Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние гепастериала А на течение реперфузионного синдрома

На правах рукописи МАЛОВА ИННА ЮРЬЕВНА

ВЛИЯНИЕ ГЕПАСТЕРИЛА А НА ТЕЧЕНИЕ РЕПЕРФУЗИОННОГО СИНДРОМА (Экспериментальное исследование)

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Старая Купавна - 2005 г.

Работа выполнена в Государственном учреждении Краснодарского края "Краснодарский краевой научно-исследовательский медицинский центр" и Адыгейском филиале Кубанской государственной медицинской академии

Научный руководитель -

Научный консультант -

Официальные оппоненты:

член-корреспондент АМН Республики Казахстан доктор медицинских наук профессор Лысенков Сергей Петрович

член-корреспондент РАМН доктор медицинских наук профессор Галенко-Ярошевский Павел Александрович

доктор медицинских наук профессор Березовская Ирина Владимировна;

доктор медицинских наук профессор Яворский Александр Николаевич

Ведущая организация

Защита состоится «

ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН

ОЛч/^цг2005 г. в _часов на

заседании диссертационного совета Д 217.004.01 при открытом акционерном обществе "Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ" (ОАО "ВНЦ БАВ") по адресу: 142450, Московская обл., п/о Старая Купавна, ул. Кирова, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОАО "ВНЦ БАВ".

Автореферат разослан « » г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук профессор

Корольченко Л.В.

JOM-Г

msY

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы: В последние годы проблема постишемического, или ре-перфузионного, синдрома привлекает многих исследователей. Известно, что реперфузи-онный синдром часто встречается в клинической практике и имеет место после реконструктивных операций на сосудах, чрескожной транслюминальной балонной ангиопластики, при пересадке органов, синдроме реплантации конечностей, инфаркте миокарда, синдроме длительного сдавливания и других состояниях (П.А.Галенко-Ярошевский, В.В. Гацура, 2000; Е.С.Золотокрылина, 2000; А.В.Ефремов, 2001; М.Ю.Андианова, 2003; С.А. Афанасьев, 2003; А.В.Вабищевич, 2003; А.М.Игнашов, 2003; В.А.Куксинский, 2003; Н.Ю.Семиголовский, 2003; Н.А.Томилина, 2003; W.Brooks, 1992; D.Lucas, 1998; M.Hour-mant, 1999). При восстановлении кровообращения включается целый ряд механизмов, вызывающих повреждение органов и систем и часто приводящих к гибели организма (М.В.Биленко, 1989; В.И.Шумаков, 1995; Н.Н.Петрищев, 1997; Л.Н.Маслов, 2004; W. Brooks, 1992). В связи с высокой летальностью этой категории пациентов вполне оправдан поиск путей, смягчающих патологические проявления реперфузионного синдрома.

Одним из важных подходов в решении проблемы профилактики и лечения пости-шемических расстройств является улучшение тканевого метаболизма в зоне ишемии (М.Н.Амосова, 2000; П.А.Галенко-Ярошевский и соавт., 2001; А.Н.Пархоменко, 2002; S. Kozhukhov, 2003; R.Jennings, 2001). В настоящее время при разработке различных&ари-антов фармакотерапии этой патологии обнадеживающие результаты были получены при использовании естественных метаболитов, являющихся естественными факторами адаптации к экстремальному и патологическому воздействию на организм гипоксии. В основе использования интермедиатов цикла Кребса как возможных средств энергообеспечения ишемизированных органов и тканей лежат следующие предпосылки: 1) повышение при ишемических состояниях проницаемости клеточных мембран для интермедиатов цикла Кребса (М.Н.Кондрашова, 1972); 2) увеличение резистентности окислительных систем митохондрий, "загруженных" субстратами цикла трикарбоновых кислот, к гипок-сической альтерации (В.И.Малюк,1977); 3) наличие дефицита сукцинил-КоА, фумарата и оксалоацетата, образующихся в физиологических условиях при окислении аминокислот (В.В.Гацура, 1982; М.Н.Кондрашова, 1978; Л.Д.Лукьянова, 1982).

Особый интерес представляют собой интермедиаты цикла Кребса - янтарная и яблочная кислоты. Назначение этих веществ ведет к торможению перекисного окисления липидов мембран клеток, стабилизации лизосомных мембран, нейтрализации мембрано-тропного действия гуморальных агентов - гистамина, кининов, гиалуронидазы, фосфо-липаз, лизосомных протеаз и других (П.А.Галенко-Ярошевский, В.В.Гацура, 2000). Так, в многочисленных исследованиях показано, что янтарная и яблочная кислоты способны оказывать защитное действие на органы и ткани, находящиеся в условиях ишемического повреждения (В.В.Гацура, 1982; 1985; 1988; А.К.Рачков, 1988; Л.А.Балыкова, 1992; В.В.Бульон, 2002; А.А.Скоромец, 2003; Л.А.Журавлева, 2004; A.Bums, 1978; D.Hayes et al., 1987; C.Ceconi, 1996), а также обладают антистрессорной и антигипоксической активностью, повышают жизнеспособность трансплантатов кожи (Ф.З.Меерсон,1984; К.С. Васьков и соавт.,1988,1990; П.А.Галенко-Ярошевский и соавт.,1990,1998).

В литературе имеются сообщения об органопротекторном действии комплексного препарата гепастерила А, включающего аргинин, аспарагиновую кислоту, сорбит, яблочную кислоту, Na+, К+, СГ, рибофлавин, декспантенол, пиридоксин и никотинамид.

Экспериментальные работы, рассматривающие фармакотерапию последствий по-

рог i! ' 'ли м» и-н ■ i , ■ \

стишемического синдрома, в основном посвящены исследованию ишемии и реперфузии отдельных органов (сердца, почек, печени, нижних конечностей, кожи). Профилактическое и лечебное воздействие гепастерила А как противоишемического средства на ре-перфузию комплекса органов и систем при выключении больших сосудистых зон ранее не проводилось.

