Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Роль нейтрофилов в формировании колонизационной резистентности слизистых оболочек

На правах рукописи

Шишкова Юлия Сергеевна

РОЛЬ НЕЙТРОФИЛОВ В ФОРМИРОВАНИИ КОЛОНИЗАЦИОННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК

14.03.09-клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Челябинск-2010

004608199

Работа выполнена в научно-исследовательском институте иммунологии, на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и Южно-Уральском научном центре РАМН

Научный консультант:

заслуженный деятель науки РФ, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Долгушин Илья Ильич

Базарный Владимир Викторович Смолягин Александр Иванович Аклеев Александр Васильевич

Ведущая организация: Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, г. Екатеринбург

Защита состоится 2О^т. в ""'часов на заседа-

нии диссертационного совета Д 208.117.03. при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному .развитию» по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, д. 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию». Автореферат разослан «_»_200_ г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук,

профессор Л.Ф. Телешева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одним из важнейших и до сих пор мапо исследованных механизмов антимикробной защиты является колонизационная резистентность кожи и слизистых оболочек, под которой понимают устойчивость эпителия к колонизации патогенными и условно-патогенными микроорганизмами (Бодяжина В.И., 1978; Долгушина В.Ф., 1991; Медведев Б.И., Казачкова Э.А. и др., 2001). Колонизационная резистентность обеспечивается совокупностью разнообразных факторов: на слизистых оболочках это, прежде всего, муцин, образующий достаточно сложноорганизованный биослой. В этот биослой встроены все защитные инструменты: резидентная микрофлора, секреторные антитела, разнообразные бактерицидные молекулы, типа лизо-цима, лактоферрина, токсические метаболиты кислорода, азота и т.д. (тендеров Б.А., Ануфриева Р.Г. и др., 1996; Рязанцев C.B., Хмельницкая Н.М. и др., 2000). До сих пор не ясна роль фагоцитирующих клеток, в частности нейтрофилов (Нф), в защите слизистых оболочек. Нейтрофилы-это, прежде всего, тканевые клетки. Именно в тканях они участвуют в воспалительных и антимикробных реакциях. А вот работают ли они в слизистом биослое — не ясно.

И.И. Долгушиным было высказано предположение, что Нф, мигрирующие на поверхности слизистых оболочек, играют важную роль в их защите (Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001). Покидая ткани и выходя в слизистый биослой, Нф секретируют биоцидные продукты, которые могут участвовать не только в антимикробной защите, но и в регуляции микробиоценозов, заселяющих соответствующие биотопы. Данное предположение и обозначило цель исследования.

Цель исследования

Определить роль нейтрофилов и их секреторных продуктов в формировании колонизационной резистентности слизистых оболочек нижнего отдела репродуктивного тракта женщин.

Задачи исследования

1. Исследовать состояние лейкоцитарного звена цервикальнрго и вагинального секретов здоровых женщин в разные фазы менструального цикла.

2. Изучить состав растворимых антимикробных факторов церви-кального и вагинального секретов здоровых женщин в разные фазы менструального цикла.

3. Определить in vitro влияние S.aureus (штамм 209), E.coli (штамм M-17), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp, и бактериального комплекса на жизнеспособность, функциональный статус, антимикробную активность и цитокинпродуцируюицую функцию нейтрофилов.

4. Разработать способ экспресс-обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек.

5. Изучить in vitro образование внеклеточных ловушек нейтрофила-ми периферической крови после взаимодействия с Е, coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. или бактериальной смесью и оценить их эффективность.

6. Сравнить бактерицидный эффект секреторных продуктов интак-тных и активированных взвесью S.aureus (штамм 209), E.coli (штамм М-17), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. нейтрофилов.

7. Установить in vitro влияние нейтрофилов и их секреторных продуктов на состав микрофлоры нижнего отдела генитального траста и адгезивную активность грибов рода Кандида на поверхности вагинального эпителия здоровых женщин и женщин с бактериальным вагинозом.

Научная новизна

В работе дана комплексная оценка состояния факторов врожденного иммунитета слизистых оболочек нижнего отдела генитального тракта здоровых женщин в разные фазы менструального цикла, впервые проведена сравнительная оценка состава растворимых антимикробных факторов, в том числе и катионных пептидов цервикального и вагинального секретов. Показано, что в цервикальном секрете здоровых женщин содержится значительно большая концентрация антимикробных факторов (оксид азота, лактоферрин, дефенсины, БПИ, миелопероксидаза), чем в вагинальном.

Впервые определено влияние S.aureus (штамм 209), E.coli (штамм М-17), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. и бактериального комплекса на жизнеспособность, функциональный статус, антимикробную активность и цитокинпродуцирующую функцию нейтрофилов периферической крови здоровых женщин. Показано, что представители нормоф-. лоры (лакто- и бифидобактерии) обладают выраженным апоптогенным действием, в меньшей степени стимулируют внутриклеточные киллин-говые системы, не провоцируют выброс провоспалительных цитокинов (ИЛ-1а, ИЛ - 1(J, ИЛ-8, ФНО-а, РАИЛ-1 и ИЛ-6), при этом усиливают секрецию бактерицидных белков (БПИ и лактоферрика).

Разработан способ экспресс-обнаружения нейтрофильных ловушек

(Долгушин И.И., Андреева Ю.С. Приоритетная справка от 01.04.2008г. Заявка на изобретение № 2008112636/20 (013666)) и способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах (Долгушин И.И., Андреева Ю.С., Савочкина А.Ю. Приоритетная справка от 2.6.01.2009г. Заявка на изобретение № 2009102579)

Впервые показано образование внеклеточных ловушек нейтрсфи-лами периферической крови после взаимодействия с Е. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. или бактериальной смесью и оценена их эффективность.

Проведен сравнительный анализ бактерицидности секреторных продуктов интактных и активированных нейтрофилов на Е. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp.

Изучено действие супернатантов интактных и активированных нейтрофилов на состав микробиоценоза и адгезию грибов рода Candida на поверхности вагинального эпителия здоровых женщин и женщин с бактериальным вагинозом. Впервые показано, что секреторные продукты нейтрофилов периферической крови обладают селективной бактерицид-ностью: они снижают в вагинальном секрете содержание условно-патогенных бактерий и не влияют на лактофлору, кроме того, супернатанты нейтрофилов здоровых женщин снижают адгезию грибов рода Кандида на поверхности вагинальных эпителиоцитов, у женщин с бактериальным вагинозом продукты секреции нейтрофилов не обладают антиадгезивной активностью.

Впервые определено, что на поверхности слизистых оболочек нейт-рофилы реализуют свой антимикробный потенциал в большей степени за счет внеклеточной секреции компонентов клетки в окружающую среду.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты исследований позволяют расширить представление о роли нейтрофилов в защите слизистых оболочек.

Полученные данные о содержании антимикробных продуктов и ци-токинов в супернатантах неактивированных и активированных нейтрофилов периферической крови, а также продукция нейтрофильных внеклеточных ловушек имеют существенное значение в понимании проблемы регулирующего влияния нейтрофильных гранулоцитов в формировании микробиоценозов слизистых оболочек. Нарушение функционирования нейтрофильного звена на поверхности слизистых оболочек может рассматриваться как один из факторов формирования патологических микробных сообществ и развития дисбактериозов.

Разработка экспресс-метода обнаружения нейтрофильных ловушек открывает возможность оценки антимикробной функции нейтрофилов даже после их гибели, а сам факт наличия внеклеточных нейтрофильных сетей является новым направлением в изучении физиологии грану-лоцита.

Селективная бактерицидность и антиадгезивная активность супер-натантов нейтрофилов открывают перспективу практического применения секреторных продуктов, а результаты исследований могут стать теоретическим обоснованием для проведения клинических испытаний локального использования продуктов секреции нейтрофилов с целью коррекции дисбиотических процессов нижних отделов генитального тракта женщин, повышения качества лечения больных с бактериальным ваги-нозом, что в конечном итоге, позволит снизить заболеваемость у женщин, частоту осложнений беременности и родов, а также перинатальную заболеваемость, смертность и будет способствовать улучшению репродуктивного здоровья и рождению здорового потомства.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В цервикальном и вагинальном секретах содержится значительное количество лейкоцитов, среди которых доминирующими являются нейтрофилы, около 50% из них - это погибшие клетки, а остальные жизнеспособные и функционально активные.

2. Контакт нейтрофилов с микроорганизмами приводит к гибели гранулоцитов, при этом лактобактерии и бифидобактерии индуцируют апоптотическую гибель нейтрофилов.

3. Инкубация нейтрофилов in vitro со взвесью бактерий (Е. coli -штамм М-17, S. aureus - штамм 209, Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp.) сопровождается секрецией гранулоцитами антимикробных продуктов разного состава: резидентные для слизистых микроорганизмы (лактобактерии и бифидобактерии) в сравнении с факультативными (Е. coli и S. aureus) в большей степени стимулируют выброс антимикробных продуктов, обладающих селективной бактерицидностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам.

4. Продукты нейтрофилов изменяют состав микробиоценозов слизистых нижнего отдела генитального тракта женщин: они подавляют рост условно-патогенной флоры (гарднерелл, стафилококков, кишечной палочки, протея, дрожжеподобных грибов), препятствуют адгезии грибов рода Кандида на поверхности вагинального эпителия и существенно не влияют на содержание лактобактерий.

5. Нейтрофилы могут участвовать в регуляции микробиоценозов и в формировании колонизационной устойчивости слизистых оболочек репродуктивного тракта женщин.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии, а также используются в практической деятельности лаборатории противоинфекционного иммунитета НИИ иммунологии ГОУ ВПО «Челябинской государственной медицинской академии» и проблемной лаборатории экспериментальной и экологической физиологии системы крови, иммунитета и цитогенетики Южно-Уральского научного центра РАМН.

Издано учебно-методическое пособие «Методы оценки функционального статуса нейтрофилов» для системы послевузовского образования врачей (Челябинск, 2009).

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на IV, V конференции иммунологов Урала (Уфа, 2005; Оренбург, 2006); IX - XIII всероссийском форуме с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург2005,2006,2007,2008, 2009); республиканской научной конференции "Иммунология репродукции" (Иваново, 2005); российской научно-практической конференции "Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия" (Курск, 2006); 1 и 2 международном российско-чешском форуме (Челябинск, 2006, 2008); IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); VIII конгрессе "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии" (Москва, 2007); на национальной конференции "Аллергология и клиническая иммунология-междисциплинарные проблемы" (Москва, 2008); на объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008, 2009); на конференции, посвященной 10-летию Южно-Уральского научного центра РАМН (Челябинск, 2008), на VI Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009), на X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009).

Работа была поддержана грантами Правительства Челябинской области в 2007 и 2008 гг.

Публикации

По теме диссертации опубликована 51 научная работа. Издана монография «Нейтрофильные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов».

Структура и объем диссертации

Работа изложена на 265 страницах текста, иллюстрирована 50 таблицами, 33 рисунками, 4 фотографиями, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, семи глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, содержащего 303 источников, в том числе 179 отечественных и 124 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В качестве объекта изучения были выбраны нейтрофилы периферической крови и секреты слизистых оболочек нижнего отдела гениталь-ного тракта женщин, так как в этой анатомической области имеются два абсолютно разных по своему строению и выполняемым функциям отдела: выстланное многослойным плоским эпителием, обильно обсемененное относительно однородной флорой, влагалище и цервикальный канал, просвет которого выполнен цилиндрическим эпителием, а секрет предохраняет стерильную полость матки от проникновения микроорганизмов из влагалища. Кроме того, физиология репродуктивных органов женщины зависит от гормонального статуса и подвержена колебаниям на протяжении менструального цикла, а получение исследуемого материала является неинвазивным и простым в исполнении (Телешева Л.Ф., 2000; Гольцфарб В.М., 2005; Савочкина А.Ю., 2006).

Для решения проблемы за период с 2005 по 2008 год на базе НИИ иммунологии ЧелГМА и ЮУНЦ РАМН было проведено микробиологическое, иммунологическое и биохимическое обследование 170 женщин в возрасте 19-35 лет, из которых 128 женщины были здоровы и 42 женщины имели установленный диагноз - бактериальный вагиноз. Диагноз выставлялся на основании наличия патологических вагинальных выделений, положительного аминного теста, pH влагалищного отделяемого более 4,5 и обнаружения "ключевых клеток" при микроскопии отделяемого влагалища (Коршунов В.М., Володин H.H. и др., 1999). Исследования проводились как в первую, так и во вторую фазы менструального

цикла. У всех пациенток при обследовании были исключены ВИЧ-инфекция, сифилис, трихомониаз, гонорея, хламидиоз, уреаппазмоз, ми-коплазмоз, генитальный герпес и цитомегаловирусная инфекция.

