Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Биохимические механизмы коррекции острого воспаления липидами печени трески

На правах рукописи

Крышень Кирилл Леонидович

БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ КОРРЕКЦИИ ОСТРОГО ВОСПАЛЕНИЯ ЛИПИДАМИ ПЕЧЕНИ ТРЕСКИ

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология 03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

■ $ т

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2014

005545575

005545575

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И.Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Научный руководитель:

Доктор медицинских наук Макарова Марина Николаевна

Доктор химических наук, профессор Дадали Владимир Абдулович

Официальные оппоненты:

Лесиовская Елена Евгеньевна, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт токсикологии Федерального медико-биологического агентства», ведущий научный сотрудник.

Кириллова Надежда Васильевна, доктор биологических наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая кафедрой биохимии.

Ведущая организация: Федеральное государственное казённое военное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С. М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации.

Защита состоится « 2? » 2014 г. в ¿]_ часов на заседании диссертационного

совета Д 001.022.03 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук (197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, д. 12) по адресу: 197376, Санкт-Петербург, Каменностровский пр., д. 69/71. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук. Автореферат разослан « /Г » уС^ЯУЛб. 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета:

Доктор биологических наук ^ 'Хныченко Людмила Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Долгое время считалось, что воспаление вызывает и усугубляет наиболее распространенные заболевания, включая сердечно-сосудистые, астму, воспалительные заболевания кишечника, нейродегенеративные патологии, ревматоидный артрит, болезни легких, пародоптит, диабет и рак. Тем не менее острое воспаление является физиологически необходимым для защиты хозяина от микробной инфекции и повреждения тканей. Оно характеризуется активацией иммунных клеток, изменением в сосудистой проницаемости и синтезе провоспалительных медиаторов, в том числе цитокинов, хемокинов, липидных посредников, стероидов и факторов роста (Kulinsky, V.I., Biochemical Aspects of Inflammation / Kulinsky, V.I. // Biochemistry (Moscow). - 2007. - Vol.72(6). - P.595-607).

Несмотря на свою важную функцию в защите организма острое воспаление не должно быть продлено, чтобы избежать хронического и системного, которое вовлечено в патогенезе широкого спектра заболеваний.

Успешное завершение воспалительного ответа на ранней стадии сопровождается возвращением к нормальному состоянию, и процесс известен как разрешение (резолюция) воспаления.

Клеточные и молекулярные механизмы развития острого воспаления достаточно хорошо изучены. Гораздо меньше известно о механизмах, лежащих в основе разрешения. Накопленные данные свидетельствуют о том, что разрешение острого воспаления является крайне скоординированным процессом, который жестко регулируется несколькими эндогенными противовоспалительными посредниками, включая липидные медиаторы. Так, в последние годы огромное внимание уделяется новому классу липидных медиаторов, участвующих в завершении воспалительного процесса. К ним относятся липоксины, резолвины и протектины, которые являются продуктом метаболизма <о-3 полиненасыщенных жирных кислот (Serhan, С. Resolution phase of inflammation: novel endogenous anti-inflammatory and proresolving lipid mediators and pathways / Serhan, C. // Annu. Rev. Immunol. - 2007. - Vol.25. - P.101-137).

Таким образом, понимание роли липидов в завершении воспалительной реакции требует глубокого рассмотрения биохимических механизмов воспаления и предоставляет перспективные терапевтические стратегии для профилактики и лечения воспалительных заболеваний.

Степень разработанности темы исследования

Полная элиминация острого воспалительного процесса является идеальным результатом для сохранения ткани от чрезмерного повреждения и развития хронического воспаления. Переход от инициации воспаления к его разрешению происходит как на клеточном (например, инфильтрация нейтрофилов, их апоптоз и последующее уничтожение макрофагами), так и на молекулярном уровнях (переключение синтеза провоспалительных медиаторов на противовоспалительные) (Serhan, С. Resolution of inflammation: the beginning programs the end / Serhan, C., Savill, J. //Nat. Immunol. -2005,-Vol.6. -P.l 191-1197).

Начало воспаления определяется в основном липидными медиаторами, получаемых из со-6 полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) ферментами циклооксигеназой-2 (ЦОГ-2) и 5-липооксигеназой (5-ЛОГ). Разрешение же воспалительного процесса преимущественно регулируется липидными медиаторами, получаемых из со-З ПНЖК (Schmitz, G. The opposing effects of n-3 and n-6 fatty acids / Schmitz, G., Ecker, J. // Prog.

Lipid. Res. - 2008. - Vol.47. - P.147-155). Известно, что при низких наномолярных концентрациях резолвин El подавляет воспаление, блокируя трансэндотелиальную миграцию нейтрофилов, провоспалительные сигнальные каскады (например, NF-kB активацию) и высвобождение провоспалительных цитокинов, включая TNFa, IL-1 и IL-6 (Martin, S. Mechanisms of chemical-induced innate immunity in allergic contact dermatitis / Martin, S., Esser, P. Weber, F., Jakob, T., Freudenberg, M., Schmidt, M., Goebeler, M. // Allergy.-2011.-P. 1-12).

Провоспалительные медиаторы образуются в течение нескольких секунд и минут начала процесса острого воспаления, в то время как в более позднее время (от часов до дней) постепенно растет количество противовоспалительных посредников и медиаторов процесса разрешения. Тонкое изменение липидных посредников из провоспалительных эйкозаноидов в противовоспалительные медиаторы имеет решающее значение для завершения воспалительного процесса (Holgate, S. Roles of cysteinyl leukotrienes in airway inflammation, smooth muscle function, and remodeling / Holgate, S., Peters-Golden, M., Panettieri, R., Henderson, W. // J. Allergy Clin. Immunol. - 2003. - Vol.lll(l). - P.18-34). Таким образом, важнейшим механизмом завершения острого воспаления является коррекция синтеза медиаторов каскада арахидоновой кислоты.

На модели адьювантного артрита у крыс были обнаружены

противовоспалительные эффекты липидного комплекса, выделенного по оригинальной технологии из печени трески (Рыбакова, A.B. Изучение противовоспалительной активности нового ветеринарного препарата афлогилекс на модели экспериментального адъювантного артрита / Рыбакова, A.B., Крышень, К.Л., Соколов, В.Д. // Международный вестник ветеринарии. 2012. №1. С. 39^13). Липидный комплекс представляет собой уникальную композицию липофильных соединений (Шиков, А.Н. Новые технологии переработки гидробионтов / Шиков, А.Н., Пожарицкая, О.Н., Уракова, И.Н., Рыбакова, A.B., Крышень, К.Л. Макаров, В.Г. // Фармацевтические и медицинские биотехнологии. Биотехнология: состояние и перспективы развития. Москва, Россия. 2012. С. 385). В липидном комплексе (ЛК) обнаружено высокое содержание остатков ю-3 ПНЖК, в том числе эйкозапентаеновой кислоты в составе фосфолипидов.