Цель работы: обосновать в эксперименте возможность использования комплексного витаминометаболитного препарата гепастерила А для коррекции реперфузионного синдрома, вызванного временным прекращением кровообращения комплекса органов и тканей.

Задачи исследования. Для достижения поставленной цели планировалось решение следующих задач:

1. Дать оценку органопротективного действия гепастерила А, его влияния на клини-ко-биохимические показатели крови, выживаемость животных и клиническую картину в динамике реперфузионного синдрома.

2. Определить и обосновать оптимальные сроки введения гепастерила А, при которых наблюдаются наиболее выраженные положительные органопротекторный и клинический эффекты.

3. Изучить патоморфологическую и морфометрическую картину внутренних органов и тканей в динамике реперфузионного периода, вызванного временным прекращением кровотока в грудной аорте.

4. Выявить селективность гепастерила А по отношению к исследуемым органам и тканям при введении его в различные временные периоды ишемии и реперфузии.

Научная новизна исследования. В работе впервые показана возможность использования гепастерила А для профилактики реперфузионных нарушений при ишемии комплекса органов и тканей. Впервые определены оптимальные сроки введения препарата, при которых наблюдается наиболее выраженный клинико-фармакологический эффект, благоприятно сказывающийся на морфологических и биохимических показателях животных. Показано, что наряду с известными свойствами гепастерил А оказывает влияние на микрогемодинамику и степень гидратации внеклеточного и внутриклеточного секторов. Впервые установлена органоспецифичность препарата по отношению к определенным органам и тканям, что расширяет показания к применению препарата. Установлено, что деструктивные процессы наиболее интенсивно активируются в первые десять минут после восстановления кровообращения и одним из важных звеньев патологической цепи является относительный дефицит энергетических субстратов в клетках. Возмещение указанного дефицита в раннем реперфузионном периоде позволяет "смягчить" прогрессиро-вание патологических процессов.

Теоретическая и практическая значимость работы заключается в обосновании возможности использования гепастерила А как органопротектора при временном прекращении с последующим восстановлением кровообращения одновременно больших сосудистых зон печени, почек, кишечника, скелетных мышц, кожи. Экспериментально установлены оптимальные сроки введения препарата, при которых отмечается наиболее выраженный фармакологический органосохраняющий эффект препарата. Установлены новые фармакологические эффекты гепастерила А, обусловленные влиянием на микродинамику и гидрофильность тканей. Это может в перспективе расширить спектр показаний к назначению препарата. Полученные данные используются в учебном процессе на кафедре фармакологии Кубанской государственной медицинской академии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Формирование реперфузионного синдрома активизируется с момента восстановления кровообращения и проявляется рядом патоморфологических признаков: расстройством кровообращения в микроциркуляторном русле; распространенными деструктивными изменениями стенок внутриорганных сосудов: отеком, плазморрагией, дистрофическими изменениями, сегментарным некрозом; распространенными дистрофическими изменениями (зернистой, вакуольной, гиалиново-капельной, реже жировой дистрофиями) и очаговыми некрозами паренхимы, деструктивными изменениями ретикулярной стромы.

2. Гепастерил А может быть использован как эффективное противоишемическое средство для коррекции реперфузионного синдрома.

3. Органопротекторный эффект гепастерюта А проявляется во время ишемии, а также в первые 7 минут после восстановления кровообращения и сопровождается снижением летальности животных, улучшением клинического течения, клинико-биохимических показателей крови и морфологической картины.

4. Органоселективность гепастерила А в наибольшей степени проявляется по отно-I шению к легким, миокарду, печени и мозгу и характеризуется уменьшением количества

микроателектазов в легких, нормализацией микрогемодинамики и противоотечным эффектом в миокарде, печени и мозге.

Апробация работы:

Материалы и основные положения диссертации докладывались и обсуждались: на расширенных заседаниях (22.05.04 г., 18.10.04 г., 27.12.04 г.) Краснодарского краевого отделения Российского научного общества фармакологов с приглашением представителей лаборатории фармакологии нарушений периферического кровообращения Государственного учреждения Краснодарского края "Краснодарский краевой научно-исследовательский медицинский центр"; научно-практических конференциях (2000 2 2003 гг.) сотрудников Адыгейского филиала Кубанской государственной медицинской академии; Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Перспектива - 2004" (Нальчик, 2004 г.).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура диссертации: Материал диссертации изложен на 156 страницах компьютерного текста. Диссертация состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 1 главы собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы.

Работа иллюстрирована 44 рисунками и 21 таблицей. Библиография включает 189 I источников литературы, из которых 130 отечественных и 59 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ I. Материалы и методы исследования.

Работа выполнена на 214-и наркотизированных (тиопентал натрия 40 мг/кг внутри-брюшинно) беспородных белых крысах обоего пола массой 200 - 280 г. Эксперименты проведены в соответствии со статьей 11 -й Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (1964) и "Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных" (1985).

Моделирование постишемического синдрома проводилось по методу С.П.Лысен-кова, Л.З.Тель (1995) путем перевязки грудной части аорты без пневмоторакса с после-

дующим восстановлением кровотока.

Гепастерил А (производитель фармзавод ХЕМОФАРМ, Вршац, Югославия) вводился внутривенно (в хвостовую вену).

В экспериментах было использовано пять групп животных. Во всех группах кровоток в аорте восстанавливали после 28-минутной ишемии путем снятия лигатуры. Указанный временной интервал был выбран и обоснован экспериментальным путем. При этой продолжительности ишемии наблюдалась высокая летальность животных и хорошая воспроизводимость модели.

Первой контрольной группе (48 крыс) внутривенно вводился физиологический раствор в дозе 2 мл/кг с последующим созданием ишемии. Второй группе животных (36 особей) введение гепастерила А осуществлялось внутривенно в дозе 2 мл/кг до наложения лигатуры. В третьей группе (48 животных) препарат вводился сразу после снятия лигатуры, в четвертой (36 крыс) и пятой группах (36 крыс) введение гепастерила А осуще-^ ствлялось через 7 и 10 минут после восстановления кровотока в той же дозе. В послеопе- ' рационном периоде состояние животных оценивалось по показателям общего состояния (ПОС) в баллах (С.П.Лысенков, 1995) через 3, 20, 24 и 48 часов после снятия лигатуры. Часть выживших животных наблюдали в течение месяца после операции. Удовлетворительное состояние животного оценивалось в ноль баллов, клиническая смерть - в 100 баллов.

