Автореферат и диссертация по медицине (14.00.17) на тему:Влияние интерлейкинов 1 и 2 на систему гемостаза

На правах рукописи

■ Г 5 ОД

Юхно Татьяна Ростиславовна & 1 гь он ш

ВЛИЯНИЕ ИНТЕРЛЕЙКИНОВ 1 И 2 НА СИСТЕМУ ГЕМОСТАЗА

14.00.17 - Нормальная физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медининскнх наук

Чита - 1999

• »

■е

Работа выполнена на кафедре нормальной физиологии Читинской государственной медицинской академии Научный руководитель -доктор медицинских наук Ю.А.Витковский Научный консультант -Заслуженный деятель науки Российской Федерации, лауреат премии Совета Министров СССР, доктор медицинских наук, профессор Б.И.КУЗНИК

Официальные оппоненты: Лауреат премии Совета Министров СССР.

доктор медицинских наук, профессор Н.Н.ЦЫБИКОБ

доктор медицинских наук В.Г.ПАТЕЮК

Ведущая организация -

Институт биорегуляции и геронтологии Северо-Западного отделения

РАМН

Зашита диссертации состоится 1999 ,

в_часов на заседании диссертационного совета Д 84.74.01 при

Читинской государственной медицинской академии (672000, г. Чита, ул. Горького. 39-А)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Читинской государственной медицинской академии по адресу: 672000. г. Чита, ул. Горького, 39-А

Автореферат разослан ' '___— / 1999 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 84.74.01

кандидат биологических наук, с.н.с. А.Н.Ложкина

УСЛОВНЫЕ ОБОЗНАЧНИЯ

ЛДФ - аденозинлифосфорная кислота: ЛИ - активатор нлазмпногепа: АТ-Ш - антитромбин III;

АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время;

ДВС - диссеминированное впутрисосудистое свертывание крови;

ВМК- высокомолекулярный кининоген:

ИАП - ингибитор активатора плазминогена;

ИФА - иммуноферментный анализ;

МонАТ- моноклональные антитела;

ПДФ- продукты деградации фибрина;

а2-МГ - а:-макроглобулин;

а,-АТ- а1-антитрипсин;

Ig- иммуноглобулин;

IL - интерлейкин;

РпС - протеин С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время активно изучаются механизмы иммунной регуляции физиологических функций, в том числе сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, свертывания крови и фибринолиза. Известно, что в организме существует единая интегральная клеточно-i-уморальная система защиты, включающая иммунитет, гемостаз и песпецифическую резистентность организма (Кузник Б.И.. Цыбиков H.H., 1982 - 1996; Витковский Ю.А., 1997). Изменения в одной из функциональных единиц этой системы влекут за собой сдвиги в других.

Важными связующими звеньями между ними являются цитокины, выступающие, с одной стороны, в качестве физиологических модуляторов клеточно-опосредованных механизмов регуляции системы гемостаза в норме, а с другой - триггеров гиперкоагуляции при развитии патологических состояний (Кузник Б.И. и соавт., 1995 - ¡999; Витковский Ю.А. и соавт., 1995 - 1999; Colucci М., 1995; Seghatchian М„ Samama М., 1996).

За последние годы накоплено достаточно много сведений об иммунных и гсмостатических нарушениях при различных патологических состояниях. Обнаружено, что в процессе гемокоагуляции образуются аутоантитела к активированным факторам свертывания крови (Цыбиков Н.Н. и соавт., 1982 - 1996). Установлено, что в регуляции системы гемостаза принимают участие макрофаги, моноциты, лимфоциты, гранулоциты, фибробласты, эндотелиоциты и другие клетки (Малежик JI.II, 1985; Кузник Б.И. и соавт., 1989; Ostcrud В., 1996; Pearson J.D., 1993; Semeraro N., Colucci M., 1992). Многочисленными исследованиями показано, что при заболеваниях, сопровождающихся ДВС-синдромом. одновременно происходят сдвиги в иммунитете, в том числе и в продукции цитокинов (Белокриницкая Т.Е., 1995-1999; Витковский Ю.Л., 1995-1999; Кузник Б.И., 1995-1999; Esmon С.Т., 1993; Muller-Berghaus G. et al., 1993; Seghatchian M.J., Samama M.M, 1996 - 1998). Более того, выявлено, что секреция медиаторов иммунного ответа зависит от исходного состояния крови (Витковский Ю.А., 1997). Особый интерес представляют провоспалительные цитокииы, являющиеся ключевыми молекулами в инициации иммунных и гемостатических реакций при различных заболеваниях. Однако до сих пор окончательно не установлены биологические эффекты этих молекул в поддержании жидкого состояния крови в условиях гиперкоагуляции и торможения фибринолиза. Решение этих вопросов позволит расширить наши сведения о патогенезе

геморрагических и тромбоэмболических осложнений, а также поможет разработать новью пути для диагностики, лечения и профилактики нарушений системы гемостаза.