Наличие эйкозопентаеновой кислоты дает основание предположить конкурентное субстратное взаимодействие с ферментами ЦОГ-2 и 5-ЛОГ и, таким образом, снижение синтеза простагландинов и лейкотриенов и активацию синтеза противовоспалительных медиаторов.

В основе противовоспалительного эффекта Ж могут лежать и другие молекулярные механизмы, в том числе активация То11-подобных рецепторов, ингибирование фосфорилирования внутриклеточных сигнальных белков МАРК р38, ERK1/2, выброс гистамина тучными клетками.

Цель исследования

Целью настоящего исследования было установление механизма действия липидов печени трески при остром воспалении в экспериментах in vivo, in vitro и на изолированных тканях и клеточных линиях.

Задачи исследования

1. Установить влияние липидов печени трески на активность 5-липооксигеназы и циклооксигеназы-2;

2. Установить влияние липидов печени трески на высвобождение гистамина базофилами крысы линии RBL-I;

3. Выявить взаимодействие липидного комплекса с Н1-гистаминовыми рецепторами на модели изолированной подвздошной кишки морской свинки;

4. Изучить действие липидного комплекса на модели острого воспаления "каррагениновый воздушный мешочек" у крыс;

5. Исследовать действие липидного комплекса на модели контактного дерматита у мышей;

6. Определить влияние липидного комплекса на индуцированное фосфорилирование митоген-активированных протеинкиназ р38 и ERK1/2 на клеточной линии моноцитов человека U937;

7. Выявить взаимодействие липидного комплекса с То11-подобными рецепторами.

Научная новизна исследования

Впервые рассмотрены биохимические механизмы процесса разрешения острого воспаления в условиях поступления в организм липидов, выделенных из печени тресковых. Оценено взаимодействие липидного комплекса с ферментами циклооксигеназой-2 и 5-липооксигеназой в условиях in vitro, с Н1-гистаминовыми рецепторами на изолированной подвздошной кишке морской свинки. Кроме того на клеточной линии RBL-I установлено мембрано-стабилизирующее действие, препятствующее выбросу гистамина. Изучено взаимодействие с То11-подобными рецепторами и влияние на индуцированное фосфорилирование внутриклеточных МАР-киназ р38 и ERK1/2. На моделях "каррагениновый воздушный мешочек" у крыс и контактном дерматите у мышей подтверждено участие липидных компонентов тресковых в процессе разрешения воспалительного процесса.

Научно-практическая значимость

Результаты исследований были включены в регистрационное досье ветеринарных препаратов Афлогилекс-раствор для инъекций 0,1% Рег.№ПВР-3-3.0/02688 от 30.01.2012 и Афлогилекс-гель 0,02% Рег.№ПВР-3-3.0/02688 от 30.01.2012. Материалы диссертационного исследования были внедрены в учебный процесс кафедры биологической и общей химии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И.Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Методология и методы исследования

Методология исследования включала оценку биохимических механизмов коррекции острого воспаления липидами печени трески «in vivo», «in vitro» и на изолированных тканях и клеточных линиях.

Эксперименты «in vivo» включали исследования противовоспалительного действия JIK на моделях "каррагениновый воздушный мешочек" у крыс и контактный дерматит у мышей.

Молекулярные механизмы действия JIK изучали в условиях in vitro с использованием тест-систем для оценки взаимодействия с ЦОГ-2 и 5-ЛОГ. Для анализа влияния ЛК на липополисахарид-индуцированное фосфорилирование МАР-киназ использовали клеточную линию моноцитов человека U937 с последующим разделением белков клеточного лизата методом гель-электрофореза и определения фосфорилированных

форм белков р38 и ERK1/2 методом Вестерн-блот. Для оценки влияния JIK на дегрануляцию тучных клеток использовали клетки базофилов крысы линии RBL-I с последующим анализом индуцированного выброса гистамина методом иммуно-ферментного анализа. Для регистрации взаимодействия с Н1-гистаминовыми рецепторами использовали модель индуцированного гистамином сокращения подвздошной кишки морской свинки.

Положения, выносимые на защиту

1. Установлено, что липидный комплекс снижает образование продуктов превращения арахидоновой и линолевой кислот под действием ЦОГ-2 и 5-ЛОГ соответственно;

2. Выявлено, что липиды печени трески ингибируют дегрануляцию тучных клеток, снижая выброс гистамина;

3. На изолированной подвздошной кишке морской свинки установлено, что липидный комплекс снижает гистамин-индуцированное сокращение подвздошной кишки морской свинки посредством блокады Н1-гистаминовых рецепторов;

4. На моделях воспаления "каррагениновый воздушный мешочек" у крыс и контактном дерматите у мышей показано, что липидный комплекс приводит к снижению воспалительного процесса в тканях, инфильтрации лейкоцитов и снижению синтеза простагландина F2a-

Степень достоверности и апробация материалов исследования

Степень достоверности определяется достаточным для статистической обработки данных количеством экспериментальных животных 112 крыс и 70 мышей в экспериментах in vivo, постановкой нескольких параллелей в экспериментах на изолированных тканях, клеточных линиях и in vitro.

Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на II всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», IV съезде фармакологов России, XVI международном съезде «Phytopharm 2012», во П Всероссийской конференции с международным участием «Профилактическая медицина 2012», 61-ом международном конгрессе «Society for Medicinal Plant and Natural Product Research 2013».

Апробация диссертации прошла на заседании проблемной комиссии №5 от 19 сентября 2013 года государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Северо-Западного государственного медицинского университета имени И.И.Мечникова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Личное участие автора в выполнении исследования

Исследования были выполнены на базе кафедры биологической и общей химии СЗГМУ им. И.И. Мечникова. Автор лично осуществлял планирование экспериментов и их непосредственное выполнение, статистическую обработку полученных результатов, обсуждение, написание статей, тезисов и докладов, диссертации и автореферата.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения результатов и выводов, заключения и практических рекомендаций, списка литературы и двух приложений. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, иллюстрирована 46 рисунками и 16

таблицами. Библиографический указатель содержит 210 наименований, из них 8 на русском языке и 203 - на иностранных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1 представляет собой обзор литературы, посвященный молекулярным механизмам инициации, развития и разрешения острого воспалительного процесса. Особое внимание уделено современным аспектам участия липидных медиаторов в разрешении воспаления.

