Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Влияние факторов цервикального секрета (резидентной и факультативной микрофлоры, муцина) на функциональную активность нейтрофилов

ос

На правах рукописи /У

ПЛЕХАНОВА Екатерина Викторовна

ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ЦЕРВИКАЛЬНОГО СЕКРЕТА (РЕЗИДЕНТНОЙ И ФАКУЛЬТАТИВНОЙ МИКРОФЛОРЫ, МУЦИНА) НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ

14 00 36 - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□□3161455

Челябинск-2007

003161455

Работа выполнена в лаборатории противоинфекционного иммунитета НИИ иммунологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ"

Научный руководитель:

заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Долгушин Илья Ильич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Сибиряк Сергей Владимирович

доктор медицинских наук,

профессор Колесников Олег Леонидович

Ведущая организация:

Государственное учреждение "Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук" г Пермь

Защита состоится » ноября 2007 г в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208 117 03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ" по адресу 454092, г Челябинск, ул Воровского 64

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ"

Автореферат разослан « 02 » октября 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Л.Ф. Телешева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Одним из важнейших и мало изученных механизмов антимикробной защиты является колонизационная резистентность кожи и слизистых оболочек, под которой понимают устойчивость эпителия к колонизации условно патогенными и патогенными микроорганизмами Колонизационная резистентность обеспечивается совокупностью разнообразных факторов на слизистых оболочках это, прежде всего, муцин, образующийся в достаточно сложный биослой В этот биослой встроены и в нем функционируют все защитные инструменты резидентная микрофлора, секреторные антитела, разнообразные бактерицидные молекулы, такие как лизоцим, лактоферрин, токсические метаболиты кислорода, азота и т д (Железная Л А, 1998, Краснопольский В И и др, 1999, Кира Е Ф , 2001, Кафарская Л И и др , 2002, Андреева Ю С , 2005)

До сих пор не ясна роль фагоцитирующих клеток (нейтрофилов и макрофагов) в защите слизистых оболочек Фагоциты - это тканевые клетки, на сегодняшний день достаточно хорошо изучены лишь фагоциты легочных секретов (Пигаревский В Е , 1982, Бережная НМ, 1988, Бакуев М М , 1992, Маянский А Н , Маянский Д Н , 1989, Маянский Д Н и др , 1996, Ройт А, Бростофф Дж, 2000, Долгушин И И, Бухарин О В , 2001) Фагоцитирующие клетки слизистых оболочек других органов изучены мало

Особый интерес представляют механизмы защиты слизистых оболочек репродуктивного тракта женщин, поскольку, в силу особенностей строения женских половых органов, между микробнообсемененным нижним отделом и стерильной полостью матки располагается лишь слизистая пробка шейки матки, которая и сдерживает натиск огромной армии возбудителей (Бодяжина, В И, 1980, Гршценко В И и др , 1981, Долгушина В Ф, 1991, Теплякова М В, Радионченко А А, 1991, Телешева Л Ф , 2000)

В работе Андреевой Ю С показано, что нейтрофилы и их секреторные продукты участвуют в регуляции измененного микробиоциноза влагалища, поскольку они подавляют рост условно патогенной флоры и мало влияют на резидентные бактерии влагалищного биотопа (Андреева ЮС 2005)

Тканевые нейтрофилы, закончив свой жизненный цикл, погибают При этом определенная часть клеток подвергается как алоптозу, так и некробиозу, вероятно, в результате активации структурами микроорганизмов, составляющих резидентную микрофлору биотопа Смерть клеток происходит после реализации их биологической программы в очаге воспаления, в нормальной ткани, после их выделения на поверхность слизистых оболочек (Долгушин И И, Бухарин О В , 2001) Остается не ясным вопрос о биологическом смысле такого "марша смерти" нейтро-филов в слизистый биослой

Мы полагаем, что нейтрофилы, покидая ткани и выходя в слизистый биослой под влиянием «факторов слизистых оболочек», погибают и выделяют биоцидные продукты, которые участвуют в регуляции микро-биоцинозов, заселяющих соответствующие биотопы, в том числе и нижний отдел гениталий В этой связи возникло предположение, что функциональные свойства нейтрофилов изменяются под влиянием муцина и микроорганизмов, содержащихся в цервикальном секрете

Цель исследования

Изучить влияние факторов цервикального секрета (резидентной и факультативной микрофлоры, муцина) на функциональную активность нейтрофилов, их способность секретировать биоцидные продукты

Задачи исследования

1 Оценить в экспериментальной модели in vitro характер изменения жизнеспособности нейтрофилов периферической крови после их активации муцином, различными видами микроорганизмов, обычно заселяющими слизистые оболочки (Lactobactenum spp , Bifidobacterium spp , S aureus (штамм 209), E cob (штамм М-17)), а также цервикальным секретом

