Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние эмоксидина и натрия оксибутирата на митохондриальные процессы в головном мозге крыс при острой циркуляторной гипоксии

дадшя мщщшяшх шун Рзг сто- исследовательский ннсютут фаркакодагия Тексяого тутого Центра ЛЯП СССР

Пл прчвпзг рртоятсп

ГОБОРСКИЯ Александр. Николаеаот

Яягчнм янскситтат я натрия скскбутпрата гга яттсхоядриадмшэ процессы ъ головном шага крио прп остро Л цирку ляторяо*! ггшоетпп

14.00.25 - |3аркакологкя

Ш0РКЕ2РАТ дпссертшри пз соискаинэ ученой стэпэкя капмдпта дадкцинсюпс пзук

Томск - Ш1

1'вбэ%'в Еополи&на в Кауч.чо-иаеледо&ательекам института фармакологии ТНЦ АШ СССР

Научна« руководители: профессор и. Е Кондрашова

с. н. о. В. А. Хааанов

Официальные оппоненты: профессор Н. II Ларионов

с. н. с. Т. а ИЬвожеева

Бедутцая организация - Институт фармакологии Ш1 СССР (г. Иосквь)

Защита диссертации состоится " 91 .1992 г. ь 14 чаа

на заседании специализированного совета К. 001.33.01 цри ШШ фармакологии ТНЦ АМН СССР (634028, Томск, пр. Лгиина 3).

С диссертациэй можно ознакомиться в научной чаоти фармакологии ТНЦ АШ СССР.

Авторзферат разослан " ___1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

/А ,

с, н. с. <Г & У. Горимава

< ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Защита головного мозга от повреждения при различного генеза нарушениях церебральной гемодинамики является одной из важнейших проблем а практика неврологии и нейрохирургии, где довольно часто возникают состояния, сопровождающиеся частичной ишемией органа (тромбозы и эмболии магистральных сосудов головного мозга, операции на брахизцефальных артериях и др.) СБи-ленко II В., 1989; Салалькин B.Ii, Арутюнов Л. К , 1978; Johnson Q., MarcouxF.V., 19SS; Siesjo Во. К., 19783.

Однако, недостаточно изученным остается патогенез илнмическо-' го повреждения клеток головного мозга. Значительно количество ра-Сст указывает на 2едуцую ролъ в этом процессе нарушения эиергети-чгеного м?та5олизма мозга Ci.fela L. . 1079; Siesjo Во. К. , Wieloch Т., ЮА53 , и прежде всего, процессов окислительного фосфорилнрова-нил в митохондриях, являюк?:хся ocHOEHbD.ni поставвзжаш энергии в кл5тк& Сйг>1д;.азс^а НЕ, 1D89; Лукьянова Л. Д., 1989; Johnson а , Marccux F., ISi"; Karl man К., 1985]. 3 то время, роль этой вак-нейтей систеп; ь механизме поддержания метаболического гомеостаэа при ишемии недостаточно ясна.

Виссте с тем, есть основания предполагать суерствэниуп заинтересованность энергопродуцирующэй и. сопряженных с пай систем, в частности, трансамшаэных путей поступления субстратов в реакции окисленгл в поддержании структурно-функциональной целостности ней-рональнгй ткани при нарушениях мозговой гемодинамики СКондракова 1t tt , tSSQ, 1991; Писаренко Е И. и др., 1986], г клад которых в механизм адаптации при циркуляторной гипоксии остается нераскрытым.

Основные усилия по фармакологкчесiioa гзщяге мозга яря изммии а настояла время сосредоточены в области создания. прэпаратоз» иермалпгуг:?:* гемодинамику, поставку кислорода, ограничивав®« функциональную активность ткаяи л:;5о сшекук;« после;*,г?8ка нарушений энергетического обмена (ингиеаторы яэйроиаяьного ксгреддения) £Лукг>янсва Л. Д., 1SS9; Johnsons., Мггссия: Р, '4 , 19853.

По ймэвззшеа дднним южно првдполозоггь, что коррэгази метаболических сдвигов в самой системе ьзиохокдркагьнсго емюяика является новым и одним из наиболее аерспвктшшх паарзвлеггай в оЗлзохй защиты мозга от ииемичэекогэ повреждения СКоз!,праюва .НЕ, 1089; Дгкьянова Л. Д.. 12393.

В настоявре аремя одни« из этыснетк прэдгтзвжэгеа аятитп-поксантов считается нзгрга окскЗутяоаг. Згрсйбягазшаги соэдкзснкя-

ми, для которых показана высокая аатигипоксическая активность на различных моделях патологии являются производные 3 -оксипиридина, В частности, - эмэксипин tАтаСаева р.Е. и др., 1991; Герыанова Э. Л. И др., 1991; Смирнов Л. Д., Дюмаев К.М., 1982].

Влияние натрия оксибутирата на энергетически!« метаболизм при гипоксии широко обсуждается в литературе t Иванова И. А. и др., 1986; Хватова E.U. , Мартынов ЕЕ , 1977; Хватова E.U. и др., 1987; Laborit Н., 1964; McMillan v., 1980}. Вместе с тем, метаболические аффекты эмоксипина изучены недостаточно, в частности, отсутствует данные о его влиянии на функциональное состояние митохоидрка типизированного мозга.

Имеющиеся в литературе данные, относительно влияния антиги-поксактов на процессы окисления б Ш в норт и патологии оцеииаа-стоя препмущэствеиио, с позиции традиционных взглядов на взаимосвязь реакций гликолиза, ЦГК и его анаплеротических путей в норме и патологии. Сформировавшиеся к настоящему времени иог.ые представления о взаимоотношении реакций ДТК и сопряженных с циклом анаплеро-хических реакций в реализации адаптивной реакции системы митохокд-риального окисления в условиях экстремальных энергозапросов С Кондралова М.Е, 1091 j Khazanov V. A. et al., 19913, а также установленная в нашей лаборатории стадийность изменений функционального состояния Ых в процессе ишемического повреждения мозга [Панина О. Е. , 19911, позволяют по новому, прежде всего, с точки зрения влияния на процессы митохондриаяьного окисления, взглянуть на проблему фармакологической заняты мозга при ишемии.

