0,01).

Полученные результаты свидетельствовали об отсутствии ассоциации индивидуального полиморфизма G12141C в экзоне 4 с развитием ОЛЛ в детском возрасте. Повышение распространенности диких генотипов интронов 3 и 6 у больных ОЛЛ можно интерпретировать различным образом. Нуклеотидные вариации интронов определяют соматический статус генов, а также стабильность и сплайсинг мРНК [Hillebrandt S., 1997; Braithwaite A.W., 2005]. В геноме человека блок сцепления включает среднем 60 ОНП [Kochethu G., 2006], возможно интронные полиморфизмы гена р53 являются лишь сцепленными маркерами функционально значимых локусов. Не исключается, что генотипы -dup 16 bp/-dup 16 Ьр и GG13494 относятся к неспецифическим генетическим вариантам детского возраста [Пузырев В.П., 1996; Казначеев К.С., 2008].

Таким образом, «сбои» апоптотической программы бластных клеток, способствующие развитию ОЛЛ у детей не были связаны с полиморфизмами гена р53. Нарушение своевременной элиминации злокачественных клеток могло быть обусловлено подавлением транскрипции гена р53 [Krammer Р.Н., 2002; Weston V.J., 2004] или трансляции его мРНК [Ronen D., 1991], а также функциональным дисбалансом белков семейства Bel, включающего позитивные и негативные регуляторы митохондриального пути апоптоза [Dumont Р., 2003 ; Sullivan А., 2004].

Мутационный и полиморфный статус экзона/интрона 7 гена р53 у первичных больных ОЛЛ ДНК-образцы 40 первичных больных ОЛЛ были исследованы на наличие миссенс-мутаций экзона 7 гена р53. Методом SSCP-анализа в четырех образцах выявлены дополнительные однонитевые конформации. Из соответствующих нуклеотидных замен две обнаружены непосредственно в экзоне 7 и две другие - в смежной интронной области (табл. 3).

Таблица 3

Нуклеотидные замены в последовательности экзона/интрона 7 генар53 в ДНК-образцах первичных больных острым лимфобластным лейкозом

№№ Нуклеотидная Замена в Аминокислотная Количеств

позиций замена кодоне замена о образцов

14023 С>А АТОАТА Пе>11е 1

14084 А>С АСОССС Тгр>Рго

14183 С>Т ОНП С14183Т - 1

14201 T>G ОНПТ1420Ш - 3

Обе вариации кодирующей последовательности выявлены в одном и том же ДНК-образце, при этом трансверсия С14023А не связана с изменением первичной структуры белка р53, а замена А14084С определяла изменение его аминокислотной последовательности (Тгр253Рго). Транзиция С14183Т и трансверсия T14201G, идентифицированные в трех других ДНК-образцах, представляли собой редкие полиморфные варианты интрона7. Полученные результаты соответствовали данным о низкой частоте соматических мутаций гена р53 при ОЛЛ детского возраста [WadaM., 1993; KawamuraM., 1999; Бартновский А.Э., 2003].

Полиморфизм del 32 bp гена CCR5

Распределение полиморфизма CCR5del 32 у пациентов с ремиссией ОЛЛ характеризовалось значительным повышением частоты встречаемости минорного аллеля: 32,6% против 14,7% у первичных больных и 11,2% у здоровых детей при р < 0,01 (рис. 3). Уровень значимости различий с группой здоровых детей и показатель OR =3,84, CI95 % = 2,27-6,51 свидетельствовали о связи аллеля CCR5 del32 с развитием ОЛЛ. Различия между больными в дебюте и ремиссии ОЛЛ обусловлены потерей делецированной копии у 15 из 24 первичных гетерозиготных носителей (62,5 %). Клинико-гематологическая ремиссия предполагает элиминацию опухолевого клона [Алексеев Н.А., 1998],

которая сопровождается «возвращением» полиморфных локусов к первоначальному статусу. Восстановление гетерозиготного генотипа у пациентов, гомозиготных в дебюте заболевания, свидетельствовало об исходно высокой частоте аллеля СС115 с!е132 (М) у детей с ОЛЛ.