В Главе 2 отражены основные методы и экспериментальные модели исследования, которые были использованы при выполнении диссертационной работы.

Глава 3 объединяет результаты собственных исследований.

В Главе 4 представлено обсуждение полученных результатов и выводы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования

В качестве объекта исследования использовали липидный комплекс, полученный из печени трески по оригинальной технологии в соответствии с патентом РФ 2420213 [приоритет от 16.11.2009]. В качестве объекта переработки использовали свежемороженную печень трески (Gadus morrhua L).

Методом ВЭЖХ-ELSD установлено, что исследуемая субстанция содержит фосфолипиды, эфиры холестерина, холестерин, моноглицериды и другие вещества, при этом основным фосфолипидом является фосфатидилхолин, содержание которого составляет не менее 40 мг/г. Жирнокислотный состав представлен миристиновой, пальмитолеиновой, пальмитиновой, стеариновой, гондоиновой (11-эйкозеновой), линолевой кислотами, олеиновой и 11-цис/транс-октадекановой (цис/транс-вакценовой) кислотами. Сделано заключение, что фосфатидилхолин содержит остатки пальмитиновой (23,0%), эйкозапентаеновой (14,5%) и олеиновой кислоты (11,9%); в фосфатидилэтаноламине основными кислотами являются эйкозапентаеновая (14,0%), олеиновая (12,8%) и пальмитиновая (10,2%) кислоты, в фосфатидилинозитоле -стеариновая (17,8%), олеиновая (15,7%), эйкозапентаеновая (10,9%) и пальмитиновая кислоты (10,8%).

Анализ влияния липидного комплекса на энзиматическую активность 5-липооксигеназы

Исследование влияния ЛК на энзиматическую активность 5-ЛОГ проводили в конечных концентрациях 50; 25; 12,5; 6,75; 3,375 и 1,69 мкг/мл с использованием набора Lipoxygenase Inhibitor Screening Assay Kit (Cayman Chemical, США), включающим очищенный фермент 5-ЛОГ и субстрат линолевую кислоту. В качестве позитивного контроля использовали неселективный ингибитор 5-ЛОГ — NDGA (Nordihydroguaiaretic acid, Cayman Chemicals, США) в конечной концентрации 15 мкМ. В качестве отрицательного контроля использовали растворитель 5% диметилсульфоксид (ДМСО).

С помощью тест-системы оценивали количество гидропероксидов, продуцируемых в реакции липоксигенации. Образцы исследовали в четырех повторностях. Реакцию проводили при комнатной температуре на орбитальном шейкере. Время инкубации неселективного ингибитора NDGA/ЛК с 5-ЛОГ и линолевой кислотой составляло 10 минут. Энзиматический катализ останавливали внесением хромогена. Через 5 минут инкубации проводили измерение оптической плотности при длине волны 490 нм на планшетном спектрофотометре xMark (BioRad, США). После регистрации оптической плотности вычисляли % снижения продукта энзиматической реакции от контроля.

Анализ влияния липидного комплекса на энзиматическую активность циклооксигеназы-2

Исследование влияния Ж на энзиматическую активность ЦОГ-2 проводили с использованием набора СОХ inhibitor Screening assay kit (Cayman Chemicals, США) в соответствии с инструкцией производителя. Тест-система включает очищенный фермент ЦОГ-2 и арахидоновую кислоту в качестве субстрата. ЛК изучали в концентрациях 25, 20, 15, 10 и 1 мкг/мл. В качестве позитивного контроля использовали селективный ингибитор ЦОГ-2 нифлумовую кислоту (Cayman Chemicals, США) в концентрации 0,1 мкМ. В качестве отрицательного контроля использовали растворитель 5% ДМСО.

В ходе энзиматической реакции ЦОГ-2 и арахидоновой кислоты формируется нестабильный продукт PGH2, который подвергали редукции хлоридом олова (SnCl2) для образования стабильного простагландина F2ct (PGF2a). С помощью иммуноферментного анализа (ИФА) определяли количество PGF2a (Cayman Chemicals, США). После проведения цветной ферментативной реакции измеряли оптическую плотность образцов при длине волны 405 нм на планшетном спектрофотометре xMark (BioRad, США). После снятия оптической плотности вычисляли % снижения продукта энзиматической реакции от контроля.

Определение влияния липидного комплекса на индуцированную продукцию

гистамина

Определение влияния JIK на индуцированную продукцию гистамина проводили с использованием культуры клеток RBL-I базофильной лейкемии крысы. JIK изучали в концентрациях 1, 2, 4, 16 мкг/мл. В качестве позитивного контроля использовали субстанцию кетотифена в конечной концентрации 16 мкг/мл. Экспозиция клеток с субстанциями длилась 15 минут при 37°С и 5%С02. Далее в культуру вносили индуктор дегрануляции Compound 48/80 (Sigma-Aldrich, США) в конечной концентрации 100 мкг/мл и выдерживали в тех же условиях в течение 60 минут. После инкубации 50 мкл культуральной среды переносили в стерильные пробирки и проводили ацилирование образцов. В ацилированных образцах определяли концентрацию гистамина методом ИФА. Ацилирование и ИФА осуществляли с использованием реагентов в составе набора Histamine ELISA kit (IBL International, Германия).

Анализ влияния липидного комплекса на индуцированное фосфорилирование митоген-активированных протеинкиназ (МАР-киназ)

Для изучения ЛПС-индуцированного фосфорилирования МАР-киназ р38 и ERK1/2 использовали суспензионную клеточную линию моноцитов человека U937.

Фосфорилирование МАР-киназ оценивали методом иммуноблоттинга по количеству фосфорилированных форм белков после инкубации клеток с ЛК в концентрации 10 мкг/мл в течение 16 часов и обработкой липополисахаридом (ЛПС Escherichia coli серотипа 0111:В4, Sigma-Aldrich, USA) в концентрации 1 мкг/мл в течение 60 минут.

Для специфического выявления белков на иммуноблоте использовали поликлональные кроличьи антитела против фосфорилированных по триптофану и тирозину (Thr202/Tyr204) ERK1/2 и (Thrl80/Tyrl82) р38 (Cell Signaling Technology, США). В качестве вторичных антител применяли козьи антитела, выработанные против иммуноглобулинов кролика и конъюгированные с пероксидазой хрена (GAR-HRP, Cell Signaling Technology, США). Электрофоретическое разделение белков проводили методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии лаурилсульфат натрия

(SDS). Разделённые в полиакрнламидном геле белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (BioRad, США) в камере для "мокрого" переноса (BioRad, США) в соответствии с инструкциями производителя.