Нужно подчеркнуть, что многие из принятых условий изучения тканевого дыхания далека от физиологических. К ним прежде всего относится избыток кислорода в традиционных условиях исследования (на воздухе). Как известно, кислород может значительно видоизменять митохондриальные белки, окисляя их SH- группы [Кондрвшова U.S. • а др., IQTOi Леонов А. Е , Барсуков Е А., 1970; Carlsen J. В., 1876; Ozola J. et al., 1068; Smith R. E. et al., 19323; возмокно, и повышенное содержание окисленного ЦАД будет изменять соотношение ШДг и фдавин-зависиют реакций а гипер- и нормоксии. Есе это, по-видимому, искажает ответную реакцию Ых и небезразлично при исследовании их функционального состояния.

Выл»изложенное подтолкнуло нас к разработке нового методического подхода в исследовании Ux, который позволит, по наши представлениям, оценить состояние процессов митохондриального окисления я норме, при ивеиии и действии антигилоксантов в условиях максимально приближенных к внутриклеточным. Использование нового методического приема, мы полагаем, существенно дополнит традиционный

метод исследования органелл и позволит с большей достонерностъв говорить о реальном состояния процессов китохондриального дыхания "in situ" при различных состояниях организма.

Цель работы. Исследовать влг.л;;;:з смсксипина в сравнении с натрия оксибутиратом на процессы дыхания митохондрий в мозга при циркуляторной гипоксии.

Задачи исследования. •

1. Разработать способ выделения и исследования митохондрий мозга крыс в условиях, максимально сохраняющее их нативноэ состояние;

2. Изучить состояние сукцинат- и НАД-зависимых процессов окисления ипохондрий мозга в норме п при ипемическом повреждении органа;

3. Исследовать вклад реакций переаминирования в механизм поддзр-жанил метаболического гомеостаза - эзга при ишемии;

4. Исследовать влияние эмоксипина и натрия оксибутнрата на знер-гозависимые реакции ипохондрий мозга при иеэкии.

Научная новизна.

1. ЕперЕые при работе с Мх мозга применен оригинальный способ выделения и исследования органелл в условиях, максимально сохраняюсь их яативное состояние за счет поддержания парциального даздэ--шя кислорода в используемых в работе средах на уровне внутриклеточных значений;

2. Описаны изменения функционального состояния Мх мозга з "перо-ломкой" стадии ишемии (3.5 часа), роль сукидаат- и НАД-зависимых процессов в формировании ответной реакции органелл в этот, период;

3. Использование нового методического подхода позволило выявить доминирующую роль глутамат-зависимой системы пзреаиинироваввя, в поддержании функционального состояния 16с при цйркуляторвой гипоксии;

4. Показано, что змоксипин и- натрия оксибутират предупреждает развитие ниэкоэнергетического сдвига при етэкии за счэт уаияэнка образования эндогенной янтарной же лот н в реакциях яереакиккровь-ния.

Научно-практическая значимость работы.

1. Разработанный и апробированный способ получения препарата митохондрий головного мозга относится к акеаерикзнталикой мгдицжэ и может быть использован в научных всы»дозаяиях по изучения энэргэ-тического метаболизма. Пидупэно пмэтатвдшда рэкэякз от Ю. 04.91г. о выдаче авторского сзидогааствв по гаавкэ N4855103/14 (083705) "Способ получения препарата мггохоздрпа головного мозга".

2. Результаты исследования с5оекоз:ааа? целесообразность пркмэве-ш-л эдоксиппна а качэстге средства, предотзра^аг^эго разакяю ка-

рушений процессов митохондриальной энергопродукции головного мозга при циркудягорной гипоксии; они войдут в материалы по оценке специфической активности эмоксилина как корректора нарушений энергетического метаболизма мозга при пиемии, для представления в Фармакологический комитет ЫЗ СССР.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на 3-й конгрессе фармакологического общества Болгарии (София, 1990), Всесоюзном совещании "Ыолекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена" (Цущино, 1990), 20 -м съезде федерации европейских биохимических сообществ (Будапешт, 1990), Всесо-юаном совещании "Физиология и биоэнергетика гипоксии" (Цущино, 1990), Всесоюзном совещании по результатам клинического г. экспериментального исследования препаратов 1 и ЗХ эмоксипина и максидола (Москва, 1991), 15-м европейском биохимическом конгрессе (Иерусалим, 1691), Всесоюзной конференции "Фармакологическая коррекция гипоксических состояний" (Гродно, 1991).

. Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ и подучбно авторское свидетельство на изобретение N4855106/ 14 (083706). Объем и структура диссертации. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, включая 20 таблиц и 9 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, глав по материалам и методам исследования, результатам исследования, заключения, выводов и списка литературы, включающего 232 источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на 260 белых крысах-самцах линии Vistaг массой 160-220 г. Наиболее близкой к клинической ситуации является неполная ишемия мозга CSiesjo Во.К., 19783, которую мы создавали перевязкой у крыс обеих сонных артерия. Операцию проводили в течении 16-20 минут под ¿фирным наркозом. Через 3.6 часа после операции крыс вабиаали декапитацией. Контролем служила группа ложноопе-рированных животных. ,

Изучаемые препараты в форме водного раствора вводили животным внутриброшинно: вмэкситш в дозе 5иг/кг [Шведова А.А., 19863, натрия оксибутират - 100 иг/кг С Бобков Ю. Г., Иванова И. А., 1987; Олейник Н. Б., 19903 ва 1 час до перевязки сонных артерия.

Исследовали дыхание митохондрий (Их) мозга крыс. ;В работе была использована методика получения и исследования дыхательной активности митохондрий, позволяющая в значительной степени сохранить их нативно« состояние и особенности ультраструктуры. Bee основе работы, выполненные под руководством IL Е Ковдрашовоя в лаборатории

функциональной биофизики ЛН СССР в г. Пущ:нэ и исследования проведенные наз® в лаборатории фармакологии мозгового кровообращения НШ> АШ СССР С Кондраиова И IL , Анзяенко А. А., 1973; Кондрашова М. Н., Григорэнко 3. и др., 1S87; лаэапов El я др., 19SQ3.