Цель и задачи исследования. Основной целью наших исследований явилось изучение роли интерлсйкина-1 (IL-1) и IL-2 в регуляции системы гемостаза в норме и патологии.

В связи с этим решались следующие задачи:

1. Изучение влияния IL-1 и IL-2 на опосредованную лимфоцитами регуляцию сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, свертывания крови и фибринолиза в опытах in vitro.

2. Исследование действия IL-la, IL-ip и IL-2 на продукцию прокоагулянтов, антикоагулянтов и фибринолитических агентов в гепаринизированной и фибринолизной крови, а также в фибриновом сгустке.

3. Изучение взаимосвязи между содержанием IL-la, IL-ip и состоянием системы гемостаза у больных с ожоговой болезнью.

Научная новизна. Установлено, что 1Ь-1вызываст опосредованное лимфоцитами торможение адгезии и агрегации тромбоцитов. Клетки крови после краткосрочного контакта с IL-1 продуцируют антикоагулянты РпС, os-МГ и a)-AT. Продолжительное воздействие IL-1 повышает выброс прокоагулянтов лимфоцитами, присутствие же кровяных пластинок или коллагена усиливают этот эффект. IL-la и IL-ip проявляют действие, свойственное полному IL-1, как при краткосрочном, так и длительном контакте с лимфоцитами. IL-1 способствует продукции АП лимфоцитами, а в присутствии кровяных пластинок, особенно на фоне коллагена, приводит к секреции ИАП. IL-2, независимо от времени воздействия, усиливает синтез и секрецию лимфоцитами прокоагулянтов.

IL-1 способствует выбросу прокоагулянтов, антикоагулянтов и фибринолитических агентов из клеток крови в гепаринизированной и

кропи, а также фиирпповим 1>

гепаринизированпой крови 1Ь-1 стимулирует продукцию клетками антикоагулянтов - РпС. а:-МГ и агАТ, а также образование ИЛП; в фибринолизной крови угнетает продукцию РпС, сь-МГ, сц-АТ и ингибирует фибринолиз; в сгустке крови - тормозит синтез РпС, а2-МГ и агА'Г и стимулирует фибринолиз. В сгустке 1Ь-1(3 способствует выходу АП, а 1Ь-2 - ИАП. В фибринолизной крови обе фракции 1Ь-1 (а и (3) усиливают продукцию ИЛП.

При заболеваниях, сопровождающихся внутрисосудистым свертыванием крови на фоне иммунодефицитов, наблюдается усиление продукции 1Ь-1а и 1Ь-1Р. Наличие внутрисосудистого свертывания крови при ожоговой болезни сопровождается пропорциональным увеличением содержания [Ь-1а и 1Ь-1р. У больных с ожоговой болезнью в суточной культуре гепаринизированной крови повышается, а в кровяном сгустке и фибринолизной крови снижается продукция 1Ь-1р.

Практическая ценность работы. Полученные нами данные свидетельствуют о способности 1Ь-1а, 1Ь-1Р и 1Ь-2 изменять ход гемостатических реакций в норме и патологии. В связи с этим результаты исследований могут быть полезными для расширения сведений о патогенезе заболеваний, сопровождающихся нарушениями гемостаза и иммуногенеза, и с учетом сказанного позволяют более корректно подходить к лечению больных. Повышение концентрации

провосиалительных 1Ь-1а и 1Ь-1Р при заболеваниях является дополнительным критерием в диагностике различных изменений в системе гемостаза, в том числе и развития ДВС-синдрома.

Внедрение в практику. Материалы диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедр нормальной и патологической физиологии ряда вузов страны. Автором разработаны, модифицированы и

внедрены в научные исследования теоретических и клинических кафедр Читинской медицинской академии лабораторные тесты для экспериментальных и клинических целей.

Апробация диссертации. Материалы исследований доложены на заседаниях Читинского отделения общества физиологов и патофизиологов в 1996, 1997,1998 и 1999 г.г.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 таблицами и 10 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 2 глав собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов, практических рекомендаций и списка литерачуры, включающего 112 отечественных и 165 зарубежных источников.