Изучение взаимодействия липидного комплекса с ТоИ-подобными рецепторами

В качестве тест-системы для оценки взаимодействия с парами рецепторов TLR1/2, 2/2, 2/6 были выбраны адгезионные клеточные линии HEK-Blue-hTLR2 (InvivoGen, США), полученные производителем трасфекцией плазмиды, кодирующей рецептор hTLR2. В качестве тест-системы для оценки взаимодействия с hTLR4 и hTLR5 были выбраны адгезионные клеточные линии HEK-Blue-hTLR4 и HEK-Blue-hTLR5 (InvivoGen, США).

Липидный комплекс тестировали в концентрациях 100, 10, 1 и 0,1 мкг/мл. В качестве растворителя использовали 5% ДМСО.

Стимуляцию рецепторов проводили специфическими агонистами TLR1/2 -Pamp3CSK 1 нг/мл, TLR2/2 - HKLM 108 клеток/мл, TLR2/6 - FSL1 1 нг/мл, TLR5 -Flagellin 1 нг/мл, TLR4 - ЛПС 10 нг/мл. Для нейтрализации рецепторов и определения специфичности стимуляции использовали соответствующие поликлональные антитела (Ab) Anti-hTLR-Ab (InvivoGen, США). Стимуляция рецептора агонистом приводит к активации транскрипционных факторов NF-кВ и API и последующей выработке фермигга щелочной фосфатазы. Уровень стимуляции рецепторов детектировали по ферментативной цветной реакции после добавления субстрата. Измеряли оптическую плотность на длине волны 630 нм с помощью планшетного спектрофотометра xMark (BioRad, США).

Определение взаимодействия липидного комплекса с Н1-гистаминовыми

рецепторами

Оценку взаимодействия ЛК с Н1-гистаминовыми рецепторами проводили на выделенных фрагментах подвздошной кишки морской свинки. У морских свинок извлекали подвздошную кишку и помещали в емкость с раствором Кребса-Хенселейта. Фрагменты кишки длинной около 1 см закрепляли металлическими крючками в проточных камерах установки для изолированных тканей (ООО «Кардиопротект», Россия). За 100% сокращения принимали сокращение, индуцированное 80 шМ раствором KCl. Проточные камеры заполняли водным раствором гистамина (10 М). В течение 10 минут осуществляли регистрацию силы сокращения. Далее добавляли ЛК в концентрациях 10, 20, 100 и 1000 мкг/мл. В качестве позитивного контроля использовали блокатор Н1-гистаминовых рецепторов кетотифен в концентрации 5 нг/мл. Во время всего опыта регистрировали кривую изометрической силы сокращения, учитывали амплитуду сокращения и время наступления максимального сокращения, используя программное обеспечение «PhysExp» (ООО «Кардиопротект», Россия).

Оценка противовоспалительного действия липидного комплекса на модели острого воспаления «каррагениновый воздушный мешочек у крыс»

Крысы-самцы породы Wistar были получены из питомника лабораторных животных "Рапполово". Масса животных к началу исследования составляла 220-250г. За шесть дней до начала введения тестируемых объектов крыс помещали в С02 камеру до достижения анестезии на 30 секунд. Стерильным шприцом вводили 20 мл воздуха подкожно во внутрикапсульную область спины крысы. На 6 день под С02 анестезией вызывали воспаление, вводя 5 мл 0,5% раствора Х-каррагенина (X-Carrageenan, Sigma-Aldrich, США) непосредственно в мешочек.

JIK тестировали в трех различных дозах 4 мг/кг, 0,4 мг/мл и 0,04 мг/кг. Растворителем служил 5% ДМСО. JIK в каждой дозе вводили внутрь мешочка. В качестве препарата сравнения использовали диклофенак (раствор для инъекций 25 мг/мл, Hemopharm, Сербия) и вводили внутрь мешочка сразу после инъекции раствора каррагенина в дозе 2 мг/кг.

Спустя 6 часов после инъекции животное подвергали эвтаназии ингаляцией С02. Экссудат забирали через 6 часов после индукции воспаления. Анализировали клеточный состав экссудата при помощи ветеринарного гематологического анализатора Abacus Unior Vet (Diatron, Австрия). Анализ PGF2a проводился с помощью набора для количественного определения простагландина F2a методом ИФА Prostaglandin F2a EIA kit (Cayman Chemicals, США).

Оценка противовоспалительного действия липидного комплекса на модели

контактного дерматита у мышей Беспородные мыши-самцы были получены из питомника лабораторных животных "Рапполово". Всего в эксперименте было сформировано 7 групп по 10 животных в каждой. В качестве индуктора контактного дерматита использовали 1-хлор-2,4-динитробензол (ДНХБ, Sigma-Aldrich, США) в виде 2% раствора в 95% этаноле. На 1, 8 и 14 день эксперимента животным на предварительно выбритые участки спины наносили 100 мкл 2% раствора ДНХБ с целью сенсибилизации организма. На 18 день на правое «опытное» ухо животным наносили 20 мкл 2% спиртового раствора ДНХБ дважды с интервалом 1 час.

JIK вводили внутримышечно в дозах 2, 4 и 8 мг/кг. В качестве препарата сравнения использовали Супрастин (20 мг/мл хлоропирамина гидрохлорид, Egis Pharmaceuticals, Венгрия). Супрастин вводили внутримышечно в дозе 22 мг/кг, эквивалентной терапевтической дозе для человека. В качестве плацебо вводили 5% ДМСО. Тестируемые объекты вводили по лечебной схеме, начиная с 8 по 20 день эксперимента внутримышечно один раз в сутки.

На 21 сутки эксперимента животных эвтаназировали в С02 - камере. "Опытное" и "контрольное" ухо забирали для гистологической оценки поражения и степени отека.

Для оценки степени отека после эвтаназии определяли массу «опытного» и «контрольного» уха. Вычисляли индекс реакции (ИР), выраженный в процентах разницы в массах «опытного» и «контрольного» уха. Оценку концентрации IgE в сыворотке крови мышей проводили с использованием ИФА тест-системы (Kamiya Biomedical Company, США). Гистологическая оценка включала в себя анализ степени воспалительных изменений в коже уха по 5 признакам: лейкоцитарно-плазмоцитарная реакция; степень выраженности воспалительных изменений на разных уровнях слоев кожи; глубина поражения; фиброз и склероз.

