Автореферат и диссертация по медицине (14.00.32) на тему:Влияние газовых смесей с различным содержанием кислорода на культивируемые эндотелиальные и мезенхимальные стромальные клетки человека

На травах рукописи

ГРИНАКОВСКАЯ ОЛЬГА СЕРГЕЕВНА

ВЛИЯНИЕ ГАЗОВЫХ СМЕСЕЙ С РАЗЛИЧНЫМ СОДЕРЖАНИЕМ КИСЛОРОДА НА КУЛЬТИВИРУЕМЫЕ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫЕ И МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА

14.00.32 - авиационная, космическая и морская медицина 03.00.25 - цитология, гистология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ии^ие19 ю

Москва, 2007

003061910

Работа выполнена в Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биолошческих проблем Российской академии наук.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Буравкова Людмила Борисовна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Северин Александр Евгеньевич доктор медицинских наук Солдатов Павел Эдуардович

Ведущее учреждение: Российская Военно-медицинская академия им. СМ. Кирова (г. Санкт-Петербург)

Зшцита диссертации состоится « Ь » 2007 г. в У®**

часов на заседании диссертационного совета (К 002.111.01) в Государственном научном центре РФ - Институте медико-биолошческих проблем РАН (ГНЦ РФ - ИМЕЛ РАН) по адресу: 123007, г Москва, Хорошевское шоссе, 76-а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ - ИМБП РАН. Автореферат разослан «

Я

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук ^¡ТР^. .л И П. Пономарева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Использование новых искусственных газовых сред в обитаемых гермообъектах (космические корабли и орбитальные стащил, подводные лодки и подземные объекты, барокамеры различного назначения) требует тщательной всесторонней проверки их биологической активности с использованием различных тест-систем Показано что важным является не только изучение эффектов измененного содержания кислорода, но и реакция живых систем на такую важную составляющую как индифферентный газ [Вдовин и др, 1998, Ветош и др, 1999, Гальчук и др , 2001, Павлов и др, 1999, 2004, Шулагин и др, 2001, Соок, 1950, А1-КаЬиЬ1 <Л а1, 1997, Кшс^аП ег а1, 1995]

Гипоксические состояния могут возникать у здоровых людей в связи со специфическими условиями профессиональной деятельности и возможными чрезвычайными происшествиями в результате неисправности систем жизнеобеспечения В таких случаях снижение содержания кислорода в газовой среде протекает с различной скоростью и может вызывать тяжелые органные нарушения, если не удается сразу устранить причину появления экзогенной гипоксии Основная группа риска в данном случае - это водолазы, подводники, летчики, космонавты, шахтеры, пожарники и дайверы [Малкин и др, 1977, Гуляр и др, 1991, Полещук и др, 1991, Кт(1\уа11 е1 а1, 1995]

Для компенсации недостатка Ог, возникающего вследствие эндогенной и экзогенной гипоксии в настоящее время широко применяются гипероксические газовые смеси Они незаменимы при оказании неотложной медицинской помощи для купирования таких состояний как острая гипоксия, отравление угарным газом, декомпрессионные расстройства и другие [Жиронкин и др, 1968, 1972, Леонов и др , 1993, Сапов и др , 1982, Кш<1\уа11 й а1,1995]

Эффекты, возникающие при гипоксии и гипероксии, непосредственно связаны с изменением содержания кислорода в среде Высокая окислительная способность кислорода, имеет как положительные, так и отрицательные стороны Наряду с реакциями окислительного фосфорилирования, в которое вовлекается около 90% потребляемого кислорода, в живых организмах постоянно протекают процессы с образованием активных форм кислорода (АФК) [Скулачев, 1996] Одним из самых важных отрицательных действий кислорода на клетку является избыточная генерация АФК и их производных

В последние годы проводятся исследования, направленные на изучение воздействия газовых смесей с различным содержанием кислорода и широким спектром индифферентных газов на организм человека [Павлов и др, 1999, 2006, Шулагин и др, 2001] Большинство этих работ посвящено оценке эффектов газовых смесей на уровне

целого организма Однако для понимания клеточных и молекулярных механизмов возникающих изменений необходимо проведение исследований на уровне отдельных клеток Использование клеточных моделей позволяет не только оценить влияние газовых смесей с повышенным или пониженным содержанием кислорода на функционирование клеток, но и изучить молекулярные механизмы ответа клеток на изучаемый стимул [Буравкова и др, 1995, Ткачук и др, 1997; Nishida et al, 2000, Mold et al, 2001, Sengupta et al, 2001, Lee et al, 2005]

К сожалению, данные, получаемые при изучении влияния смесей с различным содержанием кислорода на клеточном уровне не только малочисленны, но и часто противоречивы Наблюдаемые изменения могут быть специфическими для изучаемого типа клеток, именно поэтому, очень важен выбор экспериментальной модели Для изучения эффектов измененных газовых сред m vitro наиболее интересными являются эндотелиальные клетки (ЭК), которые в силу своего положения в организме находятся в условиях различного содержания кислорода, и, как следствие, обладают механизмами коррекции своих функций и адаптации к изменяющимся условиям среды Изучение эффектов газовых сред на ЭК позволяет получить представление о влиянии измененной газовой среды на высокодифференцированные клеточные популяции

Для более полного понимания эффектов, оказываемых смесями с различным содержанием кислорода на организм человека, необходимо изучать их воздействие и на более пластичные и менее дифференцированные популяции клеток, такие как мезенхимальные стромальные клетки-предшественники (МСЬС), интерес к которым значительно возрос в связи с их возможным применением в регенеративной медицине Одним из наиболее доступных источников МСК является жировая ткань, которая, также как и костный мозг, является производным мезенхимы и содержит поддерживающую его строму, которая может быть легко изолирована [Zuk et al, 2001, 2002, Katz et al, 2002, Ryang et a!, 2004, Leong et al, 2005, Dicker, 2005] Сравнительное изучение клеточных популяций (ЭК и МСК) с различным потенциалом дифференцировки в одних и тех же экспериментальных условиях (параметры культивирования, состав газовой среды, кратность и продолжительность воздействия) позволит оценить насколько степень дифференцировки клетки может определять клеточную реакцию на изменение содержания кислорода в окружающей среде

Разработка соответствующего экспериментального протокола является необходимым условием для получения результатов, наиболее адекватно отражающих эффекты воздействия измененных газовых сред на культивируемые клетки Условия использования измененных газовых сред, применяемых в различных исследованиях очень вариабельны

Чаще всего изучаются однократные кратковременные или длительные воздействия Однако для того, чтобы более достоверно оценить влияние изменения содержания кислорода на клетки, представляется важным сравнить влияние одно- и многократных экспозиций и эффекты последействия Создание такого протокола является чрезвычайно актуальным в связи с необходимостью тестирования вновь создаваемых газовых смесей для замкнутых гермообъектов и/или компенсации различных патологических состояний, возникающих у людей при изменении содержания кислорода

Цель работы, оценка эффектов измененных газовых сред на модели культивируемых клеток с разным потенциалом дифференцировки в качестве тест-системы Задачи исследования'

1 Разработать модель для исследования in vitro действия газовых сред с измененным содержанием кислорода на культивируемые клетки человека

2 Исследовать влияние кратковременных и длительных экспозиций в гипоксических и гипероксических газовых средах на пролиферативную активность, жизнеспособность и экспрессию молекул адгезии эндотелиальных клеток человека in vitro

3 Изучить влияние газовых сред с измененным содержанием кислорода на миграцию и синтез биологически активных веществ культивируемыми эндотелиальными клетками человека

4 Провести сравнительное исследование газовых сред с измененным содержанием кислорода на низкодифференцированные мезенхимальные клетки человека при кратковременных и длительных экспозициях

5 Сравнить с использованием культивируемых клеток эффекты гипероксических газовых сред, получаемых из медицинского кислорода и пшероксической кислородно-азотно-аргоновой среды, получаемой по методу короткоцикловой безнагревной адсорбции