2 Исследовать in vitro апоптогенное действие муцина, цервикаль-ного секрета, различных видов резидентных и факультативных бактерий слизистых оболочек гениталий женщины на нейтрофилы периферической крови

3 Изучить функциональную активность нейтрофилов периферической крови после их активации S aureus (штамм 209), Е coli (штамм М-17), Lactobacterium spp , Bifidobacterium spp, муцином в экспериментальной модели in vitro

4 Определить бактерицидный эффект супернатантов нейтрофилов, интактных и активированных S aureus (штамм 209), Е coli (штамм М-17), Lactobacterium spp и Bifidobacterium spp, в отношении этих же тест-культур бактерий

5 Изучить концентрацию метаболитов оксида азота (нитратов и нитритов), активность пероксидазы, активность каталазы в супернатантах нейтрофилов, интактных и активированных in vitro различными видами микроорганизмов

Научная новизна исследования

Впервые был изучен характер изменения жизнеспособности нейтрофилов периферической крови после активации различными видами микроорганизмов, а также муцином и латексом m vitro Показано, что нейтрофильные гранулоциты погибают в результате апоптоза или некроза после их активации Lactobacterium spp и Bifidobacterium spp , S aureus (штамм 209), E coli (штамм M-17) Установлено, что резидентные бактерии репродуктивного тракта женщины (Lactobacterium spp и Bifidobacterium spp) обладают большим апоптогенным действием, чем S aureus и Е coli При этом Lactobacterium spp и Bifidobacterium spp индуцируют секрецию нейтрофилами продуктов с большей бактерицид-ностью, чем S aureus и Е coli Впервые показано, что продукты нейтрофилов обладают селективной бактерицидностью по отношению к различным видам резидентной и факультативной флоры репродуктивного тракта женщины

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные данные позволяют расширить представление о роли нейтрофилов в защитите слизистых оболочек, об их участии в регуляции состава микробиоцинозов, заселяющих поверхность эпителия нижнего отдела гениталий женщины Показано, что после контакта с Lactobacterram spp и Bifidobacterium spp , S aureus (штамм 209), E coli (штамм М-17) изменяется жизнеспособность гранулоцитов, а также спектр их противомикробной активности Результаты исследования открывают перспективу для дальнейшего более детального изучения механизма селективной гибели нейтрофилов после воздействия на них бактерий и других факторов секретов слизистых оболочек, а также роли этих клеток в формировании колонизационной резистентности мукозно-го эпителия

Положения, выносимые на защиту

1 Инкубация ш. vitro нейтрофилов периферической крови с различными представителями микрофлоры слизистых оболочек (Lactobactenum spp , Bifidobacterium spp, S aureus (штамм 209), E coli (штамм М-17)), а также муцином, цервикальным секретом и латексом приводит к снижению жизнеспособности значительного числа фагоцитов

2 Активация нейтрофилов периферической крови различными видами микроорганизмов (Lactobactenum spp , Bifidobacterium spp , S aureus (штамм 209)), муцином, цервикальным секретом, латексом в экспериментальной модели ш vitro увеличивает число погибших (трипано-позитивных) клеток и клеток, ушедших в апоптоз Lactobactenum spp и Bifidobactenum spp обладают большим апоптогенным действием, чем S aureus (штамм 209) и Е coli (штамм М-17)

3 После культивирования m vitro нейтрофилов со взвесью Lactobactenum spp , Bifidobacterium spp , S aureus (штамм 209) и E coli (штамм M 17) фагоциты изменяют свою функциональную активность

4 Культивирование нейтрофилов с активирующими их различными факторами сопровождается выделением в околоклеточную среду бак-

терицидных продуктов Lactobactenum spp и Bifidobacterium spp , индуцируют секрецию нейтрофилами факторов с большей бактерицидной активностью, чем S aureus и Е coli

5 В супернатантах нейтрофилов, интактных и активированных различными видами микроорганизмов, содержание количества метаболитов оксида азота (нитратов и нитритов) разное, так же как и активность пероксидазы и каталазы

6 Взаимодействие нейтрофилов и резидентных бактерий цервикаль-ного биотопа играет важную роль в повышении биоцидности секретов нижних отделов гениталий женщины Под влиянием Lactobactenum spp Нейтрофилы выделяют продукты обладающие селективной бактерицид-ностью в отношении факультативной флоры данного биотопа

Апробация работы и внедрение результатов исследования

Основные положения диссертации доложены, обсуждены и опубликованы на Всероссийском научном Форуме имени академика В И Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии» (г Санкт-Петербург, 2006, 2007), Конференции иммунологов Урала (г Оренбург, 2006), VI и V итоговой научно-практической конференции молодых ученых, ЧелГМА (Челябинск, 2005, 2006) Результаты исследования используются в процессе преподавания на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии, а так же в практической работе лаборатории противоинфекционного иммунитета НИИ иммунологии ГОУ ВПО Челябинской государственной медицинской академии