У выживших животных через 48 часов после активной эйтаназии (А.П.Зильбер, 1998, 2002) путем мгновенной декапитации под тиопенталовым наркозом забирали кровь в сухие пробирки и подвергали центрифугированию при 900 g (3000 об/мин) в течение 10 минут.

Содержание креатинина и мочевины в плазме крови определялось с помощью биохимических наборов фирмы "Лахема" (Чехословакия). Алании- (АлАТ) и аспартатами-нотрансфераза (АсАТ) определялись по Райтману. Количество калия в плазме крови исследовалось с помощью пламенного фотометра.

Метод светооптической микроскопии использовался для изучения морфологических изменений органов и тканей. Для исследования были взяты кусочки 7 следующих органов и тканей: 1) в мозге - часть больших полушарий; 2) в сердце - часть левого и правого желудочков; 3) в легких - базальные отделы правого и левого легкого; 4) в печени - часть правой доли; 5) в почках - нижние полюсы правой и левой почек; 6) в кишечнике - часть подвздошной кишки; 7) в мышцах - часть приводящих мышц бедра.

Гистологический материал фиксировали в 10% формалине, обезвоживали в серии спиртов возрастающей концентрации и заключали в парафин; с помощью санного микротома готовили парафиновые срезы толщиной 5-6 мкм; срезы окрашивались гематоксилин-эозином по методу Б.Ромейс (1954). Морфометрическое исследование осуществлялось по Г.Г.Автандилову (1990). С каждого кусочка органа готовилось по два среза, в каждом срезе исследовалось не менее 30 полей зрения.

Статистическая обработка полученных данных проводилась с помощью методов вариационной статистики с применением параметрических и непараметрических критериев с использованием программы '^айвйка", версия - 5,0.

II. Результаты исследования и их обсуждение

Показатель выживаемости. Путем использования моментного метода, установлено (рис. 1), что у крыс контрольной группы через 3 часа после моделирования реперфу-

Рис. 1. Выживаемость животных в течение 48 часов после снятия лигатуры в контрольной группе и в группах с введением гепастерила А в различные временные периоды. £

Примечание. I, И, III, IV, V - группы опытов.

*/><0,01.

зионного синдрома показатель выживаемости достоверно отличался от такового животных опьггных групп и составил 0,89 (во П-й группе - 1,00, Ш-й - 0,94, и1У-й - 0,92, а в V-й группе показатель был таким же, как и в контрольной группе). Выявлено, что у животных контрольной группы через 20 часов после операции показатель выживаемости оказался достоверно ниже, чем в группах с введением гепастерила А, и составил 0,44 (во П-й группе - 0,67, Ш-й - 0,84, IV-й - 0,74; в V-й группе показатель выживаемости сравнялся с таковым в контрольной группе).

Через 48 часов после восстановления кровообращения на момент наблюдения в контрольной группе показатель выживаемости составил 0,14; во И, III и IV-й группах этот показатель оказался равным 0,44, 0,56 и 0,43 соответственно. В V-й группе показатель выживаемости оказался идентичным таковому контрольной группы. Используя логран-говый критерий, было установлено, что показатели выживаемости во II, III и IV группах были достоверно выше (р < 0,01), чем в контрольной группе.

Таким образом, было выявлено, что наибольшая выживаемость животных имела место во II, III и IV-й группах. В Ш-й группе, где введение гепастерила А осуществлялось сразу после снятия лигатуры, выжило самое большое количество животных (73%). Одна-кЪ в V-й группе, где гепастерил А вводился через 10 минут после восстановления кровообращения, препарат не оказал влияния на выживаемость животных.

Влияние гепастерила А на ПОС животных. В результате проведенных экспериментов было установлено (табл. 1), что у животных контрольной группы ПОС достоверно выше (общее клиническое состояние тяжелее), чем в группах с введением гепастерила А, перед перевязкой аорты и в течение первых 7 минут после снятия лигатуры на всем временном интервале наблюдения.

У крыс контрольной группы, так же как и в группах с введением гепастерила А,

Таблица 1. ПОС и время полного восстановления общего состояния животных в контрольной группе и в группах с введением гепастерила А в условиях постишемическо-го синдрома.

Группы Время восстановления нормального статуса Показатель общего состояния, в баллах

через 3 часа через 20 часов через 24часа через 48 часов

I (контроль) 30 + 2,3 82 (32 )±2,4 57 (14) ±3,51 48 (10)±2,94 29 (10)±4,2

II 18+1,9 75 (36) ±2,82 45 (24) ±1,79 32 (24)13,02 16(24)±1,14

Р1 1-П** 1-Й** 1-П** 1-11** 1-П**

III 20 ± 1,3 75 (34) ±1,74 44 (30) ±2,46 33 (28)£2,77 18 (26)±1,89

Р1 1-Ш** 1-Ш** 1-Ш** 1-Ш** 1-Ш**

IV 24 ±1,7 78 (33) ±2,57 51 (26) ±3,27 40 (24)ЬЗД4 23 (23)±1,56

Р1 1-Р/** 1-1У** 1-1У** 1-1У** НУ**

V 29 ±2,0 80 (32) ±3,53 55 (14) ±2,06 45 (12)±2,79 27 (10)±3,95

П 1-У 1-У* 1-У 1-У* 1-У

* р <0,05, **р<0,01.

Примечания. 1. Р1 — сопоставляемые группы. 2 В скобках - количество выживших животных

в раннем реперфузионном периоде клиническая картина характеризовалась аритмичным дыханием (у многих животных дыхание осуществлялось с участием вспомогательных мышц), сопровождалась отсутствием рефлекса переворачивания при положении на спине, выраженным экзофтальмом, отсутствием тонуса мышц передних и задних конечностей и ответа на шумовой раздражитель.