/

90% /А 80% \\ 70% I I 60%

50% Г Л 40% | I 30% |/I 20%

10% \ Ж

0% Щ

V/ М Ш! \Ш ММ

кПервичныебольные. п=92 ИПациенты с ремиссией. п=46

□Здоровые дети, п=219

Рис. 3. Частотное распределение полиморфизма с!е132 Ьр гена ССВ.5 у больных

острым лимфобластным лейкозом и здоровых детей. Примечание. Указаны значимые отличия пациентов с ремиссией от первичных больных (*) и здоровых детей (**) (р < 0,01).

Связывание хемокиновых лигандов с рецептором СС115 инициирует экспрессию генар53 посредством белков 1АК2, р38 и МАРК [МапеБ Б., 2003]. Делецированный аллель кодирует функционально неактивный белок, нарушение передачи апоптогенных сигналов могло способствовать малигнизации стволовых кроветворных клеток. С другой стороны, активация рецептора СС115 приостанавливает передачу сигнала в системе СХС114/СХС1Л2, индуцирующей синтез молекул адгезии созревающих бластных клеток к костномозговому матриксу. При этом незрелые лимфоидные элементы приобретают повышенную чувствительность к' хемотаксическим стимулам, способствующую их преждевременному выходу в кровоток |Х>щт£ I, 2001; Нопсгагепко М., 2002]. Хемокин ССЬ5 (КАЖЕБ) обладает выраженным митогенным эффектом в отношении клеток-предшественников В-лимфоцитов [Т>еапМ., 1999]. Поэтому нельзя исключить, что после начала заболевания у детей пониженная мембранная плотность ССК5 сдерживала промоцию ОЛЛ, ограничивая рост опухолевой массы и поступление злокачественных клеток системную циркуляцию.

Полиморфизм С28152А гена АЖСС7 (А^3990п) При анализе распределения ОНП С28152А гена ХКСС1 в группах сравнения выявляли значимое повышение частоты встречаемости минорного аллеля (А28152) в обеих выборках больных в отличие от здоровых детей: 46,7 % и 48,9 % против 34,2 % при р < 0,05 (рис. 4). Установлена потеря гетерозиготности данного локуса у четырех из 20 (20 %) носителей генотипа \\ГМ вследствие утраты аллеля М (А28152).

W M WW WM MM

п Первичные больные, п=92 иПациенты с ремиссией, п=46

□Здоровые дето, п=202

Рис. 4. Частотное распределение полиморфизма G28152A (Arg399Gln) гена

XRCC1 у больных острым лимфобластным лейкозом и здоровых детей. Примечание. Указаны значимые различия с группой здоровых детей для первичных больных (*) и пациентов с ремиссией (**) (р < 0,01).

Полученные данные указывали на связь редкого аллеля А28152 с развитием ОЛЛ у детей. Белковый фактор XRCC1 координирует элиминацию модифицированных азотистых оснований и однонитевых разрывов ДНК, возникающих с чрезвычайно высокой частотой как при воздействии на клетку генотоксических факторов, так и спонтанно [WoodRD., 2001; Sharer O.D., 2003; BremR., 2005]. Генный полиморфизм G28152A в экзоне 10 кодирует замену аминокислоты Arg399 на Gin в домене BRCT-I. Данная область связывает синтетазу PARP-1, которая выступает в роли первичного сенсора повреждений ДНК, подлежащих восстановлению путем эксцизионной репарации оснований (ЭРО). Поскольку указанное взаимодействие служит сигналом для формирования репаросомы, изменение конфигурации XRCC1 предположительно понижает его сродство к PARP-1, что, в свою очередь, может замедлить сборку репарационного комплекса [CaldecottK.W., 2003; McNally R.J.Q., 2004; Levy N.. 2009].