Органеллы выделяли методом дифференциального центрифугирова-Ш!я. Среда выделения Кх: сахароза 0.3 U (фирмы "Beckman"), Нерезбуфер 10 M (ф«р>.'.ы "Sigma"), ЭД1А 2-loSí (фирмы "Signa"), pH» 7.4 при t- 0+1° С.

Полярографически, по скорости потребления кислорода суспензией Мх в различных метаболических состояниях по Чанеу СChance в. , Williams С., 1956], регистрировали дыхательную активность ерга--нелл. В установке использованы полярограф РА-2 (ЧССР), термостати-руеизя ячейка оригинальной конструкций с мембранным электродом кларковского типа и системой под: и и поддержания газового состава, Среда инкубации: сахароза 0.17 U, KCL 4-10*!Л (ОСЧ), Hepes-Cy-фер 10*Ы, КЛ2Р0^5-10"н (ОСЧ), КШ05 8-10**11(ОСЧ) , ЭДТА 2-10"\ рН= 7. 4 при t- 26° С.

С целью детальной оценки состояния сукцинат- и НАД-завис гаю ft систем энергопродукции и вклада реакций переаккнирования в окисление субстратов митохондриями моэга крыс использованы следующие ме- • тодическш приемы:

1) выявление замаскированного термокеяия сукцинатдегидрогена-зы (т-СДГ) СКондраиова У. H., Григорекко Е. В., 1981-, Кондрапова Ы.Н., 19833; ,

2) оценка вкладз сукцината и НАД-гавксимых субстратов в уровень дыхания !¿x СМаевский Е. И., Нондрзшва lia , 1978; Окон Е. Е , 1979J;

3) определение уклада окисления эндогенной янтарной кислоты (ЭЯК) а дыхательную активность митохондрий СНОндралюва Ii К., t&es-ский Е. и., 1978], в сочетании с ковш, разработанным паст, методой исследования органелл.

С целью создания условий Слизких к такозкм "in situ", ерэдн, суСстрати, суспензию Мх в г.-эркод работы продувала газовой смесь», в составе 0г- 4t, С0а- 8Z, ÎJZ- 83*. Продувку осуществляя! год контролем газоанализатора ABL-4 (Radíonetr, Дания) до полз:ого ния, что соответствовало парциальному давлен:® кислорода £0 терр я соотносимо со средними значениями р04этого газа s ткани мозга "m situ" t Иванов К П., Ккслякоз йЯ, 1979; Коваленко Е. Д., 1973}'Ш-оз М. Т., 1931; Lubbers D. V., 1933; í.tecMíllan V., 1S71; b'airP.K.' et al., 1933], это позволило выявить ряд оссСэнностея кятохондрк-. ального окгяаеная итрахзся взиную роль в поддержании шгабавгкз-' кого гсмэостгза. В качестве контроля использовали Ifx, Ёвдздекнкз

аналогичный способом, на средах уравновешенных по газовому составу с воздухом (гипероксия), то есть в общзпринятых условиях изучения функционального состояния органолл СКондрашова ILE, Ананенко A.A., 18733.

В качестве субстратов окисления использовали янтарную кислоту (Як) б ОД яблочную кислоту 3 мЫ и пировинограднув кислоту 3 иЫ (все субстраты фирмы "Sigma"). АДФ (фирмы "Stem") вносили в ячейку до концентрации 5 >1(5 U, ингибитор сукшнатдегидрогеназы (СДГ) маловат - до 2мИ Для выявления скрытого т-СДГ мы использовалиJt-оксибутярат и. ai-глицерофосфат или глуташт, в концентрации 3 uU каждого, внося юс в среду инкубации одновременно с сукцинатом S MU. Вклад окисления ЭЯК, рассчитывали как разницу скоростей фосформирующего дыхания при утилизации смеси яблочной кислоты (3 мМ) и глутаыата ( 2.5 ulQ совместно с ингибитором трансамкнаг аминооксиа-цэтатом (АОА) (1 Ш) (фарш "Serva") и активаторов сукцинатаависи-uoro дыхания ^-оксибутирата и «/.-глицерофосфата (по 3 мЮ и без последних.

Белок определяли по методу t Lowry 0. H., Rosenbrough F., lCSll, величину pH, содержание в мозговой ткани молочной кислоты определяли по CHohorst H. J., 19703 в норме и через 3.5 часа после двусторонней перевязки сонных артерий бег и с введением препаратов. Статистическая обработка результатов проведена методом парных сравнений по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни, а также с использованием t-критерия Стыодента СГублер Е. В,, Генкин А. А., 1Q733.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

i Влиякие условий исследования на функциональное состояние митохондрий головного моага крыс

Исследование митохондрий в нормоксичесюпс условиях (опыт) показало значительные изменения их дыхательной активности относительно контроля (гиперонеия) (риал, 4). Окисление сукцината в нормоксии (рис.1) характеризовалось повышением скоростей дыхания, увеличением диапазона дыхательной активности (V3-V4) при неизменной величине коэффициента сопряженности окислительного фссфорили-рования (АДФ/0) и снижении времени фосфоршшрования (Тр). Внесение s среду инкубация совместно е сукцинатом активаторов СДГ «¿-ГФ и Jr 0U усиливало различие состояния Ух в гипер- и нормоксических условиях инкубации (рис. 1). В частности, ати добавки вызывали на 33% больший прирост скорости фосфорилирусщэго дыхания органелл в нор-шксии с соответствующим увеличением на 113% диапазона дыхательной

Рис Л Окисление сукцината митохондриями ноэга крыс до (-0 и после внесения совместно о сукцинатои активаторов СДГ: «¿-глицерофосфата и^-оксибутирата (—) или глутаната в гипер- и) и нормоксических (2) условиях эксперимента.

Таблица I'

Влияние эмоксипина и натрия оксибутирата на содераанив лактата' и величину рН в ткани мозга при 3.5 ч. острой циркуляторной гипоксии вызванной двустйронней перевязкой сонных артерий у крыс

Контроль (п?8)

Ишемия зтойч.