Научная новизна работы Впервые на модели культивируемых ЭК человека показано, что при длительных многократных экспозициях в гипероксических газовых средах (от 75% до 95% Ог) происходит уменьшение экспрессии CD54 (ICAM-1), что свидетельствует о снижении степени активации эндотелиальных клеток

Установлено, что кислородный стресс (гипоксия или гипероксия) вызывает в ЭК человека увеличение экскреции IL-6 и VEGF во внеклеточную среду, при этом выявлена кумулятивная зависимость от времени и кратности экспозиций в измененной газовой среде

Впервые на культивируемых клетках проведено тестирование новых гипероксических смесей, получаемых по методу короцикловой безнагревной адсорбции, и

при этом выявлен их меньший повреждающий эффект по сравнению с гипероксическими смесями на основе кислорода и азота

Научно-практическая значимость работы

Разработана и апробирована тест-система, позволяющая изучать эффекты, оказываемые газовыми смесями на культивируемые клетки

Показано, что в периоде последействия (при возвращении клеток в стандартные условия культивирования) выявляются повреждающие эффекты измененного содержания кислорода в среде, не регистрируемые во время и сразу после воздействия Это указывает на необходимость учета латентных нарушений при использовании культур клеток в качестве тест-системы

Установлено, что при использовании мезенхимальных стромальных клеток-предшественников в качестве экспериментальной модели ш. vitro следует принимать во внимание их устойчивость к изменению напряжения Ог в среде

In vitro показано, что гипероксическая газовая смесь, получаемая по методу короткоцикловой безнагревой адсорбции, обладает меньшим повреждающим действием на культивируемые клетки, чем гипероксические смеси на основе медицинского кислорода Основные положения, выносимые на защиту:

1 Разработанная и апробированная тест-система позволила выявить гипероксические и гипоксические эффекты m vitro и провести оценку повреждающего действия газовых смесей с различным содержанием индифферентных газов, на модели культивируемых дифференцированных (ЭК человека) и малодифференцированных (МСК человека) клеток

2 Снижение содержания кислорода в среде до 5% при многократных кратковременных и длительных экспозициях не влияет на пролиферацию, миграцию и жизнеспособность, но модифицирует экспрессию клеточных маркеров и синтез IL-6 и VEGF эндотелиальными клетками человека

3 В условиях гипероксии (75% - 100% 02) ингибируется пролиферативная активность ЭК человека, но не МСК, при этом на поверхности МСК снижается экспрессия молекул клеточной адгезии (CD9, CD54)

Апробация работы и публикации Основные результаты и положения работы были доложены и обсуждены на Ш, V конференциях молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященных Дню космонавтики (Москва, 2005 г, 2007 г ), VI Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, 2005 г), 2nd International Conference "Strategies m Tissue Engineering" (Wurzburg, Germany, 2006), International Society for adaptive medicine (ISAM) VIII World

Congress, (Moscow, 2006), Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006 г )

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН «Космическая физиология и биология» 21 06 2007 Работа выполнена при поддержке рангов МНТЦ-196, НТТ1-6364 2002 4 и контрактов в рамках ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям науки и техники на 2002 -2006 г г » Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 154 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, главы собственных исследований с обсуждением полученных результатов и выводов Список литературы содержит 193 источника, из них 42 - на русском и 151 - на иностранных языках Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 38 рисунками

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Химические реактивы и культуральные среды и пластик диспаза (нейтральная протеаза из В polymixa) (Gibco), гепарина натриевая соль (ICN), коллагеназа IA (Clostndiopepüdase А из Clostridium hystolyticum) (Sigma), 0,2% раствор желатина (Sigma), L-глугамин 200 мМ, пенициллин-стрептомицин (10000 ЕД/мл - пенициллин, 10000 мг/мл - стрептомицин), пируват натрия 100 мМ, сбалансированный солевой раствор Эрла, среда 199 с солями Эрла и 25 мМ HEPES, эмбриональная телячья сыворотка (FBS), 0,02 % трипсин - 0,05% ЭДТА (все Gibco), среда DMEM (low glucose, Gibco, ICN) Чашки Петри диаметром 60, 100 мм, центрифужные пробирки 50 и 15 мл (Coming, Costar, Nunc), 100 nm фильтры (Mihpore)

Культуры клеток В работе использовали культуры ЭК человека и лМСК человека Для получения первичных культур ЭК пупочной вены человека использовали метод Gimbrone et al, в модификации [Антонов и др, 1981] вместо коллагеназы использовали 0,15% раствор диспазы Клетки, полученные после отмывки раствором Эрла, ресуспендировали в среде роста и высевали на покрытые 0,2% раствором желатина чашки Петри Культуру помещали в С02-инкубатор в стандартные условия 37°С, 5% С02, 95% воздуха, 100% влажности По достижении культурой конфлуэнтного монослоя проводили пассирование клеток Рост и состояние культур контролировали с помощью фазово-контрастного микроскопа Axiovert 25 (Carl Zeiss)

Культуру лМСК получали по методу Zuk et al [Zuk et al, 2001, 2002] Подкожно-жировую клетчатку, полученную в ходе липоаспирации, помещали в пробирку и инкубировали на водяной бане в растворе коллагеназы I в течение 35 минут при перемешивании Фермент инакгивировали добавлением среды роста с сывороткой, после чего суспензию фильтровали через 100 нм фильтр и дважды отмывали центрифугированием Полученный осадок ресуспендировали в 10 мл DMEM с 20% FBS и помещали в чашку Петри Среду меняли каждые 3 дня и по достижении 90% монослоя

пассировали с плотностью 3*103 кя/емг. Субкультивирование клеток проводили до 4 пассажа, после чего анализировали экспрессию маркеров, характерных для популяции мезенхимальных клсток-предшественникое, выделенных из липоаспирата человека.

Изучение пролиферации кле.ок проводили при многокраггних кратковременных (3 часа) и длительных (18 часов) воздействиях на культивируемые ЭК и лМСК человека кислородно-аргоновых и шелородно-азотно-аргоновых смесей с различным содержанием кислорода.

Нммунофенотипирояание. Для идентификации клеток-предшественников, использовали ионоклоиальные антитела фирмы Beckman Coulter: CD9, CD31, CD34, CD49, CD54, CD62L, CD62P, CD71, CD90, HLA-ABC, CD117(c-kif), виментин, меченые ИТС. Клетки анализировали на проточном цитофлуоримегре BeckmanCouiier Epicx XL. Для этого клетки трнпсииизярояалк 0,25% раствором трипснн-ЭДТА, подсчитывали, отмывали и аликвоты, в концентрации 3*105 кл/100 мкл, инкубировали с антителами в течение 15 минут в темноте. нри+4°С.

Оценка жизнеспособности культуры. Жизнеспособность культуры оценивали с помощью метода проточной цитометрии с использованием набора ArmexinV-Propidium Iodide (PI) (Immunotech, Франция) по стандартному протоколу. Метод основан на одно времен нем использовании Н, проникающего в поврежденные клетки и взаимодействующего с ДНК, и Annexin V, аффинного к фосфатидилсерину, который в процессе апоптоза локализуется на клеточной поверхности и формирует один из специфичных сигналов для распознавания апоптогических меток. Использование пары Annexin-Pl позволяет выявить живые, некротические и апоптотические клетки.

Cxe.ua эксперимента. Экспозиции в среде с измененным газовым составом осуществляли однократно иди повторно в течение 3 ч и 18 ч в герметично замкнутой камере (StemCell Technologies Inc., Vancouver, Canada) (рис. 1). Причем период нормоксии при длительных воздействиях составлял не более 6 часов. В каждой чашке Петри подсчитывали по 3 стационарных поля клеток с помощью программы SigmaSean Pro. За 100% принимали среднее значение при подсчете 3 полей через сутки после пассирования клеток. Оцифровку изображений осуществляли с использованием инвертируемого микроскопа Алю vert 2 5 (Zeiss) и цифровой видеокамеры.

Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием непараметрическою критерия Манна-Уитни

Рис. К Модифицированная герметично замкнутая камера для экспозиций клеточных культур в условиях измененной газовой среды.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование влияния гипоксических и гипоксических газовых смесей на культивируемые эндотелиальные клетки человека.

Пролиферативная активность ЭК человека в условиях гипоксических газовых

сред.

Изучение пролиферации ЭК проводили при кратковременных (3 часа) и длительных (18 часов) одно- и/или многократных воздействиях гипоксических смесей с 5% содержанием кислорода с использованием различных газов-разбавителей (аргон или азот) За 100% принимали среднее значение клеток в поле зрения при подсчете трех полей зрения через сутки после пассирования клеток Относительные изменения (в %) динамики пролиферативной активности клеточных культур представлены в таблицах (табл 1)

Таблица 1

Влияние гипоксических газовых сред на пролиферацию ЭК человека при кратковременных и длительных воздействиях различной кратности

Экспозиция Количество экспозиций Пролиферативная активность, в % по отношению к фоновым значениям

90% N2+ 5%02 + 5% со2 95% воздух + 5%С02 90%Аг + 5%02 + 5%С02 95% воздух + 5%С02

Краткосрочные (3 часа) 1 100+5,7 100+6,7 100±6,9 100+8,7

2 120 + 6,3 138 ±9,6 117+11,7 139 ±10,9

3 204 ±9,8 200+12,0 200 ±9,9 220 ±11,8

Длительные (18 часов) 1 100 ±6,5 100 + 9,9 100 ±5,0 100 + 3,9

2 118 + 3,9 132 ±7,8 125 + 12,1 158 ±7,9

3 180 ±10,1 196 ±9,3 205 + 7,6 230 ±9,8

При замещении воздуха гипоксической газовой смесью с 90% содержанием N2 пролиферация клеток несколько замедлялась после двукратной кратковременной экспозиции по сравнению с клетками, находившимися в условиях нормоксии После трехкратной кратковременной экспозиции пролиферация ЭК в нормоксической и гипоксической (5% Ог) средах практически не отличалась Сходные эффекты наблюдались при использовании гипоксической кислородно-аргоновой смеси

При одно- и двукратных длительных экспозициях в условиях измененного содержания кислорода наблюдалась сходная тенденция - незначительное замедление пролиферации по сравнению с контрольной культурой клеток при однократной и двукратной экспозиции в гипоксических газовых средах, которое практически нивелировалось к третьей длительной экспозиции

Таким образом, было показано что при использовании гипоксических газовых смесей (5% Ог) вне зависимости от кратности, длительности экспозиций и от использованного индифферентного газа (Аг или N2) в изучаемых средах не наблюдалось достоверных изменений в скорости пролиферации ЭК человека

Жизнеспособность ЭК человека в условиях гипоксических газовых сред.

Ранее полученные результаты исследований влияния гипоксии на жизнеспособность ЭК человека при пониженном содержании 02 неоднозначны Так, в работе С^а\уа [1990] было показано, что кратковременное воздействие вызывает обратимое изменение барьерных и противокоагулянтных функций ЭК, и эти изменения не вызывают увеличения гибели клеток В то же время в работах [Римку, 1995, Ваиёгу, 1998, МюЫек, 1998] приведены данные о том, что длительное гипоксическое воздействие приводит к увеличению проницаемости сосудистого эндотелия и гибели клеток

Для оценки повреждающего эффекта пониженного содержания кислорода в среде на ЭК человека мы оценивали количество апоптотических и некротических клеток Показано, что кратковременные многократные экспозиции в аргоносодержащей гипоксической газовой среде не приводят к увеличению количества апоптотических и некротических клеток по сравнению с контролем В периоде последействия (через 24 и 48 часов после однократной трехчасовой экспозиции) было отмечено незначительное повышение доли некротических клеток и снижение числа апоптотических клеток, сходная тенденция наблюдалась и в период последействия после двукратных кратковременных экспозиций При использовании гипоксической среды с 90% содержанием N2 доля апоптотических клеток в культуре составляла 2% (при однократном трехчасовом воздействии) и затем незначительно увеличивалась при последующих воздействиях Доля некротических клеток, экспонировавшихся в Иг-содержащей газовой смеси была выше, чем в Аг-содержащей среде (до Зх раз) В периоде последействия (24 и 48 часов после однократного воздействия) доля некротических и апоптотических клеток значительно не изменялась

При длительных инкубациях клеточных культур в исследуемых газовых смесях было отмечено двукратное увеличение доли некротических клеток в Аг-содержащей газовой среде без увеличения доли апоптотически поврежденных клеток Доля некротически-поврежденных клеток после экспозиции в Ыг-содержащей газовой среде составила 11,8% при однократной экспозиции, и 5% при двух- и трехкратной экспозициях Доля апоптотически-измененных клеток при этом составляла 3% При стандартных условиях культивирования доля некротических и апоптотических клеток составляла 4% и

2%, соответственно Выявленные изменения не были статистически значимыми, в то же время, газовая смесь, содержащая Аг, оказывает меньший повреждающий эффект на ЭК человека, что, по-видимому, связано с некоторым протективным действием аргона в условиях гипоксии

Ранее в литературе уже появлялись данные о протективных эффектах аргона [Pavlov et al, 1997, Содцатов и др, 1998, 2000, 2002] Так в экспериментах с грамм-положительными и грамм-отрицательными бактериями было показано стимулирующее действие аргоносодержащих гипоксических сред на передачу Р-плазмид В экспериментах на крысах было показано, что добавление гипоксическую в газовую среду аргона приводит к достоверно большему выживанию экспериментальных животных Проведенные эксперименты на эмбрионах японского перепела показали, что присутствие аргона в качестве газа-разбавителя достоверно повышает выживаемость эмбрионов и оказывает антитератогенный эффект Полученные нами результаты и приведенные выше литературные данные позволяют предположить, что аргон обладает физиологической активностью и может влиять на метаболизм клеток, повышая резистентность организма к гипоксии

Содержание цитокинов в среде культивирования ЭК человека.

Важным свойством, характеризующим функциональное состояние клеточной популяции, является синтез цитокинов Было исследовано содержание цитокинов IL-1, IL-6, а также фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) Содержание цитокинов определяли в культуральной среде сразу после воздействия Было показано, что при кратковременных (3 часа) и длительных (18 часов) повторяющихся гипоксических воздействиях синтез интерлейкина-1 остается неизменным и концентрация его в культуральной среде составляет 5-7 pg/ml В то же время синтез IL-6 эндотелиальными клетками человека во время инкубации в гипоксических средах и в период реоксигенации достоверно увеличивался по сравнению с первоначальным уровнем (рис 2) Известно, что увеличение синтеза клетками IL-б свидетельствует об активирующем (повреждающем) влиянии гипоксических газовых сред на ЭК человека [Gleadle et al, 1998]

VEGF впервые был описан как продукт синтеза опухоли, модифицирующий сосудистую проницаемость, позднее была описана его способность увеличивать пролиферацию ЭК при культивировании [Ferrara et al, 1999] Увеличение продукции VEGF эндотелием связывают, главным образом, с индукцией экспрессии HIF-la в ядре и запуском гипоксия-чувствительных генов, к которым относится и VEGF [Forsythe et al, 2000] Наши данные показали, что кратковременные экспозиции в исследуемых газовых

средах не влияют на синтез УЕвР, в то же время длительные экспозиции приводят к увеличению синтеза исследуемого фактора В периоде последействия как после кратковременных, так и длительных экспозиций в гипоксических Аг или ^-содержащих средах наблюдалось увеличение синтеза УБОР

Полученные результаты свидетельствуют о стимулирующем гипоксии на синтез синтез биологически активных веществ, таких как К.-6 и \TiGF, которое выявляется при длительном воздействии или в периоде последействия

Экспрессия молекул адгезии культивируемыми ЭК человека в условиях гипоксической газовой среды.