Положения, выносимые на защиту.

1. IL-lcx и IL-1 Р, воздействуя на лимфоциты, оказывают влияние на состояние сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, свертывания крови и фнбринолиза. Эти эффекты определяются микроокружением клеток и исходными показателями системы гемостаза. IL-1 вызывает торможение адгезии и агрегации тромбоцитов, модулирует выброс прокоагулянтов, антикоагулянтов и фибринолитических агентов из лимфоцитов и других клеток в гепаринизнрованной и фибринолизной крови, а также в сгустке. 1L-1 и отдельные его фракции (а и Р). способны индуцировать продукцию клетками крови прокоагулянтов и ашикоагулянтов (РпС, а:-МГ', ex,-AT), активаторов и ингибиторов плазминогена. 1L-2 усиливает выделение клетками прокоагулянтов и ИАП.

2. При патологических состояниях, сопровождающихся увеличением продукции IL-la и IL-lp. развивается внутрисосудистое свертывание крови.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Наши наблюдения проведены на 72 здоровых людях обоего пола от 18 до 40 лет, 46 больных с ожоговой болезнью ПЫУ степени. Объектами изучения служили цельная кровь, плазма, сыворотка, форменные элементы крови, а также среда роста культуры лимфоцитов, выделенных из гепаринизированной, фибринолизной крови и кровяного сгустка.

Культивирование лимфоцитов. Выделенные и отмытые лимфоциты в концентрации 2 х 10" клеток/мл выращивали в питательной среде 199 с добавлением 5% эмбриональной телячьей сыворотки и без нее. В опытные культуры вносили рекомбинантный 1Ь-1, содержащий обе фракции (а и Р), и 11.-2 в концентрациях 2000 пкг/мл. К контрольным лимфоцитам добавляли фосфатный солевой буфер (рН = 7,4). В качестве второго контроля служили лимфоциты, к которым добавляли МонАТ против 1Ь-1 в избыточном количестве.

Опытные и контрольные лимфоциты инкубировали при следующих условиях.

1) Клетки находились как в обычных нолистироловых чашках, так и в чашках, которые предварительно были покрыты коллагеном.

2) К контрольным и опытным лимфоцитам в обычные чашки и чашки, покрытые коллагеном, добавлялись аутологичные тромбоциты, которые были получены из цитратной плазмы и отмыты фосфатно-солевым буфером (рН = 7,4). Часть вносимых кровяных пластинок в момент забора крови непосредственно в пробирке предварительно обрабатывались индометацином, угнетающим их метаболизм, в дозе 50 мг/мл, после чего отмывались фосфатно-солсвым буфером. Другая часть тромбоцитов дополнительно активировалась АДФ в концентрации 103 М/мл.

В отдельной серии изучили влияние 1Ь-1а, 1Ъ-1Р и 1Ь-2 в конечной концентрации 2000 пкг/мл на выброс прокоагулянтов и фибринолитических агентов лимфоцитами.

Лимфоциты культивировали в течение 2 и 24 часов, после чего среду роста исследовали в гемостатических и иммунологических тестах.

Культивирование цельной крови. У здоровых людей пунктировали V. сиЬ^аПз и заполняли кровыо полистироловые чашки для культур клеток. Схема эксперимента включала следующие варианты исследований. Часть полистироловых чашек предварительно заполняли гепарином в дозе 50 ЕД/мл и, таким образом, кровь на протяжении инкубации сохранялась в жидком состоянии. В другую часть полистироловых чашек заранее вносили стрептокиназу, в результате чего активировался фибринолиз, и к концу исследований кровь становилась жидкой. Третья часть чашек оставалась интактной, поэтому внесенная в нее кровь свертывалась и сохранялась в виде сгустка в течение всего периода наблюдения. Предварительно в опытные чашки, содержащие гепаринизированную, фибринолизную кровь и фибриновый сгусток, вносили 1Ь-1сх, 1Ь-1Р и 1Ь-2 в конечной концентрации 2000 пкг/мл. В контроле добавляли фосфатный солевой буфер (рН = 7,4). В качестве второго контроля служила кровь, в которую вносили МонАТ против 11.-1 в избыточной концентрации. Опытные и контрольные образцы инкубировали при I = 37°С в течение 24 часов, после чего исследовали в иммунологических и гемостатических тестах.

Иитерлейкины, добавляемые к культивируемым лимфоцитам и крови, получены от ТОО "Цитокин" (г.Санкт-Петербург).