В период с 3 до 24 часов после восстановления кровообращения у крыс контрольной группы отмечалась постепенная нормализация ритма дыхания, однако частота его была уменьшена, реакция на боль была снижена, рефлекс переворачивания при положении на спине у большинства животных был слабый, отмечались клонические судороги; крысы имели неопрятный вид, не принимали корм.

Через 20 - 24 часа после снятия лигатуры в послеоперационном периоде ПОС у выживших крыс в группах с введением гепастерила А уменьшался. После проведенной операции у животных достаточно быстро восстанавливалось нормальное дыхание, рефлекс переворачивания при положении на спине оставался у большинства крыс слабым, тонус мышц задних и передних конечностей был в норме, ответ на шумовой раздражитель был снижен, они активно принимали корм. В позднем реперфузионном периоде у выживших крыс контрольной группы наблюдались характерные изменения: немотивированное агрессивное поведение, склонность к каннибализму, пароксизмы клонико-тонических судорог.

Введение гепастерила А в различные временные интервалы положительно сказывалось на течении реперфузионного периода. Наиболее выраженный клинический эффект наблюдался во II и Ш-й опытных группах. В позднем реперфузионном периоде выжившие крысы существенно не отличались от интактных. Важно отметить, что препарат оказывал влияние и на скорость восстановления неврологического статуса животных. Если полное его восстановление в контрольной группе происходило в течение 30 ± 2,3 сут., то во II группе - за 18 ± 1,9 сут. (р < 0,05). В У-й группе, как и в контрольной, полное вос-

становление крыс наблюдалось только через 29 + 2,0 сут.

Влияние гепастерила А на биохимические показатели плазмы крови. Исследование биохимических показателей плазмы крови, проведенное через 48 часов после восстановления кровообращения, показало (табл. 2), что значения АлАТ и АсАТ в контрольной группе были достоверно выше, чем аналогичные показатели в группах с введением гепастерила А перед перевязкой аорты и в течение первых 7 минут раннего пости-шемического периода. Так, показатели АлАТ в контрольной группе (с введением физиологического раствора) оказались достоверно выше (1,74 ± 0,07 мМ/л.ч.), чем во II -1,61 ± 0,04, III - 1,49 ± 0,06 и IV -1,63 + 0,05 мМ/л.ч. В V-й группе показатели АлАТ максимально приближались к таковым контрольной группы. Достоверное снижение уровня АсАТ под влиянием гепастерила А имело место во II (2,60 ± 0,06мМ/ л.ч.), III (2,45 ± 0,08мМ/л.ч.) и IV-й группах (2,72 ± 0,07 мМ/л.ч.). Снижение этих показателей под влиянием гепастерила А свидетельствует об уменьшении степени повреждения мышц и клеток печени, что указывает на органопротекторные свойства препарата.

Таблица 2. Сравнительный анализ биохимических показателей плазмы крови у крыс контрольной группы и опытных групп (после введения гепастерила А в условиях постишемического синдрома).

Биохимические показатели

Группы АлАТ, АсАТ, калий, креатинин, мочевина

мМ/л. ч. мМ/л ч. мМ/л мМ/л мМ/л

Здоровые 1,36+0,08 1,90+0,05 5,11+0,16 0,005±0,0006 7,2+1,22

I (контроль) 1,74 ±0,07°° 2,85 ±0,1°° 6,50±0,22°° 0,02+0,007°° 10,9+1,06м

II 1,61+ 0,04° 2,60 + 0,06° 5,80+1,07 0,009+0,0015 9,5±1,43°°

Pt I -II** 1-Й** I-U** 1-11° 1-11°

III 1,49 ±0,06 2,45±0,08° 5,42±0,89 0,01±0,003 9,8±0,97°°

Pt I-III** I-III** I-III* 1-ПГ I-UI°

IV 1,63 ±0,05° 2,72 ±0,07°° 5,84±1,34°° 0,018±0,008°° 10,3±1,6300

Pt I-IV** I-IV** I-IV I-IV I-IV

V 1,70 ±0,07°° 2,83 ± 0,09°° 6,4±1,51°° 0,02±0,005°° 10,7±1,27°°

Pt I-V I-V I-V I-V I-V

*р< 0,05, **р< 0,01.

0 р < 0,05, 00 р < 0,01 по отношению к показателям группы здоровых животных с использованием критерия Манна - Уитни (для показателей креатинина и мочевины)

Примечание. Pt - сопоставляемые группы

В качестве одного из критериев выраженности повреждения органов и тканей был использован показатель концентрации калия в плазме крови. Этот показатель значительно возрастал у животных контрольной группы и приближался к нормальному у животных, получающих гепастерил А сразу после восстановления кровообращения.

В наших экспериментах повышение содержания калия в плазме крови животных наблюдалось в контрольной и во всех группах с введением гепастерила А, однако достоверные различия выявлялись только между I и III группами. Так, в I группе уровень калия составлял 6,50 ± 0,22 мМ/л, а у животных 1П группы (сразу после восстановления

7

кровотока) концентрация калия достоверно снижалась (5,42 ± 0,89 мМ/л) по сравнению с показателями контрольной группы. В остальных группах введение гепастерила А не оказало существенного влияния на содержание калия в плазме крови. Следовательно, наиболее выраженный благоприятный гипокалиемический эффект гепастерила А отмечен только при введении его непосредственно после восстановления кровообращения. По-видимому, повышение уровня калия в крови животных с реперфузионным синдромом является одним из слагаемых в развитии их терминального состояния и гибели. Выявленный гипокалиемический эффект гепастерила А, очевидно, имеет важное значение в нивелировании последствий постишемического синдрома.