Для проведения исследований нейтрсфилы выделяли из периферической венозной крови здоровых женщин репродуктивного возраста на двойном градиенте растворов фиколла-верографина, доводили до концентрации 5х106кл/мл в физиологическом растворе. В качестве индукторов использовали 0,1 мл взвеси суточной культуры контрольных моноштаммов S. aureus («Cowan 209»), Е. coli (штамм М-17) (препарат "Колибактерин", ФГПУ"НПО"Микроген"МЗ РФ, г. Москва), Lactobacterium spp, (препарат "Лактобактерин сухой", фирма "ИмБио", г. Нижний Новгород), Bifidobacterium spp. (препарат "Бифидумбактерин сухой", ЗАО "Эко-полис", г. Ковров), доведенной до концентрации 1 млрд. микробных тел в 1мл (по стандарту мутности БАК-10, ООО "Ормет", г. Екатеринбург) и разведенной в 10 раз, или смеси бактерий, состоящей из 103 КОЕ/мл Lactobacterium spp.+ 10s КОЕ/мл Bifidobacterium spp. + 102 КОЕ/мл S. aureus +102 КОЕ/мл E. coii на 1 мл взвеси нейтрофилов. Для получения контрольных значений нейтрофилы оставляли без активации или стимулировали частицами латекса (диаметр частиц 1,7 мкм) из расчета 50 частиц на один нейтрофил.

Для оценки жизнеспособности нейтрофилов периферической крови и лейкоцитов секретов нижнего отдела репродуктивной системы женщин, использовали витальный краситель-трипановый синий, при этом погибшие клетки, в связи с нарушением их мембраны, окрашивались в темно-синий цвет (трипанопозитивные), а клетки, сохранившие целостность оболочки (живые и апоптозные), не пропускали краситель и оставались прозрачными (трипанонегативными).

Для количественного учета апоптозных нейтрофилов нами был использован метод флюоресценции с окраской клеточной взвеси этидиум бромидом и акридиновым оранжевым (Gasiorowski К., 2001), а также метод проточной цитофлюориметрии.

Фагоцитарную активность нейтрофилов исследовали по способности поглощать частицы полистирольного латекса (Лебедев К.А., Поня-кина И.Д., 1990). Оценку внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов проводили с помощью НСТ-теста (Маянский А.Н., Виксман М.К., 1979). Лизосомальную активность определяли по суммарной люминесценции лизосом (Фрейдлин И.С., 1984).

Для определения уровня лизоцима в биологических жидкостях нами был использован нефелометрический метод, предложенный в 1968 г.

Дорофейчук В.Г.

Определение оксида азота проводили по содержанию нитратов и нитритов (Показ, липид. обмена ..., 2002). Содержание нитратов определяли в виде нитритов по реакции Грисса, после восстановления их губчатым кадмием (Емченко Н.Л., Цыганенко О.И. и др., 1994).

Количество лактоферрина, дефенсинов, бактерицидного/индуцирующего протеина и провоспалительных цитокинов в тестируемых образцах определяли с помощью иммуноферментного анализа.

Для определения нейтрофильных ловушек, которые являются по своей сути волокнами ДНК, нами был опробован способ выявления нуклеиновых кислот по способу Фельгена (Меркулов ГА, 1956). Реакцию ставили с использованием клеточной взвеси нейтрофилов периферической крови, выделенных на градиентных растворах фиколла-верогра-фина и активированных Е. cols (штамм М-17), S. aureus «Cowan 209», Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp., затем взвесь наносили на стекло, высушивали и фиксировали 96% этиловым спиртом. Однако данная реакция требовала дополнительной фиксации клеток на стекле по методу Лилли в 10% забуференном формалине. Для приготовления реактивов были задействованы агрессивные среды (соляная кислота, фуксин-сернистая кислота, сернистая вода), готовые реагенты нуждались в специальных условиях хранения. Кроме того, постановка реакции проходила в 2 этапа и занимала около 2-2,5 часов. При соблюдении всех технических условий ядерное вещество окрашивалось в красно-фиолетовый цвет. Учет реакции проводили с помощью иммерсионной микроскопии при увеличении 100x10x1,5. Однако даже при соблюдении всех требований выполнения данной реакции учет представлял определенные сложности: при световой микроскопии не всегда удавалось рассмотреть тонкие внеклеточно расположенные волокна ДНК активированных нейтрофилов и, кроме того, не определялись бактерии-активаторы.

Учитывая, что акридиновый оранжевый окрашивает ядра нейтрофилов в зеленый цвет, нами был использован данный краситель с целью определения внеклеточно расположенных волокон нейтрофильных ДНК. Такой способ окраски обладал следующими существенными отличительными признаками:

-для окраски использовался всего лишь один реактив (акридиновый оранжевый);

- учет проводился с помощью люминесцентной микроскопии, позволяющей четко различать окрашиваемые структуры;

-такой способ окраски позволял не только качественно, но и коли-

явственно охарактеризовать данное явление.

Определение образования нейтрофильных ловушек осуществляли следующим образом:

1) Взвесь нейтрофилов получали используя 15,0 мл гепаринизиро-ванной (10-15 ЕД/мл гепарина фирмы "Гедеон-Рихтер", Hungery) периферической венозной крови, которую с целью осаждения эритроцитов отстаивали в стерильной пробирке при температуре + 37°С в течение 30 минут. Нейтрофилы выделяли из лейкоцитарной взвеси на двойном градиенте плотности стерильных растворов фиколла-верографина (Pharmacia, Sweden). Плотность верхнего слоя градиента составляла 1,075-1,077, а нижнего - 1,093-1,095. Объем каждого градиента равнялся 1,5 мл. Через 40 минут центрифугирования при 1500 оборотов в минуту на границе между градиентами появлялось кольцо гранулоцитов с чистотой 98-100%. Кольцо нейтрофилов аккуратно собирали, переносили в стерильные центрифужные пробирки, трижды отмывали от градиента стерильным физиологическим раствором хлорида натрия центрифугированием при 1500 оборотов в минуту в течение 10 минут и доводили до концентрации 5x106 клеток/мл.

2) Полученную взвесь клеток инкубировали при температуре +37°С в течение 30 минут в присутствии 0,1 мл взвеси суточной культуры контрольных штаммов (S. aureus (штамм 209), Е. coli (штамм М-17) (препарат "Колибактерин", ФГПУ "НПО "Микроген" МЗ РФ, г Москва), Lactobacterium spp. (препарат "Лактобактерин сухой", фирма "ИмБио", г. Нижний Новгород), доведенной до концентрации 1 млрд. микробных тел в 1мл (по стандарту мутности БАК -10, ООО "Ормет", г. Екатеринбург) и разведенной в 10 раз, или смеси бактерий содержащей 10в КОЕ/мл Lactobacterium spp., 10s КОЕ/мл Bifidobacterium spp., 103 КОЕ/мл S. aureus, 103 КОЕ/мл E. coli в 1 мл на 1 мл взвеси нейтрофилов. Для контроля использовали взвесь нейтрофилов, инкубируемых в тех же условиях, но без активаторов.

3) Для окрашивания нейтрофильных ловушек использовали 200 мкл рабочего раствора акридинового оранжевого (концентрация 2 мкг/мл).

6) Учет проводили с помощью люминесцентного микроскопа, увеличение 100x10x1,5, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длиной волны 520 нм.

В результате применения данного способа сегментированные ядра нейтрофилов окрашивались в ярко-зеленый цвет, цитоплазма грануло-цитов не окрашивалась, клетки, имеющие недифференцированное ядро,

были представлены структурами зеленого цвета, у которых невозможно было различить ядро и цитоплазму, нейтрофильные ловушки были представлены в виде тонких ярко-зеленых нитей, занимающими пространство в 2-3 раза превосходящее диаметр нейтрофила, а бактерии-активаторы имели ярко-оранжевый цвет.

Такой способ окраски позволил провести количественную оценку образования ловушек, так как была хорошо различима морфология нейт-рофилов. Именно по этому признаку все визуализируемые структуры нами были разделены на 3 группы: 1 группа объединяла клетки с сегментированным ядром, 2 группа включала клетки с недифференцированным ядром, и к 3 группе отнесли свободнолежащие ярко-зеленые волокна, представляющие собой нити ДНК нейтрофила (нейтрофильные ловушки). Нами проводился подсчет 100 структур разных групп, и определялось процентное содержание каждой морфологической единицы.

Предлагаемый способ окраски позволил оценить эффективность фагоцитоза и нейтрофильной внеклеточной ловушки. Для этого рассчитывали следующие показатели:

1. Активность фагоцитоза - число нейтрофилов с сегментированным ядром, содержащих бактериальные клетки в цитоплазме, на 100 подсчитанных клеток.

2. Интенсивность фагоцитоза - число бактерий в 100 подсчитанных клетках с сегментированным ядром в пересчете на 1 клетку.

3. Число нейтрофильных ловушек - количество нейтрофильных ловушек, содержащих бактериальные клетки на 100 подсчитанных структур.

4. Индекс нейтрофильной ловушки-число бактерий в 100 подсчитанных ловушках в пересчете на 1 клетку.

Бактерицидную активность секреторных продуктов нейтрофилов изучали по отношению к этим же штаммам микроорганизмов, используя фотонефелометрический метод О.В. Смирновой и Т.А. Кузьминой (Им-мунол. методы ..., 1981).

Для оценки содержания микроорганизмов в секретах генитального тракта женщин исследуемый материал забирали из цервикального канала и заднего свода влагалища на 7-10 и 21-23 дни менструального цикла и подвергали бактериологическому исследованию.

Для определения влияния нейтрофилов и их секреторных продуктов на микробиоценоз женщин в день проведения исследований у пациентки забирали 0,1 мл вагинального содержимого в пробирку с 0,9 мл изотонического раствора хлорида натрия и 15 мл крови из локтевой вены в пробирку с антикоагулянтом. Выделение чистой взвеси нейтрофилов

проводили на двойном градиенте растворов фиколла-верогрэфинэ. Выделенные клетки доводили до концентрации 5*10® кл/мл и использовали для опыта. Секреторные продукты неактивированных нейтрофилов получали после инкубации клеток (концентрация 5x10s кл/мл) при температуре + 37°С в течение 30 минут без индукторов секреции. После этого клетки центрифугировали 20 мин при 3x103 об/мин, полученный супернатант фильтровали через мембранные фильтры и сразу использовали для тестирования. Секреторные продукты активированных нейт-рофилов получали после инкубации клеток (концентрации 5x10® кл/мл) в тех же условиях, но в присутствии вагинального содержимого. После центрифугирования при 3*103 об/мин, полученный супернатант пропускали через мембранные фильтры и сразу использовали для исследования.

Для регистрации возможного влияния нейтрофилов и их секреторных продуктов на микрофлору влагалища применяли классический метод определения бактерицидной активности (Иммунол. методы ... ,1981). С этой целью 0,9 мл каждого тестируемого образца соединяли с 0,1 мл вагинального содержимого. Для контроля использовали 0,9 мл физиологического раствора. Смесь инкубировали в течение 30 мин при температуре +37°С. После инкубации из контрольной и опытных пробирок проводили высев количественным методом на 5% кровяной, желточно-со-левой агар, на тиогликолиевую среду, среду MRS и Сабуро. Через 48 часов инкубации в эксикаторе со свечой изучали рост микроорганизмов, определяли степень обсеменения вагинальной слизи, выделяли чистые культуры и проводили их идентификацию. Бактерицидный эффект определяли по разнице числа колоний, выросших в контроле и в опыте.

Для изучения влияния секреторных продуктов нейтрофилов на адгезивную активность грибов рода Кандида на поверхности вагинальных эпи-телиоцитов женщин в день исследования забирали вагинальный эпителий с боковых стенок влагалища стерильной ложкой Фолькмана и помещали в пробирку с 5 мл раствора Хенкса без фенолового красного, дважды отмывали забуференным физиологическим раствором (ЗФР, pH 7,2— 7,4) в течение 5 минут при 1500 об/мин и готовили взвесь с концентрацией 106 кл/мл (подсчёт клеток осуществляли в камере Горяева).

С. albicans штамм 601 (1x107 клеток/мл) и супернатанты интактных и активированных контрольными штаммами S. aureus (штамм 209), Е. coli (штамм М-17), Lactobacterium spp. нейтрофилов смешивали в равных объемах (по 0,5 мл) и инкубировали 30 мин при температуре +37°С, встряхивая каждые 5 мин. После инкубации кандиды отмывали десяти-

кратным объемом ЗФР и использовали для изучения адгезивных реакций на поверхности вагинальных эпителиоцитов. Контролем служил ЗФР. Результаты оценивали по трём показателям:

1. Активность адгезии (.ДА) - количество вагинальных эпителиоцитов с адгезированными кандидами из 100 посчитанных эпителиоцитов, %

2. Интенсивность адгезии (ИА) - количество кандид, адгезирован-ных на 100 вагинальных эпителиоцитах, усл. ед.