Статистическая обработка результатов Для всех данных была применена описательная статистика: данные проверены на нормальность распределения. Тип распределения определялся критерием Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения были подсчитаны среднее значение и стандартная ошибка среднего, которые вместе со значением п представлены в итоговых таблицах. В случаях ненормального распределения была рассчитана медиана и квартальный размах. Межгрупповые различия анализировали параметрическими или непараметрическими методами, в зависимости от типа распределения. В качестве параметрического критерия был использован критерий Стьюдента для независимых переменных. В качестве непараметрического критерия использовали U критерий Манна-

Уитни. Различия были определены при 0.05 уровне значимости. Статистический анализ выполняли с помощью программного обеспечения Статистика 6.0 (StatSoft, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Анализ влияния липидного комплекса на энзиматическую активность 5-липооксигеназы

Одним из возможных механизмов перехода к завершению воспаления может быть снижение синтеза простагландинов и лейкотриенов.

Липооксигеназная система относится к растворимым цитозольным ферментам, она обнаружена в цитоплазме альвеолярных макрофагов, тромбоцитах, тучных клетках и лейкоцитах. Наиболее важным среди ферментов этой системы является 5-ЛОГ. 5-ЛОГ является индуцибельным ферментом, экспрессирующимся в результате воздействия на клетки различных стимулов (провоспалительные цитокины и антигены).

Проведенное исследование показало, что ЛК снижал образование продукта реакции 5-ЛОГ с линолевой кислотой дозозависимо (рисунок 1).

Концентрация ЛК, мкг/мл

Рисунок 1 - Влияние ЛК на энзиматическую активность 5-ЛОГ

По уравнению аппроксимирующей кривой вычисляли ЕС50 (эффективную концентрацию на уровне 50% активности), равную 16,2 мкг/мл. Ингибитор ЖЮА в концентрации 15 мкМ снижал количество продукта реакции на 71%.

Анализ влияния липидного комплекса на энзиматическую активность циклооксигеназы-2

Простагландины, образующиеся под действием ЦОГ-2 из арахидоновой кислоты, обладают широким биологическим действием, участвуют в нормальном гомеостазе, являются ключевыми медиаторами в развитии острого воспалительного процесса.

Проведенный анализ показал, что ЛК снижал образование продукта реакции ЦОГ-2 с арахидоновой кислотой дозозависимо. Кривая снижения концентрации продукта

реакции имела сигмоидиую форму с выходом на плато на уровне 60% при концентрациях >15 мкг/мл (рисунок 2).

80-,

-1-1-■-1-1-1-1-1-■-г-

0 5 10 15 20 25

Концентрация ЛК, мкг/мл

Рисунок 2 - Влияние ЛК на энзиматическую активность ЦОГ-2

По уравнению аппроксимирующей кривой вычисляли ЕС50, равную 9,8 мкг/мл. Нифлумовая кислота в концентрации 0,1 мкМ снижала количество продукта реакции на 21%.

Определение влияния липидного комплекса на индуцированную продукцию гистамина

Гистамин является важным химическим медиатором аллергических реакций и воспаления. Он синтезируется и хранится во вторичных гранулах тучных клеток различных тканей и циркулирующих в крови базофилах. В начале воспалительного процесса гистамин высвобождается из клеток и взаимодействует со специфическими гистаминовыми рецепторами. Через Н1-гистаминовые рецепторы гистамин вызывает спазм гладкой мускулатуры бронхов и кишечника, активирует антиген-презентирующие клетки, стимулирует экспрессию молекул клеточной адгезии, индуцирует привлечение эозинофилов и нейтрофилов в очаг воспаления, повышает проницаемость капилляров, за счет чего инициирует развитие отека тканей.

Проведенное исследование выявило, что ЛК подавляет индуцированный выброс гистамина клетками 1ШЬ-1. Инкубация клеток с ЛК в течение 75 минут (15 мин до внесения в культуру клеток индуктора дегрануляции и 60 минут после) снижала выброс гистамина более чем в 2 раза в сравнении с контролем во всех тестируемых концентрациях 1, 2, 4 и 16 мкг/мл. Инкубация клеток с кетотифеном (16 мкг/мл), выбранным в качестве вещества сравнения, привела к полному подавлению высвобождения гистамина (рисунок 3).

1

*

я —1— 1- -

i

pfaa я

I 1 *

Интактные Контроль Кетотифен, ЛК ЛК ЛК J'IK

16 мкг/мл 1 мкг/мл 2 мкг/мл 4НКГ/МЛ 16мкг/мл

Рисунок 3 - Влияние JIK на индуцированное высвобождение гистамина в культуре базофилов крысы линии RBL-I Примечание - * - отличия статистически значимы в сравнении с контролем по t критерию Стыодента при р<0,05.

Таким образом, в присутствии JIK в концентрациях 1, 2, 4 и 16 мкг/мл обнаружено снижение дегрануляции гистамина в 2 раза клетками базофифилов крысы линии RBL-I.

Анализ влияния липидного комплекса на индуцированное фосфорилирование митоген-активированных протеинкиназ (МАР-киназ) in vitro

Продукция провоспалительных медиаторов в самом начале воспалительного процесса находится под контролем внутриклеточных сигнальных белков МАР-киназ р38, ERK1/2, ядерных транскрипционных факторов NF-кВ и АР-1.

Проведенное исследование было направлено на оценку влияния JIK на ЛПС-индуцированное фосфорилирование МАР-киназ р38 и ERK1/2. ЛК тестировали в одной концентрации 50 мкг/мл. В качестве препарата сравнения использовали ловастатин в концентрации 4 мкг/мл. Внесение в культуру ловастатина статистически значимо снижало количество фосфо-р38. Оценка действия ЛК на ЛПС-индуцированное фосфорилирование МАР-киназ р38 и ERK1/2 показала отсутствие эффекта (таблица 1).

Таблица 1

Влияние ЛК на ЛПС-индуцированное фосфорилирование МАР-киназ р38 и ERK1/2 в

культуре моноцитов человека линии U937 (n=3, Me±Q2)

Пробы Количество фосфо-МАРК (усл. ед.)

р38 ERK1/2

Интактные 1786±2178 3476±221

Контроль 716Ш264* 659б±1149

Ловастатин, 4 мкг/мл 2830±660# 1722±1444

ЛК, 50 мкг/мл 4710±1319 6003±3437

Примечание -

* - отличия статистически значимы в сравнении с интактными клетками по и критерию Манна-Уитни при р<0.05;

"-отличия статистически значимы в сравнении с контролем по и критерию Манна-Уитни при р<0.05.