Иммунологические тесты. Для определения концентрации цитокинов 1Ь-1а, 1Ь-1р использовали наборы реагентов ТОО "Цитокин" (г.Санкт-Петербург). Измерение уровня интерлейкинов проводили метолом тветгхЬазногп ИФА г. ппмпщьк» двойных антител и применением

псроксидазы хрена (КФ 1.11.1.7). Один тип моноклональных антител против IL-lu, IL-lß иммобилизировали на внутренних поверхностях ячеек планшетов для микротитрования. Другой тип моноклональных антител к независимому эпитопу молекул цитокипов применялся в виде конъюгата с биотином. Индикаторным компонентом реакции являлся конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином. Реакцию окрашивали 3-диметиламинобензоагом, после чего образцы исследовали с помощью фотометра для микропланшета с длиной волны 450 нм (Friemel Н., 1987; Ngo Т.Т., Lenhoff Н.М., 1988).

Иммуноглобулины классов А, М, G у больных людей определяли методом ракетного иммуноэлектрофореза (Laurell G.,1966).

Система гемостаза. Агрегацию кровяных пластинок изучали фотометрическим методом (Born G., 1962), в качестве индукторов агрегации использовали АДФ и тромбин.

Для исследования свертывания крови и фибринолиза использовали реактивы и фибринтаймер фирмы Behring (Германия). Коагуляционный гемостаз мы оценивали по следующим тестам: время свертывания крови (Lee R.J., White P.,1913), время рекальцификации плазмы (Bergerhof H.D., Roka L., 1954), АЧТВ (Larricn M.J., Weillard С., 1957), протромбяновое (Quick A.J., 1943), тромбиновое время (Sirmai Е„ 1957), этаноловый тест (Godal Н., Helle J., 1963) и протамиисульфатный тест (Lipinski A. et al., 1968). Концентрацию фибриногена определяли коагулометрически и способом радиальной иммунодиффузии. Содержание аптикоагулянтов AT-I11, РпС, а]-АТ, а;-МГ выявляли методом радиальной иммунодиффузии реактивами Behring (Германия).

Фибринолиз оценивали по времени лизиса эуглобулинового сгустка (Kowarzyk Н, Buluk К.. 1954), по площади лизиса фибриновых пластин в присутствии и отсутствии стрептокиназы (Astrup Т. et al.. 1953), а также

при активации каолином, и по концентрации плазминогена (Behring, Германия).

Статистическая обработка материала. Полученные данные обработаны методом вариационной статистики для связанных и несвязанных между собой наблюдений и вычислен показатель достоверности различий (Венчиков А.И., Венчиков В.А., 1974).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Влияние IL-1 и [L-2 на сосудисто-тромбоцитарный гемостаз, свертывание крови и фибринолиз

Нами установлено, что добавление IL-1 и IL-2 к тромбоцитам не влияет на их адгезию к коллагену и агрегацию на АДФ и тромбин. Однако супернатант двухчасовой культуры лимфоцитов в присутствии IL-1 на ранней стадии угнетает адгезию тромбоцитов, полностью препятствуя прилипанию кровяных пластинок к коллагену на 1-й мшгуте. К началу 3-й минуты в присутствии среды роста лимфоцитов с IL-1 адгезируют только 25% тромбоцитов, и лишь па 4-й минуте наблюдения кривая быстро нарастает, достигая максимального значения. Предварительное внесение в культуру Мои AT против IL-1 полностью устраняет ингибирующее влияние супернатанта на адгезию кровяных пластинок к коллагену. Супернатант суточной культуры лимфоцитов в присутствии 1L-1 проявляет такую же активность, хотя волна ингибиции бывает менее выраженной. Кроме того, супернатант 2-х и 24-х часовой культуры лимфоцитов подавляет агрегацию кровяных пластинок на АДФ и тромбин, а также тормозит реакцию высвобождения.

Среда роста лимфоцитов после двухчасового контакта с IL-1 удлиняет АЧТВ, блокируя контактную фазу активации (р < 0,01). В такой среде обнаружено повышение уровня РпС, сс,-АТ, а:-МГ. Между тем,

супернатант суточной культуры клеток в присутствии 1Ь-1 проявляет выраженную прокоагулянтную активность. Следует отметить, что лимфоциты, культивируемые на коллагеновых подложках, обладают более высокой прокоагулянтной активностью.