3. Адгезивное число (АЧ) - количество адгезированных кандид на одной эпителиальной клетке, усл. ед.

I

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для понимания вопросов участия нейтрофилов в формировании колонизационной резистентности слизистых оболочек, нами решено было сначала определить состояние факторов врожденного иммунитета нижних отделов репродуктивной системы здоровых женщин в разные фазы менструального цикла.

Учитывая, что основными клетками изучаемых секретов являются лейкоциты (Телешева Л.Ф., 2000), нами было подробно охарактеризовано состояние лейкоцитарного звена, изучено общее содержание, жизнеспособность, морфология и функциональная активность лейкоцитов нижних отделов репродуктивной системы здоровых женщин.

В результате проведенных исследований определили, что на поверхности слизистых оболочек нижних отделов репродуктивного тракта здоровых женщин находится большое количество лейкоцитов (рисунок 1).

- 5,04 — *<

/ ,69 ±11,91

1 3 ■яэ

к

2 !

Цервикальный Вагинальный

секрет секрет

01 фаза менструального цикла □ 2 фаза менструального цикла

Рис. 1. Количество лейкоцитов в секретах нижних отделов репродуктивного

тракта здоровых женщин в разные фазы менструального цикла, п=21

Хотя, в цервикальном и вагинальном секретах встречались эозино-филы, макрофаги, базофилы и лимфоциты, доминирующими клетками как цервикального, так и вагинального секретов являлись нейтрофилы.

В цервикальном и вагинальном секретах процентное содержание трипанопозитивных (нежизнеспособных) клеток составило 25% и 31% соответственно.

На протяжении менструального цикла в цервикальном секрете содержание апоптозных клеток оставалось стабильным и составляло около 27% от общего числа нейтрофилов. В вагинальной слизи содержание апоптозных нейтрофилов в первую фазу менструального цикла было сопоставимо с аналогичным показателем цервикального секрета, во вторую фазу вагинальный секрет содержал значительно меньше нейтрофилов, подвергшихся естественной гибели (16%).

При изучении функциональной активности нейтрофилов установлено, что нейтрофилы секретов нижнего отдела генитального тракта фагоцитируют частицы латекса, обладают активным лизосомальным аппаратом и способны к кислородзависимому метаболизму, причем у нейтрофилов цервикального секрета все эти функции проявляются значительно сильнее, чем у гранулоцитов влагалища. Циклические изменения в организме здоровой женщины на оказывают значимого влияния на функциональную активность нейтрофилов цервикального и вагинального секретов.

Помимо клеток, нами были охарактеризованы гуморальные механизмы врожденного иммунитета мукозальных секретов генитального тракта здоровых женщин: определено содержание лизоцима, оксида азота, лактоферрина, дефенсинов, БПИ, активность миелопероксидазы (таблица 1).

У здоровых женщин репродуктивного возраста уровень лизоцима в цервикальной и в вагинальной слизи значимым образом не отличался и оставался стабильным на протяжении всего менструального цикла.

Достоверно более высокий суммарный уровень нитратов и нитритов обнаружился в цервикальном секрете и сохранялся на протяжении всего менструального цикла, превышая аналогичные показатели вагинальной слизи в 2-2,5 раза.

Результаты исследований показали, что шеечный секрет содержит значительно больше лактоферрина, дефенсинов и бактерицидного/индуцирующего протеина, чем вагинальный.

Показатели активности миелопероксидазы цервикальной слизи в 2-2,5 раза превосходили такие же показатели вагинального содержимо-

Таблица 1.

Содержание растворимых антимикробных факторов в секретах репродуктивного тракта здоровых женщин в разные фазы менструального цикла

Антимикробный фактор Цервикальный секрет Вагинальная слизь

Фаза менструального цикла Фаза менструального цикла

1 фаза 2 фаза 1 фаза 2 фаз

Нитраты и нитрты, мкмоль/л 96,93±10,32* 96,93±10,32* 44,94±7,31 30,40±3,11

Лизоцим, мкг/л 30,54+6,32 28,85+6,94 21,05+5,04 24,60±7,69

Ашшоаъ миелсперсксидазы, мкат/л 3,57+0,27* 3,96+0,27* 1,25±0,10 1,58 ±0,14

Дрфэты, нЛ/п 194,20+26,58* 148,0±32,75* 56,27+8,87 50,7±11,15

БПИ, Н"Алл 292,8±73,39* 142,30±35,64* 56,89+16,00 27,54±7,08

Лэстоферрш, нАлл 157,20+29,16* 84,51+24,16* 53,06+8,59 40,51+10,57

Примечание:

* - достоверное различие между показателями цервикальной и вагинальной слизи в идентичные фазы менструального цикла

го. На протяжении менструального цикла изучаемые параметры оставались стабильными.

Таким образом, на поверхности слизистых оболочек канала шейки матки и влагалища имеется богатый арсенал клеточных (в основном это нейтрофилы) и гуморальных микробоцидных факторов, большинство из которых может секретироваться нейтрофилами, обеспечивающих постоянную защиту репродуктивных органов женщины от проникновения чужеродных агентов. В цервикальном канале концентрация этих факторов значительно выше, что делает секрет шейки матки основным барьером на пути восходящей инфекции. Полученные нами данные не только не противоречат ранее проведенным исследованиям (Телешева Л.Ф., 2000, Голь-цфарб В.М., 2005, Савочкина А.Ю., 2006), а еще раз с привлечением дополнительных методов демонстрируют важную роль врожденного иммунитета, в том числе и нейтрофилов, в защите слизистых оболочек.

Для исследования механизмов участия нейтрофилов в антимикробных реакциях в мукозальном иммунитете нами было in vitro изучено влияние оп дельных представителей флоры генитального тракта женщин на функцис нальную, секреторную активность и жизнеспособность нейтрофилов.

Проведенные исследования позволили установить, что нейтрофи-лы способны активно фагоцитировать частицы латекса, кишечную палочку, золотистый стафилококк, лактобактерии и в меньшей степени бифидобактерии. Е. coli, S. aureus и бактериальная смесь значительно стимулировали кислородзависимый метаболизм и лизосомальную активность нейтрофилов. Подобный эффект отмечен и в работах Белоц-кого СМ., Филюковой О.Б. (1986) и Мазурова Д.В., Дамбаевой C.B. (2000). Эти данные показали, что внутриклеточные киллинговые системы нейтрофилов в большей степени активируются Е. coli и S. aureus, чем Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp.

Учитывая, что микробоцидная функция нейтрофилов заключается не только в поглощении и внутриклеточной переработке захваченного материала, но и в секреции антимикробных факторов за пределы клетки, нами решено было изучить спектр бактерицидных факторов, таких как лизоцим, оксид азота, миелопероксидаза, лактоферрин, дефенси-ны, БПИ в супернатантах нейтрофилов (таблица 2).

После стимуляции гранулоцитов частицами латекса, повышался уровень лизоцима и лактоферрина. После взаимодействия нейтрофилов с Е. coli (штамм М-17) и S. aureus (штамм 209) все изучаемые показатели оставались на прежних значениях. При действии лакто- и бифи,-добактерий повышалось содержание БПИ и лактоферрина.

Таким образом, в ответ на стимуляцию как микробными, так и немикробными агентами, нейтрофил секретирует в окружающую среду широкий спектр антимикробных факторов с разным механизмом действия. Часть этих компонентов, обладающих преимущественно прямым бактерицидным эффектом, расходуется на утилизацию бактерии-активатора, в то же время факторы непрямого (лактоферрин) и внутриклеточного (БПИ) действия определяются в больших количествах в супернатантах нейтрофилов, активированных резидентными для слизистых микроорганизмами (лакто- и бифидобактериями), но не Е. coli, S. aureus или латексом.

После оценки состава микробоцидных продуктов представляло интерес изучение содержания цитокинов в супернатантах неактивированных и активированных латексом и взвесью различных микроорганизмов нейтрофилов периферической крови. Учитывая, что нейтрофи-лы являются основными клетками-эффекторами воспалительной защитной реакции организма человека, нами решено было изучить цито-киновый профиль провоспалительных цитокинов (ИЛ-1а, ИЛ-Iß, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-а) и антивоспалительного медиатора (РАИЛ-1) (таблица 3).

Таблица 2.

Показатели уровня бактерицидных факторов в супернатантах активированных и неактивированных нейтрофилов периферической крови здоровых женщин (п=20)

Показатели Супернатант нейтрофилов

СНН CAHIat САНЕ CAHS CAHL САНВ САсмесь бактерий

Лизоцим, мкг/мл 0,7±0,08 2,46±0,09* 0,69±0,08 0,65+0,12 0,65+0,07 0,55±0,05 0,62+0,03-

Нитраты и нитриты, мкМоль/л 19,42±1,57 17,21+0,88 19.69±1,75 19,69±1,75 19,40±1,84 18,53+1,65 20,62±1,68

Пероксидаза, мкагг/л 1,08±0,14 1,29+0,15- 0,90+0,14 0,89±0,15 1,13±0,17 1,13+0,13 1,22±0,18

Дефенсины, нг/мл 3,24±0,42 — 2,55+0,53 2,29±0,43 2,15±0,33 2,46±0,58 —

БПИ, нг/мл 0,79±0,22 — 1,12±0,28 1,44+0,32 2,65±1,01 3,20+0,95* —

Лактоферрин, нг/мл 30,23±4,97 449,5±87,99* 31,62+6,12 52,22±11,52 40,84+4,92 52,69±10,03* 116,50+14,25*

Примечание:

* - достоверность различий показателей по отношению к СНН;

СНН - супернатант неактивированных нейтрофилов;

CAHIat - супернатант нейтрофилов, активированных латексом;

CAHS - супернатант нейтрофилов, активированных S. aureus (штамм 209);

САНЕ - супернатант нейтрофилов, активированных Е. co!i (штамм М-17);

CAHL- супернатант нейтрофилов, активированных Lactobacterium spp.;

САНВ - супернатант нейтрофилов, активированных Bifidobacterium spp;

САН смесь бактерий - супернатант нейтрофилов, активированных смесью бактерий.

Таблица 3.

Показатели уровня цитокинов в супернатантах активированных и неактивированных нейтрофилов

периферической крови здоровых женщин (п=20)

Супернатант нейтрофилов

Показатели СНН CAHIat САНЕ CAHS CAHL САНВ САсмесь бактерий

1 2 3 4 5 6 7

ИЛ -1а, пг/мл 44,17+6,73 32,27±13,60 55,49+5,26 56,8216,55 45,79+7,22 44,24±6,97 57,64±12,18

ИЛ -1[i, пг/мл 24,07±5,41 10,83±2,27 32,0±5,46 23,56±4,66 25,00±5,99 21,01±4,15 11,83±3,88

РАИЛ-1, пг/мл 166,5±32,82 25,1+3,94* 1061,0+141,3* 344,1 ±145,10 124,90±29,23 182,20±43,57 17,78+2,69*

ИЛ-6, пг/мл 1,92±0,29 1,62+0,17 2,37±0,43 2,49±0,44 2,12±0,26 1,90*0,23 1,91+0,20

ИЛ-8, пг/мл 38,31±7,67 25,52±4,93 48,49±11,66 55,21±13,10 38,52+6,93 46,48±7,05 31,85±5,77

ФНОа, пг/мл 2,21±0,19 3,12±0.15* 2,06 ±0,17 2,76±0,26 2,07±0,22 2,07±0,15 2,00+0,29

Примечание:

* - достоверность различий показателей по отношению к СНН;

СНН - супернатант неактиаирозанных нейтрофилов;

CAHIat - супернатант нейтрофилов, активированных латексом;

CAHS - супернатант нейтрофилов, активированных S. aureus (штамм 209); '

САНЕ - супернатант нейтрофилов, активированных Е. colt (штамм М-17);

CAHL - супернатант нейтрофилов, активированных Lactobacterium spp.;

САНВ - супернатант нейтрофилов, активированных Bifidobacterium spp.

САсмесь бактерий - супернатант нейтрофилов, активированных смесью бактерий

В результате проведенных исследований обнаружили, что после 30 минутной инкубации без индукторов в супернатантах находились все искомые медиаторы. Хотя их концентрация была невысокой (пг/мл), исключение составил РАИЛ-1.