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и

списка литературы, включающего 137 работ отечественных авторов и 70 работ иностранных авторов Работа иллюстрирована 32 таблицами, 1 рисунком

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Нами было проведено иммунологическое обследование 121 женщины в возрасте от 18 до 26 лет Все женщины были практически здоровы Исследования проводились в первой фазе менструального цикла

Жизнеспособность нейтрофилов периферической крови определяли с помощью окраски клеток трипановым синим Апоптоз нейтрофилов изучали с помощью метода проточной цитометрии (Сибиряк С В , Кидрасова Е Н, 2006) на базе Всероссийского центра глазной и пластической хирургии (г Уфа), и методом люминесцентной микроскопии (Gasiorowski К , Brokos В et al, 2001) Функциональный ответ нейтрофилов крови оценивался по лизосомальной активности (Фрейдлин И С , 1984), с помощью спонтанного и индуцированного НСТ-теста проводилось определение внутриклеточного кислород-зависимого метаболизма полиморфноядерных лейкоцитов (Маянский А Н , Виксман М К , 1979), исследование фагоцитарной активности нейтрофилов проводилось на модели поглощения частиц полистирольного латекса (Лебедев К А, По-някинаИ Д , 1990) и контрольных штаммов S aureus (штамм 209), Е Coll (штамм М-17), Lactobactenum spp (препарат "Лактобактерин сухой", фирма "ИмБио", г Нижний Новгород), Bifidobacterium spp (препарат "Бифидумбактерин", ЗАО "Экополис", г Ковров) (Иммунологические методы ,1981, 1987)

Для получения продуктов секреции нейтрофилов использовали ге-паринизированную венозную кровь Выделение секреторных продуктов полиморфноядерных лейкоцитов проводили с помощью метода, разработанного Долгушиным И И , Зурочкой А В идр (1992) Секреторные продукты получали из взвеси нейтрофилов периферической крови, по-

лученных на двойном градиенте растворов фиколла-верографина (Pharmacia, Sweden, Spofa, CSSR), плотность первого слоя была 1,0751,077, а второго -1,093- 1,095

Для определения бактерицидной активности секреторных продуктов нейтрофилов использовали фотонефелометрический метод предложенный О В Смирновой и Т А Кузьминой (Иммунологические методы ,1981) С этой целью вначале получали секреторные продукты нейтрофилов, интактных и активированных ш vitro взвесью контрольных штаммов S aureus (штамм 209), Е coli (штамм М-17), Lactobactenum spp , Bifidobacterium spp по отношению к Е coli (штамм М-17) В пробирки наливали по 4,5 мл стерильного 5% мясо-пептонного бульона, добавляли по 0,1 мл, 0,5 мл и 1,0 мл секреторных продуктов нейтрофилов, активированных взвесью штаммов либо S aureus, либо Е coli, либо Lactobactenum spp , либо Bifidobacterium spp , либо не активированных Затем во все пробирки вносили по одной капле 24-часовой культуры кишечной палочки (плотность взвеси 0,46-0,48, которую определяли на ФЭКе с зеленым светофильтром при длине волны 540 нм) Содержимое пробирок тщательно перемешивали и стерильной пипеткой отбирали по 2 мл для измерения на ФЭКе оптической плотности (Д) Смесь, оставшуюся в пробирках инкубировали в термостате при температуре +37° С 3 часа После этого вновь измеряли оптическую плотность содержимого пробирок Бактерицидную активность (БА) вычисляли следующим образом (Иммунол методы , 1981)

Д0 через 3 часа - Д0 перед инкубацией

БА,% = 100 - _ х 100

Дк через 3 часа - Дк перед инкубацией Где Д0 - оптическая плотность в опыте

Дк - оптическая плотность в контроле Таким же образом определяли бактерицидную активность секреторных продуктов интактных и активированных нейтрофилов по отношению к S aureus

Для оценки бактерицидной активности по отношению к Lactobacteraun spp использовали модифицированную жидкую питательную среду MPC, а для бифидобактерий - тиогликолевую среду (ОАО "Биомед" им И И Мечникова), исследования проводили по той же схеме Аналогичное исследование выполнялось Андреевой Ю С (2006) В отличие от работы Андреевой Ю С , в настоящем исследовании эксперимент проводился с супернатантами сразу после его выделения, тестированный супернатант использовался в объеме 0,1,0,5, и 1мл, не доводился физиологическим раствором до объема 1 мл, а контролем служил физиологический раствор в объеме 0,1, 0,5 и 1,0 мл

Содержание оксида азота (конечные его метаболиты - нитраты, нитриты) в супернатантах нейтрофилов определяли методом хроматографии с использованием кадмиевой колонки по цветной реакции Грисса (Емченко H Л , Цыганенко О И и др , 1994) Принцип определения активности пероксидазы основан на фотометрической регистрации понижения концентрации индигокармина, который окисляется перекисью водорода в присутствии пероксидазы (Попов Т, Нейковска JI, 1971)