Ишемия неуст,

1Ьемня Квения

устойч. неуст, + эмок. + натрия ок.

(п=7) (п=бЗ ; (п»7) Сп=б5 •

рН 7.37;0.03 7.0I;0.0$w*б.5í^;0.ofн''7.28JO.Oг',* Т.Я'.О.Ъг**

лактат 1.69;С.ОЗ 2.04;0.04*" г.ЩЪМ*' 1.6Г.0.05 1.^7;0.03"'*

(мкмоль на .

- I грамм ткани) _______

Примечание:

** различия с контролем достоверна прй р<0.01. различия с контролем достоверна при р<0.001

.дсь

активности и снижением на 10Х времени фосфорилирования по сравне-юш с гипероксическим состоянием. Глутамат в этих условиях не влиял на V3 контрольных Ых, существенно активируя опытные. Причем, как хорошо видно на рис. 1, реакция органелл на него была более выражена, чем на об- Г® Hjâ-OH Тогда как довольно часто встречается, представленное на том жэ рис. 1, снижение V3 при внесении глутамата в среду инкубации Ых, окисляющих Як. Существует, мнение, что оС- ГФ и J-OU являются более сильными активаторами СДГ, чем Глу С Кондра-ШОВаЕЕ, Григоренко Е. В. И др., 1987; Qrigorenko Е. et al., 19843, однако, эти данные получены в гипероксических условиях. Вероятно, в условиях нормоксии реализуется не только способность Глу устранять торможение СДГ подобно </. -ГФ hj5-OM за счет повышения восстановленности дыхательной цепи на участке НАДН -дегидрогенага - коэнэкм Q, но и выступает на первый план вклад этого субстрата в реакции переаминирования СКзндрашова М.Е и др., 1987; Кондрашова Ы.Е, 1991; Chance В., Hagihara Б., 19623, что обеспечивает более полное удаление ингибитора СДГ оксалоацетата (ОАА).

Таким образом, в гипер- и нориоксических условиях исследования мы видим два типа реакций Их окисляющих сукцинат. Они могут быть связаны с известными закономерностями развития т-СДГ СКондрашова U. Е и др., 1987; Grigorenko Е., 19843. В частности, ингиби-рование дыхательной активности Ых в гипероксии, по-видимому, обусловлено накоплением ОАА, с одной стороны, за счет активации избытком кислорода его образования в реакции окисления сукцината, а с другой, - вследствие недостаточной интенсивности путей утили-вации ингибитора и, в первую очередь, реакций переаминирования.

Дополнительным подтверждением этому служат результаты полученные при использовании ингибитора-трансаминаз ашшооксиацетата (АОА) (рис.2). В гипероксических условиях при утилизации Ых смеси субстратов глутамат, малат - АОА существенно угнетал скорость'фос-форилирухи^его дыхания органелл, причем она имела выраженный двухфазный характер (рис.2). В нормоксии АОА также выражено ингибиро-вал дыхание Ых, но при этом двухфазность изменения скорости V3 отсутствовала. Чувствительность дыхания Ых к АОА подтверждает предположение об участии трансаминазкого цикла окисления в рассматриваемых процессах. А наблюдаемое нарастание торможения скорости фосфорилирухпрго дыхания в гипероксии вероятно свидетельствует о постепенном подавлении этого пути утилизации ОАА.

Внесенные в среду инкубации совместно с Глу, манатом и АОА активаторы СДГot-ГФ иjS-OM (рис.2) устраняли наблюдаемое в гипери нормоксии ингибирование, что проявлялось в увеличении скоростей дыхания органелл и нивелировании двухфааности изменения V3 в гипе-

POIÎCJÎH.

Ыалонат, внесенный в сроду инкубация, органелл совместно с активаторами СДР существенно "вырезал" сг.'Я/удггруекьЯ vt-T® и J>- СИ прирост дыхания кш: 2 r:rnop- Tait и в норноксии, возвращая его к близкому с ИСХОДНЫМ уровню (рис.2).

Добавка к АОА не оказывала влияния на величяну коэффициента сопряженности'окислительного фосфорилирования (АДФ/О). В то же время внесение в среду инкубации активаторов СДГ приводило к снижет® величины ЛДО/О как в гипер- так и в нормоксии (р<0.05). Добавка к Их совместно с od-ГФ и^й-01! малой ат а приводила к увеличении коэффициента АДФ/О до исходного уровня. Причем, в гипероксичееких условиях эксперимента коэффициент АДФ/О возрастая до бодьпих вели-чил (р<0.05).

йзико предположить, что выявленные нами Изменения величины коэффициента сопряженности окислительного ^сформирования указывают на различный вклад и рассматриваемся процессы сукцинат- и НАД -зависимого дыхания. В частности, некоторое, хотя и не достоверное увеличение коэффициента АДФ/О в ответ на добавку в среду АОА отражает уменьшение образования и окисления ЭЯК. Синяекиэ коэффициентов АДО/О глк в гипер- так и в нормоксии при использовании активаторов СДГ говорит об увеличении вклада в митахсндркальное дыхание окисления ЭЯК, ' поступакедэй в цикл, как известно, преимущественно через реакции переашгаирозания ГКондравова M. Н., 1S87, 1989, 10911. Применение мзлоязта подтверждает данное предположение. Увеличение при его использовании величины АДФ/О (р<0.05) отрагазт повышение в процессе дыхания доли окисления НАД -зависших субстратов и оно более гырааано в гипероксии. Одной из пркчин этого помимо тормояэкия СДГ и снижения вклада в дыхание окисления сукцинат:., может быть и высокая степень. окиопэнностн НАД в гийерокски, стимулирухщая окисление дегидрогэназ.