В дальнейшем мы несколько изменили условия инкубирования лимфоцитов и дополнительно внесли в культуру аутологичные тромбоциты. Это решение обусловлено следующими обстоятельствами: 1) тромбоциты являются функционально подвижными пластинами, способными активироваться микроокружением (коллагеном, АДФ и др.); 2) кровяные пластинки служат источником высвобождаемых соединений, имеющих непосредственное отношение к гемостазу; 3) по всей видимости, при активции тромбоциты приобретают антигенные свойства; 4) кровяные пластинки контактируют с лимфоцитами через молекулы межклеточной адгезии; 5) тромбоциты являются возможными источниками интерлейкинов. Все сказанное позволяет предположить, что кровяные пластинки сами способны воздействовать на прокоагулянтную активность лимфоцитов, во многом имитируя влияние 1Ь-1.

Нами выявлено, что внесение интактных тромбоцитов приводит к повышению продукции прокоагулянтов лимфоцитами, как в контроле, так и в опыте. Однако в отличие от других серий, присутствие 1Ь-1 в культуре клеток на коллагеновой подложке сопровождалось более выраженным прокоагулянтным эффектом. Добавление АДФ-активированных тромбоцитов в культуру лимфоцитов во всех сериях повышало прокоагулянтную активность супернатанта, особенно в контрольной серии без использования коллагена. Эти результаты, по всей видимости, можно объяснить 1Ь-1-подобным действием кровяных пластинок, ибо предварительная обработка их индометацином, тормозящим метаболические процессы, существенно уменьшала этот эффект. Коллаген- и АДФ- активированные, а также обработанные индометацином

аутологичные тромбоциты во всех опытных сериях не изменяли прокоагулянтный эффект 1Ь-1, поскольку действие последнего было преобладающим.

Таким образом, 1Ь-1, как и кровяные пластинки, стимулирует выброс прокоагулянтов лимфоцитами в среду роста.

Выраженное влияние оказывает на процесс свертывания крови 1Ь-2. Установлено, что при инкубации 1Ь-2 с культурой лимфоцитов на протяжении 2-х часов в среду роста выделяются прокоагулянты, укорачивающие время рекальцификации плазмы (Р<0,001), протромбиновое время и АЧТВ (Р<0,01). Если же лимфоциты инкубировались с 1Ь-2 на протяжении 24-х часов, то при этом наблюдалось лишь укорочение времени рекальцификации плазмы (Р<0,001) и протромбинового времени (Р<0,05).

Полученные данные свидетельствуют о различном действии 1Ь-1 и 1Ь-2 на свертываемость крови: 11.-1 [3 при кратковременном воздействии на лимфоциты ( до 2-х часов) приводит к выделению антикоагулянтов, а при длительном (24 часа) - прокоагулянтов, тогда как 1Ь-2 и в том, и в другом случае стимулирует выход в окружающую среду из лимфоцитов только прокоагулянтов,

Нами установлено, что 1Ь-1 стимулирует образование АП лимфоцитами. Коллаген потенциирует действие 1Ь-1 на АП-продуцирующую функцию клеток. Внесение в инкубационную среду интактных тромбоцитов приводит к повышению выброса АП лимфоцитами, тогда как 1Ь-1 не проявляет подобного действия. Между тем, предварительная активация тромбоцитов АДФ усиливает способность лимфоцитов в присутствии 1Ь-1 синтезировать ИАП. Инкубация клеток на коллагеновой подложке увеличивает разницу между контрольными и опытными сериями исследований.

Нами также исследовано влияние 1Ь-1 и 1Ь-2 на продукцию нрокоагулянтов, антикоагулянтов и фибринолитических агентов лимфоцитами здоровых людей, выделенных из гепаринизированной и фибринолизной крови, а также из сформировавшегося кровяного сгустка.

Обнаружено, что среда роста лимфоцитов, выделенных из гепаринизированной крови, в присутствии 11,-1 увеличивает (р < 0,001), а клетки из интактного и лизированного сгустка - сокращают время рекальцификации плазмы и АЧТВ (р < 0,001). Следует отметить, что при этом супернатант контрольных клеток, выделенных из

гепаринизированной крови, проявляет максимальную, а из фибринолизной - минимальную прокоагулянтную активность. Не исключено, что в такой культуре клеток оказывает свое влияние 1Ь-1, который присутствует в небольших количествах в крови здоровых людей. В то же время предварительное внесение в кровь моноклональных АТ против цитокина полностью устраняет этот эффект.