Известно, что молекулы адгезии играют важную роль при адаптации клеток к изменяющимся условиям внеклеточной среды В наших экспериментах показано, что в гипоксических газовых средах различного состава, после однократного воздействия, доля клеток несущих 1САМ-1 (СБ54), резко увеличивается (до 3-х раз от первоначального значения) и снижается в периоде реоксигенации, не достигая первоначального уровня (рис 4) После двукратной кратковременной экспозиции этот показатель резко возрастает - до 2-х раз при инкубации ЭК человека в гипоксической среде, содержащей N2, и в 3 раза при инкубации ЭК в среде, содержащей Аг В периоде последействия через 24 и 48 часов после нахождения в гипоксической среде, в состав которой входит азот, доля клеток, несущий исследуемый маркер уменьшалась в 1,6 и 2,7 раза, соответственно При реоксигенации культуры, подвергнутой воздействию гипоксической газовой среды с 90% содержанием аргона, было отмечено увеличение доли клеток, экспрессирующих на своей поверхности СВ54 в 2 раза после 24 часов и 1,4 раза после 48 часов После трех1фатной кратковременной экспозиции в среде содержащей азот количество клеток, экспрессирующих СВ54, оставалось неизменным по сравнению с первоначальным уровнем, а в среде, содержащей аргон, оно увеличилось в 2,2 раза (рис 4)

При изучении влияния длительных одно- и многократных экспозиций в исследуемых гипоксических газовых смесях было показано, что после однократной 18-часовой экспозиции количество клеток, экспрессирующих на поверхности С054, уменьшается в 1,5-2 раза, а после третьей экспозиции доля клеток, экспрессирующих изучаемый маркер, достигает первоначального уровня (газовая среда, содержащая 90% N2 + 5% СОг + 5% Ог) или остается пониженным (газовая среда, содержащая 90% Аг + 5% С02 + 5% 02)

е.*

* - достоверно Дл н p-cD.il Ь по критарию М^чНа-УИТЬ и

Ряс. 2. 1 ипоксня увеличивает синтез 1Ь-6 при кратковременных (а) и длительных (б) воздействиях, а также в период реадаптации к кормоксическим условиям после краткосрочных (в) и длительных (г) воздействий (где Н - 21% Аг - смесь, содержащая 90%Аг + 5% СО; + 5%02: - смесь, содержащая 90%М3 + 5%СОг + 5%02).

в! Л

' - ДСхгТомрНЙ ЯЛ" Р'-С.СЙ ПП кри-шр^н, " Л

Рис. 3. Гипоксия увеличивает синтез УЕОР при кратковременных (а) и длительных (б) воздействиях, а также в период реадаптации к нормокснческнм условиям гтосле краткосрочных (в) и длительных (г) воздействий (где Н - 21% Сь, Аг - смесь, содержащая 90%Аг + 5% СЮ2 + 5%0г, N2 - смссь, содержащая 90%Ы3 + 5%СО; + 5%Оз).

Рис. 4. Влияние гипоксии (5% Ог) на изменение экспрессии СБ54 (1САМ-1) при кратковременных (а) и длительных (б) воздействиях, а также в период реоксигепации к нормоксии после краткосрочных (в) и длительных (г) воздействий,

-24 ч -деч

-24 ч - 4И 4 " 144

кратность и лв н £

Рис. 5. Влияние гипераксических газовых смесей различного состава на пролиферацию ЭК человека при краткосрочных (3 часа) экспозициях ь а - 100% От, б - 89% О; + 4,5% Лг + 6,5 % N2, в - 95% 02 + 5% Аг. г - 75% О; - 25% Аг

2 3

копии ест во воздействий

количество воздействий

количество воздействий

■ Смесп

Я Иэру-ХСЛЯ

1 2 _ 3 Г

количество поздеиствии i 2 3

* ■ достоверна для р<0,05 по критерию Ма*жа-У*т*« количество воздействий

Рис. в. Влияние гипероксических газовых смесей различного состава на пролиферацию ЭК человека при длительных {18 часов) экспозициях в а - 100% Q2l б - 89% Оз + 4,5% Аг + 6,5 % N2s в - 95% 02 + 5% Лг? г - 75% 02 + 25% Аг.

■ Смесь

М Hopucusw

б

Рис. 7. Влияние гипероксических газовых смесей на пролиферацию лМСК человека при кратковременных (а) и длительных (б) экспозициях в условиях гипероксических газовых сред.

11% О j, 1ППНО;

К". О] - 4V.A.

KjlUTiKJCTb мпэеЯсткиА

После помещения культур ЭК в нормоксические условия (95% воздуха + 5% СОг) было отмечено снижение уровня экспрессии СЭ54 в 1,5 - 2 раза во всех исследуемых газовых средах через 24 часа после воздействия и восстановление до первоначального уровня экспрессии на поверхности через 48 часов (рис 4)

Таким образом, при исследовании изменения степени экспрессии СБ54 на поверхности эндотелиальных клеток человека в гапоксических газовых средах было показано, что при кратковременных инкубациях в среде, содержащей аргон, наблюдается более выраженная активация экспрессии молекул адгезии, чем в среде, содержащей в своем составе азот Изменения, выявленные в периоде последействия также указывают на меньшее повреждающее действие аргоносодержащей среды При многократных длительных экспозициях в исследуемых средах с пониженным содержанием кислорода наблюдающееся уменьшение экспрессии молекул адгезии может косвенно свидетельствовать об возможности замедления миграции ЭК человека при моделировании повреждения сосудистой стенки, которая, как известно, контролируется регуляцией экспрессии молекул адгезии класса интегринов [Ьсига М е1 а1, 2004, всИагг М А е1 а1, 2005,хю0е1а1,2006]

Пролиферативная активность культивируемых ЭК человека в условиях гипероксических газовых сред.

Изменение пролиферативной активности в условиях гипероксических газовых сред было показано на различных типах клеток, таких как перициты, альвеолярные макрофаги, эпителиальные клетки легких, фибробласты (ТУАтоге, 1987, №гигкаг, 1988, С1етегй, 1992, Сопсот, 2004] Эти данные позволили предполагать, что если ЭК чувствительны к увеличению содержания кислорода в окружающей среде, то они тоже могут отвечать изменением скорости роста. Для того чтобы проверить данное предположение была изучена пролиферативная активность ЭК человека в условиях гипероксических газовых сред с различным содержанием кислорода

Экспериментальные исследования проводили при инкубации ЭК человека в 75% -100% кислородно-аргоновой смеси Показано, что многократные кратковременные экспозиции (по 3 часа ежедневно) культивируемых ЭК в условиях гипероксии (75%-100% кислорода) приводят к снижению пролиферативной активности клеток (рис 5) При этом тенденция к замедлению пролиферации наблюдалась после второй экспозиции в исследуемых газовых смесях, а достоверные различия в количестве клеток в культуре были выявлены только после третьей экспозиции в среде со 100% содержанием кислорода

Длительное (18 часов) гипероксическое воздействие тормозило пролиферативную активность культивируемых ЭК уже после первой экспозиции (рис 6) Отставание в нарастании количества клеток в культуре становилось достоверным после второй и

третьей экспозиции в условиях гипероксии При воздействии 100% кислорода количество клеток практически не изменялось, что свидетельствует о полном ингибировании пролиферации, поскольку известно, что даже использование модели «жесткой» гипероксии (95% кислорода и 5% углекислого газа в течение 3 суток) не приводит к изменению жизнеспособности клеток по сравнению с контролем [Semo et al, 2001]