Обнаруженная нами доминирующая чувствительность дыхания Их к АОА в нормоксии. Выявляемое увеличение почти вдвоеннпйируецэго малонатсм дыхания при добавлении et-ТО и jS-ОЫ и известный вклад окислэния ЭЯК в уровень дыхательной активности lis о кислящих смесь ШД-аависнмых субстратов Пйевскнй Е. И. и др., 1078; Окон Е. В. , , 19793, указывают на то, что установлзкнш различия а действии АОА : саяваны с различной степенью активации трансашшазного (быстрого) цикла окисления субстратов в lis и отражет разный уровень накопления ОАА в гипер- и яоршксиа, недостаточную эффективность путей : пвреаминирования в устранении ингибитора СДГ' в условиях гипэрок-

СИИ. . ;

В ксслздуэком иахш;г:з:.з вл5ятгя пкоро.тагксигх условий экс- ;

Рис.2 Влияние аминооксиацетата на скорость дыхания и сопряжённость окислительного фосфорилирования митохондрий мозга крыс в гипер- (I) и нормоксических кЮ условиях эксперимента»

а) - глутамат+малат, б) - глутамат+малат+аминооксиацетат (АОА), в) - глутамат+малат+АОА-иС-глицерофосфат^о-оксибутират, г) - глу-тамат+малат+АОА-уС-глицерофосфат+^-оксибутиратниалонат

1

Г

4

Рис.? Влияние цясгеина и ме.рхаптоэтанола «а дыхательнуя акмш-

Шть митохондрий мозга крыс окисляющих сукцинат в тгоер-и нормоксических \2) условиях элсвердненга.

Рис.1» Окисление НАЛ-аввисимых субстратов (малаг, пиру ват в присутствия налоната) митохондриями мозга крыс в гипер- (I) и норчзксмчвских (£) условиях эксперимента.

4

и

перимента на показатели дыхания !& мозга необходимо учитывать возможность прямого окисления кислородом 5Н-групп тиоловнх ферментов и, в частности, АТФ-аз и транса>,отказ С Елисеева C.B. и др., 1973; Лукащ А.И. и др., 1975; Smith R.Е. at al., 19823. Ш нашим данным, донаторы тиоловых групп цистеин и меркаптоэтанол (5-10 М), внесенные в среду инкубации te мозга, исследуемых в гипероксических условиях, повышали скорости дыхания органелл при окислении. Як не влияя на сопряженность окисления и фосфорилирования (рис.3). В нормоксии препараты не оказывали влияния на дыхательную активность Мх.

Рассматривая влияние условий исследования на 1'х головного' мозга крыс мы исследовали состояние как сукцинат, так и НАД - зависимой энергопродукции органелл. Как видно из рис. 4 в отличии от Як показатели дыхательной активно ■•и 3& при утилизации НАД-зависи-мых субстратов в нормоксии находились на уровне или были снижены относительно значений получаемых в гипероксии. Величина коэффициента сопряженности окислительного фосфорилирования при этом оставалась неизменной, время фосфорилирования увеличивалось. Более высокая скорость НАД-зависимого дыхания Мх а гипероксии очевидно обусловлена влиянием высокой концентрации кислорода как субстрата, • на восстановленность переносчиков дыхательной цепи и соответственно активность НАД-зависимых дегидрогеназ. В кормоксии, где Ух находятся в условиях максимально приближенных к внутриклеточным, степень окисленности НАД ниже (больше восстановленной формы кофер-мента - НАДН), что обменяет меньшие скорости дыхания органелл.

Таким образом, предложенные нами нормоксические условия выделения и исследования митохондрий позволяют сохранить ингибируэмда гипероксией сукцинат-эависимую и трансаминззнунз фрагецни дахааия органелл, ограничивает гиперактивкость НАД-зависимого дыхания, что в целом предупреждает развитие метаболического дисбалланса в системе «итохондркального окисления и приближает реакции органелл к таковым "in situ".

2. Влияние ишемии на функциональное состояние митохондрий моагз

крыс

Состояниэ процессов окислительного фосфорилирования в Йс юз-га изучали на крысах с окклюзией обеих сонных артерий ддигега-msîsD 3.5 часа. Контролем служили ложнооперированныэ яивотякэ.

Ранее СПЗяика О. П. , 1991; Казаков Е А. и др., 19893 Саяо показало, что рассматриваемый период rpevsH-д (3.5 "-crû a и2ймии является начатом изменений, которые оС-усяогят ктосгадстейп

-12 .гибель или выживаемость животных, и представляю собой "переломный" этап в течении циркуляторкой гипоксии. 11а основании этих работ бьшо сформулировано предположение о валкой роли реакций переа-шшированиз в . формировании адаптивной реакции системы здергопродукции мйзга на итмачесйое воздействие. Выявить некоторые механизмы изменений, компенсации нарушений митохондриального дыхания, которые, по нашим представлениям,• более близки к таковым "situ", . позволил разработанный нами способ выделения и исследования Ых мозга.

У 50Х экспериментальны:: животных, к концу третьего или вначале четвертого часа патологии, ш набявдали развитие,судорог. Такие животные погибали в течении суток. Те крысы, у которых в данный Еременной промежуток не развивались судороги - выливали. В ткани ко гга этих животных выявленные изменения величины рН и содержания лактата,.были шкее вырезаны по сравнена» с первыми (табл. 1).

Таким образом, по факсу возникновения судорожных припадков в течение 3-3.5 ч. и&шии ш разделили мшотмык па группы устойчивых ("бесаудорожные") и неустойчивых ("судороаныэ") к двусторонней окклюзии сонных артерий.

Как видно из рис. 5 iix крыс разных групп через 3.S часа ишемии находятся в принципиально различных иетабодкчаскях состоящих. У . животных, неустойчивых к иоешш шгга, в традиЕСвонныж условиях инкубации, • наблюдалось выраженное угнетение сукцзнат-завпсиюго дыхания и разобщение окислительного фосфорилирования.

У Мх "бессудорожных" животных (рис.Б) все показатели дыхания органелл находилась на уровне значений ложнооперироваиных крыс.. .

Использование в среде инкубации органелл совместно с Як Глу или смеси «й-ГО иJr<M способствовало контрастировании изменений вызываемых гашмией и приводило у "судорожных" крыс (рис.5) а первом случае к снижении, относительно исходного уровня, митохондриального дыхания. В то же время, Глу, внесенный совместно с Як в среду инкубации Ых "бессудорояных" животных, повышав V3, V3-V4, СД, ДК, снижая время фосфорилирования при кеиаценном АДй/Q как относительно исходного уровня, так и контрольных значений. Уровёаь т-СДГ составлял 25Х, превышая контрольный и выявляемый у "судорожных" крыс (т-СДГ- -14.8).