Как показал анализ концентрации креатинина и мочевины, достоверные различия по исследуемым показателям выявлены только между контрольной, второй и третьей группами (табл. 2). Так, в контрольной группе (без введения препарата) уровень креатинина составил 0,02 ± 0,007 мМ/л, а в группах с введением гепастерила А перед созданием / ишемии и сразу после восстановления кровообращения - 0,009 ± 0,0015 мМ/л и 0,01 ± 0,003 мМ/л соответственно.

Концентрация мочевины в плазме крови животных контрольной группы превышала таковую у здоровых животных и составила 10,9 ± 1,06 мМ/л. Введение гепастерила А сопровождалось умеренным снижением этого показателя во II -й группе до 9,5 ± 1,43, а в Ш-й - до 9,8 ± 0,97 мМ/л. В остальных группах введение препарата не оказало существенного влияния на содержание в плазме крови креатинина и мочевины.

Влияние гепастерила А на патоморфологические изменения в органах и тканях. У животных контрольной группы при микроскопическом исследовании органов и тканей наблюдались признаки нарушения кровотока на уровне микроциркуляторного русла, вызванные рядом факторов, из которых значительная роль принадлежит сужению просвета поврежденным и отечным эндотелием, сдавлению мелких сосудов нарастающим в ре-перфузионном периоде внеклеточным отеком, а в мышечных органах (сердце, скелетных мышцах) - нарастающей ишемической контрактурой, а также паралитической дилатаци-ей сосудов. При патоморфологическом исследовании органов и тканей животных в раннем реперфузионном периоде было обнаружено, что введение гепастерила А оказало положительное влияние на выраженность расстройств микроциркуляторного русла. Введение препарата перед перевязкой аорты и в течение первых 7 минут после восстановления кровообращения достоверно снизило проявления острого венозного полнокровия, а также отека и дистрофических изменений в стенках сосудов.

Во внутренних органах животных контрольной группы вокруг сосудов наблюдались диапедезные кровоизлияния. При введении животным гепастерила А происходило уменьшение количества или полное исчезновение диапедезных кровоизлияний в органах. Кроме того, препарат оказывал существенное влияние на выраженность дистрофических и некробиотических изменений в клетках паренхимы органов. У животных контрольной группы дистрофические процессы в клетках паренхимы были представлены необратимыми некробиотическими изменениями - балонной и гиалиново-капельной дистрофиями. У животных в группах с введением гепастерила А наблюдались менее выраженные дистрофические процессы в органах.

Использование морфометрической методики позволило определить органоспеци-фичность гепастерила А как органопротектора в условиях ишемии и постишемического периода. Цифровое выражение морфологических нарушений позволило объективно установить преимущественный органосохраняющий эффект по отношению к тому или иному органу (или ткани). Сравнительный анализ морфометрических критериев показал,

что наибольшее органосохраняющее действие гепастерил А проявляет при введении его перед ишемией либо в первые 7 минут после восстановления кровообращения.

Анализ морфометрических показателей органов и тканей в различные временные интервалы (7 минут, 1, 3, 20 и 48 часов) после реперфузии позволил выявить положительный фармакологический эффект гепастерила А спустя уже 7 минут с момента его введения (табл. 3). Следует отметить, что морфологические различия между животными контрольной и опытных групп наиболее отчетливо проявлялись через 48 часов постише-мического периода. Так, введение гепастерила А отражалось в первую очередь на морфологической картине легких. Препарат в значительной мере уменьшал количество микроателектазов, степень кровенаполнения венул межальвеолярных перегородок (рис. 2, 3) и выраженность внутриальвеолярного отека. При морфометрическом исследовании животных в группах с введением гепастерила А (через 48 часов после реперфузии) было обнаружено, что в легких количество микроателектазов оказалось достоверно меньше (во П-й группе -1,20 ± 0,16,1П-й -1,48 ± 0,1, IV-й - 2,23 ± 0,17 и V-й - 3,03 ± 0,17), чем в контрольной группе (3,53 ± 0,22). Выраженность полнокровия венул интерстиция во II, III и IV-й группах составила 1,95 ± 0,13, 2,10 ± 0,29 и 2,73 ± 0,22 соответственно, что достоверно меньше, чем аналогичные показатели контрольной группы (3,35 ± 0,25). Показатели V-й группы не отличались от контрольных.

Обращал на себя внимание тот факт, что применение гепастерила А в ишемическом и раннем постишемическом периоде (в первые 7 минут) сопровождалось по отношению к мозгу (коре больших полушарий) выраженным противоотечным эффектом. Установлено, что в II, III, IV и V-й группах перицеллюлярный отек нейроцитов составил 1,20 ± 0,18, 1,40 ± 0,22, 1,80 ± 0,16 и 2,60 ± 0,26 соответственно. Показатели отека нейроцитов у животных V-й группы приближались к таковым контрольной (2,75 ± 0,31). Примечательно, что противоотечный эффект гепастерила А проявлялся при сохранившихся нарушениях кровообращения в венозном русле головного мозга. Показатели полнокровия венул коры больших полушарий головного мозга во II, III, IV и V-й группах составили

I,05 ± 0,1, 1,13 ± 0,15, 1,13 ± 0,15 и 1,23 ± 0,17 соответственно. Достоверные различия между показателями полнокровия венул мозга животных контрольной группы (1,30±0,48) и аналогичными показателями в группах с введением гепастерила А выявлены не были.

Выраженный положительный эффект гепастерила А отмечен и по отношению к миокарду. Так, в группах крыс, которым вводился гепастерил А, уменьшалось количество эпизодов отека интерстиция и кардиомиоцитов, а также дистрофических изменений в последних, полнокровия венул. Морфометрические показатели отека интерстициальной ткани у животных опытных групп оказались значительно ниже, чем в контрольной (3,75 ± 0,1), и составили: во II группе 1,65 ± 0,19, III -1,83 ± 0,13 и IV-й - 2,48 ± 0,1. Показатели отека кардиомиоцитов составили во И, III и IV-й группах 1,85 ±0,19; 2,08 ± 0,1 и 2,40 ±0,16 соответственно против 2,95 ± 0,19 в контроле. Показатели полнокровия венул во

II, III и IV-й группах составили 1,43 ± 0,22; 1,78 ± 0,13 и 2,75 ±0,19 соответственно; в контроле - 3,28 ± 0,22.