В ответ на действие частиц латекса, в продуктах секреции нейтрофилов значительно уменьшалось содержание РАИЛ-1 и повышалось количество ФНОа. При действии кишечной палочки в супернатантах нейтрофилов регистрировался повышенный уровень РАИЛ-1. Лакто- и би-фидобактерии не вызывали изменения содержания изучаемых цитоки-нов.

Для оценки влияния монокультур Е. coli, S. aureus, Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. и смеси перечисленных бактерий на жизнеспособность нейтрофилов периферической крови нами использовался витальный метод окраски трипановым синим.

В процессе выделения нейтрофилов из периферической крови 43% клеток теряли свою жизнеспособность, действие монокультур микробных агентов усиливало гибель клеток.

Апоптогенное действие Е. coli, S. aureus, Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. на нейтрофилы регистрировалось методом проточной цитометрии. После 30 минутной инкубации нейтрофилов периферической крови в присутствии кишечной палочки, золотистого стафилококка или бактериальной смеси процент апоптозных клеток не изменялся, лакто- и бифидобактерии значительно повышали уровень клеток, подвергшихся естественной гибели.

В последние годы показано, что даже после гибели нейтрофилы могут выполнять атимикробную функцию за счет образования внеклеточных ловушек (Neutrophil Extracellular Traps, NETs, НВЛ). В ответ на микробные и немикробные стимулы нейтрофилы активно формируют во внеклеточном пространстве сетеподобные структуры, состоящие из нуклеиновых кислот и ферментов (Fuches Т. A., Abed U. et al., 2007).

Используемый нами способ позволил разделить нейтрофилы в зависимости от морфологии на следующие группы: нейтрофилы с сегментированным ядром, с недифференцированным ядром и свободнолежа-щие нити ДНК нейтрофила (нейтрофильные ловушки).

Данным способом было окрашено 70 фиксированных препаратов, из которых 10 содержали взвесь нейтрофилов без активаторов (контроль), и 6 групп по 10 мазков были приготовлены из взвеси нейтрофилов, активированных частицами латекса, Е. coli, S. aureus, Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. или смесью бактерий соответственно.

Таблица 4.

Содержание различных морфологических форм нейтрофилов периферической крови здоровых женщин после взаимодействия с частицами латекса, Е. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. и смесью бактерий (п=10),%

Показатели Нейтрофилы

НН AHIat АНЕ AHS AHL АНВ АН смесью бактерий

1 2 3 4 5 6 7

Содержание нейтрофилов с неизмененным ядром, % 59,69±6,19 56,56±5,03 32,40±5,38* 40,70±2,21* 28,40±4,81* 24,00±4,94* 56,33+6,59

Содержание нейтрофилов с недифференцированным ядром, % 24,11 ±3,47 19,56±3,26 31,30+2,31* 32,9+4,72 37,10±3,83* 21,11±2,56 15,33±1,63

Содержание НВТ,% 16,0±4,22 23,69±4,15 36,30±3,89* 30,00±2,73* 34,50±4,50* 54,89+4,69* 28,33±5,15*

Примечание:

* - достоверность различий показателей по отношению к НН;

НН -неактивированные нейтрофилы;

AHIat - нейтрофилы, активированные латексом;

AHS нейтрофилы, активированные S. aureus (штамм 209);

АНЕ - нейтрофилы, активированные Е. соП (штамм М-17);

AHL- нейтрофилы, активированные Lactobacterium spp.;

АНВ - нейтрофилы, активированные Bifidobacterium spp;

АН смесью бактерий - нейтрофилы, активированные смесью бактерий.

CD °

,5o£

« N Й ь I g

« I

5 a 3 о

01 Jd

s ё

ю -I

о

Г- О. г- (t >S

2 Ш

X

m

5

ГО 55

h- XI

3 S

^ Q)

:= ГО

о m

и s

Ш * . tiro ro

О X

^ ю

Q) о

ГО s:

с; |

s

i—

C5

ГО W

T E

* 3 Л С

x a;

-r- -fr-'

i n

Xi

о

^ e

S CD П .

S a.

ra CL

~ W

£ э

Ш

о

Q_ -

О ta

ь _

О <ц

s s

О re Ю

(t- !

m

3

~ a. о & tS и я ■О

ю о о +1 (О

г> о

to

Е о .2

О о

СП

о"

а

о Т

о"

л

см

№ &

го и

+1 СП

•ч-

о о

ш

Л ТО

о

s а: го «

to in

OJ I

OJ CD

o"

CO Ю

e> о

&>

со

+1 Ш CO

a>

CD in o" +1 CO Ю

cm"

+1 CM

in

О in

8" T-

cn «о

+i CM

s

к

о c

? Э"

о го

X

Я « у

о >

го

-е

m g &

га Е

ш

I

го ш Щ го

I *

го

CD Q.H 0) Ш

о a

с;

В.

га

*

CL О

CL О О О.

о га

то о.

га о

■у ь

а> о

s SS ч П. |

с:«

В результате проведенных исследований обнаружили, что при действии в течение 30 минут монокультур кишечной палочки, золотистого стафилококка, лакто- и бифидобак-терий содержание ней-трофилов с сегментированным ядром снижается, а количество нейтрофильных ловушек возрастает. При этом максимальные изменения этих показателей наблюдаются при действии бифидобакте-рий (таблица 4).

Сравнивая фагоцитарную активность неизмененных нейтро-филов и эффективность улавливания бактерий в нейтрофильных ловушках, определили, что внеклеточно расположенные сети нейтро-фила, способны задержать в 2-3 раза больше как микробных, так и немикробных агентов (таблица 5).

Таким образом, нами установлено, что после 30 минутного взаимодействия с микробными и немикробными агентами in vitro нейтро-

филы образуют внеклеточные сетеподобные структуры, хорошо визуализируемые при окраске фиксированных препаратов акридиновым оранжевым. Они способны эффективнее, чем живая клетка улавливать и частицы латекса, и любые бактерии. При этом представители нормоф-лоры активно стимулируют производство ловушек.

Кроме того, важно отметить, что агрессивные факторы гранул ней-трофила, секретируемые во внеклеточное пространство, связаны нитями ДНК нейтрофильной ловушки (Fuches Т. A., Abed U. et al, 2007). При этом они не способны вызвать развитие воспалительных изменений в 1 тканях и оказать повреждающее действие на клетки слизистых оболочек при их колонизации представителями нормофлоры. Таким образом, нейтрофильные внеклеточные ловушки могут быть одним из основных и эффективных факторов антимикробной защиты слизистых оболочек.

После определения влияния микроорганизмов на жизнеспособность и функциональный ответ нейтрофилов, нами решено было оценить суммарный бактерицидный эффект продуктов секреции нейтрофилов периферической крови в отношении контрольных штаммов S. aureus {штамм 209), Е. coii (штамм М-17), Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp.

Результаты исследований показали, что продукты секреции интакт-ных нейтрофилов обладают широким спектром антимикробного действия (рисунок 2).

S.aureus Ecoii Lactobacterium Bifidobacterium

Рис. 2. Бактерицидный эффект секреторных продуктов неактивированных нейтрофилов на S. aureus (штамм 209), Е. coli (штамм М-17), Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp.

|

23

I

Это объясняется высоким содержанием различных биологически активных продуктов в клетке, в том числе и токсичных, которые образуются в процессе созревания нейтрофила и накапливаются в гранулах (Borregaard N., Cowland J., 1997). При дегрануляции содержимое гранул выливается в околоклеточное пространство, что и обуславливает бакте-рицидность супернатантов нейтрофилов (Алексеев Н.А., 2002).

После первичного взаимодействия с Е. coli, S. aureus и Bifidobacterium spp., нейтрофил либо теряет, либо сохраняет на прежнем уровне бактерицидные свойства своих секреторных продуктов. Такая избирательная потеря бактерицидности, по-видимому, связана с тем, что антимикробные пептиды и ферменты лизосом обладают определенной специфичностью своего действия на различные группы микроорганизмов, и предварительная инкубация нейтрофилов с этими штаммами сопровождается расходованием (истощением) бактерицидных продуктов в супернатантах. При повторном контакте с лактобактериями происходит усиление антибактериальной активности секреторных продуктов нейтрофилов периферической крови здоровых женщин.

Для определения влияния нейтрофилов на микробиоценоз слизистых оболочек, нами решено было оценить влияние чистой взвеси нейтрофилов и супернатантов интактных и активированных вагинальным секретом нейтрофилов на состав микрофлоры и адгезивную активность грибов рода Кандида на поверхности вагинальных эпителиоцитов здоровых женщин и женщин с бактериальным вагинозом.

Для решения этой задачи, прежде всего, было изучено исходное состояние флоры нижних отделов генитального тракта женщин в разные фазы менструального цикла. У здоровых женщин в первую фазу менструального цикла из цервикального канала в основном высевались лактобактерии, в 10% случаев встречались коагулазонегативные стафилококки и в единичных случаях дрожжеподобные грибы рода Candida и представители семейства Enterobacteriaceae, что совпадало и с литературными данными (Костюк О. П., ЧернышоваЛ. И. и др., 1998; Коршунов В.М., Володин Н.Н. и др., 1999; Воробьев А.А., Лыкова Е.А., 1999; Анкир-ская А.С., Муравьева В.В., 2000; Кира Е.Ф., 2001; Валышев А.В., Елагина Н.Н. и др., 2001; Кафарская Л.И., Коршунова О.В. и др., 2002; Кудрявцева Л.В., Ильина Е.Н. и др., 2003; Sautter R. L., Brown W.J., 1980). Во вторую фазу менструального цикла в цервикальном канале чаще обнаруживались представители факультативной флоры: стафилококки, дрожжеподобные грибы, Е. coli, Enterobacter spp. и Enterococcus spp.

В секрете заднего свода влагалища основными представителями

Таблица 6.

Влияние супернатантов нейтрофилов на адгезивную способность Candida albicans к вагинальным

эпителиоцитам здоровых женщин (М ± т)

Показатели Кандада

Без воздействия (контроль) п=23 Предварительно обработанные СНН п=23 Предварительно обработанные CAHL п=13 Предварительно обработанные САНВ п=7 Предварительно обработанные CAHS п=10 Предварительно обработанные САНЕ п=13

1 2 3 4 5 6

Активность адгезии, % 59,91 ±2,12 49,13+3,09* 53,54+2,04* 67,14±2,09 51,00+3,18* 59,92±2,64

Интенсивность адгезии, усл. е д. 125,57±7,53 95,57+8,26* 99,77+5,53* 205,00+23,04* 96,40+7,58* 140,08±11,59

Адгезивное число, усл. ед 2,06±0,07 1,89+0,07* 1,86+0,06* 3,04 ±0,30 1,87±0,06 2,30±0,12

Примечаниа:

* - достоверность различий показателей по отношению к контрольным значениям; СНН - супернатант неактивированных нейтрофилов;

CAHS - супернатант нейтрофилов, активированных S. aureus (штамм 209); САНЕ - супернатант нейтрофилов, активированных Е. coli (штамм М-17); CAHL- супернатант нейтрофилов, активированных Lactobacterium spp.; САНВ - супернатант нейтрофилов, активированных Bifidobacterium spp.

флоры также были определены лактобактерии, содержание которых значительно превосходило количество этих микроорганизмов в церви-кальном канале. Состав факультативной флоры влагалища не отличался от микробного пейзажа цервикального канала. На протяжении менструального цикла микрофлора влагалища претерпевала такие же изменения, как и флора цервикального канала.

При оценке влияния нейтрофилов и их секреторных продуктов на микробиоценоз и адгезивную активность грибов рода Кандида на поверхности вагинальных эпителиоцитов, определили, что у здоровых женщин содержание лактобактерий в пробе под действием нейтрофилов и их секреторных продуктов существенного не менялось. Нейтрофилы значимо снижали содержание коагулазонегативных стафилококков в вагинальной слизи. Секреторные продукты интактных нейтрофилов, а также нейтрофилов, активированных лактобактериями или S. aureus, при воздействии на С. albicans снижали адгезивную активность грибов, тем самым, препятствуя колонизации вагинального эпителия (таблица 6). Результаты наших исследований совпадали с результатами Свиридова М.А. (2007).

Нами была исследована бактерицидная и антиадгезивная активность нейтрофилов периферической крови и их секреторных продуктов в отношении представителей влагалищной флоры женщин с бактериальным вагинозом. Данное заболевание представляло наибольший интерес, так как при бактериальном вагинозе наблюдаются значительные нарушения микробиоценоза влагалища, характеризующиеся снижением удельного веса лактобактерий и повышением уровня условно-патогенных микроорганизмов (Муравьева В.В., Анкирская A.C., 1996; Wiiks М., Thin R.N. et al., 1984; Harnmann R., Kronibus A. et al., 1987). Кроме этого, одним из проявлений такого состояния является нормальное содержание лейкоцитоэ в вагинальной слизи (Кафарская Л.И., Коршунова О.В. и др., 2002) и практически полное отсутствие классической воспалительной реакции.