Определение активности каталазы в супернатантах нейрофилов основано на способности перкиси водорода образовывать с солями молебдена окрашенный продукт (M А Корелюк с соавт (1988)

Полученные результаты исследования были подвергнуты статистической обработке с использованием пакетов статистических программ Statistica for Wmdows 6 0, с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±ш) О достоверности различий показателей в сравниваемых группах судили по непараметрическим критериям Ман-на-УигнииВилкоксона-Манна-Уитни (ГублерЕ В , 1973,ГланцС , 1999)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При миграции нейтрофилов на поверхности эпителия происходит их дегрануляция, и антимикробные продукты, содержащиеся в лизосо-мах, выделяются наружу Секреторная дегрануляция сопутствует практически всем формам реактивности нейтрофилов респираторному взры-

ву, адгезии, фагоцитозу Показано, что при миграции нейтрофилов на поверхность слизистых, значительная часть этих клеток погибает или в результате некробиоза, или в результате апоптоза (Маянский А Н, Гали-уллин Д Н, 1984, Маянский А Н , Маянский Д Н , 1989, Маянский Н А и др , 2000, Долгушин И И, Бухарин О В , 2001)

Одной из задач нашего исследования было изучение жизнеспособности и механизма гибели нейтрофилов после взаимодействия их с культурами бактерий, наиболее часто заселяющими нижний отдел репродуктивного тракта женщины Lactobactenum spp, Bifidobacterium spp , S aureus, E Coir, а так же цервикальной слизью, муцином и частицами латекса

После инкубации с Lactobactenum spp , Bifidobacterium spp, E Coli, частицами латекса и муцином жизнеспособность клеток снижается и достоверно отличается от интактных нейтрофилов Жизнеспособность нейтрофилов составляет после контакта с Lactobactenum spp - 39,67%, Bifidobacterium spp - 42,08%, E coli - 41,81% и частицами латекса -35,09% соответственно После инкубации с муцином количество жизнеспособных нейтрофилов становилось ниже по сравнению с нейтро-филами, активированными Lactobactenum spp и составляло 27% После инкубации нейтрофилов с S aureus и безклеточным фильтратом цервикальной слизи число жизнеспособных клеток значимо не изменялось Таким образом, действие латекса, муцина и ряда микроорганизмов приводит к гибели нейтрофилов

Одним из механизмов гибели клеток является апоптоз Для определения апоптотических клеток взвесь окрашивали красителями этидий бромид и акридиновый оранжевый, учет результатов проводили с помощью люминесцентной микроскопии, по дифференцированному окрашиванию жизнеспособных, апоптозных и погибших клеток При использовании данного метода отмечено, что бактерии обладают более выраженным апоптогенным действием, чем слизь и муцин Значимые отличия получены при активации клеток Lactobactenum spp (40,35±4,45 %) и муцином (8,57±1,58%) Кроме люминесцентной микроскопии для оцен-

ки апоптоза нами использовался метод проточной цитометрии, исследования проводили на базе иммунологической лаборатории Всероссийского центра глазной и пластической хирургии (г Уфа) результаты представлены б таблице 1

Таблица 1

Уровень апоптоза нейтрофильных гранулоцигов периферической крови интактных и после инкубации с Lactobactenum spp , Bifidobacterium spp , S aureus, E Coll, частицами латекса, цервикальной слизью и муцином определенный (метод проточной цитометрии, %) (М ± т)

Опыт Номер опыта Стат показатель Апоптоз

Неактиви1)Ованные нейтрофилы 1 М±т 15,88 ±3,57

п 31

Нешрофилы + Lactobactenum spp 2 М±т 54,4 ± 6,75

п 16

Р р 1-2 =0 00001

Нейтрофилы + Bifidobacterium spp 3 М±т 51,65 ±7,68

п 18

Р р 1-з =0 0001

Нешрофилы + S aureus 4 М±т 14,49 ± 4,79

п 11

P р 2 -4 =0 0002 рз-4 =0 002

Нешрофилы + E Coli 5 М±т 11,27 ±5,25

п 15

P р 2 5 = 0 00004 р з-5 = 0 0001

Нешрофилы + латекс 6 М±т 28,80 ± 8 43

п 11

Р р 2 6 = о 02 р з-б = 0 04

Нейтрофилы + слизь 7 М±т 8Д±2,56

п 12

Р P 6-7 =0,03 р2-7 = 0,0004 рз-7= 0,0004

Нешрофилы + муцин 8 М±т 11,95±1,58

п 11

Р р э_8 = 0,009 Р 3-8 =0,01 р 2-8 = 0,00005

Сразу после выделения нейтрофилов процент апоптозных клеток составлял 4,88%, через 30 минут инкубации в термостате этот показатель значительно увеличился до 15,88% Поэтому результаты дальнейших исследований были оценены в сравнении с показателями апоптоза нейтрофилов без активации, но выдержанных в термостате