Исследование эффектов гипероксической смеси (89% СЬ + 4,5% Аг + 6,5 % N2), получаемой в лабораторной установке при адсорбционном разделении воздуха, выявило более слабый эффект подавления пролиферации как при кратковременных, так, и особенно, при длительных многократных экспозициях Даже трехкратные воздействия по 18 часов ежедневно не приводили к достоверным различиям в увеличении числа клеток по сравнению с контрольными значениями в контрольных и опытных культурах При этом процент прироста числа клеток после трех суток эксперимента, был схожим с результатами, полученным в серии с использованием азот-содержащей газовой смеси с объемной долей кислорода равной 75% Таким образом, токсическое действие кислорода на культивируемые эндотелиальные клетки человека при использовании гипероксической смеси, получаемой по методу короткоцикловой безнагревной адсорбции [Gngonev et al, 2001], несколько ниже, чем смесей, содержащих медицинский кислород в близком диапазоне концентраций (75%-95% О2)

Необходимо отметить, что в литературе практически нет данных о влиянии на пролиферацию ЭК, экспозиций в условиях «жесткой» гипероксии Ранее проводимые эксперименты на обезьянах показали, что длительные экспозиции в условиях повышенного содержания кислорода (от 80% до 100%) приводят к гибели через 6-8 дней от дисфункции ЭК и альвеолоцитов легких, причем первые признаки кислородного отравления наблюдаются уже через 48 часов [Bowden, 1978, Adamson et al, 1980, Gaciutto et al, 1993] В работе Cui [Cui, 1988], было показано, что при нахождении крыс в течение недели в среде с 70% О2, наблюдалось достоверное ингибирование пролиферации ЭК, альвеолоцитов и других элементов стромы легких В то же время, при изучении ультраструктуры клеток не было отмечено значимых изменений В экспериментах Junod, проведенных с использованием культивируемых ЭК человека, показано, что длительная 48-часовая гипероксия (95% Ог) не влияла на пролиферацию клеток и морфологию клеток [Junod, 1987] При использовании той же модели гипероксии, но на культуре растущих клеток, было обнаружено значительное ингибирование активности тимидин-киназы, т е снижение пролиферативной активности и остановка клеточного деления Известно, что одним из механизмов реализации гипероксического воздействия на клетки является избыточная генерация активных форм кислорода, которые могут оказывать повреждающее действие При этом образование АФК влияет на клеточную подвижность и цитоскелет, а последующее увеличение концентрации АФК в клетке ведет к снижению

пролиферативной активности клеток [Boyd, 1995, Ingber, 1995 Alexandrova, 2006, Moldovan, 2006]

Исследование миграции ЭК человека в условиях измененной газовой среды

Миграционная активность является одной из функциональных характеристик ЭК, используемых при тестировании культивируемых клеток Известно, что репарация незначительных по ширине участков повреждения эндотелиального монослоя in vitro и in vivo осуществляется в течение нескольких часов только за счет распластывания клеток [Hirsh et al, 1977, Smirnov et al, 1988]

Исследование миграции культивируемых ЭК человека, показало, что значительное (до 50% от контрольных значений) ингибирование миграции ЭК наблюдалось при длительных экспозициях (18 часов) культур в гипероксических газовых средах, содержащих 75%- 95% Ог, дополненных соответствующим количеством аргона до 100% Кратковременные (3 часа) многократные экспозиции культур в тех же условиях приводили к недостоверному снижению миграции ЭК (80% от контрольных значений) Незначительная активация миграции наблюдалась только при однократной кратковременной экспозиции эндотелия в гипероксической среде, содержащей 5% Аг или N2 и 95% 02

Изучение миграции культивируемых ЭК человека в условиях среды с пониженным содержанием кислорода, с использованием той же модели показало, что гипоксия незначительно (до 15%) ингибирует миграцию как при кратковременных многократных экспозициях, так и при длительных экспозициях в измененных газовых средах по сравнению с культурой клеток, находившейся в стандартных условиях (95% воздуха, 5%СОг, 37°С, 100% влажность) Не было отмечено значимых изменений миграции клеток в зависимости от состава газовой среды Таким образом, изменение содержания кислорода в среде влияет как на скорость пролиферации, так и на миграцию ЭК, однако степень ингибирования пролиферации и миграции зависит не только от газового состава среды, но и от режима экспозиции

Изучение влияния газовых сред с различным содержанием кислорода на мезенхимальные стромальные клетки, выделенные из липоаспирата человека (лМСК)

Характеристика лМСК человека в условиях нормоксии

В ходе экспериментов нами была адаптирована методика выделения и культивирования мезенхимальных стромальных клеток (лМСК), выделенных из липоаспирата человека [Zuk Р et al, 2001, 2002, Ryden М et al, 2003] В первичной культуре лМСК формировали типичные колонии адгезивных, быстроделящихся клеток с

фибробластоподобной морфологией и достигали конфлуэнтности к концу первой недели культивирования

Для идентификации и характеристики культивируемых клеток нами использовался набор моноклональных антител фирмы Beckman Coulter - гематопоэтические и эндотелиальные (CD31, CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit), HLA-DR) и так же антитела к CD9, CD54, CD71, CD90, CD105, HLA-ABC, виментину, которые являются маркерами, характерными для мезенхимальных стромальных клеток-предшественников В качестве изотопического контроля к антителам использовались FITC- и РЕ-меченые IgG соответствующего класса Результаты иммунофенотипирования свидетельствуют о том, что на культивируемых лМСК экспрессируются CD9 (37-49,8%), CD54 (30,5-40,1 %), CD71 (87-97%), CD90 (98,7-100 %), CD105 (58-98,3%), CD106 (60-79,5 %), HLA-ABC (99,8100%), виментин (100%) и не экспрессируются маркеры, характерные для эндотелия (CD31) и гематопоэтических клеток-предшественников (CD34, CD62L, CD62E, CD62P, CD117(c-kit), HLA-DR)

Пролиферативная активность лМСК человека в условиях гипероксических газовых сред.

Известно, что одним из наиболее изученных проявлений ответа клеточных систем на измененное содержание кислорода в окружающей среде является изменение пролиферации клеток [Rrick et al, 2005, Кшо-ока et al, 2005, Wang et al, 2006] Полученные нами данные показали, что при культивировании лМСК в условиях гипероксии (100% Ог или 96%Ог + 4% Аг) при одно- и многократных кратных кратковременных инкубациях не происходило снижения пролиферации клеток ни в одной из исследуемых смесей по сравнению с клетками, находившимися в стандартных условиях (95% воздуха, 5%С02) Это может быть связано с увеличением активности антиоксидантных систем клеток или незначительным повреждением структур клеток образующимися АФК в период воздействия гипероксических газовых смесей

При длительных (18 часов) однократных и многократных экспозициях в условиях гипероксии с использованием исследуемых газовых смесей не было показано достоверных отличий в скорости пролиферации клеток ни в одной из культур, подвергнутых воздействию гипероксической смеси Некоторое снижение пролиферативной активности лМСК, может указывать на изменения в системах внутриклеточной регуляции, при помещении клеток в условия с повышенным содержанием кислорода

Полученные данные указывают на высокую устойчивость культивируемых лМСК к токсическому действию высокого парциального давления кислорода

Исследование изменения жизнеспособности лМСК человека в условиях гипероксических газовых сред

Для оценки повреждающего эффекта повышенного содержания кислорода в среде на стромальные клетки-предшественники исследовали количество апоптотических и некротических клеток

При кратковременных экспозициях в исследуемых гипероксических средах, было выявлено незначительное увеличение доли апоптотических клеток по сравнению с нормоксическим контролем Максимальная доля апоптотических клеток при многократном кратковременном воздействии 100% кислорода не превышала 3,1%, а в газовой смеси, содержащей 96% 02 + 4% Аг - 2,7% Гораздо больше в этих условиях появилось некротических клеток - до 5% Однако, если последующий 24-часовой период восстановления после действия 100% Ог приводил к резкому нарастанию (до 20%) некротических клеток, то гипероксическая смесь, получаемая на установке, разработанной в ГНЦ РФ - ИМБП РАН [Солдатов и др, 2000, Gngonev et al, 2001], не приводила к таким выраженным последствиям Количество PI-положительных клеток не превышало 7% Необходимо отметить, что в периоде последействия не наблюдалось увеличения доли апоптотических и некротических клеток