Установлено, что у женщин с бактериальным вагинозом из влагалища выделяется более широкий спектр микроорганизмов, чем у здоровых женщин. Наряду с лактобактериями, которые определялись в более низких титрах, из влагалища в 78% случаев высевали гарднереллы, в 30% случаев встречались коагулазонегативные стафилококки и в единичных случаях - дрожжеподобные грибы, бифидобакгерии, Е. coli и протей, что совпадало с данными литературы (Коршунов В.М., Володин H.H. и др., 1999; Кира Е.Ф., 2001; Кудрявцева Л.В., Ильина E.H. и др., 2003).

05 ГГ

с. ю го

ь-

5 Е

+1

ГО

ю о

X и

3

X

си

03 О

о.

ж

л о

с; си I-

с о

о го ш

8 -

Т С/>

2 С

О. ГО

0) о

-е-!

ш "2

2 я

-9-

_ -О

й §

ш ю

т8

§ о

Ё 5

го я

I -

О- 3

О Л

с ш

>< ь.

О с£

Ш га

^ го

X X К

^ Й

с: 5

£П 8 х

га т

| Кандада | Предварительно обработанные САН Е.сой п=5 со см 8 см со С) СО +1 со СО гС ю 1,69±0,23

Предварительно | обработанные САН Б.аигеиз л=5 1 ю 34,5±4,5 я § о со" СО 1,91±0,17

Предварительно обработанные САН 1_асДо п =8 \ СО 36,67±4,12 к г--' +1 ГО ОЭ со 1,69±0,04

Предварительно обработанные СНН 1 п=10 | см см 00 ТГ -н см" ■ч- О! се -н СО а>" СО со СО о СО со —

Без воздействия (контроль) ■п=10 | - со я' О) о" со СО„ -н со со" к г--о 3 СО т—

Показатели Активность адгезии, % Интенсивность адгезии, усл. ед. Адгезивное число, усл. ед.

При исследовании влияния нейтрофилоз и их медиаторов на флору вагинальной слизи женщин с бактериальным вагинозом было отмечено снижение содержания в секрете количества стафилококков под действием секреторных продуктов нейтрофи-лов. Нейтрофилы, суперна-тант неактивированных и активированных нейтрофилов значимо снижали содержание гарднерелл в вагинальной слизи. На лактофлору нейтрофилы и продукты их секреции не оказывали значительного влияния.

Оценивая адгезивную активность грибов рода Кандида на поверхности вагинальных эпителиоцитов женщин с бактериальным вагинозом определили, что уровень активности и интенсивности адгезии значительно ниже аналогичных показателей здоровых женщин, в тоже время продукты секреции нейтрофилов не препятствуют адгезии Кандид (таблица 7).

В результате проведенных исследований можно сделать вывод о том, что нейтрофилы и их секреторные продукты оказывают регулирующее и нормализующее влияние на состав флоры слизистых оболочек, тем са-

мым, участвуя в селективной деконтаминации влагалищного биотопа. Бактериальный вагиноз - это эпителиальная инфекция, и, по-видимому, дефицит локальной лейкоцитарной реакции может быть одной из причин развития вагинального дисбиоза. В то же время восполнение этих клеток в секрете приведет к нормализации влагалищной флоры.

Таким образом, нейтрофилы слизистых оболочек, оснащенные богатым набором рецепторов, которые позволяют ему быстро и дифференцировано реагировать на малейшие изменения окружающей среды (Семенов Б.Ф., Зверев В.В., 2007), связываясь с бактериальными компонентами, активируются. В зависимости от природы возбуждающего агента, активированный нейтрофил решает эффекторные задачи либо с помощью фагоцитоза, либо путем секреции биологически активных веществ и ДНК(Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; FuchesT. A., Abed Ü. et al., 2007).

Если в качестве активатора выступают патогенные или условно-патогенные микроорганизмы, то в ответ нейтрофил поглощает возбудителя и, за счет гидролитических ферментов лизосом и активных форм кислорода, осуществляет внутриклеточный киллинг. Этот процесс сопровождается секрецией широкого спектра провоспалительных цитокинов в окружающую среду, однако нами обнаружено, что наряду с провоспа-лительными цитокинами в больших концентрациях секретируется противовоспалительный цитокин - РАИЛ-1. Вероятно, повышенные концентрации этого медиатора осуществляют блокаду как рецепторов для ИЛ -1, предупреждая развитие воспалительной реакции и повреждения окружающих тканей на ранних этапах взаимодействия, так и Toll - подобных рецепторов, имеющих высокую степень гомологии с аналогичными участками рецептора ИЛ-1 (Симбирцев A.C., 2005), тем самым, ограничивая гиперактивацию и контакт нейтрофила с окружающей средой. Это благоприятным образом отражается на внутриклеточной переработке фагоцитированного материала. После реализации своей биологической программы, нейтрофил погибает. В данном случае гибель сопровождается разрушением клеточной оболочки, как при некрозе, и флогогенные факторы, вытекая в окружающую среду, все же могут привести к воспалительным изменениям.

Иначе происходит взаимодействие нейтрофилов с непатогенными представителями нормофлоры слизистых оболочек. Нф слабо фагоцитируют эти бактерии. Однако, по-видимому связывание компонентов микробной стенки с паттерн-распознающими рецепторами нейтрофила приводит к активации НАДФН - оксидазы и внутриклеточных мессенд-

жероз с последующей секреторной дегрануляцией (Сидоренко C.B., 2001; Артамонов Р.Г., 2004; Маянский А.Н., Маянская И. В., 2004). В результате такого процесса из гранул высвобождаются антиадгезивные и микро-боцидные факторы. Антимикробные вещества (микробоцидные ферменты, антибактериальные катионные белки, нейтральные сериновые про-теазы, металлопротеиназы, кислые гидролазы, продукты респираторного взрыва - перекись водорода, гидроксильный радикал, галогены, атомарный кислород, оксид азота, пероксинитрит и другие, в том числе и миелопероксидаза) связываются внутриклеточно с нитями ДНК нейтро-фила, и секретируются во внеклеточное пространство, образуя нейтро-фильные внеклеточные ловушки, ограничивая повреждение близлежащих тканей. Бактерии эффективно задерживаются в этих структурах и разрушаются (Fuches Т. A., Abed U. et al., 2007).

Продукты секреции нейтрофилов обладают селективной бактери-цидностью: они способны подавлять рост патогенной и условно-патогенной флоры, и не влиять на лакто- и бифидобактерии. Селективная бактерицидность продуктов нейтрофилов, скорее всего, обусловлена тем, что гранулы этих клеток гетерогенны, скорость их функциональной мобилизации неодинакова (Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001), и при активации нейтрофилов через различные рецепторы, в том числе и Toll-подобные, клетка секретирует неодинаковый набор антимикробных медиаторов.

Кроме того, на поверхности слизистых цервикального канала и влагалища бактерицидный эффект нейтрофилов может быть усилен за счет кооперации гранулоцитов и лактобактерий. Миелопероксидаза взаимодействует с Н202, которая продуцируется лактобактериями влагалища женщин, и хлоридами вагинального секрета с образованием гипохлор-ной кислоты (HOCI) - мощного оксиданта, способствующего избирательному киллингу микроорганизмов. Работы М.М. Бакуева и М.З. Саидова (1991) подтверждают расходование и снижение активности миелоперок-сидазы в секреторных продуктах нейтрофилов после контакта клеток с живыми пероксидпродуцирующими бактериальными культурами.

Нами показано, что лакто- и бифидобактерии не влияют на секрецию провоспалительных цитокинов и обладают апоптогенным действием, что может быть обусловлено подавлением лактобактериями активации нуклеарного фактора NF-kB (Маянский А.Н., Маянский H.A. и др., 2007). Это сопровождается индукцией аполтоза и блокадой воспалительных реакций, обеспечивая существование нормоценозов слизистых оболочек (рисунок 3).

E.coli

ИЛ1а"

ИЛ1(3

ИЛ6

ИЛ 8

ФНОа

РАИЛ

S.aureus

РЯ/?

Блокада рецепторов ';

1:1 *

go Фагоцитоз f *

Внутриклеточный

Bifidobacterium Lactobacterium

Л /

о г"

ОН "

нгог

. N0 НА

Лизоцим Лактоферрин Дефенсины БПИ

Миелопероксидаза »

Антиадгезивное действие

HOCI

Гибель нейтрофила

Некроз

Апопгоз

Экстацеллюлнрные внеклеточные ловушки

Рис. 3. Функциональный ответ нейтрофилов на действие различных представителей микробной флоры слизистых оболочек

Таким образом, нейтрофилам и их секреторным продуктам принадлежит определенная роль в регуляции микробиоценоза влагалища женщин, и, наряду с эпителиальными клетками влагалища, вагинальной средой, микрофлорой генитального тракта и другими факторами неспецифической защиты, они могут участвовать в формировании колонизационной резистентности за счет количественного превосходства этих клеток на поверхности слизистых оболочек, выраженного антимикробного потенциала и селективного действия бактерицидных продуктов на представителей непатогенной и условно-патогенной флоры, участия в процессах адгезии микроорганизмов на поверхности эпителиоцитов и образования нейтрофильных внеклеточных ловушек.

ВЫВОДЫ

1. В цервикальном и вагинальном секретах содержится значительное количество лейкоцитов. Доминирующими среди них являются нежизнеспособные нейтрофилы, окрашивающиеся трипановым синим или

подвергшиеся апоптозу. Жизнеспособные нейтрофилы секретов способны к фагоцитозу, обладают янзосомальным аппаратом и кислородзави-симыми эффекторными системами, более выраженными у нейтрофи-лов цервикальной слизи.

2. В слизи шейки матки и влагалища присутствуют растворимые антимикробные факторы: лизоцим, дефенсины, бактерицидный/индуцирующий протеин, лактоферрин, миелопероксидаза, нитраты и нитриты, уровень которых остается стабильным или незначительно снижается во вторую фазу менструального цикла, при этом в цервикальном секрете содержание микробоцидных субстанций значительно превосходит показатели влагалищного отделяемого.

3. Нейтрофилы периферической крови здоровых женщин in vitro активно фагоцитируют частицы латекса, Staphylococcus aureus (штамм 209), Escherichia coli (штамм М-17), Lactobacterium spp., при этом обладают меньшей фагоцитарной активностью по отношению кбифидобак-териям. Контакт гранулоцитов со Staphylococcus aureus, Escherichia coli или смесью бактерий сопровождается повышением кислородзависимо-го метаболизма и активности лизосом, лакто- и бифидобактерии не изменяют функциональный статус гранулоцитов.

4. Взаимодействие in vitro нейтрофилов периферической крови со взвесью культур микроорганизмов Staphylococcus aureus (штамм 209), Escherichia coli (штамм М-17), Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp. приводит к гибели значительного числа гранулоцитов, при этом Lactobacterium и Bifidobacterium обладают выраженным апоптогенным действием.

5. Культивирование интактных нейтрофилов in vitro сопровождается выделением наружу растворимых антимикробных факторов (лизоци-ма, оксида азота, лактоферрина, миелопероксидазы, дефенсинов и бактерицидного/индуцирующего протеина) и провоспалительных цитокинов (интерлейкин-1а, интерлейкин-1р, рецепторный антагонист интерлейки-на 1, интерлейкин-6, интерлейкин-8, фактор некроза опухоли а), придающих культуральной жидкости способность подавлять рост эталонных штаммов кишечной палочки, золотистого стафилококка, лактобактерий и бифидобактерии.

6. Индукция нейтрофилов in vitro различными агентами приводит к секреции биологически активных продуктов неодинакового состава: при действии частиц латекса в среде культивирования повышаются преимущественно уровни лизоцима, лактоферрина, рецепторного антагониста интерлейкина 1 и фактора некроза опухоли а. После активации нейтро-

филов кишечной палочкой повышается уровень рецепторного антагониста интерлейкина 1, при действии Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp. - уровень бактерицидного/индуцирующего протеина и лактоферри-на. Максимальная концентрация этих продуктов наблюдается после активации бифидобактериями. Если в качестве индуктора секреции применяется взвесь стафилококка, кишечной палочки или бифидобактерий, то секреторные продукты нейтрофилов теряют бактерицидность по отношению к этим же штаммам бактерий. Повторный контакт нейтрофилов с лактобактериями приводит к усилению антимикробной активности.