Инкубация клеток с культурами Lactobacterium spp и Bifidobacterium spp приводила к резкому увеличению количества клеток, ушедших в апоптоз, до 54,4% и 51,65% соответственно, и существенно отличалась по сравнению с остальными опытами

Результаты проточной цитометрии убедительно показывают, что лакто и бифидобактерии являются сильными апоптогенами, а цервикаль-ная слизь и ее основной компонент - муцин, не оказывают выраженного действия на этот процесс

Учитывая то, что жизнеспособность нейтрофилов после взаимодействия их с Е coli (штамм М-17), S aureus (штамм 209), Lactobacterium spp , Bifidobacterium spp , латексом и муцином изменялась, мы изучили функциональную активность этих клеток

После активации нейтрофилов латексом снижался процент жизнеспособных клеток и увеличивались показатели НСТ-теста

Стимуляция нейтрофилов взвесью лактобактерий приводила к достоверному снижению количества живых клеток, увеличению числа мертвых нейтрофилов и клеток, ушедших в апоптоз При этом активность и интенсивность фагоцитоза, лизосомапьная активность и индекс активности лизосом, а так же показатели НСТ-теста достоверно не отличались от исходного уровня

Взаимодействие нейтрофилов с Bifidobacterium spp , приводило к снижению количества жизнеспособных клеток, увеличению числа апоптозных клеток, к снижению активности и интенсивности фагоцитоза по сравнению с активацией клеток латексом, и снижению показателей активности лизосом по сравнению с неакгивированными нейтрофилами Инкубация нейтрофилов со взвесью S aureus сопровождалась уве-

личением индекса люминисценции лизосом и НСТ-теста, в то время как их жизнеспособность значимо не отличалась от неакгивированных ней-трофилов

Взаимодействие нейтрофилов с Е coli приводило к снижению количества жизнеспособных клеток, при этом количество апоптозных клеток не изменялось по сравнению с неактивированными нейтрофилами Отмечалось увеличение индекса люминесценции лизосом и НСТ-теста, по сравнению с неакгивированными нейтрофилами

После инкубации нейтрофилов с муцином отмечено снижение жизнеспособности нейтрофилов Количество клеток, ушедших в апоптоз, достоверно не отличалось от не активированных нейтрофилов При этом достоверно снижались показатели лизосомальной активности и НСТ-теста

В результате проведенных исследований m vitro можно говорить о том, что S aureus (штамм 209), Е Coli (штамм М-17) активируют внутриклеточные шиллинговые системы нейтрофилов в большей степени, чем Lactobactenum spp (препарат "Лакгобакгерин сухой"), Bifidobacterium spp (препарат "Бифидумбакгерин сухой") В то же время, Lactobactenum spp , Bifidobacterium spp приводят к достоверному снижению числа жизнеспособных нейтрофилов и увеличению количества клеток, ушедших в апоптоз, S aureus (штамм 209) и Е Coli (штамм М-17), подобным действием обладают в меньшей степени

За последние годы получены данные о секреторной функции нейтрофилов, химическом строении их медиаторов (Третьякова И Е , 2003) Нейтрофилы содержат различные биологически активные продукты, которые образуются в процессе созревания клеток и присутствуют в их гранулах, а также синтезируются после активации (Маянский А Н , Га-лиуллин Д Н , 1984, Долгушин И И , Бухарин О В , 2001)

Учитывая то что, нейтрофилы после взаимодействия с Lactobactenum spp, Bifidobactenum spp , S aureus, E coli, нейтрофилы, изменяют свою функциональную активность, было решено оценить бактерицидные свой-

ства супернатантов нейтрофилов, интактных и активированных Е coli, S aureus, Lactobacterxum spp , Bifidobacterium spp по отношению к этим же микроорганизмам в экспериментальной модели in vitro и сразу же после выделения

Первым этапом исследования было изучение влияния супернатанта интактных нейтрофилов на контрольные штаммы микроорганизмов Е Coli (штамм М-17), S aureus (штамм 209), Lactobacterium spp , Bifidobacterium spp , в зависимости от концентрации супернатанта нейтрофилов

При воздействии супернатантов интактных нейтрофилов на эталонные штаммы бактерий отмечено снижение содержания всех видов микроорганизмов в пробе Супернатант неактивированных нейтрофилов оказывал бактерицидное действие в высоких концентрациях на S aureus и на Е coli На лактобакгерии в объеме 0,1 и 0,5 мл такой супернатант действовал бактерицидно, а в концентрации 1 мл оказывал стимулирующее влияние Bifidobacterium spp устойчивы к действию супернатанта интактных нейтрофилов