Таким образом, на клеточной линии моноцитов человека 11937 показано отсутствие влияния ЛК в концентрации 50 мкг/мл на ЛПС-индуцированное фосфорилирование МАР-киназ р38 и ЕЮС1/2;

Изучение взаимодействия липидного комплекса с То11-подобными рецепторами на примере Т1Л*4

Стимуляция клеточной линии ЛПС в конечной концентрации 10 нг/мл привела к кВ-зависимой выработке щелочной фосфатазы, обнаруженной при помощи цветной субстрат-ферментной реакции, интенсивность которой составила 0,63 ± 0,01 единиц оптической плотности на длине волны 630 нм. Нейтрализация антителами привела к полному блокированию экспрессии щелочной фосфатазы (уровень сигнала не отличался от фонового).

Стимуляция клеточной линии ЛК отражает исходный уровень активации для каждой концентрации отдельно. Активации рецептора обнаружено не было ни в одной из исследуемых концентраций (рисунок 4).

Рисунок 4 - Результаты взаимодействия ЛК с рецептором ТЬЯ4

Примечание - * - отличия статистически значимы в сравнении с фоновым уровнем активации по г критерию Стьюдента при р<0,05.

Во всех используемых концентрациях ЛК не повлиял на взаимодействие ЛПС с рецептором ЬТЬК4.

Аналогичные результаты были получены для всех изученных рецепторов ИЛ 1/2, Т1П2/6,1ЛЖ112 и ТИ<5.

Таким образом, результаты экспериментов на клеточных линиях НЕК-В1ие-ИЫ12, НЕК-В1ие-ЬТЬК4 и НЕК-В1ие-ЬТЬ115 демонстрируют отсутствие агонистического и антагонистического действия липидного комплекса по отношению к рецепторам Т1ЛШ2, ТЪЮ./2, ТЬЯ2/6, ТЦ14 и ТЬЯ5 в концентрациях 100, 10, 1 и 0,1 мкг/мл.

Определение взаимодействия липидного комплекса с Н1-гистаминовыми рецепторами

Используя гистамин-иидуцированное сокращение подвздошной кишки морской свинки, выявлено, что ЛК подавляет реакцию гладкой мускулатуры на гистамин, отразившееся в дозозависимом снижении амплитуды гистамин-индуцированного сокращения кишки и увеличении времени наступления максимального ответа (таблица 2).

Таблица 2

Амплитуда гистамин-индуцированного сокращения и время наступления

максимального ответа (Ме±С>)

Группа Амплитуда (% от 80мМ KCl) Время (единицы от 80мМ KCl)

Контроль 98±33.. 5±1„

Кетотифен 5 нг/мл 2±2* 45±16*

ЛК 10 мкг/мл 59±8*». 18±3*..

ЛК 20 мкг/мл 46±14'„ 25±9*

ЛК 100 мкг/мл 14±5\. 32±12*

ЛК 1000 мкг/мл 5±2* 45±12*

Примечание -

* - отличия статистически значимы в сравнении с контрольной группой, при р < 0,05; ** - отличия статистически значимы в сравнении с группой кетотифена, при р < 0,05.

ЛК проявил дозозависимый эффект, наиболее выраженный в концентрации 1000 мкг/мл. По выраженности выявленный эффект соответствовал эффекту субстанции кетотифена в концентрации 5 нг/мл. Вычисленное среднее значение ЕС50 по отношению к амплитуде сокращения и времени наступления максимального ответа составило 18,1 мкг/мл.

Таким образом, обнаружено взаимодействие липидного комплекса с Н1-гистаминовыми рецепторами с ЕС50, равной 18,1 мкг/мл, отразившееся в дозозависимом снижении амплитуды гистамин-индуцированного сокращения подвздошной кишки морской свинки и увеличении времени наступления максимального ответа.

Оценка противовоспалительного действия липидного комплекса на модели острого воспаления «каррагениновый воздушный мешочек у крыс»

ЛК тестировали в трех дозах 4 мг/кг, 0,4 мг/кг и 0,04 мг/кг при введении внутрь каррагенинового мешочка сразу после введения 0,5% раствора ^.-каррагенина. В качестве показателей противовоспалительной активности служил клеточный состав забираемого экссудата, а также продукция простагландина РОР2а.

Интактная группа характеризовалась низкими значениями общего количества лейкоцитов 1,2х106 кл/мл. Введение внутрь воздушного мешочка 0,5% раствора X-каррагенина привело к развитию острой воспалительной реакции с инфильтрацией лейкоцитов в зону воспаления через 6 часов до 9,2x106 кл/мл, из которых 82% составляли нейтрофилы (Таблица 3).

Таблица 3

Клеточный состав экссудата через 6 часов после индукции воспаления, М±т, п=7

Группа № Описание групп Общее количество лейкоцитов, х 10® кл/мл Лимфоциты, х106 кл/мл Моноциты, х106 кл/мл Нейтрофилы, х106 кл/мл

I Интактная 1,2 ±0,7 0,9 ± 0,6 0,0 ± 0,0 0,3 ±0,1

2 Контрольная 9,2 ±2,3 1,4 ±0,7 0,58 ± 0,32*" 8,8 ±2,3

3 Диклофенак, 2 мг/кг 3,7±0,8*# 0,5 ± 0,2 0,21 ±0,11*# 2,8 ±0,3*"

4 ЛК, 0,04 мг/кг 7,9 ± 2,3 1,2 ±0,5 0,13 ±0,08 6,6 ±0,9

5 ЛК, 0,4 мг/кг 6,8 ± 2,2 0,9 ± 0,4 0,08 ± 0,03 5,8 ±1,1

6 ЛК, 4 мг/кг 5,3 ± 1,2 0,6 ±0,1 0,15 ±0,08*" 4,6 ±0.5**

Примечание —

* - отличия статистически значимы в сравнении с интактной группой по I критерию Стьюдента при р<0,05;

# - отличия статистически значимы в сравнении с группой контроля по I критерию Стьюдента при р<0,05.

Препарат сравнения диклофенак в дозе 2 мг/кг статистически значимо снижал количество лейкоцитов в экссудате на 60% до 3,7x106 кл/мл. ЛК был наиболее эффективен в дозе 4 мг/кг, снижая общее количество лейкоцитов на 42%, в дозах 0,4 и 0,04 мг/кг на 26% и 14% соответственно (таблица 3).

Острое воспаление характеризовалось продукцией провоспалительных медиаторов. Так, оценка содержания РОР2а в экссудате в контрольной группе составила 2756 пг/мл. Препарат сравнения диклофенак, неселективный ингибитор циклооксигеназы, ингибировал выброс РОР2а практически до 0, что полностью согласуется с его механизмом действия (рисунок 5).