7. Индукция нейтрофилов периферической крови in vitro взвесью монокультур Staphylococcus aureus (штамм 209), Escherichia coli (штамм М-17), Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp., приводит к образованию гранулоцитами внеклеточных ловушек, состоящих из нитей дезок-сирибонуклеиновой кислоты и бактерицидных гранул. Бифидобактерии наиболее активно стимулируют образование таких сетей. Эффективность улавливания бактерий в нейтрофильных ловушках значительно превосходит поглощение аналогичных микроорганизмов нейтрофилами при фагоцитозе. Экспресс-метод обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек с помощью окраски акридиновым оранжевым позволяет дать качественную и количественную оценку этому явлению.

8. Нейтрофилы и их секреторные продукты участвуют в регуляции измененного микробиоценоза влагалища при бактериальном вагинозе, поскольку обладают селективной бактерицидностью: они подавляют рост условно-патогенных микроорганизмов и не влияют на лактофлору, при этом не оказывают существенного влияния на микробиоценоз нижних отделов генитального тракта здоровых женщин.

9. Секреторные продукты нейтрофилов периферической крови здоровых женщин снижают адгезию грибов рода Кандида на поверхности вагинальных эпителиоцитов, при бактериальном вагинозе супернатан-ты нейтрофилов периферической крови не обладают антиадгезивной активностью.

10. Нейтрофилы слизистых оболочек шейки матки и влагалища могут участвовать в формировании колонизационной резистентности эпителия нижних отделов генитального тракта за счет выраженного антимикробного потенциала и селективного действия бактерицидных продуктов на представителей непатогенной и условно-патогенной флоры, участия в процессах адгезии микроорганизмов на поверхности эпителиоцитов и образования нейтрофильных внеклеточных ловушек.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Андреева, Ю.С. Роль нейтрофилов в регуляции микробиоценоза влагалища женщин : дис.... канд. мед. наук/Ю.С.Андреева. - Челябинск, 2005. -150 с.

2. Долгушин, И.И. Регуляция нейтрофилами и их секреторными продуктами микробиоценоза влагалища здоровых женщин и женщин с бактериальным вагинозом / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева II Медицинская иммунология.-2005.-Т. 7, № 2-3.-С. 184-185.

3. Андреева, Ю.С. Оценка жизнеспособности нейтрофилов, активированных in vitro различными видами бактерий: материалы IV конф. иммунологов Урала / Е.В. Плеханова, И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, М.А. Свиридов // Иммунология Урала. - 2005. - № 1(4). - С. 194.

4. Андреева, Ю.С. Функциональная активность нейтрофилов периферической крови здоровых женщин после активации различными видами микроорганизмов: материалы IV конф. иммунологов Урала / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, Е.А. Мезенцева//Иммунология Урала. -2005. -№1(4).-С. 9.

5. Андреева, Ю.С. Роль нейтрофилов в регуляции микробиоценоза репродуктивного тракта женщин I И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -2005. - № 5. - С. 84-87.

6. Андреева, Ю.С. Участие нейтрофилов в регуляции микробиоценозов слизистых оболочек / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева II Цитокины и воспаление. - 2005. - Т. 4, № 3. - С. 134-135.

7. Андреева, Ю.С. Изучение влияния нейтрофилов и их секреторных продуктов на представителей микрофлоры влагалища при бактериальном вагинозе / Ю.С.Андреева, И.И.Долгушин II Материалы республиканской науч. конф. "Иммунология репродукции": тез. докл. II Russian Journal of Immunology. - 2005.-Vol. 9, Suppl. 2. - P. 254.

8. Долгушин, И.И. Определение роли нейтрофилов в регуляции микробиоценоза влагалища женщин / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева / / Новые лабораторные технологии в диагностике и лечении заболеваний человека: материалы конф., посвящ. 25-летию ЦНИЛ ЧелГМА. - Челябинск, 2006. - С. 76-79.

9. Долгушин, И.И. Участие нейтрофилов в регуляции микробиоценоза влагалища женщин: материалы респ. науч. конф. "Иммунология репродукции": вводные лекции и тез. докл. / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева // Russian Journal of Immunology. -2006. - Vol. 9, Suppl. 3. - P. 96-97.

10. Андреева, Ю.С. Изучение функциональной активности нейтро-филов периферической крови здоровых женщин после активации различными видами микроорганизмов / Ю.С. Андреева// Материалы 4 итоговой науч.-практ. конф. молодых ученых ЧелГМА. - Челябинск, 2006. -С. 6-7.

11. Андреева, Ю.С. Бактерицидная активность секреторных продуктов нейтрофилов периферической крови здоровых женщин / Ю.С. Андреева II Материалы 4 итоговой науч.-практ. конф. молодых ученых ЧелГМА. - Челябинск, 2006. - С. 4-5.

12. Долгушин, И.И. Нейтрофилы регулируют формирование микробиоценоза слизистых оболочек / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, Е.А. Мезенцева, А.Ю. Савочкина, Е.В.Плеханова, М.А.Свиридов, М.В. Пеши-кова II Медицинская иммунология. - 2006. - Т. 8, № 2-3. - С. 135-136.

13. Долгушин, И.И. Нейтрофилы и их секреторные продукты в формировании микробиоценоза репродуктивного тракта женщин / И. И. Долгушин, Ю.С. Андреева // Российско-чешский медицинский форум: сб. науч. тр. - Челябинск, 2006. - С. 168-170.

14. Андреева, Ю.С. Определение функциональной активности нейтрофилов периферической крови здоровых женщин после активации S. aureus (штамм 209), Е. coli (штамм М-17), Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp. / Ю.С. Андреева // Российско-чешский медицинский форум: сб. науч. тр. - Челябинск, 2006. - С. 166-168.

15. Свиридов, М.А. Изучение функциональной активности различных штаммов дрожжеподобных грибов рода Candida на поверхности вагинальных эпителиоцитов / М.А.Свиридов, И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, Л.В. Плаксина // Российско-чешский медицинский форум: сб. науч. тр. - Челябинск, 2006. - С. 163-164.

16. Плеханова, Е.В. Изучение апоптоза нейтрофилов, активированных бактериями, входящими в состав микрофлоры урогенитального тракта женщин / Е.В.Плеханова, И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, М.А.Свиридов, Д.Н. Матвеева, Л.В'. Подлубная//Медицинская иммунология. -2006. - Т. 8, №2-3.-С. 281-282.

17. Свиридов, М.А. Влияние временного фактора на взаимодействие дрожжеподобных грибов рода Candida и вагинальных эпителиоцитов in vitro/ М.А.Свиридов, Ю.С. Андреева, Е.В.Плеханова, Л.В. Плаксина, Л.В. Подлубная // Материалы 4 итоговой науч.-практ. конф. молодых ученых ЧелГМА. - Челябинск, 2006. - С. 100-101.

18. Плеханова, Е.В. Изучение апоптоза нейтрофилов периферической крови после их взаимодействия с Е. coli, S. aureus, Lactobacillus spp.

Bifidobacterium spp. / E.B. Плеханова, И.И.Долгушин, Ю.С. Андреева Материалы IX съезда всероссийского науч.-практ. о-ва эпидемиоло-зв, микробиологов и паразитологов: в 3-х т. - М.: Санэпидмедиа, 2007. -. 2. - С.125-126.

19. Плеханова, Е.В. Изучение жизнеспособности нейтрофилов периферической крови после их взаимодействия с Е. coii, S. aureus, Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp. / Е.В.Плеханова // Материалы IX

ъезда всероссийского науч.-практ. о-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: в 3-х т. - М.: Санэпидмедиа, 2007. - Т. 2. - С.125.

20. Долгушин, И.И. Влияние нейтрофилов и их секреторных про-уктов на формирование микробиоценоза слизистых оболочек гениталь-

ного тракта женщин / И.И.Долгушин, Ю.С. Андреева // Материалы IX съезда всероссийского науч.-практ. о-за эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: в 3-хт. - М.: Санэпидмедиа, 2007. - Т. 2. - С.104-105.

21. Савочкина, А.Ю. Сравнительный анализ уровня пероксидазы нейтрофилов периферической крови и цервикальной слизи / А.Ю. Савочкина, Ю.С. Андреева, Е.В. Плеханова // Материалы IX съезда всероссийского науч.-практ. о-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов: в 3-х т. - М.: Санэпидмедиа, 2007. - Т. 2. - С. 129.

22. Долгушин, И.И. Влияние нейтрофилов и продуктов их секреции на факторы, участвующие в формировании колонизационной резистентности / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, М.А. Свиридов, А.Ю. Савочкина, Е.А. Мезенцева, Е.В. Плеханова, А.Н. Скороходов, В.В. Чванов, Л.Ф. Телешева, С.И. Марачев, Д.Н. Матвеева, В.А.Тупиков // Медицинская иммунология. - 2007. - Т. 9, № 2-3. - С. 133-134.

23. Долгушин, И.И. Нейтрофилы и продукты их секреции оказывают регулирующее влияние на факторы колонизационной резистентности слизистых оболочек / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, М.А. Свиридов II Российский аллергологический журнал. - 2007. -№ 3, прил. 1,- С. 263.

24. Плеханова, Е.В. Изучение жизнеспособности нейтрофилов IN VITRO после активации лактобаетериями: материалы V конф. иммунологов Урала / Е.В. Плеханова, И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева II Иммунология Урала. - 2006. - № 1(5). - С. 24-25.

25. Андреева, Ю.С. Изучение бактерицидной активности секреторных продуктов нейтрофилов периферической крови после их взаимодействия с Е. coli, S. aureus, Lactobacillus spp. и Bifidobacterium spp / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева II Обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия населения и защиты прав потребителей в Челябинской области: материалы X съезда организаторов госсанэлидслужбы, ги-

гиенистов, эпидемиологов, микробиологов и дезинфекционистов Челябинской обл. - Челябинск, 2007. - С. 184-185.

26. Андреева, Ю.С. Взаимодействие нейтрофилов с различными бактериальными агентами / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, Е.В. Плеханова II Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2008. - № 5. - С. 103-105.

27. Долгушин, И.И. Нейтрофилы слизистых оболочек / И.И. Долгушин, Ю.С.Андреева, М. А. Свиридов, Е.А. Мезенцева, Л.Ф. Теле-шева II Медицинская наука и образование Урала. - 2008. - № 2.-С. 37-39.

28. Долгушин, И.И. Нейтрофильные гранулоциты слизистых оболочек / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, Е.А. Мезенцева, Е.В. Плеханова, А.Ю. Савочкина, М.А. Свиридов, Д.Н. Матвеева // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2 (11), № 2-3,- С. 246.

29. Долгушин, И.И. Определение роли представителей флоры ге-нитального тракта здоровых женщин в индукции апоптоза нейтрофилов / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, Е.В. Плеханова, А.Ю.Савочкина // Российско-чешский медицинский форум: сб. науч. тр. - Челябинск, 2008. - С. 53-55.

30. Долгушин, И.И. Сравнительный анализ содержания бактерицидных субстанций в секретах нижнего отдела генитального тракта здоровых женщин в разные фазы менструального цикла / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, Э.Н. Коробейникова, Е.А. Мезенцева // Российско-чешский медицинский форум: сб. науч. тр. - Челябинск, 2008. - С. 50-52.

31. Долгушин, И.И. Формирование микробиоценоза слизистых оболочек контролируется нейтрофилами I И.И. Долгушин, Ю.С.Андреева, М. А. Свиридов, Е.А. Мезенцева, А.Ю. Савочкина// Российский аллерго-логический журнал. - 2008. - №1, прил. 1. - С. 94-95.

32. Долгушин, И.И. Нейтрофильные ловушки / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, А. И. Рыжкова, Е.А. Мезенцева, Е.В. Плеханова, А.Ю. Савочкина, М.А. Свиридов, Д.Н. Матвеева, А.Н. Скороходов // Российский иммунологический журнал. - 2008. -Т.2(11), №2-3. -С. 127.

33. Долгушин, И.И. Взаимодействие нейтрофилов с различными бактериальными агентами / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, Е.В Плеханова //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2008. - № 5. - С. 103-105.

34. Андреева, Ю.С. Роль нейтрофилов в формировании микробиоценоза слизистых оболочек / Ю.С. Андреева, И.И. Долгушин / / Вестник новых медицинских технологий. - 2009. - № 1. - С. 20-22.

35. Савочкина, А.Ю. Иммунологические показатели в диагнос-*ке воспалительных заболеваний репродуктивного траста женщин А.Ю. Савочкина, Ю.С. Андреева, И.И. Долгушин, Л.Ф. Телешева, .А. Мезенцева, К.В. Никушкина, О.С. Абрамовских, Е.В. Плеханова, I.A. Свиридов, С.И. Марачев, А.И. Рыжкова II Вестник новых меди-инских технологий. - 2009. - Na 1. - С. 77-79.