Показано, что максимальной продукцией РпС в присутствии обладают лимфоциты, выделенные из гепаринизированной крови, а также контрольные лимфоциты, получепные из сгустка и фибринолизной крови. Вместе с тем, наименьшую способность к выделению РпС в присутствии 1Ь-1 проявляют клетки из кровяного сгустка и фибринолизной крови. Предварительное внесение МонАТ против 1Ь-1 отменяет этот эффект.

Одновременно с РпС в культуральной среде лимфоцитов обнаружены агАТ и сь-МГ; их продукция повторяет динамику РпС. 1Ь-1 способствует выходу этих соединений из лимфоцитов, выделенных из гепаринизированной крови, и тормозит их секрецию клетками сгустка и фибринолизной крови. МонАТ против 1Ь-1 отменяют эффект цитокина. Отдельные фракции 1Ь-1 (а и р) повторяют влияние 1Ь-1, тогда как 1Ь-2 независимо от условий воздействия повышает прокоагулянтные свойства среды, в которой инкубировались лимфоциты.

Установлено, что IL-1 стимулирует продукцию ИАП лимфоцитами, выделенными из гепаринизированной и фибринолизной крови, а в сгустке приводит к интенсивному образованию АП. Способностью стимулировать образование АП в сгустке обладает IL-ip, в то время как IL-2 усиливает выход ИАП. Однако влияние 1L-2 зависит от пермиссивного (от англ. permission - разрешение) действия IL-1. поскольку МонАТ против 1L-1 устраняют ингибиторные эффекты IL-2.

Сыворотка, полученная из фибринолизной крови с повышенным содержанием IL-1 или 1L-2, значительно тормозила фибринолитическое действие урокиназы и плазмина, что, несомненно, связано с образованием ИАП и ингибитора плазмина. Это действие гораздо сильнее проявлялось под влиянием IL-la. В меньшей степени на фибринолитическую активность сыворотки, полученной из фибринолизной крови, действовал IL-ip и слабее всего 1L-2. Следует заметить, что в этих исследованиях моноклональные антитела против IL-1 не ингибировали действие 1L-2.

Таким образом, продукция прокоагулянтоп и фибринолитических агентов лимфоцитами тесно связана с концентрацией IL-1 в окружающей среде и исходным состоянием крови. Невольно напрашивается мысль, что обнаруженные факты зависят от различной интенсивности иммунного ответа. В связи со сказанным мы изучили продукцию IL-1 в сгустке цельной крови в процессе его формирования и лизиса.

Нами установлено, что в гепаринизированной и фибринолизной кроЕИ и сгустке цельной крови здоровых доноров нет существенного увеличения продукции 1L-1. Однако внесение IL-la вызывает усиление секреции не только IL-lcx, но и JL-ip. При этом максимальный выход фракций IL-1 отмечался в гепаринизированной и фибринолизной крови. Предварительное добавление моноклональных антител против 1L-1 устраняло обнаруженный эффект. 1L-2 в гепаринизированной крови

усиливает выход 1Ь-1а. В сгустке 1Ь-2 стимулирует секрецию 1Ь-]р и тормозит продукцию 1Ь-1 а.

2. 11.-1 а и И-1[1 и гемостаз при ожоговой болезни

В патогенезе гнойно-воспалительных заболеваний важная роль принадлежит гемостатическим реакциям и иммунной системе, в частности, провоспалительному !Ь-!. В связи с этим нами изучена продукция 1Ь-1 и состояние системы гемостаза у 46 больных (36 мужчин и 10 женщин) с ожогами Ш-1У степени. Исследования проведены при поступлении больных в клинику - в первый день наблюдения, а также на 15 день после начала лечения.

Как показали наши исследования, у больных с ожогами уже в первые сутки развивается выраженная гиперкоагуляция. При этом сокращается время свертывания крови, рскальцификации плазмы, АЧТВ, протромбиновое и тромбиновое время, резко падает концентрация антитромбина III, но более чем в 2,5 раза возрастает концентрация фибриногена. У таких больных почти в 9 раз повышается концентрация ПДФ, резко тормозится тотальный эуглобулиновый и Хагеманзависимый фибринолиз, а также фибринолиз, индуцированный стрептокиназой, более чем в 2 раза удлиняется время растворения 1 г фибрина и у всех без исключения больных выпадает положительный этаноловый тест.

При повторном исследовании системы гемостаза у 12 больных через 15 дней после получения ожога установлено, что гиперкоагуляция и торможение фибринолиза полностью сохраняются.