Аналогичную картину наблюдали при длительных инкубациях клеток в гипероксических газовых смесях Увеличение доли клеток, подвергшихся некрозу, было схожим при однократных и двукратных 18-часовых экспозициях, причем доля некротических клеток в среде с медицинским кислородом была >13% и достоверно больше, чем в среде с гипероксической смесью, содержащей 96% Ог +4% Аг Следует отметить, что последующего увеличения доли поврежденных клеток в периоде последействия не наблюдалось Выявлено даже некоторое снижение доли PI-положительных клеток через 24 часа после завершения 18-часового воздействия медицинским кислородом Общеизвестно, что один из механизмов токсического действия кислорода на клетки - активация процессов апоптоза и некроза. Гибель клеток при гипероксии связана с усиленной генерацией АФК, влекущей за собой процессы перекисного окисления липидов, а также недостаточной эффективностью антиоксидантных систем, включающих в себя каталазу, супероксиддисмутазу, глютатион-редуктазу, витамины Е, С и регулирующих экспрессию генов, ответственных за регуляцию стресс-ответа и генов апоптоза [Iraní, 1988, Honda et al, 2001] Возможно, увеличение доли поврежденных клеток может быть связано с возросшей генерацией АФК

Таким образом, при исследовании эффектов гипероксических газовых смесей на культивируемые лМСК, было показано, что гибель клеток в условиях кислородного cipecca идет преимущественно по пути некроза, активация которого зависит от кратности и длительности экспозиции при использовании 100% (медицинского) кислорода

Гипероксическая среда (96% 02 + 4% Аг) приводит к достоверно меньшему (1,5-2 раза) уровню повреждения в популяции лМСК

Исследование изменения экспрессии молекул адгезии лМСК человека в условиях гипероксических газовых сред.

Исследование эффектов гипероксических газовых смесей показало, что многократные кратковременные и длительные экспозиции (по 3 и 18 часов ежедневно) лМСК в условиях пшероксии (100% Ог, 96% 02 + 4% Аг) приводят к уменьшению количества клеток, экспрессирующих маркеры клеточной адгезии (СВ9, СВ54) по сравнению с клетками, находящимися в нормоксических условиях Достоверное уменьшение количества клеток, экспрессирующих на своей поверхности СЭ9 и СБ54 наблюдалось уже после первой 3-часовой экспозиции в исследуемых газовых смесях Увеличение числа экспозиций в условиях гипероксии вызвало незначительное увеличение количества клеток, экспрессирующих СИ54 и СВ9, которое, впрочем, так и не достигло значений в нормоксии Важно отметить, что при экспозиции клеток в среде, содержащей 96%02 + 4%Аг, получаемой по методу безнагревной короткоцикловой адсорбции, приводили к достоверно меньшему снижению экспрессии СБ54 и СБ9 как после кратковременных, так и длительных воздействий по сравнению с медицинским кислородом Возвращение клеток в нормоксическую среду после 3-часовых и 18-часовых инкубаций не привело к восстановлению уровня экспрессии С09 и СБ54 на поверхности лМСК, что может указывать на необратимость выявленных изменений, по крайней мере, в рамках пассажа, подвергшегося воздействию пшероксии Показано, что уменьшение доли клеток, экспрессирующих молекулы, модулирующие клеточную адгезию (СЭ9, С054) в условиях гипероксии зависело не столько от выбранного режима экспозиции (длительность и кратность), но, в большей степени, от состава тестируемой газовой смеси

Полученные результаты свидетельствуют о более выраженном повреждающем эффекте на культивируемые мезенхимальные клетки-предшественники медицинского кислорода по сравнению с гипероксической смесью, полученной методом короткоцикловой адсорбции, что наряду с данными, полученными с использованием других моделей [Павлов Н Б и др 2003, Солдатов П Э и др, 2004, 2006], позволяет рекомендовать эту гипероксическую смесь для медицинского использования

Определение содержания цитокинов в среде культивирования лМСК человека

Одним из проявлением ответа клеток на стрессогенное воздействие может быть изменение синтеза биологически-активных веществ, таких как цитокины и хемокины, а также факторы роста В частности, показано, что оГэкспрессия 1Ь-б и УЕвР является чувствительной к изменению содержанию кислорода в среде [Койег е! а1, 2005] В работах

Еупеэ и АЬАБтакЬ [ЕупеБ е1 а1, 2004, А1-АзтакЬ е1 а!, 2007] было показано, что на изменение синтеза ТЬ-6 и УЕвР оказывают большое влияние активные формы кислорода, уровень которых, как известно, в гипероксических условиях резко увеличивается Нами было показано, что как при кратковременных и длительных воздействиях, так и в периоде последействия наблюдается достоверное увеличение экскреции 1Ь-6 при экспозиции лМСК в условиях 100% медицинского Ог Активация синтеза 1Ь-6 наблюдалась только в периоде последействия при длительных экспозициях в среде, содержащей 96% О2+ 4%Аг При кратковременных гипероксических воздействиях, и в период возвращения в стандартные условия культивирования происходила активация синтеза УЕвР только при экспозиции лМСК в среде, содержащей 96% Ог+ 4%Аг Также показано, что лМСК, находящиеся в газовой среде с 100% содержанием кислорода, синтезируют больше 1Ь-6, чем клетки, находящиеся в условиях газовой смеси, содержащей 4% Аг Таким образом, нам удалось продемонстрировать, что в лМСК гипероксия вызывает активацию синтеза таких показателей стресса, как цитокины и факторы роста, но при этом ингибирует экспрессию молекул адгезии, что, по-видимому, связано с различными сигнальными путями реализации гипероксического стимула.

Ответ на изменение содержания кислорода в окружающей среде и формирование комплекса ответных реакций клеткой - один из главных факторов, запускающих каскад различных процессов в клетке Несмотря на постоянно увеличивающееся число публикаций о влиянии изменения содержания кислорода на характеристики различных типов клеток, сами механизмы этих изменений остаются еще недостаточно изученными В то же время, наблюдаемые изменения при воздействии измененного уровня Ог на культивируемые клетки различной степени дифференцировки, такие как снижение степени экспрессии молекул адгезии и активация синтеза 1Ь-6 и УЕвР, свидетельствуют о том, что в реализацию этих эффектов вовлекаются общие механизмы С другой стороны, обнаруженные различия в пролиферации ЭК и лМСК при воздействии гипероксических газовых смесей, указывают на различную чувствительность клеток, отличных по степени дифференцировки к изменению парциального давления кислорода в среде Более того, можно предположить, что культура лМСК, являющаяся гетерогенной популяцией клеток-предшественников, может содержать субпопуляции клеток как более чувствительных к кислороду, так и менее чувствительных к его содержанию во внешней среде В таком случае, более чувствительные клетки будут погибать, как правило, по пути некроза, а более устойчивые клетки могут отвечать активацией пролиферации и за счет их вклада, сохранять относительно постоянное число лМСК в культуре, в отличие от культивируемых ЭК человека

Итак, в ходе работы была создана и апробирована эффективная тест-система, позволяющая изучать эффекты различных газовых сред на клеточном уровне Показано,

что при изучении действия измененных газовых сред необходимо учитывать не только дифференцировочный потенциал изучаемых клеточных популяций, но и использовать протокол, включающий в себя одно- и многократные краткосрочные и длительные воздействия Предложенная тест-система может иметь широкое применение для тестирования вновь создаваемых газовых смесей в связи с растущими потребностями современной медицины ВЫВОДЫ