В паренхиме печени крыс контрольной группы эпизоды отека и расширения капилляров встречались чаще (1,9 ± 0,13), чем у животных II (1,1 ± 0,09), III (1,1 ± 0,06) и IV (1,4 ± 0,08) групп, получавших гепастерил А. По-видимому, положительный эффект препарата обусловлен, в первую очередь, нормализацией микрогемодинамики в этом органе, а также снижением выраженности дистрофических изменений в гепатоцитах

В почках животных, которым вводился гепастерил А перед созданием ишемии и в

Таблица 3. Сравнительный анализ показателей контрольной (I) и Ш-й групп животных через различные временные интервалы после восстановления кровообращения

Исследуемые органы Патологические изменения Временные интервалы

7 минут 1 час 3 часа 20 часов 48 часов

1а Ша 16 Шб 1в Ша 1г Шг 1д Шд

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11 12

Легкие Микроателектазы 3,04 ±0,1 1,20 ±0,16 3,16±0,15 1,28 ±0,13 3,38 ±0,13 1,39*0,14 3,48*0,16 1,52 ±0,23 3,53 * 0,22 1,48*0,1

Р <0,001 <0,001 <0,001 <0,01 <0,01

Полнокровие ве-нул интерстация 2,92*0,23 1,88±0,13 3,04±0,36 1,96±0,04 3,21*0,26 2,01±0,07 3,25*0,09 2,21*0,17 3,35*0,25 2,10* 0,29

Р <0,02 <0,05 <0,02 <0,01 <0,05

Кора больших полушарий головного мозга Отек и дистрофия нейрощпов 2,17*0,15 1,09*0,04* 2,29±0,06 1,19±0,09 2,44±0,39 1,28*0,22 2,71*0,13 1,44*0,13 2,75*0,31 1,40*0,22

Р <0,01 <0,001 >0,05 <0,01 <0,05

Полнокровие ве- нул 1,20±0,39 1,1±0,05 1,23±0,14 1,11±0,13 1,30*0,18 1,15*0,1 1,29*0,26 1,19*0,09 1,30*0,48 1,13*0,15

Р >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 >0,05

Сердце Отек кардиомиоют» 2,09±0,16 1,99±0,03 2,36±0,1 1,92*0,21 2,58*0.16 2,03*0,15 2,88*0,12 2,14*0,12* 2,95*0,19 2,08*0,1*

Р >0,05 >0,05 >0,05 <0,02 <0,02

Отек интерсткция 3,21±0,2 | 1,59±0,12 3,44*0,19 | 1,68*0,23 3,43*0,12 | 1,71±0,18 3,76*0,08 | 1,95*0,15 3,75*0,1 | 1,83*0,13

Р <0,01 <0,01 <0,01 <0,001 <0,001

Полнокровие ве- иул 3,3*0,24 1,51±0,14 3,31*0,21 1,5б±0,1 3,20*0,1 1,63*0,11 3,5*0,22 1,83*0,18 3,55*0,26 1,78±0,13

Р <0,01 <0,01 <0,001 <0,01 <0,01

Печень Полнокровие ве-нул 1,35±0,12 2,4±0,09 1,40±0,34 2,61*0,14 1,45*0,32 2^8±0,18 1,65*0,27 2,8*0,25 1,6±0,37

р <0,05 <0,05 <0,05 >0,05 >0,05

Отек станки и расширение капилляров 1,2*0,19 1,0±0,07 1,3±0,14 1,2*0,01 1,55*0,28 1,06*0,03 1,75*0,08 1,15*0,09 1,9*0,13 1,1*0,06

Р >0,05 >0,05 >0,05 <0,01 <0,01

* " *

%

Окончание таблицы 3

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Почки Полнокровие ве-нул 3,1*0,24 1,85*0,15 3,19±0,22 1,92*0,08 3,27*0,13 2,01*0,12 3,31*0Д5 2,3*0,13 3,4*0,27 2,2*0,16

Р <0,02 <0,01 <0,01 <0,05 <0,02

Отек н дистрофия эпителия канальцев 2,94*0,31 1,77*0,13 3,0*0,29 1,86*0,2 3,15*0,19 1,98*0,2 3,19*0,3 2,18*0,1 3,2*0,35 2,1*0,19

Р <0,05 <0,05 <0,02 <0,05 >0,05

Коллапс клубочков 2,3*0,2 1,41*0,12 2,5*0,18 1,48*0,05 2,62*0,2 1,56*0,09 2,7*0,18 1,98*0,13 2,8*0,25 1,7*0,12

Р <0,02 <0,01 <0,01 <0,05 <0,02

Тонкий кишечник Отек и десквама-ци» эпителия ворсин 4,0*0,37 2,3*0,18 4,15*0,3 2,5*0,12 4,31*0,26 2,63*0,2 4,52*0,38 2,85*0,21 4,6*0,42 2,8*0,23

Р <0,02 <0,01 <0,01 <0,02 <0,02

Скелетные мышцы Отек мышечных волокон 2,11*0,31 1,12*0,06 2,2*0,3 1,17*0,08 2,35*0,18 1,24*0,13 2,4*0,2 1,38*0,05 2,50*0,26 1,33*0,1

Р <0,05 <0,05 <0,01 <0,01 <0,02

Рис. 2. Сравнительный анализ влияния гепасгерила А на полнокровие венул в легких (а), коре больших полушарий головного мозга (б), сердце (в), печени (г) и почках (д) крыс. 4

* р < 0,05 по отношению к контрольной группе

Примечание. По оси ординат - количество эпизодов полнокровия венул, по оси абсцисс - группы животных. .