3500 --

3000 ---== =-

2500 --- I -

В 2000 -----------г*"—!-*-

5 р т

и 1

С- 1500 -----5Й-

О юоо---

си

500 --- Я - ---—

0 2756 61 ЙЙ 1994 1446

0 интактная контрольная диклофенак 0,04 мг/кг 0,4 мг/кг 4 мг/кг

Рисунок 5 - Концентрация простагландина Р2а через 6 часов после индукции воспаления Примечание - * - отличия статистически значимы в сравнении с контрольной группой по I критерию Стьюдента при р<0,05.

2756

1994

1440

0 * 61 2932

интактная контрольная диклофенак 0,04 мг/кг 0,4 мг/кг 4 мг/кг

В дозе 4 мг/кг было обнаружено снижение количества РОБ2а в пробах в 2,2 раза по отношению к контролю, что подтверждает установленный механизм действия, связанный с ингибированием ЦОГ-2.

Таким образом, на модели острого воспаления "каррагениновый воздушный мешочек" у крыс при введении липидного комплекса в дозах 0,04, 0,4 и 4 мг/кг установлено значимое снижение инфильтрации лейкоцитов и уровня простагландина Р2а в зоне воспаления.

Оценка противовоспалительного действия липидного комплекса на модели

контактного дерматита у мышей Индекс реакции в контрольной группе животных через трое суток после нанесения разрешающей дозы химического аллергена ДНХБ составил 52% (рисунок 6). У животных, получавших растворитель 5% ДМСО, ИР не отличался от контроля. Препарат сравнения супрастин снижал степень отека пораженного уха на 78%. ЛК снижал ИР дозозависимо. В дозе 2 мг/кг степень отека была ниже плацебо на 41%, в дозе 4 мг/кг на 66%, в дозе 8 мг/кг на 68%.

Интактная Контроль Плацебо Супрастин 2 мг/кг 4 мг/кг 8 мг/кг

Рисунок 6 - Степень отека пораженного уха Примечание - * - отличия статистически значимы в сравнении с группой плацебо по I критерию Сгьюдента при р<0,05.

Морфологическая оценка показала, что "Опытное" ухо контрольных животных характеризовалось хроническим продуктивным воспалением с резко выраженной лейкоцитарно-плазмоцитарной инфильтрацией с вовлечением в воспалительный процесс нижних слоев дермы и поражением хрящевой ткани. Группа плацебо по выраженности изменений не отличалась от контроля. В группе животных, получавших препарат Супрастин, наблюдали умеренно выраженное воспаление, не затрагивающее нижние слои дермы, которое в соответствии с бальной системой было снижено на 54%, что согласуется с данными полученными при оценки отека (ИР) (рисунок 6).

Рисунок 6 - Результаты гистологического исследования "опытного" уха в баллах Примечание - * - отличия статистически значимы в сравнении с группой плацебо по и критерию Манна-Уитни при р<0,05.

ЛК был эффективен во всех трех дозах. Изменения имели дозозависимый характер и характеризовались плазмоцитарно-лейкоцитарной инфильтрацией с вовлечением только верхних слоев дермы. Интенсивность воспалительного процесса, определенная по бальной системе, в дозах 4 и 8 мг/кг была снижена на 71% в сравнении с контрольной группой.

Таким образом, на модели контактного дерматита у мышей подтверждено противовоспалительное действие липидного комплекса при внутримышечном введении в дозах 2, 4 и 8 мг/кг, выраженное в снижении отека ткани и гистологических признаков воспалительного процесса.

ВЫВОДЫ

1.Установлено, что ЛК снижает образование провоспалительных продуктов преобразования арахидоновой и линолевой кислот под действием ЦОГ-2 и 5-ЛОГ в присутствии липидного комплекса с ЕС50, равными 9,8 и 16,2 мкг/мл соответственно;

2.В присутствии ЛК в концентрациях 1, 2, 4 и 16 мкг/мл обнаружено снижение высвобождения гистамина в 2 раза базофифилами крысы линии КВН;

3.Выявлено взаимодействие ЛК комплекса с Н1-гистаминовыми рецепторами с ЕС50, равной 18,1 мкг/мл, отразившееся в дозозависимом снижении амплитуды гистамин-индуцированного сокращения подвздошной кишки морской свинки и увеличении времени наступления максимального ответа;

4.На модели острого воспаления "каррагениновый воздушный мешочек" у крыс при введении липидного комплекса в дозах 0,04, 0,4 и 4 мг/кг установлено значимое снижение инфильтрации лейкоцитов и уровня простагландина Р2а в зоне воспаления;

5.На модели контактного дерматита у мышей подтверждено противовоспалительное действие ЛК при внутримышечном введении в дозах 2, 4 и 8 мг/кг, выраженное в снижении отека ткани и гистологических признаков воспалительного процесса;

6.На клеточной линии моноцитов человека 11937 показано отсутствие влияния ЛК на ЛПС-индуцированное фосфорилирование МАР-киназ р38 и ЕККШ;

7.Результаты экспериментов на клеточных линиях НЕК-В1ие-ЬТЕК2, НЕК-В1ие-11ТЫ14 и НЕК-В1ие-ЬТЬН.5 демонстрируют, что ЛК в концентрациях 100, 10, 1 и 0,1 мкг/мл не

проявляет агонистичеекого n антагонистического действия по отношению к рецепторам TLR1/2, TLR2/2, TLR2/6, TLR4 и TLR5.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Рассмотрены биохимические механизмы коррекции острого воспаления липидами печени трески. Поскольку развитие острого воспаления является сложным процессом, в котором задействованы как клеточные, так и молекулярные механизмы, действие липидного комплекса изучали на процесс воспаления комплексно в условиях in vivo, in vitro и на изолированных тканях и клеточных линиях.

Рассматривая механизмы инициации острого воспалительного процесса, возможный агонизм и антагонизм ЛК изучали по отношению к То11-подобным рецепторам, которые запускают каскад внутриклеточных биохимических процессов, активацию ядерных факторов и экспрессию сотен провоспалительных генов. На клеточных линиях, экспрессирующих отдельные TLR, было показано отсутствие взаимодействия ЛК с рецепторами TLR1/2, TLR2/2, TLR2/6, TLR4 и TLR5. На клеточной линии моноцитов человека U937 было продемонстрировано отсутствие влияния на индуцированное фосфорилирование МАР-киназ р38 и ERK1/2, играющих ведущую роль в проведении провоспалительного сигнала.

Изучая действие комплекса липидов на каскад арахидоновой кислоты, было установлено снижение образования продуктов реакций преобразования арахидоновой и линолевой кислот ферментами ЦОГ-2 и 5-ЛОГ соответственно. Последние достижения липидомики позволяют сделать вывод, что ЛК приводит к торможению синтеза простагландинов и лейкотриенов из арахидоновой кислоты, и инициирует образование нового класса противовоспалительных липидных медиаторов из со-3 полиненасыщенных жирных кислот, таких как резолвины, протектины и марезины. Эти медиаторы обладают исключительной ролью в переходе острого воспаления в стадию разрешения. На модели каррагенинового воздушного мешочка было доказано, что ЛК снижает инфильтрацию лейкоцитов и простагландина F2a.