Бактерицидность супернатантов нейтрофилов, активированных S aureus, была выражена только по отношению к Е coli Эффект на другие бактерии, в том числе на S aureus, практически отсутстваш

Бактерицидный эффект супернатанта нейтрофильных гранулоцитов, активированных Е coli, был умеренно выражен и мало отличался, при использовании различных бактерий-мишений

После стимуляции in vitro лактобактериями нейтрофильные грану-лоциты секретируют вещества, бактерицидный эффект которых был более выражен по отношению к S aureus и Е coli, чем у супернатантов интактных нейтрофилов На Bifidobacterium spp этот супернатант в дозе 0,5 мл оказывает стимулирующее действие, а в количестве ОД — тормозящее рост бактерий Иначе проявляется эффект того же супернатанта по отношению к Lactobacterium spp Если супернатант неактивированных нейтрофилов подавляет рост лактобактерий, то после активации нейтро-

Рисунок I. Бактерицидное действие суперкатантов нейтрофилов, активированных I.actobacterium spp на эталонные штаммы бактерий S.aureus, Е. coli, Lac tob act en um spp.. Bifidobacterium spp.,%

филов этими же бактериями секреторные продукты нейтрофилов, наоборот, стимулируют рост лактобакгерий, рисунок 1.

Супернатанты нейтрофилов, активированных Bifidobacterium spp., обладали выраженным бактерицидным эффектом по отношению к Е. coli. и Lactobacterium spp,, и их эффект достоверно отличается от действия супернатанта интакгных нейтрофилов. Анализируя бактерицидный эффект супернатанта в нейтрофилов, активированных Bifidobacterium spp., отмечено, что увеличение дозы супернатанта ведет к значимому увеличению бактерицидного эффекта по отношению к Е. coli.

Таким образом, секреторные продукты нейтрофилов, активированных in vitro резидентными, для нижнего отдела гениталий женщины, микроорганизмами (Lactobacterium spp, и Bifidobacterium spp ), в целом обладают более высокой бактерии и дн остью, чем стимулированные факультативными бактериями (Е. coli и S,aureus). Как правило, продукты нейтрофилов обладают меньшей бактерицидной активностью по отношению к тем штаммам, которые использовались в качестве индуктора секреции. Но супернаталт, полученный после активации нейтрофилов лак-тобактериями, наоборот, стимулирует рост последних.

Таблица 2

Содержание конечных продуктов метаболизма азота в сулернатантах нейтрофилов интактяых и активированных Е coli, S aureus, Lactobactenum spp , Bifidobacterium spp , мкмоль/л (M±m)

Продукты метаболизма азота мкмоль/л

Вид супернатанта п Нитраты (М±ш) Нитриты (М±т) Общее содержание метаболитов оксида азота (М±т)

СЫН 10 15,21±3,4 43,1±5Д7 58,31±8,35

CAHS 8 13,34±1,22 ЗЗД±2Д 46,45±2,82

САНЕ 7 13,37±1,39 46,47±6,06 59,85±6,67

CAHL 9 34Д 1±7,23 92,38±22,83 Р CAHS-CAHL = 0,03 146,3±31,67 Р CAHS -CAHL= 0,007

САНВ 5 55,01±17,08 р СНН- САНВ = 0,01 Р CAHS - САНВ= 0,01 Р САНЕ - САНВ= 0,04 152,85±16,88 р снн- слив = 0,004 Р CAHS -САНВ =0,004 Р САНЕ - САНВ= 0,004 197,9±35,24 Р снн- слив = 0,004 Р CAHS -САНВ =0,004 Р САНЕ-САНВ= 0,004

Примечание

СНЫ - супернатант неактивированных нейтрофилов

CAHS- супернатант нейтрофилов активированных S aureus

САНЕ-супернатант нейтрофилов активированныхЕ coli

CAHL - супернатант нейтрофилов активированных Lactobactenum spp

С AHB - супернатант нейтрофилов активированных Bifidobactemim spp

р CAHS CAHB-различия между супернатантами нейтрофилов, активированных

S aureus и Bifidobacterium spp

р САНЕ САНВ- различия между супернатантами нейтрофилов, активированных Е coli и Bifidobactemim spp

р CAHS CAHL - различия между супернатантами нейтрофилов, активированных S aureus и и Lactobactenum spp

Учитывая неоднозначное влияние супернатантов нейтрофильных гра-нулоцитов, интактных и активированных стандартными штаммами микроорганизмов Е coli, S aureus, Lactobactenum spp , Bifidobactemim spp , на эти же микроорганизмы, было решено изучить концентрацию метаболитов оксида азота (нитратов и нитритов), активность пероксидазы, активность катал азы в сулернатантах интактных и активированных нейтрофилов