1 Разработана эффективная модель с использованием многократного воздействия различной длительности для изучения влияния сред с измененным газовым составом на культивируемые клетки человека

2 Гипоксия (5% 02) при кратковременных и длительных одно- и многократных воздействиях не оказывает влияния на пролиферацию, жизнеспособность и миграцию ЭК, независимо от использованного индифферентного газа (Ar vs N2)

3 Длительная многократная гипоксия (5% О2) модулирует экспрессию маркеров, ответственных за межклеточное взаимодействие CD54 и CD9 и синтез IL-б и VEGF

4 Кратковременные однократные и многократные экспозиции, а также однократные длительные экспозиции в гипероксических газовых средах (75% - 100% 02) не влияют на пролиферативную активность ЭК и лМСК человека Многократные длительные экспозиции практически полностью ингибируют пролиферацию ЭК и не влияют на пролиферацию лМСК in vitro

5 Снижение жизнеспособности лМСК выявляется не только при воздействии гипероксической газовой смеси (при содержании кислорода >75%), но и в периоде последействия, в основном за счет увеличения количества некротических клеток в популяции

6 Гипероксия (90% 02) приводит к уменьшению доли лМСК, экспрессирующих молекулы, модулирующие клеточную адгезию (CD9, CD54) Выраженность эффекта зависит не столько от выбранного режима экспозиции (длительность и кратность), но в большей степени, от использованного индифферентного газа-разбавителя (Аг или N2)

7 Гипероксическая газовая смесь, содержащая 90% - 95% О2, получаемая по методу короткоцикловой безнагревной адсорбции, ингибирует пролиферацию и миграцию ЭК человека ш vitro значительно меньше, и оказывает меньший повреждающий эффект, чем смесь, получаемая на основе медицинского Ог Аналогичный протективный эффект этой смеси выявлен с использованием лМСК в качестве тест-системы

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1 Влияние гипероксических газовых смесей на пролиферацию эндотелиальных клеток человека m vitro // Тезисы Ш Молодежной конференции молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященная Дню Космонавтики, Москва, 2004 г С 14-15

2 Изучение влияния гипероксической газовой смеси на органоспецифичные клетки-предшественники человека // Тезисы VI Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» Звенигород, 2005 г, С 92 (соавт Л Б Буравкова, Е Р Андреева)

3 The effects of hyperoxic gas mixtures о human adipose tissue-derived progenitor cells // Abstracts of the 2nd International Conference "Strategies in Tissue Engineering" Wurzburg, 2006, Cytotherapy, Vol 8 Supp 2 P 37 (co-autors L Buravkova, E Andreeva, I Smirnov)

4 Влияние пшоксических газовых смесей на жизнеспособность, экспрессию молекул адгезии, миграцию и синтез интерлейкинов культивируемыми эндотелиальными клетками человека // Тезисы Всероссийского симпозиума «Биология клетки в культуре» Санкт-Петербург, 2006 г, С (соавт Л Б Буравкова, Е Р Андреева)

5 Migration activity of endothelial cells in vitro ш hyperoxic gas mixture // Abstracts of the International Symposium "Biological Motivity New Trends ш Research" Pushchino, 2006 p 41-42

6 Влияние гипероксических газовых смесей на пролиферативную и миграционную активность культивируемых эндотелиальных клеток человека // Авиакосм и эколог мед, 2006 г, Т 40, N3,- С 38-42 (соавт Н В Мерзликина, Л Б Буравкова)

7 Влияние гипероксических газовых смесей на жизнеспособность и изменение экспрессии поверхностных маркеров мезенхимальных стромальных клеток-предшественников // Технологии живых систем, 2006 г, N2, С 47-52 (соавт Л Б Буравкова, Е Р Андреева)

8 VIII Международный конгресс International Society for adaptive medicme, Москва, Россия, 2006 г, С 89, «The effect of hyperoxic gas mixtures markers expression of stromal progenitor cells» (соавт Л Б Буравкова, Е Р Андреева)

9 Влияние гипероксических смесей на полипотентные мезенхимальные стромальные клетки человека // Тезисы V Молодежной конференции молодых ученых и специалистов, аспирантов и студентов, посвященная Дню Космонавтики, Москва, 2007 г С 14-15

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода ИЛ, IL - интерлейкин

лМСК - мезенхимальные стволовые клетки, выделенные из липоаспирата МСК - мезенхимальные стволовые клетки СК - стволовые клетки ЭК - эндотелиальные клетки

CD - cluster of differentiation - кластер дифференцировки

ICAM - intracellular adhesion molecule — межклеточная молекула адгезии

VEGF - vascular endothelial growth factor - фактор роста эндотелия сосудов

Использование новых искусственных газовых сред в обитаемых гермообъектах (космические корабли и орбитальные станции, подводные лодки и подземные объекты, барокамеры различного назначения) требует тщательной всесторонней проверки их биологической активности с использованием различных тест-систем. Показано что важным является не только изучение эффектов измененного содержания кислорода, но и реакция живых систем на такую важную составляющую как индифферентный газ [Вдовин и др., 1998; Ветош и др., 1999; Гальчук и др., 2001; Павлов и др., 1999, 2004; Шулагин и др., 2001; Cook, 1950; Al-Nabulsi et al., 1997; Kindwall etal., 1995].

Гипоксические состояния могут возникать у здоровых людей в связи со специфическими условиями профессиональной деятельности и возможными чрезвычайными происшествиями в результате неисправности систем жизнеобеспечения. В таких случаях снижение содержания кислорода в газовой среде протекает с различной скоростью и может вызывать тяжелые органные нарушения, если не удается сразу устранить причину появления экзогенной гипоксии. Основная группа риска в данном случае - это водолазы, подводники, летчики, космонавты, шахтеры, пожарники и дайверы [Малкин и др., 1977, Гуляр и др., 1991, Полещук и др., 1991 Kindwall et al., 1995].

Для компенсации недостатка 02, возникающего вследствие эндогенной и экзогенной гипоксии в настоящее время широко применяются гипероксические газовые смеси. Они незаменимы при оказании неотложной медицинской помощи для купирования таких состояний как острая гипоксия, отравление угарным газом, декомпрессионные расстройства и другие [Жиронкин и др., 1968, 1972; Леонов и др., 1993; Сапов и др., 1982 Kindwall etal., 1995].

Эффекты, возникающие при гипоксии и гипероксии, непосредственно связаны с изменением содержания кислорода в среде. Высокая окислительная способность кислорода, имеет как положительные, так и отрицательные стороны. Наряду с окислительным фосфорилированием, в которое вовлекается около 90% потребляемого кислорода, в живых организмах постоянно протекают реакции с образованием активных форм кислорода (АФК), Одним из самых важных отрицательных действий кислорода на клетку является избыточная генерация АФК и их производных [Скулачев, 1996].

В последние годы проводится значительное количество исследований, направленных на изучение воздействия газовых смесей с различным содержанием кислорода и широким спектром индифферентных газов на организм человека. Большинство этих работ посвящено оценке эффектов газовых смесей на уровне целого организма [Павлов и др., 1999, 2006; Шулагин и др., 2001]. Однако для понимания клеточных и молекулярных механизмов возникающих изменений необходимо проведение исследований на уровне отдельных клеток. В настоящее время в связи с появлением методов культивирования клеток, появилась уникальная возможность моделировать различные процессы на клетках человека in vitro. Использование таких моделей позволяет не только оценить влияние газовых смесей с повышенным или пониженным содержанием кислорода на функционирование клеток, но и изучить молекулярные механизмы ответа клеток на изучаемый стимул [Буравкова и др., 1991; Ткачук и др., 1997, Nishida et al., 2000; Mold et al., 2001; Sengupta et al.; 2001; Lee et al, 2005].