первые 7 минут после восстановления кровообращения, показатели отека, дистрофии эпителия проксимальных канальцев, полнокровия венул, а также коллапса клубочков оказались достоверно ниже, чем в контрольной группе. Действие препарата было более значимым у животных II, III, и IV-й групп, у которых показатели полнокровия венул составили 2,4 ± 0,18; 2,2 ± 0,16 и 2,5 ± 0,21 соответственно, против 3,4 ± 0,27 в контроле. Применение гепастерила А значительно препятствовало коллабированию клубочков, увеличению отека и дистрофии эпителия канальцев. Так, в группах с введением препарата морфометрические показатели дистрофии и отека эпителия канальцев были значи-

Рис. 3. Сравнительный анализ противоотечного действия гепастерила А на легкие (а) кору больших полушарий головного мозга (б), сердце (в), печени (г), почки (д), тонкий кишечник (е) и скелетные мышцы (ж) крыс.

У* р < 0,05 по отношению к контрольной группе., . -г

_ Примечание. По оси ординат - количество эпизодов патоморфологических изменений, по оси абсцисс - группы животных ■»"" "

тельно ниже контрольного (3,2 ± 0,35) и составили во Н-й группе 1,8 ± 0,29, III - 2,1 ± 0,19 и IV - 2,6 ± 0,23. Следует отметить, что показатель в V-й группе (3,0 ± 0,26) существенно не отличался от контрольного.

При макроскопическом исследовании почек животных контрольной группы обращали на себя внимание увеличение их размеров, бледный корковый слой и гиперемиро-ванное мозговое вещество. Все эти признаки указывают на плохое восстановление кровотока и шунтирование крови по юкстагломерулярному пути кровообращения. Во II, III и IV-й группах животных, получавших гепастерил А, макроскопическое исследование показало, что почки не увеличены в размерах, корковый слой серовато-розового цвета,

мозговой - красного цвета, что указывает на менее выраженные нарушения, возникающие при реперфузии почек по сравнению с таковыми контрольных животных.

При сравнительном анализе показателей отека и десквамации эпителия ворсинок тонкого кишечника обнаружилось, что в группах животных, получавших гепастерил А, эти показатели оказались достоверно более низкими (2,4 ± 0,29; 2,8 ± 0,23; 3,4 ± 0,7), чем таковые контрольной группы (4,6 ± 0,42).

Выраженное гистопротекторное действие гепастерил А оказывал на скелетные мышцы в случаях инъецирования его перед перевязкой аорты и в течение первых 7 минут после снятия лигатуры. Так, во П, III и 1У-й группах отек мышечных волокон составил 1,30 ± 0,2, 1,33 ± 0,1 и 2,05 ± 0,06 соответственно против 2,50 ± 0,26 в контроле.

В позднем постишемическом периоде (через месяц после реперфузии) при пато-морфологическом исследовании органов и тканей крыс контрольной группы наблюдалось замещение погибших клеток соединительной тканью; в клетках паренхиматозных гу* органов сохранялись дистрофические явления (преимущественно в виде жировой, гиалиново-капельной и вакуольной дистрофии). В группах животных, получавших гепастерил А, дистрофические процессы были менее выражены и представлены только мелко- " £ капельной жировой дистрофией эпителия проксимальных и дистальных канальцев почек, а также гепатоцитов центральной части печеночных долек.

Таким образом, сравнительный анализ органоселективности гепастерила А выявил его преимущественную направленность по отношению к легким, мозгу, печени и сердцу. Причем по отношению к мозгу гепастерил А проявлял преимущественно противоотеч-ный эффект, а по отношению к легким - гемодинамический и противоателектатический; в печени действие препарата выражалось в уменьшении полнокровия и отека, а в сердце - нормализацией гемодинамики, уменьшением отека кардиомиоцитов и интерстиция. В то же время морфометрические показатели других исследуемых органов и тканей свидетельствуют об универсальном (по отношению к почкам, мышцам и кишечнику) органо-протекторном эффекте исследуемого препарата.

Органопротекторные свойства гепастерила А как комбинированного препарата можно объяснить с нескольких позиций. Многие из компонентов гепастерила А обладают выраженным органопротекторным действием. В первую очередь это касается яблочной кислоты, так как она является одним из основных интермедиатов цикла Кребса.

Согласно данным, представленным в работах В.М.Гукасова, В.В.Гацура (1988), В.В.Дунаева, В С.Тишкина (1988), В.И.Костина (1986), Л.Н.Сернова (1989), П.А.Гален-ко-Ярошевского и соавт. (2001), яблочная кислота (малат) обладает выраженными анти-гипоксическими и антинекротическими свойствами. Следует отметить, что наиболее и подробно исследовано действие маната на течение острой ишемии миокарда. Натрия ма- ' лат при введении собакам в острый период ишемии миокарда (В.И.Костин, 1986) вызывает снижение метаболического ацидоза и оказывает вазодилятаторное действие. Вместе с тем усиление под влиянием натрия малата коллатерального коронарного кровообращения и улучшение кислородного обеспечения тканей могут быть причиной увеличения количества синтезируемых внутриклеточных антиоксидантов и торможения перекисного окисления липидов в ишемизированном миокарде. Положительное влияние натрия малата может быть также связано с его способностью существенно повышать скорость деок-сигенации крови и мембраностабилизирующим действием (В.М.Гукасов, В.В.Гацура, 1988).

Определенный вклад в органопротекторный эффект гепастерила А, по-видимому, вносят и другие составляющие его компоненты, прежде всего такие, как аспарагиновая

кислота, аргинин и витамины (рибофлавин, пиридоксин и никотинамид).