36. Долгушин, И.И. Нейтрофильные внеклеточные ловушки: етод обнаружения и оценка эффективности улавливания бакте-ий / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева //Журнал микробиологии, эпи-емиологии и иммунологии. - 2009. - № 2. - С. 65-67.

37. Андреева, Ю.С. Грибы рода Candida стимулируют образование ейтрофильных внеклеточных ловушек/Ю.С. Андреева, И.И.Долгушин, .Ю. Савочкина, А.И. Рыжкова //Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 1, №4-5.-С. 301.

38. Савочкина, А.Ю. Использование иммунологических пока-ателей в дифференциальной диагностике хронических воспали-ельных заболеваний репродуктивного тракта женщин / А.Ю. Са-очкина, Ю.С. Андреева, Л.Ф. Телешева, С.И. Марачев, В.Ф. Долгу-жна II Вестник Уральской академической науки. - 2009. -№ 2/1. - С. 92-293.

39. Савочкина, А.Ю. Методы определения и биологическая роль ейтрофильных ловушек/А.Ю. Савочкина, Ю.С.Андреева, И.И. Дол-ушин// Вестник Уральской академической науки. - 2009.-№ 2/1. - С. 35-336.

40. Андреева, Ю.С. Солкотриховак стимулирует образование нейтрофильных внеклеточных ловушек / Ю.С. Андреева, А.Ю. Савочкина, И.И. Долгушин II Вестник Уральской академической науки. -2009. -№2/1.-С. 196-197.

41. Андреева, Ю.С. Нейтрофильные внеклеточные ловушки образуются in vitro под действием циклоферона/ Ю.С. Андреева, А.Ю. Савочкина, И.И. Долгушин, А.И. Рыжкова II Вестник Уральской ака-

[емической науки. - 2009. -№ 2/1. - С. 14-15.

42. Долгушин, И.И. Влияние вакцины Солкотриховак на образование нейтрофильных внеклеточных ловушек / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, А.И. Рыжкова, А.Ю. Савочкина, Е.А. Мезенцева, К.В. Никушкина, О.С. Абрамовских, С.И. Марачев, Д.Н. Матвеева II Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2009. - № 4. -С. 53-55.

43. Долгушин, И.И. Нейтрофильные внеклеточные ловушки /

И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, А.И. Рыжкова II Вестник новых медицинских технологий. - 2009. - Т. XVI, № 2. - С. 14-16.

44. Мезенцева, Е.А. Влияние непатогенных и условно-патогенных представителей нормофлоры слизистых оболочек на секрецию нейтрофилами антимикробных продуктов и цитокинов / Е.А. Мезенцева, Ю.С. Андреева, И.И. Долгушин, А.Ю. Савочкина, К.В. Никушкина, О.С. Абрамовских, Е.В. Плеханова, М.А. Свиридов, С.И. Марачев, А.И. Рыжкова II Вестник новых медицинских технологий. - 2009. - Т. XVI, № 2.-С. 16-17.

45. Долгушин, И.И. Бактерии стимулируют образование нейтрофиль-ных внеклеточных ловушек: материалы X Международного конгресса "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофарма-кологии" / И.И. Долгушин, Ю.С. Андреева, А.Ю. Савочкина II Казань. -2009. - С. 282.

46. Рыжкова, А.И. Влияние различных концентраций препарата "Солкотриховак" на образование нейтрофильных внеклеточных ловушек / А.И. Рыжкова, И.И. Долгушин, Ю.С. Шишкова, А.Ю. Савочкина / / Материалы VII итоговой науч.-прает. конф. молодых ученых ЧелГМА. -Челябинск, 2009.-С. 115-117.

47. Рыжкова, А.И. Образование нейтрофильных внеклеточных ловушек в чистой фракции нейтрофилов и в цельной крови под влиянием грибов рода Candida / А.И. Рыжкова, Ю.С. Шишкова, А.Ю. Савочкина // Материалы VII итоговой науч.-практ. конф. молодых ученых ЧелГМА. -Челябинск, 2009. - С. 117-120.

48. Долгушин, И.И. Нейтрофильные ловушки: методы определения, биологическая роль I И.И. Долгушин, Ю.С.Андреева, А.Ю. Савочкина, А.И. Рыжкова, В.А. Маркова, H.A. Васильева II Медицинская наука и образование Урала. - 2009. - № 3. - С. 10-12.

49. Шишкова, Ю.С. Влияние препарата "Пирогенал" на образование нейтрофильных внеклеточных ловушек/Ю.С. Шишкова, А.Ю. Савочкина, А.И. Рыжкова, Е.А. Мезенцева II Медицинская наука и образование Урала. - 2009. - № 3. - С. 23-25.

50. Долгушин, И.И. Нейтрофильные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов / И.И. Долгушин, Ю.С.Андреева, А.Ю. Савочкина. - М.: Издательство РАМН, 2009. - 208 с.

51. Долгушин, И.И. Методы обнаружения нейтрофильных ловушек / И.И. Долгушин, Ю.С.Шишкова, А.Ю. Савочкина //Аллергология и иммунология. - 2009. - Том 10, № 3. - С. 458-462.

На правах рукописи

Шишкова Юлия Сергеевна

РОЛЬ НЕЙТРОФИЛОВ В ФОРМИРОВАНИИ КОЛОНИЗАЦИОННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Челябинск-2010

Отпечатано в типографии BNL. Подписано в печать 06.05.10 г. Формат 60x84 Vi6. Гарнитура Arial Суг. Бумага офсетная. Печать на ризографе. Объем 2 усл. п.л. Тираж 100 экз.

Актуальность проблемы

Одним из важнейших и мало изученных механизмов антимикробной защиты является колонизационная резистентность кожи и слизистых оболочек, под которой понимают устойчивость эпителия к колонизации условно-патогенными и патогенными микроорганизмами.

Колонизационная резистентность обеспечивается совокупностью разнообразных факторов: анатомическими и физиологическими особенностями, наличием нормальной микрофлоры, гуморальных и клеточных факторов иммунитета (Бодяжина В.И., 1978; Долгушина В.Ф., 1991; Железная Л.А., 1998; Краснопольский В.И., Радзинский В.Е. и др., 1999; Кира Е.Ф., 2001; Медведев Б.И., Казачкова Э.А. и др., 2001; Кафарская Л.И., Коршунова О.В. и др., 2002; Гольцфарб В.М., 2005).

На сегодняшний день достаточно хорошо изучен состав нормофлоры влагалища женщин, а также его изменение при дисбиотических процессах. Подробно описаны механизмы взаимного влияния микробных ассоциантов друг на друга (Костюк О.П., Чернышова Л. И. и др., 1998; Коршунов В.М., Володин H.H. и др., 1999; Воробьев A.A., Лыкова Е. А., 1999; Анкирская A.C., Муравьева В.В., 2000; Кира Е.Ф., 2001; Валышев A.B., Елагина H.H. и др., 2001; Кафарская Л.И., Коршунова О.В. и др., 2002; Кауе D., Levinson М.Е., 1977; Morin A., Saheb S.A. et al., 1980, 1982; Morin A., Bisaillon J.G. et ah, 1984). Достаточно полно раскрыты этапы взаимодействия между представителями микрофлоры и клетками вагинального эпителия (Черкасов C.B., Забирова Т.М. и др., 2001; Валышев A.B., Елагина H.H. и др., 2001; Маянский А.Н., Маянская И.В., 2004; Holgate S.T., Lackie P.M. et ah, 1999; Mills P.R., Davies R.G. et ah, 1999; Godaly G., Bergsten G. et ah, 2001; Rastogi D., Rather A.G. et ah, 2001).

В последние годы активно исследуется участие нейтрофилов в регуляции иммунного и других звеньев гомеостаза (Долгушин И.И., 1980; Бережная Н.М., 1988; Зурочка A.B., 1991; Пигаревский В.Е., 1992; Маянский А.Н., Невмятуллин A.JI. и др., 1995; Чукичев A.B., 1996; Колесников О.Л., 1998; Долгушин И.И., Зурочка A.B., 1998; Точолян

A.A.,1999; Долгушин И.И., Зурочка A.B. и соавт., 1986, 1988, 1990, 1992, 2000; Долгушин И.И., Телешева Л.Ф. и др., 2000; Хаитов P.M., 2001; Ishibashi Y., Yamashita Т. et al., 1981, 1985, 1989; Goto К., Nakamura S. et al., 1984; Zeman K., Tchorzewski H. et al., 1987; Lillard 1. W., Boyaka P.N. et al., 1999; Yang D., Chertov O. et al., 2001; Nathan C., 2006). Однако остается не изученным вопрос участия нейтрофилов в формировании микробных сообществ слизистых оболочек.

Традиционно нейтрофилы относятся к тканевым фагоцитирующим клеткам (Пигаревский В.Е., 1982, 1992; Бережная Н.М., 1988; Бакуев М.М., 1992; Воробьев A.A., Медуницин Н.В., 1995; Маянский Д.Н., Цырендоржиев Д.Д. и др., 1996; Ройт А., Бростофф Дж. и др., 2000). Именно в тканях они осуществляют все свои эффекторные функции, участвуя в антимикробных и воспалительных реакциях. Однако фагоцитоз, хотя и важный, но не единственный способ реализации гранулоцитами своих эффекторных функций.

Нейтрофилы - это секреторные клетки, способные выделять биологически активные продукты, с помощью которых они могут осуществлять внеклеточный киллинг, а также, вступая в медиаторные контакты с гуморальными системами и клетками крови, соединительной ткани, оказывать регуляторное действие (Зурочка A.B., 1991; Пигаревский

B.Е., 1992; Маянский А.Н., Невмятуллин А.Л. и др., 1995; Чукичев A.B., 1996; Колесников О.Л., 1998; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Третьякова И.Е., 2003; Жогин A.B., 2003; Ishibashi Y., Yamashita Т. et al., 1981, 1985, 1989; Goto К., Nakamura S. et al., 1984; Zeman K., Tchorzewski

H. et al., 1987; Lillard I. W., Boyaka P.N. et al, 1999; Yang D., Chertov O. et al., 2001).

Недавно открыт и расшифрован еще один механизм уничтожения патогенов. Показано, что в ответ на микробные и немикробные стимулы нейтрофилы активно формируют во внеклеточном пространстве сетеподобные структуры, состоящие из нуклеиновых кислот и ферментов -нейтрофильные внеклеточные ловушки (Neutrophil Extracellular Traps, NETs, HBJl), способные задерживать и убивать микроорганизмы (Brinkmann V., Reichard U., et al., 2004). Таким образом, даже после смерти нейтрофил продолжает борьбу с микробами.

В последние годы показано, что значительная часть гранулоцитов покидает ткани и мигрирует на поверхность слизистых оболочек, где они и погибают. Была высказана гипотеза о том, что нейтрофилы не случайно выходят на поверхность слизистых оболочек (Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001). Особый интерес представляют механизмы защиты слизистых оболочек репродуктивного тракта женщин, поскольку, в силу особенностей строения женских половых органов, между, обильно обсемененным микрофлорой, нижним отделом и стерильной полостью матки располагается лишь слизистая пробка цервикального канала, которая и сдерживает натиск огромной армии возбудителей (Бодяжина, В.И., 1980; Грищенко В.И., Дахно Ф.В, 1981; Долгушина В.Ф., 1991; Теплякова М.В., Радионченко А.А., 1991; Телешева Л.Ф., 2000; Bartlett J.G., Polk B.F., 1984).

Можно предположить, что, мигрируя на поверхность эпителия и разрушаясь, нейтрофилы выделяют антимикробные продукты своих гранул и образуют внеклеточные ловушки, которые, обладая бактерицидностью, влияют на микрофлору, заселяющую слизистые оболочки, повышая биоцидность секретов, а также, вступая в контакты с микрофлорой слизистых оболочек могут оказывать регулирующее действие на формирование микробиоценозов. Данное предположение и определило цель нашей работы.

Цель работы

Определить роль нейтрофилов и их секреторных продуктов в формировании колонизационной резистентности слизистых оболочек нижнего отдела репродуктивного тракта женщин.

Задачи исследования

1. Исследовать состояние лейкоцитарного звена цервикапьного и вагинального секретов здоровых женщин в разные фазы менструального цикла.

2. Изучить состав растворимых антимикробных факторов цервикального и вагинального секретов здоровых женщин в разные фазы менструального цикла.

3. Определить in vitro влияние S.aureus (штамм 209), E.coli (штамм М-17), Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. и бактериального комплекса на жизнеспособность, функциональный статус, антимикробную активность и цитокинпродуцирующую функцию нейтрофилов.

4. Разработать способ экспресс-обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек.

5. Изучить in vitro образование внеклеточных ловушек нейтрофилами периферической крови после взаимодействия с Е. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. или бактериальной смесью и оценить их эффективность.