Таблица 1. Содержание IL-la и IL-lß (пкг/мл) в крови больных с ожоговой болезиыо (М ± т)

п ■ сутки наблюдения 15 сутки наблюдения

IL-la IL-lß IL-la IL-lß

Здоровые 20 12 ± 3 8 ± 2 12 ± 3 8 ±2

Больные ожогами 14 130±33 Pt<0,001 128 ±2 7 Р!<0,001 98 ±24 р,<0,001 р:> 0,05 234 + 36 Pi<0,001 р2<0,001

Pi - достоверность различий по сравнению со здоровыми людьми;

р2- достоверность различий по сравнению с 1-ми сутками наблюдения.

Представленные данные свидетельствуют о том, что при ожоговой травме развивается типичный хронический ДВС-синдром. При этом ускорение процесса свертывания крови осуществляется как по внешнему (сокращение протромбинового времени), так и по внутреннему (сокращение АЧТВ) механизму. Важную роль в развитии гиперкоагуляции и ДВС-синдрома играет снижение уровня антитромбина III (AT-III), что. в первую очередь, обусловлено его потреблением в результате внутрисосудистого свертывания крови. Следует заметить, что падение концентрации AT-I1I не достигает критических цифр. Не вызывает сомнений, что наряд)' с AT-III падает концентрация и других естественных антикоагулянтов (гепарина, кофактора гепарина II и др.), о чем свидетельствует резкое сокращение тромбинового времени.

У больных с ожогами тормозится не только тотальный, но и Хагеманзависимый фибринолиз. Этот эффект может быть обусловлен падением уровня калликреина и высоко-молекулярного кининогена (ВМК), принимающих участие не только в фибринолизе, но и свертывании крови. У таких пациентов удлиняется время лизиса сгустка, индуцированного стрептокиназой, что может быть обусловлено потреблением плазмина в результате адсорбции на образующихся в процессе внутрисосудистого свертывания крови фибриновых сгустках. Торможение фибринолиза можно объяснить и увеличением концентрации фибриногена.

Подобная картина со стороны системы гемостаза развивается на фоне высокой продукции 1Ь-1а и 1Ь-1р. Через 2 недели после получения ожога концентрация 1Ь-1Р существенно нарастает (р2<0,001). Увеличение цитокинообразовання приводит к усугублению ДВС-синдрома.

Из приведенных данных следует, что при ожогах различной степени и тяжести наблюдается выраженный ДВС-синдром, который развивается на фоне усиления продукции 1Ь-1 (см. рис.).

Нами установлено, что при ожоговой болезни, по сравнению со здоровыми людьми, в гепаринизированной крови существенно нарастает продукция всех провоспалительных цитокинов, в том числе 1Ь-1а и 1Ь-1р.

В культуре сгустка цельной крови выявлена иная картина. У больных с ожоговой болезнью продукция 1Ир была существенно ниже, чем у здоровых людей.

Антигены.

Антигены

Макрофаги

Эндотелиальные клетки

->- ФАТ

Индукция тка VII —

^вого фактора

¡Vvila

Образование протромбиназы по внешнему пуп

Калликреин /1К

Активация

,тромбоцитов *

(при участии факторов ХИа, Xla, IXa, Villa)

i

Образование протромбиназы j~jo внутренннему пути

ТАП

Тромбоцитопения, биоамплификация свертывания крови^ фибринолиза

Плазминоген

Отложение фибрина, образование ПДФ, сосудистая обструкция, ишемия тканей и полиорганная недостаточность

Кровотечение

Потребление факторов свертызания__

и амтикоагулянтов

Рис Участие пнтерлейкиноз 1 и 2 в развитии ДВС-еимлроча.

В суточной культуре фибринолизной крови больных с ожогами Ш-IV степени отличия со здоровыми выглядели еще ярче - содержание 1Ь-1Р было ниже, чем в сгустке цельной крови.

Таким образом, у больных с ожоговой болезнью в культуре гепаринизированной крови повышена продукция всех провоспалительных цнтокинов, а в кровяном сгустке и фибринолизной крови снижен уровень 1ЫР.

Резюмируя изложенное, можно утверждать, что при патологических состояниях, сопровождающихся выраженными сдвигами в гемостазе, нарушениями клеточных и гуморальных механизмов специфической и неспецифической защиты, изменяется продукция медиаторов иммунного ответа - цитокинов.