Известно, что в условиях ишемии и реперфузии органов и тканей возникает дефицит аминокислот, окисление которых лежит в основе образования интермедиатов цикла Кребса, таких, как аспарагин и аргинин (.ШасПег, 1978; Т.ЗапЬош, 1979). Аспарагиновая кислота уже давно привлекает внимание фармакологов как "кондуктор" калия. Наиболее изучено влияние аспарагиновой кислоты на ишемизированный миокард (Т.А.Бракш, 1968, 1969; А.В .Сапожков, 1984; П.П.Митченко, 1996; К.ВЫтЬе^ег, 1962). В кардиомио-цитах аспартат вовлекается в метаболические реакции, а высвобождаемые калий и магний пополняют внутриклеточный пул этих катионов. Аспарагинат и сам играет важную роль в энергообеспечении выживаемости ишемизированной клетки за счет образования фумарата и щавелевоуксусной кислоты, утилизирующихся в цикле Кребса. Кроме того, аспарагиновая кислота заметно повышает коллатеральный коронарный кровоток при практически стабильном артериальном давлении (А.В.Сапожков, 1968). Высокий анти-гипоксический эффект имеют и соли аспарагиновой кислоты (В.В.Пичугин и др., 1984). Аргинин снижает интенсивность процессов перекисного окисления липидов в крови при гипоксии (Н.П.Милютина, 1991; Я.С.Гудивок, 1987; К.АйсЫвоп, 1998), а также оказывает протекторное действие в условиях гипоксии (Л.В.Могильницкая, 1991; К.Н.Наджи-мутдинов, 1993; Р.Вгишег, 1997).

Установлено, что витамины, входящие в состав гепастерила А (рибофлавин, пиридоксин и никотинамид), в условиях гипоксии и метаболического ацидоза могут активировать гликолиз и пентозофосфатный путь обмена углеводов, снижать тяжесть метаболического ацидоза, а также улучшать коллатеральное коронарное кровоснабжение (А.Ф. Сидоренко, В.В.Гацура, 1984, П.А.Галенко-Ярошевский, В.В.Гацура, 2000). В опытах на сердце крыс, находящемся в условиях гипоксии, показано, что отмеченный комплекс витаминов способен резко тормозить снижение содержания в миокарде АТФ и глюкозо-6-фосфата (А.Ф.Сидоренко,1985; Р.А.Ахундов, 1991).

Таким образом, гепастерил А в условиях реперфузионного синдрома у крыс способен повышать их выживаемость и проявлять органопротекторное действие относительно мозга, сердца, легких, печени, почек, кишечника, а также скелетных мышц.

ВЫВОДЫ

1. Патоморфологическая картина реперфузионного синдрома начинает активно формироваться с момента восстановления кровообращения и характеризуется выраженными нарушениями микрогемодинамики, особенно в венулярной части микроциркуля-торного русла, развитием интерстициального отека (преимущественно в легких, мозге и миокарде), нарушением структуры мембран, внутриклеточного матрикса и органелл (преимущественно в печени и скелетных мышцах), что является морфологической основой исследуемого синдрома.

2. Гепастерил А в постишемическом периоде, обусловленном прекращением кровообращения в грудном отделе аорты, оказывает выраженный универсальный органопро-тективный эффект, сопровождающийся снижением летальности в течение первых трех суток и положительной клинической динамикой.

3. Фармакологическое действие (снижение летальности, нормализация дыхания и локомоторной функции, рефлекса переворачивания и других показателей) гепастерила А проявляется при его введении непосредственно перед моделированием ишемии либо в

первые 7 минут реперфузионного периода.

4. Фармакологический эффект гепастерила А в отношении биохимических показателей крови в динамике реперфузионного периода проявляется в снижении ферментной активности аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы, а также уменьшении концентрации калия в крови.

5. Органоселективность гепастерила А наиболее выражена по отношению к легким, мозгу (коре больших полушарий), печени, миокарду и проявляется уменьшением количества ателектазов в легких, нормализацией микрогемодинамики в легких, печени, миокарде и противоотечным эффектом по отношению к мозгу, печени и миокарду.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Гепастерил А рекомендуется для дальнейшего доклинического изучения в качестве органопротекторного средства при реперфузионном синдроме, вызываемом временной ишемией органов брюшной полости и скелетных мышц.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. И.Ю.Малова, С.ПЛысенков, К.П.Квициния. Влияние гепастерила А на течение реперфузионного синдрома. //Материалы научно-практической конференции «Медицина будущего». - Краснодар - Сочи, 2002. -С. 73 - 74.

2. И.Ю.Малова, С.П.Лысенков, К.П.Квициния. Влияние гепастерила А на течение реперфузионного синдрома у крыс. //"Теоретические и прикладные аспекты проблемы здоровья населения Северного Кавказа". - Майкоп, 2002. - С. 199 - 200.

3. И.Ю.Малова, С.ПЛысенков, К.П.Квициния. Протективное действие гепастерила А на течение реперфузионного синдрома. //Материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых и студентов "Перспектива - 2003". - Нальчик, 2003. - С. 70 - 72.

4. И.Ю.Малова, С.ПЛысенков, К.П.Квициния. Изменение биохимических показателей крови в реперфузионном периоде под влиянием гепастерила А. //"Теоретические и прикладные проблемы медицины и биологии". - Майкоп, 2003. - С. - 329 -331.

5. И.Ю.Малова, С.ПЛысенков, К.П.Квициния. Исследование протективных свойств гепастерила А в морфологическом аспекте. //"Теоретические и прикладные проблемы медицины и биологии". - Майкоп, 2003. - С. - 331 - 333.

6. И.Ю.Малова Влияние гепастерила А на выживаемость крыс и основные морфологические изменения при реперфузионном синдроме. //Материалы Всероссийской научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Перспектива - 2004". -Нальчик, 2004. - С. 54 - 56.

7. И.Ю.Малова. Влияние гепастерила А на функциональные показатели восстановления ЦНС у крыс при реперфузионном синдроме. //III Всероссийская университетская научно-практическая конференция молодых ученых и студентов по медицине. - Тула, 2004.-С. 161 - 162.

МАЛОВА Инна Юрьевна

Влияние гепастерила А на течение

реперфузионного синдрома (Экспериментальное исследование)

Автореферат

Подписано в печать 21.03.05 г.. Формат бумаги 60 х 84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Печ. лист - 1. Заказ № 12. Тираж - 100 экз.

Краснодарское краевое региональное отделение Общероссийской общественной организации "Лига здоровья нации" Подразделение оперативной полиграфии. 350013, г. Краснодар, ул. Постовая, 18.

РНБ Русский фонд

2005-4 46654

2372