В лейкоцитах, содержащих 01п399-форму белка XRCC1, отмечено учащение рекомбинаций между сестринскими хроматидами [Duell E.J., 2000; Abdel-Rahman S.Z., 2000]. Гомологичная рекомбинация представляет собой способ восстановления двунитевых разрывов ДНК, возникающих при неэффективной репарации однонитевых поломок (прежде всего вблизи репликационной вилки) [Caldecott K.W., 2003]. Нарушение целостности обеих цепей ДНК является предпосылкой для лейкозогенных хромосомных аберраций, а также утраты копий соответствующих локусов [Bishop A.J., 2003; Greaves M.F., 2003; Takeuchi S., 2003]. Действительно, 15 из 17 больных ОЛЛ, у которых в настоящей работе выявлена потеря гетерозиготности по маркерам CCR5,XRCC1 и/или XPD, являлись носителями аллеля А28152 генаXRCC1.

Полиморфизм А35931С гена ХРЭ (Ьу8751С1п)

При сопоставлении результатов генотипирования обеих групп пациентов с ОЛЛ у пяти из 17 (29,4%) первичных гетерозиготных носителей была обнаружена потеря гетерозиготности: в трех случаях отмечена утрата минорного и в двух - дикого аллеля. Это обусловило дефицит генотипа (АС35931) у первичных больных: 31,1% против 49,9%, соответствующих равновесию Харди-Вайнберга (р = 0,0125) (рис. 5).

90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0%

W М WW WM MM

апервичныебольные. п=90 в Пациенты с ремиссией, п=47

□Здоровые дети. п=203

Рис. 5. Частотное распределение полиморфизма A35931С гена XPD у больных

острым лимфобластным лейкозом и здоровых детей. Примечание. Указаны значимые различия с группой здоровых детей для первичных больных (*) и пациентов с ремиссией (**) (р < 0,01).

У пациентов в дебюте и ремиссии ОЛИ в отличие от здоровых детей отмечено значимое повышение доли носителей аллеля М (С35931) и снижение частоты встречаемости варианта W (A3 5931): соответственно 53,3 % и 51,0 % против 18,0%; 46,7 % и 49,0% против 82,0% (р < 0,01). Предположено, что вариант М (С35931) гена XPD ассоциирован с развитием ОЛЛ у детей (OR = 5,21, CI95 % = 3,54-7,68 для первичной и OR = 0,22, CI95 % = 0,14-0,35 и OR = 4,56, CI95 % = 2,83-7,35 для ремиссионной группы). Ранее была показана связь минорного аллеля гена XPD с пониженной эффективностью эксцизионной репарации нуклеотидов (ЭРН) in vitro и in vivo [Spitz M.R., 2001; Hou S.M., 2002; Tang D., 2002; Vodicka P., 2004]. Тем не менее, равновероятная потеря аллельных копий гена XPD затрудняла оценку патогенетической роли трансверсии А35931С при ОЛЛ.

2. Анализ комбинаций полиморфизмов р53, CCR5, XRCC1 и XPD Генотипические комбинациир53 и CCR5

«Внешний» сигнал, воспринимаемый хемокиновым рецептором CCR5, передается на генр53 JAK2- или р38-МАРК-зависимым путем [Manes S., 2003]. Делеция 32 п.н. в гене CCR5 приводит к нарушению рецепции сигнала, тогда как полиморфизмы гена р53 могут изменять его функциональный ответ [Manes S-, 2003; http://genepassport.ru /base?GenID=41]. Для каждой группы сравнения проводили анализ генотипических комбинаций полиморфизмов р53

и ССЯ5, выявивший значимые различия между пациентами с ремиссией ОЛЛ и двумя другими группами (рис. 6).

Первичные больные, п=91

Пациенты с ремиссией, п=46

Здоровые дети, п=210

lililí!!!

ШШШШШШШт

| i 1 1 i

ш К." с.

í

■///м 'ШМШт

! i ;

01 ■ 2

03 шА

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

□ 5

Рис. 6. Генотипические комбинации полиморфизмов интрона 3, экзона 4, интрона 6 генар53 и del32 bp гена CCR5 у больных острым лимфобластным лейкозом и здоровых детей. Примечания: 1. Значимые отличия пациентов с ремиссией от первичных больных и здоровых детей: комбинация Kol - р53 WW/WW/WW - CCR5 WW (Р = 0,0010 и Р = 0,0028, соответственно); №2 - р53 WW/WW/WW - CCR5 WM+MM (р = 0,0107 и р = 0,0000, соответственно); №3 - р53 WW/WM+MM/WW - CCR5 WM+MM (р = 0,0255 и р = 0,0000, соответственно).