При внесении в среду инкубации совместно с сукцинатом od-ГФ иji-ОИ (рис.5) все показатели иитохондриального дыхания неустойчивых к ишемии крыс оставались ка исходной уровне. Реакция ка активаторы СДГ отсутствовала,.. коэффициент т -СДГ был равен нулю.' У устойчивых животных (рис. Б) при использовании с сукцинатом J?ГФ и A-OU в изменении показателей дыхания наблюдались те же зако-

номерности, что и при внесении Глу з среду инкубации органелл этой группы.

Тагам образом, к 3.5 часам ишемии мы видим развитие двух типов реакций iíx шага. Первый тип характеризуется снижением скорости окисления Як относительно контроля и отсутствием иди извращением эЗФ-зкта активаторов СДГ ("судорожный" крысы). Ко второму типу мы отнесли реакции 1& "Сессудорохных" таготннх, у которых скорости окисленкя Як были на уровне контрольных показателей'и наблзздалось стимулирующее действие активаторов СДГ.

Анализ полученных данных с позиция рохл т-СДГ в регуляции ЩК С Кокдраиова М. Н. и др., 19873 позволяет предположить, что перед' нами разная степень развития патологического процесса, у группы "бессудсрожных" и "судорожных" крыс, з основе которой лежит- различная глубина т-СДГ. У первых'- . ладь пая стадия патология и, по-видимому, выявленная нам: активация окисления сукцината в Ых этгас животных является ре гуль тате к актпдгция сеттеед образования й-оккслэния Як. А у вторых - углублен;« патогенного воздействия, связанное с сильным торможением'фермента и, как,' следствие угнетением сукцрнат-аав:юимого дыхания.

Приведенные результаты катах экспериментов согласуются с по- ■ лученными, а традиционных условиях исследования, данными СГЬнина О.П., 1991] об изменении иктохоадриаланой анергопродукции и, в частности, систем окисления сукцяната, на рассматриваемом этапе циркуляторной гипоксии.

Вместе с тем, проведенная наш оценка вклада скиедэгон. ЗЯК, у "бассудорогггкх" животных, на выявила оястдгадаго увеличения его в исследуемом временном периоде (рис. 0). •

Определение вклада продукции ЗЯХ в нормокоивдеюне условиях (рис.6) показало, что данный показатель йа 120S превосходят таковой'з гияерокски и превышает коягродыт гзнаедпг? в-э?ах тегэзиязс. Таким сбрагом видим, в гиперокеиа, то.ос» з традиционных условиях исследования, маскировку вмичяны этого сшсззагеля, что (¡оркирузт ложное суядекие относительно реального состояния митохондрий. -

Помимо этого, если в гдаерошя "слабый" вкгпаатср СДГ - Глу устранял т-СДГ з такой ад »яре, кек Солео a£$ss»inuaie c¿-T3 н^1-СМ (ркс. 5), то в нормокаии он з бальсэй стисни,• чзи послэдниэ снимал ингибированке фермента (риз. 7), пркчэм сгарссгь ыаявного дыхакяя при этом бела . выше Kostpcmsaro значения з эгях условиях (р<0.05). Выявленная ссобоппоста » рзиздз на Глу и чуЕстаятюа-ность дыхания к АОА говоря о преейгадаяиа на данной с??л?!п патологии реакций перегасип-ровааяя епсссбстЗуи;» эфЙёкпэвдадг удзаэ-нкэ накаплкваквдгося ОДА и посгазгя аженрующгй СДГ - ГЯ&

Г

АД г^дД

Рис.5 влияние антигипоксантов на окисление сукцяната □ гиперокси-ческих условиях эксперимента, до (<■) и после внесения совместно с сукщшатом активаторов СДГ: оС-глицеро^осфата и Й-окси-бутиратд (—) или глутамата . ^

1 - контроль| 2 - ишемия не сопровождалась судорогами, 3 - ишемия сопрово«далась судорогами, 4 - ищеыия-кЫоксипин, 5 - ишемия+натрия оксибутират

| ?

I

га

щ 1 ••Ш '

Ч

# г- . II. &А -

Ж Г ш

4 1 1 ш

Рис.6 Вклад окисления эндогенной янтарной кислоты в дыхательную активность митохондрий в гипер- С33) и нормоксических <РЩ условиях эксперимента. Обозначения как на рис.5

1

ягт*—

Рис.? влияние антигипоксантов на окисление сукцината в нормоксических условиях эксперимента, до (*•> и после внесения совместно с сукцинатом активаторов СдГ: «А-глицерофосфата и ¿-ок-сибутирата (—> или глутамата Обозначения как. на рис.5

V

Как видно, нарастание хз гипероксии т-СДГ l'-x "бессудсрожных" животных обусловленное помимо накопления ОАА и окислением SH-групп тиодозмс формантов, в частности, трансаминаэ, кислородом СДукал А. It и др. , 197G; Smith R. Е. et al., 19823 не устраняемое даже такими мощными активаторами СДГ, как об-ГО и Jb-QU, носит более выра-кзшшй характер, ч'ем в нормоксли и, таким образом, частично нивелирует особенности окисления сукцината при данной патологии.

Таким образом, в Мх мозга "бессудоронных" крыс, на;я1 выявлена активация сукцинат-зааисимой энергопродукции, сопровождаемая торможением СДГ. Известные закономерности' развития т-СДГ свидетельствуют о компенсаторном хараетере механизма ограничения чрезмерной активности митохондряального окисления и дают основания рассматривать этот механизм, как один из способов запеты Мх от повреждения ГКондрашова litt и др., 1977; Кондравова Ii Я , Григоренко Е. В., 1981 j Кондрапоза VL Н. и др., 19873.

У "судорожных" животных, как было отмечеяо выше, налицо углубление патологического процесса, связанное с сильной "депрессией" фермента (рис. 5, 7).