6. Сравнить бактерицидный эффект секреторных продуктов интактных и активированных взвесью S.aureus (штамм 209), E.coli (штамм М-17), Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. нейтрофилов.

7. Установить in vitro влияние нейтрофилов и их секреторных продуктов на состав микрофлоры нижнего отдела генитального тракта и адгезивную активность грибов рода Кандида на поверхности вагинального эпителия здоровых женщин и женщин с бактериальным вагинозом.

Научная новизна

В работе дана комплексная оценка состояния факторов врожденного иммунитета слизистых оболочек нижнего отдела генитального тракта здоровых женщин в разные фазы менструального цикла, впервые проведена сравнительная оценка состава растворимых антимикробных факторов, в том числе и катионных пептидов цервикального и вагинального секретов. Показано, что в цервикальном секрете здоровых женщин содержится значительно большая концентрация антимикробных факторов (оксид азота, лактоферрин, дефенсины, БПИ, миелопероксидаза), чем в вагинальном.

Впервые определено влияние S.aureus (штамм 209), E.coli (штамм М-17), Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp. и бактериального комплекса на жизнеспособность, функциональный статус, антимикробную активность и цитокинпродуцирующую функцию нейтрофилов периферической крови здоровых женщин. Показано, что представители нормофлоры (лакто- и бифидобактерии) обладают выраженным апоптогенным действием, в меньшей степени стимулируют внутриклеточные киллинговые системы, не провоцируют выброс провоспалительных цитокинов (ИЛ-1 а, ИЛ - 1 р, ИЛ

8, ФНО-а, РАИЛ-1 и ИЛ-6), при этом усиливают секрецию бактерицидных белков (БПИ и лактоферрина).

Разработан способ экспресс-обнаружения нейтрофильных ловушек (Долгушин И.И., Андреева Ю.С. Приоритетная справка от 01.04.2008г. Заявка на изобретение № 2008112636/20 (013666)) и способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах

Долгушин И.И., Андреева Ю.С., Савочкина АЛО. Приоритетная справка от 26.01.2009г. Заявка на изобретение № 2009102579).

Впервые показано образование внеклеточных ловушек нейтрофилами периферической крови после взаимодействия с Е. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. или бактериальной смесью и оценена их эффективность.

Проведен сравнительный анализ бактерицидности секреторных продуктов интактных и активированных нейтрофилов на Е. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp.

Изучено действие супернатантов интактных и активированных нейтрофилов на состав микробиоценоза и адгезию грибов рода Candida на поверхности вагинального эпителия здоровых женщин и женщин с бактериальным вагинозом. Впервые показано, что секреторные продукты нейтрофилов периферической крови обладают селективной бактерицидностью: они снижают содержание условно-патогенных бактерий и не влияют на представителей лактофлоры, кроме того, супернатанты нейтрофилов здоровых женщин снижают адгезию грибов рода Кандида на поверхности вагинальных эпителиоцитов, а у женщин с бактериальным вагинозом продукты секреции нейтрофилов не обладают антиадгезивной активностью.

Впервые определено, что на поверхности слизистых оболочек нейтрофилы реализуют свой антимикробный потенциал в большей степени за счет внеклеточной секреции компонентов клетки в окружающую среду. Определение разностороннего действия супернатантов нейтрофильных гранулоцитов обозначило основную роль секреторных продуктов нейтрофилов в формировании колонизационной резистентности слизистых оболочек гениталий женщины.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты исследований позволяют расширить представление о роли нейтрофилов в защите слизистых оболочек.

Полученные данные о содержании антимикробных продуктов и цитокинов в супернатантах неактивированных и активированных нейтрофилов периферической крови, а так же продукция нейтрофильных внеклеточных ловушек имеют существенное значение в понимании проблемы регулирующего влияния нейтрофильных гранулоцитов в формировании микробиоценозов слизистых оболочек. Нарушение функционирования нейтрофильного звена на поверхности слизистых оболочек может рассматриваться как один из факторов формирования патологических микробных сообществ и провокации развития дисбактериозов.

Разработка экспресс-метода обнаружения нейтрофильных ловушек открывает возможность оценки антимикробной функции нейтрофилов даже после их гибели, а сам факт наличия внеклеточных нейтрофильных сетей является новым направлением в изучении физиологии гранулоцита.

Селективная бактерицидность и антиадгезивная активность супернатантов нейтрофилов открывают перспективу практического применения секреторных продуктов, а результаты исследований могут стать теоретическим обоснованием для проведения клинических испытаний локального использования продуктов секреции нейтрофилов с целью коррекции дисбиотических процессов нижних отделов генитального тракта женщин, повышения качества лечения больных с бактериальным вагинозом, что в конечном итоге, позволит снизить заболеваемость у женщин, частоту осложнений беременности и родов, а также перинатальную заболеваемость, смертность и будет способствовать улучшению репродуктивного здоровья и рождению здорового потомства.

Внедрение полученных результатов

Результаты диссертационной" работы используются в процессе преподавания на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии, а также в практической деятельности лаборатории противоинфекционного иммунитета НИИ иммунологии ГОУ ВПО Челябинской государственной медицинской академии и проблемной лаборатории экспериментальной и экологической физиологии системы крови, иммунитета и цигогенетики Южно-Уральского научного центра РАМН.

Положения, выносимые на защиту

1. В цервикальном и вагинальном секретах содержится значительное количество лейкоцитов, среди которых доминирующими являются нейтрофилы, около 50% из них - это погибшие клетки, а остальные жизнеспособные и функционально активные.

2. Контакт нейтрофилов с микроорганизмами приводит к гибели гранулоцитов, при этом лактобактерии и бифидобактерии индуцируют апоптотическую гибель нейтрофилов.

3. Инкубация нейтрофилов in vitro со взвесью бактерий (Е. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp.) сопровождается секрецией гранулоцитами антимикробных продуктов разного состава: резидентные для слизистых микроорганизмы (лактобактерии и бифидобактерии) в сравнении с факультативными (Е. coli и S. aureus) в большей степени стимулируют выброс антимикробных продуктов, обладающих селективной бактерицидностью по отношению к условно-патогенным микроорганизмам.

4. Продукты нейтрофилов изменяют состав микробиоценозов слизистых оболочек нижнего отдела генитального тракта женщин: они подавляют рост условно-патогенной флоры (гарднерелл, стафилококков, кишечной палочки, протея, дрожжеподобных грибов), препятствуют адгезии грибов рода Кандида на поверхности вагинального эпителия и существенно не влияют на содержание лактобактерий. 5. Нейтрофилы могут участвовать в регуляции микробиоценозов и в формировании колонизационной устойчивости слизистых оболочек репродуктивного тракта женщин.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 265 страницах текста, иллюстрирована 50 таблицами, 33 рисунками, 4 фотографиями. Состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, семи глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 303 источников, в том числе 179 отечественных и 124 зарубежных.

Публикации

По теме диссертации опубликована 51 научная работа. Издана монография «Нейтрофильные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов».

Апробация работы

Основные положения работы доложены и обсуждены на IV, V конференции иммунологов Урала (Уфа, 2005; Оренбург, 2006); IX - XI всероссийском форуме с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург 2005, 2006, 2007); республиканской научной конференции "Иммунология репродукции" (Иваново, 2005); российской научно-практической конференции "Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия" (Курск, 2006); 1 и 2 международном российско-чешском форуме (Челябинск, 2006, 2008); IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); VIII конгрессе "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии" (Москва, 2007); на национальной конференции "Аллергология и клиническая иммунология' - междисциплинарные проблемы" (Москва, 2008); на объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008, 2009); на конференции, посвященной 10-летию Южно-Уральского научного центра РАМН (Челябинск, 2008), на VI Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009), на X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Казань, 2009).

Работа была поддержана грантами Правительства Челябинской области в 2007 и 2008 гг.

выводы

1. В цервикальном и вагинальном секретах содержится значительное количество лейкоцитов. Доминирующими среди них являются нежизнеспособные нейтрофилы, окрашивающиеся трипановым синим или подвергшиеся апоптозу. Жизнеспособные нейтрофилы секретов способны к фагоцитозу, обладают лизосомальным аппаратом и кислородзависимыми эффекторными системами, более выраженными у нейтрофилов цервикальной слизи.

2. В слизи шейки матки и влагалища присутствуют растворимые антимикробные факторы: лизоцим, дефенсины, бактерицидный/индуцирующий протеин, лактоферрин, миелопероксидаза нитраты и нитриты, уровень которых остается стабильным или незначительно снижается во вторую фазу менструального цикла, при этом в цервикальном секрете содержание микробоцидных субстанций значительно превосходит показатели влагалищного отделяемого.

3. Нейтрофилы периферической крови здоровых женщин in vitro активно фагоцитируют частицы латекса, Staphylococcus aureus (штамм 209), Escherichia coli (штамм М-17), Lactobacterium spp, при этом обладают меньшей фагоцитарной активностью по отношению к бифидобактериям. Контакт гранулоцитов со Staphylococcus aureus, Escherichia coli или смесью бактерий сопровождается повышением кислородзависимого метаболизма и активности лизосом, лакто- и бифидобактерии не изменяют функциональный статус гранулоцитов.

4. Взаимодействие in vitro нейтрофилов периферической крови со взвесью культур микроорганизмов Staphylococcus aureus (штамм 209), Escherichia coli (штамм М-17), Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp. приводит к гибели значительного числа гранулоцитов, при этом Lactobacterium и Bifidobacterium обладают выраженным апоптогенным действием.

5. Культивирование интактных нейтрофилов in vitro сопровождается выделением наружу растворимых антимикробных факторов (лизоцима, оксида азота, лактоферрина, миелопероксидазы, дефенсинов и бактерицидного/индуцирующего протеина) и провоспалительных цитокинов (интерлейкин-1 а, интерлейкин -1р, рецепторный антагонист интерлейкина 1, интерлейкин -6, интерлейкин -8, фактор некроза опухоли а), придающих культуральной жидкости способность подавлять рост эталонных штаммов кишечной, палочки, золотистого стафилококка, лактобактерий и бифидобактерий.

6. Индукция нейтрофилов in vitro различными агентами приводит к секреции биологически активных продуктов неодинакового состава: при действии частиц латекса в среде культивирования повышаются преимущественно уровни лизоцима, лактоферрина, рецепторного антагониста интерлейкина 1 и фактора некроза опухоли а. После активации нейтрофилов кишечной палочкой повышается уровень рецепторного антагониста интерлейкина 1, при действии Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp. - уровень бактерицидного/индуцирующего протеина и лактоферрина. Максимальная концентрация этих продуктов наблюдается после активации бифидобактериями. Если в качестве индуктора секреции применяется взвесь стафилококка, кишечной палочки или бифидобактерий, то секреторные продукты нейтрофилов теряют бактерицидность по отношению к этим же штаммам бактерий. Повторный контакт нейтрофилов с лактобактериями приводит к усилению антимикробной активности.

7. Индукция нейтрофилов периферической крови in vitro взвесью монокультур Staphylococcus aureus (штамм 209), Escherichia coli (штамм-М-17), Lactobacterium spp. и Bifidobacterium spp., приводит к образованию гранулоцитами внеклеточных ловушек, состоящих из нитей дезоксирибонуклеиновой кислоты и бактерицидных гранул. Бифидобактерии наиболее активно стимулируют образование таких сетей. Эффективность улавливания бактерий в нейтрофильных ловушках значительно превосходит поглощение аналогичных микроорганизмов нейтрофилами при фагоцитозе. Экспресс-метод обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек с помощью окраски акридиновым оранжевым позволяет дать качественную и количественную оценку этому явлению.

8. Нейтрофилы и их секреторные продукты участвуют в регуляции измененного микробиоценоза влагалища при бактериальном вагинозе, поскольку обладают селективной бактерицидностью: они подавляют рост условно-патогенных микроорганизмов и не влияют на лактофлору, при этом не оказывают существенного влияния на микробиоценоз нижних отделов генитального тракта здоровых женщин.

9. Секреторные продукты нейтрофилов периферической крови здоровых женщин снижают адгезию грибов рода Кандида на поверхности вагинальных эпителиоцитов, при бактериальном вагинозе супернатанты нейтрофилов периферической крови не обладают антиадгезивной активностью.

10. Нейтрофилы слизистых оболочек шейки матки и влагалища могут участвовать в формировании колонизационной резистентности эпителия нижних отделов генитального тракта за счет выраженного антимикробного потенциала и селективного действия бактерицидных продуктов на представителей непатогенной и условно-патогенной флоры, участия в процессах адгезии микроорганизмов на поверхности эпителиоцитов и образования нейтрофильных внеклеточных ловушек.