2. Комбинация №4 - р53 WM+MM/WM+MM/WM+MM - CCR5 WW не выявлена у пациентов с ремиссией (значимое отличие от здоровых детей при Р = 0,0108).

3. №5 - другие комбинации (значимых различий между группами не выявлено).

У пациентов с ремиссией ОЛЛ вариант WW гена CCR5 сочетался только с тройным гомозиготным диким генотипом р53 (WW/WW/WW), причем эту комбинацию выявляли значительно реже, чем в других группах. Напротив, у этих детей преобладали сочетания делецированного аллеля CCR5 (М) с генотипами р53, ассоциированными с высокой активностью апоптоза (WW/WW/WW или WW/WM+MM/WW). Возможно, что нарушение рецепции инициирующих сигналов вследствие делеции 32 п.н. в гене CCR5, выступало как независимый фактор блокировки апоптоза у больных ОЛЛ.

Генотипические комбинации р53 и XRCC1 На системном уровне генетическая стабильность поддерживается благодаря динамическому равновесию репарации ДНК и р53-зависимой элиминации дефектных клеток [Bernstein С., 2002; Суханова М.В., 2004]. Известны функциональные различия изоформ белка р53, обусловленные ОНП его гена [Wu X., 2002]. Полиморфизм G28152A гена XRCC1 влияет на кинетику и эффективность ЭРО [McNally R.J.Q., 2004; LevyN., 2009]. Комбинации генотипов р53 и XRCC1 определяли различное соотношение активности митохондриального апоптоза и ЭРО (рис. 7).

Первичные больные, п=91

Пациенты с ремиссией, п=47

Здоровые дети, п=197

ВЗ

04

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

Рис. 7. Генотипические комбинации полиморфизмов интрона 3, экзона4, интрона 6 генар53 и G28152A гена XRCC1 у больных острым лимфобластным

лейкозом и здоровых детей. Примечания: 1. Комбинация №1 - р53 WW/WW/WW - XRCC1 WW: значимое различие между пациентами с ремиссией и здоровыми детьми (Р = 0,0218).

2. Значимые отличия от здоровых детей как первичных больных, так и пациентов с ремиссией: комбинация №2 - р53 WW/WW/WW - XRCC1 WM+MM (р = 0,0082 и р = 0,0037, соответственно); №3 - р53 WW/WM+MM/WW - XRCC1 WM+MM (р = 0,0003 и р = 0,0006, соответственно).

3. №5 - другие комбинации (значимых различий между группами не выявлено).

Развитие OJIJI у детей ассоциировалось с дефицитом ЭРО. В этих условиях генетическая нестабильность бластных клеток преодолевалась только благодаря усилению цитоплазматического механизма апоптоза, на что направлена программная терапия OJUI [Владимирская Е.Б., 2002; Bonafe М., 2002]. У детей с OJIJI аллель М (А28152) гена XRCC1 сочетался преимущественно с функционально активными генотипами р53 (WW/WW/WW и WW/WM/WW).

Генотипические комбинации р53 и XPD

Известно, что взаимодействие белков р53 и XPD модулируется заменой Lys751Gln в контактной области последнего: ингибитор хеликазной активности р53 оказывает «предпочтение» Gln751-содержащей форме XPD, с чем связывают смещение внутриклеточного равновесия в сторону апоптоза [Wang X.W., 1996; Offer Н., 2002]. В группах сравнения было изучено распределение соответствующих генотипов р53 и XPD (рис. 8). В обеих группах больных OJIJI выявлено повышение доли носителей генотипов р53 WW/WW/WW и WW/WM+MM/WW в сочетании с аллелем М гена XPD. Данные комбинационного анализа указывали на связь пониженной активности ЭРН с развитием ОЛЛ у детей. Функционально активные варианты р53 определяли более благоприятное течение заболевания, обеспечивая митохондриальную индукцию апоптоза [Владимирская Е.Б., 2003].