Очевидно, судорожный припадок характеризует еде большее нарастание т-СДГ, по сравнения с "бессудорожными" животными. Глубина патогенного влияния развивающейся ишемии на мозг настолько велика, что активаторы фермента теряют способность устранять влияние ОАА и метаболитов биогенных аминов (содержание последних в ткани мозга при судорогах значительно увеличивается С Григоренко Е. Е и др., 1983; Кондрапова Ы. Н, и др., 1937; Лризчэнкова Р. С., 19743). Это, по-видимому, обусловлено сильным эакислением среды (табл.1), накоплением лактата (табл. 1), неспособностью реакций переаминирова-ния эффективно удалять образующийся ОАА. Последнее может быть связано : истощением пула аминокислот, в частности Глу, который является одним из важнейших источников ЭЯК СКондрашова М.Е , 19913 при ишемии, а в гипероксии и прямым ингибирутщим влиянием кислорода на трансаминазы и ATО-азы Их. Высокий уровень ОАА при судорогах, является следствием не только интенсивного окисления Як, но и карбоксшшроваяия, накапливающихся при судорогах ФЕИ и пкрувата CKing L. J. et al., 10733. Одной из основных причин выявляемого глубокого т-СДГ в данном случае возможно становится и рост окисле нности дыхательной цепи в области 1 пункта сопряжения вследствие гипероксических условий эксперимента.

Итак, выявленные нами различия а реакции Их окислягщих сукци-нат, у "судорожных" и "бессудорояных" крыс, характеризуют разные стадии одного патологического процессе (ишемия), такого рода отличия могут быть связаны с разной глубиной т-СДГ и отражают разную

• - 16.

степень предшествующей нагрузки на систему энергопродукции и активности траясаминазных путей поступления субстратов в реакции окисления. Возможно, это связано с индивидуальными особенностями состояния системы окисления сукцината до ишемии у различных животных и различиями в самой реакции крыс на циркуляторную гипоксию.

Гипоксия приводит к ингибированию, прежде всего, НАД-зазиси-Мых дегвдрогеказ [Лукьянова Л Д., 19891, то есть угнетает окисление Ых.НАД-зависимьк субстратов. Результаты наших исследований показали значительное нарушение при ишемии "чистого" НАД-зависимого дыхания как в гипер-. так и в нормоксии (рис.8, 9).

однако, как показано ранее, в гипероксических условиях эксперимента повышенное, по■ сравнении с внутриклеточным, содержанке кислорода как субстрата, .высокий уровень окисленного НАЛ, активирующих НАД-зависимое дыхание, частично видоизменяют ответную реакцию их, а таким образом, и полученные результата Использование нормоксических условий, позволквнее устранить указанные влияния показало большее угнетение относительно контрольных значений, по сравнению с гипероксией, НАД-зависимого дыхания "судорожных" животных (рис.9). У "бессудорожных" крыс (рис.9) в нормоксических условиях достоверно сниженным был диапазон дыхательной активности УЗ-У4о, коэффициент ДК н увеличена скорость У4о, которая превышала У4п. Другие показатели дыхания Ых находились на уровне контрольных . значений. .

Приведенные результаты исследований в нормоксических условиях показывают, что.уже в.начальной стадии патологии происходят сдвиги (хотя и незначительные) в показателях "чистого" НАД-зависимого ды-хация (которые маскируются в гипероксии) прогрессирующие с углублением патогенного воздействия. *

. Тага» образом, .выявленные различия в окислении Ых НАДзависи-мых субстратов у "судорожных" и "бессудорожных" животных, подтверждают высказанное ранее предположение о том, что перед нами разные стадии одного патологического процесса (ишемия), связанные в данном случае с разной степенью -ингибирования ВАДзависимого дыхания,- веладетали различного уровня содержания НАД в начале и при углублении.патологии.

Итак, трехчасовая ишемия мозга крыс, вызванная двусторонней перевязкой сонных артерий приводит к повышению уровня лакгата, снижению величины рН в ткани шгга. С четвертого часа ишемии начинается гибель 602 животных, одним из предвестников которой являются судороги. Выделенные митохондрии мозга "судорожных" крыс характеризуются глубоким низкоэнергетическим сдвигом: снижением скорости фосфорилируювдго дыхания, ростом дыхания отдыха относи-

тельно дыхания покоя (V4o>V4n), увеличением времени и спикэшюц степени сопряженности процесса окислительного фосфорилкрования, угнетением процесса утилизации ингибитора СДГ ОДА. Изменения выявляются как при окислении сукщшата, так и НАД-зависимых субстратов. У Их животных без судорог выявлено активированное состояние характерное для начальных стадий патогенного воздействия, здесь налицо также низкоэнергетический сдвиг, но швьшй по значению, благодаря чему он активирует дыхательную цепь и может быть компенсирован фосфоридированием.

3, Влияние эмоксипина и натрия оксибутирата яа дыхание ипохондрий мозга крыс при ишемии

Профилактическое внутрибрюашшоо введение эмоксипина и натрия оксибутирата, несмотря на достаточно тяжелое гиг.оксическое воздействие, каким является двусторонняя перевязка сонных артерия у крыс, предотвращало возникновение судорог у всех ишемизированных животных, to своему внешнему виду и поведению ишемизированные животные не отличались от контрольных. Определение уровня лактата и величины рН в ткани мозга таких животных, выявило уменьшение первого и увеличение второго по сравнению с ишемизированными крысами без введения препаратов (табл.1).

Все показатели дыхания Мх при утилизации сукцината и НАДзави-симых субстратов оба препарата поддержизали на уровне значений ложнооперированных животных (рис.5, 7, 8, S). При окислении совместно с RKt¿-ro иJ>-Oll эффекты эмоксипина и натрия оксибутирата были аналогичны наблюдаемым в группе ложкооперироваиных животных (рис. Б). Однако, среднее арифметическое т-СДГ в группе получавших прег раты животных было в use контрольного уровня. Внесение совместно с Як в среду инкубации Глу выявил» различия в действии препаратов. Как видно из рис. 5 реакция l,ix мозга животных, получивших эмоксипин, на внесение Глу 6oáee выражена, чем на «i-ГО иJr OIL И отличается от таковой в контроле и у получавших натрия оксибутират крыс. Если оксибутират способствовал развитию сходных с контрольным изменениям показателей дыхания органето эмоксипин давал более выраженный по сравнению с оксибутиратом и контролем прирост относительно исходного уровня скоростей дыхания, особенно V3; диапазона функциональной активности, коэффициентов СД, ДК, снижал Тр при неизменном АДФ/О. Степень т-СДГ превосходила аналогичные значения в контроле и у получавших натрия оксибутират на 100% и 110JC, соответственно (р<0.05).