Поскольку при таких заболеваниях как артрит и атопический дерматит важную роль в развитии воспаления играет гистамин изучали возможность влияния ЛК на процесс высвобождения гистамина и работу Н1-гистаминовых рецепторов. Впервые на клеточной линии базофилов крысы RBL-I было установлено, что комплекс липидов проявляет мембрано-стабилизирующие свойства, снижая выброс гистамина. На модели гистамин-индуцированного сокращения подвздошной кишки морской свинки было обнаружено ингибирующие действие по отношению к Н1-гистаминовым рецепторам. Применение липидного комплекса на модели контактного дерматита у мышей подтвердило его противовоспалительные эффекты.

Подводя итог накопленным данным можно заключить, что липиды играют важнейшую роль в инициации и разрешении острого воспалительного процесса. Благодаря комплексному составу ЛК действует сразу на несколько молекулярных мишеней, включая ЦОГ-2, 5-ЛОГ, Н1-гистаминовые рецепторы и проявляет мембрано-стабилизирующие свойства, ингибируя выброс гистамина тучными клетками.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Установленные механизмы противовоспалительного действия ЛК, выделенного из печени трески, позволяют рекомендовать его использование в качестве перспективной платформы при создании новых противовоспалительных лекарственных средств для

лечения таких заболеваний, как ревматоидный артрит, псориаз, контактный дерматит, а также других воспалительных процессов и травм.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК

1. Рыбакова, A.B. Изучение противовоспалительной активности нового ветеринарного препарата афлогилекс на модели экспериментального адъювантного артрита / Рыбакова,

A.B., Крышень, KJT., Соколов, В.Д. // Международный вестник ветеринарии. - 2012. -№1. - С. 39-43.

2. Крышень, КЛ. Оценка противоаллергенных свойств нового полипептидного препарата из печени тресковых / Крышень, K.JI. Демченко, Д.В, Рыбакова, A.B., Дадали,

B.А., Рыдловская, A.B., Пожарицкая, О.Н., Макарова, М.Н., Шиков, А.Н., Макаров, В.Г. // Экспериментальная и клиническая дерматокосметология. - 2012. - №2. - С.38-42.

3. Крышень, КЛ. К механизму противовоспалительного действия комплекса, выделенного из печени трески. Антиэкссудативное действие, (сообщение №1) / Крышень, K.JI. Демченко, Д.В, Шиков А.Н., Пожарицкая, О.Н., Макарова М.Н., Макаров В.Г. // Международный вестник ветеринарии.- 2013. - №4. - С.100-106.

Прочие работы, опубликованные по теме диссертации

1. Крышень, КЛ. Противоаллергенные свойства и молекулярные механизмы действия пептидно-фосфолипидного комплекса, полученного из печени трески / Крышень K.JI. // Материалы конференеции Профилактическая медицина. - 2011. - С. 1724.

2. Рыбакова, A.B. Сравнительная оценка эффективности полипептидного препарата при эндометритах коров / Крышень, КЛ. Макарова, М.Н., Соколов, В.Д. // Международный вестник ветеринарии. - 2012. - №4. - С.38-41.

3. Шиков, А.Н. Новые технологии переработки гидробионтов / Шиков, А.Н., Пожарицкая, О.Н., Уракова, И.Н., Рыбакова, A.B., Крышень, КЛ. Макаров, В.Г. // Фармацевтические и медицинские биотехнологии. Биотехнология: состояние и перспективы развития. Москва, Россия. - 2012. - С. 385.

4. Крышень, КЛ. Двойной селективный ингибитор циклооксигеназы-2 и 5-липооксигеназы природного происхождения / Крышень, К.Л. Ацапкина, А.А, Рыбакова,

A.B., Демченко, Д.В., Рыдловская, A.B., Пожарицкая, О.Н., Макарова, М.Н., Макаров,

B.Г. // Материалы IV съезда фармакологов России. Казань, Россия. - 2012. - С.105.

5. Крышень, КЛ. Биохимические основы противовоспалительного действия нового полипептидного комплекса, полученного из печени трески / Крышень, К.Л. Рыбакова, A.B., Рыдловская, A.B., Макарова, М.Н., Дадали, В.А., Макаров, В.Г. // Материалы всероссийской молодежной конференции «Фармакологическая коррекция процессов жизнедеятельности. Доклинические и клинические исследования новых лекарственных препаратов». Уфа. Россия. - 2012. - С. 92-94.

6. Крышень, КЛ. Оценка механизмов противовоспалительного действия препарата Афлогилекс, полученного из печени трески / Крышень, К.Л., Рыдловская, A.B., Гущин, Я.А., Рыбакова, A.B., Дадали, В.А., Макаров, В.Г. // Медицинский академический журнал. - 2012. - №4. - С.88-89.

7. Крышень, КЛ. Противовоспалительное действие липидов, выделенных из печени тресковых / Крышень, К.Л. Дадали, В.А. // Материалы конференеции Профилактическая медицина - 2012. - С.86

8. Rybakova, A.V. Anti-inflammatory properties of peptide complex obtained from the cod liver (gadidae) on the model of adjuvant arthritis in the rat / Rybakova, A.V., Kryshen, K.L.,

Kovaleva, M.A., Avdeeva, O.I., Makarenko, I.E., Makarova, M.N., Makarov, V.G. // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. Материалы XVI международного конгресса Фитофарм. - 2012. - С. 93.

9. Kryshen, K.L. Biochemical basis of anti-inflammatory properties of peptide complex obtained from the cod liver (gadidae) / Kryshen, K.L., Demchenko, D.V., Rybakova, A.V., Rydlovskaya, A.V., Atsapkina, A.A., Makarova, M.N., Makarov, V.G. // Обзоры no клинической фармакологии и лекарственной терапии. Материалы XVI международного конгресса. - 2012. - С. 73.

10. Kryshen, K.L. Anti-inflammatory effects of lipids extract from the cod liver / Kryshen, K.L., Shikov, A.N., Pozharitskaya, O.N., Makarov, V.G., Laakso, I., Hiltunen, R. // Planta Med. - 2013. - Vol.79. - P.1247.

Подписано в печать 23.01.14 Формат 60x84716 Цифровая Печ. л. 1.2 Тираж 120 _Заказ 06/01_печать_

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)