Первичные больные, п=89

Пациенты с ремиссией, п=47

Здоровые дети, п=202

i ! 1 1 ! S 1

Ш

I ! i

| | '

iшшшштш

1 I 1

И1 ■ 2

ВЗ

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%О5

Рис. 8. Генотипические комбинации полиморфизмов интрона 3, экзона 4, интрона 6 генар53 и А35931С генаXPD у больных острым лимфобластным лейкозом и здоровых детей. Примечание. 1. Комбинация №1 - р53 WW/WW/WW - XPD WW: значимое различие между первичными больными и здоровыми детьми (р = 0,0196).

2. Значимые отличия от здоровых детей как первичных больных, так и пациентов с ремиссией ОЛЛ: комбинация №2 - р53 WW/WW/WW - XPD WM+MM (р = 0,0000 и р = 0,0008, соответственно); №3 - р53 WW/WM+MM/WW - XPD WM+MM (р = 0,0005 и р = 0,0000, соответственно); №4 - р53 WM+MM/WM+MM/WM+MM -XPD WW (Р = 0,0000 и Р = 0,0106, соответственно).

3. №5 - другие комбинации (значимых различий между группами не выявлено).

3. Исходы терапии острого лимфобластного лейкоза у детей с различными полиморфными вариантами генов р53, CCR5, XRCC1 и XPD

При сравнительном анализе методом «случай-контроль» выявляли ассоциации полиморфизмов генов р53, CCR5, XRCC1 и XPD с развитием ОЛЛ у детей. В дальнейшем генетические характеристики больных в дебюте ОЛЛ сопоставлялись с исходами инициальной химиотерапии (развитие рецидива или безрецидивное течение заболевания). Дополнительный анализ ОНП гена р53 позволил установить связь данных маркеров с исходами полихимиотерапии ОЛЛ у детей (рис. 9).

Подгруппа больных с рецидивом ОЛЛ по сравнению с пациентами с благоприятным течением заболевания характеризовалась значимым повышением частоты встречаемости редких аллелей (М) интронов 3 и 6: соответственно 16,7% против 3,2% и 13,3% против 1,3% (р < 0,05). Кроме того, только в данной подгруппе выявлялись носители гомозиготных минорных генотипов (Р = 0,0251 для генотипа ММ (СС12141) экзона 4).

Полученные данные указывали на ассоциацию редких аллелей гена р53 с прогрессией ОЛЛ в детском возрасте, несмотря на то, что с инициацией лейкозогенеза они, по-видимому, связаны не были. Известно, что действие антилейкемических препаратов (независимо от их фармакодинамических особенностей) реализуется через индукцию р53-зависимого алоптоза бластных клеток [Владимирская Е.Б., 2002; BonafeM., 2002]. Снижение

проапоптотической активности гена р53, обусловленное аддитивным эффектом минорных копий [\ViiX., 2002], могло повысить вероятность рецнливирования ОЛЛ вследствие неполной элиминации опухолевого клона.

0% 20% 40% 60% 80% 100% 0% 20% 40% 60% 30% 100%

А Б

Рис. 9.Частотное распределение полиморфизмов интрона 3 (А), экзона 4 (Б) и интрона 6 (В) генар53 у детей с развившимся рецидивом (Р+) и безрецидивным течением (Р-) острого лимфобластного лейкоза.

Примечание. Указаны значимые различая между подгруппами больных (*) (р < 0.05).

В распределении полиморфизмов генов ССЛЗ, ХВ.С.С1 и XТВ различий между подгруппами больных, в зависимости от результатов лечения обнаружено не было. Обобщенное представление о патогенетической значимости полиморфизмов генов р53, ССК5, ХКСС1 и ХРО для развития ОЛЛ у детей, основанное на данных литературы и результатах собственных исследований, отображает рисунок 10.