ВЫВОДЫ

1.В присутствии И.-1 из лимфоцитов выделяются соединения приводящие к торможению адгезии и агрегации тромбоцитов. Лимфоциты после краткосрочного контакта с 1Ь-1 выделяют в окружающую среду РпС, «;-МГ и а,-АТ. Продолжительное воздействие 1Ь-1 на лимфоциты приводит к ускорению свертывания крови за счет выхода прокоагулянтов. Тромбоциты и коллаген стимулируют выброс прокоагулянтов из лимфоцитов, а ГЬ-1 усиливает их действие. [Ь-2 независимо от времени воздействия повышает отдачу прокоагулянтов лимфоцитами.

2.1Ь-1 и тромбоциты изолированно способствуют продукции АП лимфоцитами. 1Ь-1, действуя совместно с тромбоцитами на лимфоциты, (особенно в присутствии коллагена), приводит к секреции ИАП.

3. 1Ь-1 в гепаринизированной крови стимулирует продукцию лимфоцитами РпС, а;-МГ и а;-АТ, а также усиливает образование ИАП. В фибринолизной крови 1Ь-1 угнетает синтез РпС, агМГ, а,-АТ и

ипгибирует фибринолиз. В кровяном сгустке 1Ь-1 тормозит продукцию РпС, ао-МГ и а,-АТ и стимулирует фибринолиз. Повышение концентрации 1Ь-1Р и 1Ь-2 в сгустке способствует выходу АП из клеток крови. В фибринолизной крови 1Ь-1а и 1Ь-1Р усиливают выделение ПАП. 1Ь-2 в гепаринизированной крови повышает выход прокоагулянтов.

4. Под влиянием 1Ь-1а в гепаринизированной крови здоровых людей увеличивается продукция 1Ь-1а и 1Ь-1р. ¡1,-2 в гепаринизированной крови усиливает выход 1Ь-1а, в сгустке 1Ь-2 стимулирует секрецию 1Ь-1Р и тормозит продукцию 11.-1 а. У больных с ожоговой болезнью в суточной культуре гепаринизированной крови продукция 1Ь-1Р повышена, а в кровяном сгустке и фибринолизной крови снижена.

5. Ожоговая болезнь сопровождаются усилением синтеза 1Ь-1ос, 1Ь-1Р и комплексом гемокоагуляционных нарушений, характерных для ДВС-синдрома. Уменьшение уровня 1Иа и 1Ь-1Р приводит к ослаблению признаков ДВС-синдрома и нормализации показателей гемостаза. У больных с ожоговой болезнью в суточной культуре гепаринизированной крови продуюшя 1Ь-1Р повышается, а в кровяном сгустке и фибринолизной крови - снижается.

6. 1Ь-1 и 1Е-2 играют существенную роль в регуляции сосудисто-тромбонитарного гемостаза, свертывания крови и фибринолиза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для прогнозирования и диагностики ДВС-синдрома, наряду с традиционными тестами исследования системы гемостаза, у больных при различных патологических состояниях рекомендуется определение уровня 1Ь-1(х, 1Ь-1р. Повышение концентрации цитокинов свидетельствует о высоком риске развития гиперкоагуляции или ДВС-синдрома. Выявление высокого уровня "провоспалительных" цитокинов позволяет на

доклиническом этапе прогнозировать и предупреждать гемокоагуляционные нарушения у больных.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Роль цитокинов в регуляции гемостаза в норме и при патологии // Цитомсдипы, цитокины и антигены главного комплекса гистосовместимости (HLA). - Чита. - 1998. - С.38 - 41 (Соавт. Ю.А.Витковский. Кузник Б.И., Белокриницкая Т.Е., Папава K.M.).

2. Влияние шперлейкинов 1, 2 и 8 на свертывание крови и фибринолиз // Актуальные вопросы акушерства, гинекологии и перинатологии. Сборник научно-практических трудов. Выпуск 11.-Чита. -

1998. - С. 140 - 142 (Соавт. Витковский 10.А., Бриль Д.Е., Едслев Д.А., Солпив A.B.)

3. Влияние тималина и эпиталамина на продукцию ировоспалительных цитокинов // Цитомедины, цитокины и антигены главного комплекса гистосовместимости (HLA). Сборник науч. трудов. Выпуск 2. - Чита. -

1999,- С. 4 - 5 (Соавт. Витковский Ю.А., Абдулаев P.A.).

4. Иммунитет, гемостаз и продукция цитокинов у больных с неосложненньш и осложненным течением острого аппендицита // Цитомедины, цитокины и антигены главного комплекса гистосовместимости (HLA). Сборник науч. трудов. Выпуск 2. - Чита. -1999. - С. 27-29 (Соавт. Витковский Ю.А.. Абдулаев P.A.).