К сожалению, данные, получаемые при изучении влияния смесей с различным содержанием кислорода на клеточном уровне не только малочисленны, но и часто противоречивы. Наблюдаемые изменения могут быть специфическими для изучаемого типа клеток, именно поэтому, очень важен выбор клеточного объекта. Для изучения эффектов измененных газовых сред in vitro, одной из наиболее удачной моделей являются эндотелиальные клетки (ЭК), которые в силу своего положения в организме находятся в условиях различного содержании кислорода, и, как следствие, обладают механизмами коррекции своих функций и адаптации к изменяющимся условиям среды. Изучение эффектов газовых сред на ЭК позволит получить представление о влиянии измененной газовой среды на высокодифференцированные клеточные популяции.

Для более полного понимания эффектов, оказываемых смесями с различным содержанием кислорода на организм человека, необходимо изучать их воздействие не только на дифференцированные системы, но и на более пластичные и менее дифференцированные популяции клеток, такие как мезенхимальные стромальные клетки-предшественники (МСК), интерес к которым значительно возрос в связи с их возможным применением в регенеративной медицине. Одним из наиболее доступных источников МСК является жировая ткань, которая, также как и костный мозг, является производным мезенхимы и содержит поддерживающую его строму, которая может быть легко изолирована [Zuk et al., 2001, 2002; Katz et al., 2002, Ryang et al., 2004; Leong et al., 2005; Dicker, 2005]. Сравнительное изучение клеточных популяций (ЭК и МСК) с различным потенциалом дифференцировки в одних и тех же экспериментальных условиях (параметры культивирования, состав газовой среды, кратность и продолжительность воздействия) позволит оценить насколько степень дифференцировки клетки может определять клеточную реакцию на изменение содержания кислорода в окружающей среде.

Создание соответствующего экспериментального протокола является необходимым условием для получения результатов, наиболее адекватно отражающих эффекты воздействия измененных газовых сред на культивируемые клетки. Условия использования измененных газовых сред, применяемых в различных исследованиях очень вариабельны. Чаще всего изучаются однократные кратковременные или длительные воздействия. Однако для того чтобы более достоверно оценить влияние изменения содержания кислорода на клетки представляется важным сравнить влияние одно- и многократных экспозиций и эффекты отмены воздействия. Создание такого протокола является чрезвычайно актуальным в связи с необходимостью тестирования вновь создаваемых газовых смесей для замкнутых гермообъектов и/или компенсации различных патологических состояний, возникающих у людей при изменении содержания кислорода.

Изучение возможности использования культивируемых клеток с различными дифференцировочными потенциями в качестве тест-системы для оценки измененных газовых сред и стала предметом настоящего исследования.

Цель работы.

Оценка эффектов измененных газовых сред на модели культивируемых клеток с разным потенциалом дифференцировки в качестве тест-системы. Задачи исследования:

1. Разработать модель для исследования in vitro действия газовых сред с измененным содержанием кислорода на культивируемые клетки человека.

2. Исследовать влияние кратковременных и длительных экспозиций в гипоксических и гипероксических газовых средах на пролиферативную активность, жизнеспособность и экспрессию молекул адгезии в эндотелиальных клетках человека in vitro.

3. Изучить влияние газовых сред с измененным содержанием кислорода на миграцию и синтез биологически активных веществ культивируемыми эндотелиальными клетками человека

4. Провести сравнительное исследование газовых сред с измененным содержанием кислорода на низкодифференцированные мезенхимальные клетки человека при кратковременных и длительных экспозициях.

5. Сравнить с использованием культивируемых клеток эффекты гипероксических газовых сред, получаемых из медицинского кислорода и гипероксической кислородно-азотно-аргоновой среды, получаемой по методу короткоцикловой безнагревной адсорбции.

Научная новизна работы.

Впервые на модели культивируемых ЭК человека показано, что при длительных многократных экспозициях в гипероксических газовых средах (от 75% до 95% Ог) происходит уменьшение экспрессии CD54 (ICAM-1), что свидетельствует о снижении степени активации эндотелиальных клеток.

Установлено, что кислородный стресс (гипоксия или гипероксия) вызывает в ЭК человека увеличение экскреции IL-6 и VEGF во внеклеточную среду, при этом выявлена кумулятивная зависимость от времени и кратности экспозиций в измененной газовой среде.

Впервые на культивируемых клетках проведено тестирование новых гипероксических смесей, получаемых по методу короцикловой безнагревной адсорбции, и при этом выявлен их меньший повреждающий эффект по сравнению с гипероксическими смесями на основе кислорода и азота.

Практическая значимость работы.

Разработана и апробирована тест-система, позволяющая изучать эффекты, оказываемые газовыми смесями на культивируемые клетки

Показано, что в периоде последействия (при возвращении клеток в стандартные условия культивирования) выявляются повреждающие эффекты измененного содержания кислорода в среде, не регистрируемые во время и сразу после воздействия. Это указывает на необходимость учета латентных нарушений при использовании культур клеток в качестве тест-системы.

Установлено, что при использовании мезенхимальных стромальных клеток-предшественников в качестве экспериментальной модели in vitro следует принимать во внимание их устойчивость к изменению напряжения 02 в среде.

In vitro показано, что гипероксическая газовая смесь, получаемая по методу короткоцикловой безнагревой адсорбции, обладает меньшим повреждающим действием на культивируемые клетки, чем гипероксические смеси на основе медицинского кислорода.

Положения, выносимые на защиту.

Разработанная и апробированная тест-система позволила выявить гипероксические и гипоксические эффекты in vitro и провести оценку повреждающего действия газовых смесей с различным содержанием индифферентных газов, на модели культивируемых дифференцированных (ЭК человека) и малодифференцированных (МСК человека) клеток.

Снижение содержания кислорода в среде до 5% при многократных кратковременных и длительных экспозициях не влияет на пролиферацию, миграцию и жизнеспособность, но модифицирует экспрессию клеточных маркеров и синтез IL-6 и VEGF эндотелиальными клетками человека.

В условиях гипероксии (75% - 100%0г) ингибируется пролиферативная активность ЭК человека, но не МСК, при этом на поверхности МСК снижается экспрессия молекул клеточной адгезии (CD9, CD54).

выводы.

1. Разработана эффективная модель с использованием многократного воздействия различной длительности для изучения влияния сред с измененным газовым составом на культивируемые клетки человека.

2. Гипоксия (5% 02) при кратковременных и длительных одно- и многократных воздействиях не оказывает влияния на пролиферацию, жизнеспособность и миграцию ЭК, независимо от использованного индифферентного газа (Аг vs N2).

3. Длительная многократная гипоксия (5% 02) модулирует экспрессию маркеров, ответственных за межклеточное взаимодействие CD54 и CD9 и синтез IL-6 и VEGF.

4. Кратковременные однократные и многократные экспозиции, а также однократные длительные экспозиции в гипероксических газовых средах (75% - 100% 02) не влияют на пролиферативную активность ЭК и лМСК человека. Многократные длительные экспозиции практически полностью ингибируют пролиферацию ЭК и не влияют на пролиферацию лМСК in vitro.

5. Снижение жизнеспособности лМСК выявляется не только при воздействии гиперокснческой газовой смеси (при содержании кислорода >75%), но и в периоде последействия, в основном за счет увеличения количества некротических клеток в популяции.

6. Гипероксия (90% 02) приводит к уменьшению доли лМСК, экспрессирующих молекулы, модулирующие клеточную адгезию (CD9, CD54). Выраженность эффекта зависит не столько от выбранного режима экспозиции (длительность и кратность), но в большей степени, от использованного индифферентного газа-разбавителя (Аг или N2).

7. Гипероксическая газовая смесь, содержащая 90% - 95% 02, получаемая по методу короткоцикловой безнагревной адсорбции, ингибирует пролиферацию и миграцию ЭК человека in vitro значительно меньше, и оказывает меньший повреждающий эффект, чем смесь, получаемая на основе медицинского 02. Аналогичный протективный эффект этой смеси выявлен с использованием лМСК в качестве тест-системы.