Установлено, что в супернатантах нейтрофилов, активированных Lactobacterium spp , и в большей степени Bifidobacterium spp содержалась более высокая концентрация конечных продуктов метаболизма азота (нитратов и нитритов), чем в супернатантах нейтрофилов, активированных S aureus или Е coli

Перикись водорода является основным компонентом в кислород-зависимой микробиоцидной системе нейтрофила Миелопероксидаза взаимодействует с Н202 и хлоридами с образованием гипохлорной кислоты (НОС1) - мощного оксиданта, способствующего киллингу микроорганизмов (АлексеевН А, 2002) Избыток перекиси водорода может быть устранен в результате действия каталазы (Мусил Я , 1985)

Было показано, что после индукции нейтрофилов различными агентами активность пероксидазы в супернатантах нейтрофилов достоверно не отличалась, однако отмечена тенденция к снижению ее активности в супернатантах нейтрофилов, активированных лактобакгериями

Активность каталазы в супернатантах нейтрофилов интактных и активированных также достоверно не отличалась

Полученные результаты позволяют говорить, что бактерицидный эффект нейтрофилов может быть усилен за счет кооперации нейтрофилов и микроорганизмов Бактериальные клетки, либо отдельные компоненты, такие как липополисахарид, липотейхоевые кислоты, бактериальная ДНК, пептидогликан, распознаются эукариотической клеткой благодаря наличию рецепторов, например Toll-like рецепторов Активация этих рецепторов запускает комплекс клеточных ответов, которые приводят к активации некоторых факторов, например транскрипционного фактора NF-kB, который регулирует экспрессию генов, клеточную пролиферацию и апоптоз (Бухарин О В , Гиннцбург А Л и др , 2005) Возможно, в результате связывания компонентов микробной стенки с То11-подобны-ми рецепторами нейтрофилов бактерии влияют не только на механизмы гибели клеток по типу апопгоза, но и приводят к активации внутриклеточных мессенджеров с последующией секреторной дегрануляцией В

результате такого процесса из гранул нейтрофилов высвобождаются бактерицидные вещества микробиоцидные ферменты, антибактериальные ка-тионные белки, кислые гидролазы, продукты респираторного взрыва -супероксид анион, оксид азота, атомарный кислород, в том числе и ми-елопероксидаза Селективная бактерицидность продуктов нейтрофилов может быть обусловлена тем, что скорость функциональной мобилизации различных гранул не одинакова (Долгушин И И, Бухарин О В , 2001), и при активации нейтрофилов через Toll-like рецепторы, клетки секрети-руют неодинаковый набор антимикробных медиаторов Показанные в работе результаты были продемонстрированы только на экспериментальной модели, где каждый фактор в отдельности влиял на нейтрофил Вероятно, что при изучении комплексного воздействия различных факторов функциональная активность нейтрофильных гранулоцитов будет изменяться, что открывает перспективы для дальнейших исследований

ВЫВОДЫ

1 Активация in vitro нейтрофилов периферической крови взвесью культур микроорганизмов S aureus (штамм 209), Е coli (штамм М-17), Lactobactenum spp и Bifidobacterium spp , а так же муцином, церви-кальным секретом и латексом приводит к гибели значительного числа гранулоцитов и изменению функционального статуса жизнеспособных клеток

2 В экспериментальной модели in vitro показано, что после инкубации нейтрофилов в течение 30 минут со всеми изученными агентами увеличивается число погибших (трипанопозитивных) клеток При этом после культивирования со взвесью Lactobactenum spp и Bifidobacterium spp значимо возрастает число нейтрофилов, ушедших в апоптоз S aureus ( штамм 209), Е coli (штамм М-17), муцин и латекс не обладают выраженными апоптогенными свойствами

3 После инкубации со взвесью культур бактерий, латексом, муцином у нейтрофилов, сохранивших жизнеспособность, по сравнению с

интакгаымя клетками, снижаются функции, связанные с эндоцитозом Нейтрофилы, инкубированные in vitro с культурой Bifidobacterium spp , обладают меньшей фагоцитарной активностью, чем после их активации взвесью S aureus (штамм 209), Е coli (штамм М-17) и Lactobactenum spp

4 Инкубация нейтрофилов с Lactobactenum spp и Bifidobactenum spp приводит к снижению HCT и лизосомальной активности нейтрофилов, в то время как контакт гранулоцитов с S aureus (штамм 209), Е coli (штамм М-17) сопровождается повышением продукции кислородных радикалов и активности лизосом

5 Культивирование нейтрофилов с активирующими их различными агентами сопровождается выделением в околоклеточную среду бактерицидных продуктов При этом Lactobactenum spp и Bifidobactenum spp , являющиеся сильными апотогенами, индуцируют выделение факторов с выраженными бактерицидными свойствами S aureus (штамм 209), Е coli (штамм М-17), имеющие слабые апоптогенные свойства, не обладают такой активностью Продукты, секретируемые нейтрофилами после их активации Lactobactenum spp , тормозят рост S aureus ( штамм 209), Е coli (штамм М-17), Bifidobacterium spp, но стимулируют рост Lactobactenum spp