Стадии лейкозогенеза

Факторы лейкозогенеза [3 ,4, 5,60, 192, 236]

Патогенетически значимые варианты

генов (данные настоящей работы)

Предполагаемый механизм влияния

Аллель del32 bp гена CCRS

— —__о. — _ _

Аллель А28152 гена ХЯСС1-, | I аллель С35931 гена ;; ХРП I

Синтез функционально неактивного белка [77]

Нарушение рецепции «внешнего» апопто генного сигнала [78, 86, 108, 131,162,218]

Функциональный дефицит эксцизионной репарации ДНК [70,115,172,199, 249, 268, 269,270]

= Спонтанные мутации; аберрации хромосом [24, 70,167]

= Потеря гетерозиготного статуса прото- и антионкогенов [44, 64, 125]

Ген ССЯ5 дикого Ген ССЯ5 дикого

типа

типа

Аллели ¿ир16 Ьр, С12141, А13494 гена р53

Функционально активный мембранный рецептор [77]

Митогенная стимуляция меток-предшественников лигандом CCL5 (RANTES) [212]

Функционально активный мембранный рецептор [77]

= Десенситизация сигнальной системы СХСЯ4/СХСЬ12 [79,104] = Повышение хемотаксической чувствительности предшественников бластных клеток [79,104]

Ослабление апоптогенного эффекта полихимиотерапии [180, 231]

Рис. 10. Роль полиморфных генов р53, ССЯ5, ХЯСС1 и ХРП в патогенезе острого лимфобластного лейкоза у детей.

выводы

1. Полиморфизмы генов р53, ССЯ5. ХЯСС! и ХРО у больных с дебютом острого лимфобластного лейкоза характеризовались более высокой частотой встречаемости гомозиготных диких генотипов нитрона 3 (—(1ир16 Ьр/-сйф16 Ьр) и нитрона 6 (0013494) гена р53, а также минорных аллелей (и вариантных генотипов) ССЯ5 (с1е132 Ьр), XR.CC! (А28152) и ХРО (С35931), чем у здоровых детей.

2. По частотному распределению маркеров генов р53, ХЯСС! н ХРО группы больных с дебютом и клинино-гематологической ремиссией острого лимфобластного лейкоза между собой не различались. Генетическая частота встречаемости делегированного аллеля гена ССЯ5 у пациентов с ремиссией ОЛЛ превышала таковую как у первичных больных, так и у здоровых детей.

3. У первичных больных острым лнмфобласгаьш лейкозом зафиксирована потеря гетерозиготности по локусам генов СС'ЯЗ, ХЯСС! и ХРО с частотой 66.7 % (у 16 из 24 носителей) 20,0 % (у четырех из 20) и 29,4 % (у пяти из 17), соответственно. В 15 из 17 случаев (88,2%) утрата аллельных копий была сопряжена с носительством варианта А28152 гена ХЯСС!.

4. Значимых изменений первичной структуры экзона 7 гена р53 у большинства пациентов с острым лимфобластным лейкозом не выявлено.

5. В формирование острого лимфобластного лейкоза в детском возрасте вовлечены вариантные аллели генов ХЯСС! (А28152), ХРО (С35931) и ССЯ5 (<1е132 Ьр), увеличивающие риск развития заболевания.

6. Эффективность антилейкемнческой полихимиотерапин острого лимфобластного лейкоза усиливается сочетанием гомозиготных диких генотипов нитрона 3, экзона 4 и интронаб гена р53 с вариантными генотипами ХЯСС! и ХРО. Носительство комбинаций минорных аллелей гена р53 (Лир 16 Ьр, С12141 и А13494) предрасполагает к развитию рецидивов.

П РА КТИЧ ЕС КИЕ Р ЕКОМ ЕН Д АЦИИ

1. У детей, страдающих острым лимфобластным лейкозом, на этапе первичной диагностики заболевания необходимо проводить молекулярно-генетичеекпй анализ полиморфизмов с!ир 16 Ьр (интрон 3), С12141 (зкзон4) и 013494А (интронб) гена р.53 для уточнения прогностического риска рецидива заболевания.

2. Исследование генотипических комбинаций данных маркеров с ОНИ 028152А гена ХЯСС! и А35931С гена ХРО у первичных больных целесообразно для оптимизации выбора адекватного химиотерапевтического протокола.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Функциональный полиморфизм генов р53 и CCR5 у долгожителей Сибирского региона / М.А. Сметанникова, В.А. Белявская, H.A. Сметанникова и др. // Вестник РАМН. — 2004. — №11. — с. 25-29.