6 В супернатантах нейтрофилов, активированных Lactobactenum spp или Bifidobactenum spp , отмечается более высокая суммарная концентрация метаболитов оксида азота по сравнению с продуктами нейтрофилов, индуцированных S aureus или Е coli После активации нейтрофилов Lactobactenum spp активность пероксвдазы в супернатантах ниже, чем после культивирования клеток с другими индукторами секреции Активность каталазы в супернатантах нейтрофилов, как активированных, так и интактных достоверно не отличается

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Плеханова, Е В Оценка уровня иммуноглобулинов и лизоцима цервикального секрета при гентальных инфекциях /ЕВ Плеханова, Н В Маурер // Труды молодых ученых России сб материалов III мед конгр -Ижевск, 2000 - С 30-31

2 Зябкина, А Ю Особенности некоторых показателей иммунитета репродуктивного тракта у женщин с генитальной инфекцией / Плеханова Е В Иванова Е JI Телешева JI Ф Маурер Н В Скороходов А Н Курносенко ИВ // Актуальные вопросы современной науки тез докл -Самара, 2001 - С 67

3 Долгушин, И И Взаимодействие нейтрофилов и их секреторных продуктов с представителями микрофлоры влагалища женщин при дисбиотических процессах в урогенитальном тракте /ИИ Долгушин, Л Ф Телешева, Ю С Андреева, А Ю Савочкина, М А Свиридов, Е В Плеханова // Актуальные проблемы медицинской науки и практического здравоохранения тр науч сессии - Челябинск, 2004 - С 29-31

4 Долгушин, И И Оценка жизнеспособности нейтрофилов, активированных щ vitro различными видами бактерий /ИИ Долгушин, Е В Плеханова, М А Свиридов, Ю С Андреева // Материалы IV конференции иммунологов Урала тез докл - Уфа, 2005 -№1(4) - С 194

5 Плеханова, ЕВ Анализ методов определения апоптоза/Е В Плеханова, М А Свиридов // Материалы IV итоговой научно-практической конференции молодых ученых Челябинской государственной медицинской академии - Челябинск Изд-во ЧелГМА, 2006 - С 87-88

6 Плеханова, Е В Изучение апоптоза нейтрофилов, активированных бактериями, входящими в состав микрофлоры урогенитального тракта женщин /ЕВ Плеханова, ИИ Долгушин, ЮС Андреева, М А Свиридов, Д И Матвеева, Л В Подлубная // Мед иммунология - 2006 -Т 8, № 2-3 - С 281-282

7 Плеханова, ЕВ Изучение жизнеспособности нейтрофилов in vitro после активации лактобактериями /ЕВ Плеханова, И И Долгушин, ЮС Андреева//Материалы V конференции иммунологов Урала тез докл -Оренбург, 2006 - № 1(5) - С 24-25

8 Долгушин, ИИ Нейтрофилы регулируют формирование микро-биоциноза слизистых оболочек /ИИ Долгушин, Ю С Андреева, Е А Мезенцева,АЮ Савочкина,ЕВ Плеханова,МА Свиридов,MB Пе-шикова//Мед иммунология - 2006 -Т 8, № 2-3 - С 135-136

9 Долгушин, ИИ Влияние нейтрофилов и продуктов их секреции на факторы, участвующие в формировании колонизационной резистентности /ИИ Долгушин, Ю С Андреева, М А Свиридов, А Ю Савочки-на, Е А Мезенцева, Е В Плеханова, А Н Скороходов, В В Чванов, Л Ф Телешева, С И Марачев, Д Н Матвеева, В А Тупиков // Мед иммунология - 2007.-Т 9, №2-3 - С 133-134

10 Плеханова,ЕВ Влияние факторов микробиоцинозарепродуктивного тракта женщин на апоптоз и жизнеспособность нейтрофилов / ЕВ Плеханова, М А Свиридов, Л В Подлубная//Материалы V итоговой научно-практической конференции молодых ученых Челябинской государственной медицинской академии - Челябинск Изд-во ЧелГ-МА, 2007 - С 64-67

ПЛЕХАНОВА Екатерина Викторовна

ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ЦЕРВИКАЛЬНОГО СЕКРЕТА (РЕЗИДЕНТНОЙ И ФАКУЛЬТАТИВНОЙ МИКРОФЛОРЫ, МУЦИНА) НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ

14 00 36 - аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск-2007

Подготовлено к печати в издательстве «Челябинская государственная медицинская академия» Лицензия № 01906 Отпечатано в ООО "ИМСИ" Подписано к печати 29 09 07 г Объем 1 п л Формат 64x84 Гарнитура «Times New Roman суг» Бумага для офисной техники, 80 мг/м2 Тираж 100 экз