2. Опухолеассоциированный полиморфизм 72-го кодона генар53: данные исследования долгожителей Новосибирской и Тюменской областей и мета-анализа / H.A. Сметанникова, М.А. Сметанникова, В.А. Белявская и др. // Сибирский онкологический журнал.—2004. — Т. 2-3. — № 10-11. — С. 124-129.

3. Поиск генов «прочности» и «бренности»: роль полиморфизма некоторых ключевых генов иммунологического гомеостаза в развитии патологий, сокращающих продолжительность жизни / В.А.Белявская, H.A. Сметанникова, М.А. Сметанникова и др. // Молекулярная медицина. — 2005, —№3. —С. 55-60.

4. Генотипы и гаплотипы гена-онкосупрессора р53: ассоциация с продолжительностью жизни у русских Новосибирской области / H.A. Сметанникова, В.Н. Максимов, С.Н. Устинов и др. // Сибирский онкологический журнал. — 2006. — №2. — С. 37-41.

5. Изучение роли полиморфизма генов иммунологического гомеостаза в развитии острого лимфобластного лейкоза у детей / H.A. Сметанникова,

B.А. Белявская, К.С. Казначеев и др. // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Современные методы лечения онкологических больных: достижения и неудачи». — Барнаул, 2006. —

C. 233-234.

6. Полиморфизм гена XRCC1 у детей с острым лимфобластным лейкозом / К .С. Казначеев, H.A. Сметанникова, Т.И. Поспелова и др. // Вестник Новосибирского государственного университета. — 2006. — №4. — С. 4952.

7. Статус гена р53 и функционально связанных с ним генов при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) у детей и у здоровых жителей г. Новосибирска / H.A. Сметанникова, К.С. Казначеев, О.Г. Курская и др. // Материалы Ш Российской конференции «Фундаментальная онкология - Петровские чтения» имени проф. H.H. Петрова. — С.-Петербург, 2007. — С. 24-25.

8. Казначеев, КС. Потеря гетерозиготности у детей с острым лимфобластным лейкозом / К.С. Казначеев, H.A. Сметанникова // Материалы УЩ Российского конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии». — Томск. — 2009. — С. 262.

9. Казначеев, К.С. Феномен потери гетерозиготности у детей, страдающих острым лимфобластным лейкозом / К.С. Казначеев, H.A. Сметанникова // Педиатрия. Журнал имени Г.Н. Сперанского. — 2009. — Т.87. — №4. — С.85-91.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОЛЛ Острый лимфобластный лейкоз

ОНП Однонуклеотидный полиморфизм

ПДРФ Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ПЦР Полимеразная цепная реакция

п.н. Пара нуклеотидов

ПХТ Полихимиотерапия

ЭРН Эксцизионная репарация нуклеотидов

ЭРО Эксцизионная репарация оснований

Bel Семейство белков-регуляторов апоптоза (от B-cell lymphoma - В-

клеточная лимфома) BRCT-I Break repair carboxyl terminal domain I (С-концевая область белка,

взаимодействующая с участком повреждения ДНК) CCR5 С-С chemokine receptor type 5 (С-С хемокиновый рецептор 5) CI Cofidence interval (доверительный интервал) OR Odds ratio (показатель отношения шансов) PARP-1 Poly(ADP-ribose)polymerase-l (поли(АПР-рибозо) полимераза 1) SSCP Single .strand conformation polymoiphism (полиморфизм

одноцепочечных конформаций ДНК) XPD Xeroderma pigmentosum group D gene (ген пигментной ксеродермы, группа D)

XRCC1 X-ray cross-complementing group I gene (ген репарации комплементарных повреждений ДНК в результате рентгеновского излучения у китайских хомячков, группа I)

Сметанникова Наталья Анатольевна

Роль полиморфных вариантов генов р53, ССЛ5, ХКСС1 и ХРй в патогенезе острого лимфобластного лейкоза у детей Автореф. днсс. на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Отпечатано в центре оперативной полиграфии ИП. Нестеров П.Н. 630084 г. Новосибирск, ул. Кропоткина, 555