Еыявлэнные различия в реакция 1& на шгппмторы СДГ при воз-

г г

л я ^ я л

Рис.6 Влияние антигипоксантов на окисление НАД-зависимых субстратов (малат. пируват в присутствии малонага) в гиперок-сических условиях аксперимента. Обозначения как на рис.5.

I-

АЛ*

к л. л

Рис.9 Влияние антигипоксантов на окисление НАД-зависимых суб. стратов (малат. пируват в присутствии малоната) в нормок-сических условиях эксперимента. Обозначения как на рис.5.

действии аиоксштека и оксибутирата еще более контрастны в вормок-сичзсккх плозиях исследования. Применение последних п эксперименте показало (рис.?) большую выражзнкость, по сразкгппз е Ух контрольных и предварительно получившие натрия оксибутират зиготных, ответных реакций органелд, окисляющих сукцинат один и в присутствии £¿-1X5 и^-ОЫ или Глу, крыс леченных эмоксипшюм. Пркчэи, вдесь также как й в гипероксии реакция на внесение Глу была Солее выражена, чэм на^-ГФ и^А-ОУ, а значений коэффициента АДЗ/О было снижено по сравнению с исходны« показателем в этих условиях и аналогичным в гипероксии (рис.5, 7). Показатели дыхания их окислявши сукцкнат и сукцинат совместно с-^-ГО и^/-ОН, группы животных получавших натрия оксибутират, находились на уровне аиачеккй показателей локнооперировшшых крыс (рис. 7), а яри использовании Глу выявлено снижение, по сравнению с последними и с органелдаки леченных эмоксипином, величины т-СДГ (рис.5, 7).

Таким образом видно, что введение препаратов предотвратило возникновение неблагоприятных сдвигов в показателях окислительного фосфорилирования. Эмоксипин и натрия оксибутират способствовали сохранности-при ишемии всех анализируемых параметров как сукця-иат-, так и НАД-эависимого дыхания. Причем, эмоксишш оказывал более выраженное заидатное действие, что отчетливо показала прш,знание нормоксическях условий исследования Их, отражающих наиболее близкую к реальной внутри клетки ситуации картину.

Эта сторона метаболической эффективности препаратов особенно отчетливо проявляется при сравнении полученных данных с показателями ишешзированных животных без введения препаратов. Большинство показателей получавик препараты крыс как в гипер-, так и в нор-моксических условиях исследования статистически достоверно отличаете: от таковых у Ых животных, неустойчивых к пиемии мозга (рис.5, 7, 8, В).

Так как устойчивые к гашш яивотныз способны компенсировать проявления данной патологии, в том числа и на уровне !£х (рис.5, 8), по-видииоиу, аффект исследуемых препаратов проявляется только на неустойчивых крысах. Однако, в связи с отсутствие» судорожных припадков, разделить крш по устойчивости к недостатку кровоснабжения в группах, получавших эмоксишш и натрия оксибутират, на представляется возможным.

Исследуемые а традиционных условиях Мх яявотных, профилакти-часки получавших зьюнештин и натрия окепбутират, функционально почти по отличались от органеда крыс устойчивых к ишемии мозга, иожао лнаь отштить, что сроднее знзчэнкэ по!шзателя т-СДГ при окисления сукцивата совместно с Глу у получавшие натрия оксибути-

рат было ниже, а эмоксипин вше аналогичного значения Их "бессудорожных" крыс.

Дрииенение же нормоксических условий исследования, позволившее Солее достоверно говорить о реальном состоянии to, выявило контрастирование различий (маскируемых гипероксией) ыедду показателями юыемиэированных. без введения, получавших препараты животных и последних между собой (рис.7).

Если введение натрия окскбутнрата не вызывало изменений показателей дыхания при утилизации органеллами сукцината относительно значений "бессудорожных-" крыс, то эмоксипин снижал скорости дыхания в состоянии покоя и отдыха, увеличивая при этом диапазон дыхательной активности (рис. 7). При внесении совместно с Як активаторов СДГ об-Г® иJi-OM препараты способствовали Солее выраженному, по сравнении с органеллаш "бессудородиьа" крыс увеличению расчетного показателя т-СДГ, повьшекпю диапазона дыхательной активности,.снижении Тр, при неизшкном ДЦФ/0 (рис.7). При использовании Глу различия Ох устойчивых и получавших антигипоксанты животных стали екэ более показательны (рис.7). Так, эмоксипин выаьаал, по сравнений с органеллаыи первых, больший рост т-СДГ, величины диапазона дыхательной активности, снижение Тр при неизменном АДГ/Q (рис. 7). Показатели дыхательной активности крыс леченных окскиутиратом были ниже ни на уровне аналогичных у"бесаудорожных" мастных (рис.7).

Оценка дыхательной активности Ш при утилизации НАД - зависимых субстратов не выявила достоверных различий ыежду устойчивыми к ишшжи'и получавших препараты группами акваткых (рис. 8, Q).

Кз выдакзлоланного видно, что введение окскбутнрата натрия » эыоксипика при двусторонней перевязке сонных артерия, лредотвргща-ет .возникновение судорог и нарушение энергетического обмена Мх мозга, характерных для ишемии. Однако, эффект препаратов на процессы митохондриального дыхания был разной степени выраженности. Если "чистое" ШД-аависидое дыхание как эмоксишш, так и натрия оксибутираг одинакова поддерживали ка уровке контроля. То их эффекты на систеку окисления сукцината отличались, эртя и были одно-направлеяы. Особенно ярко эти различия проявлялись в присутбтвии активаторов СДГ. Выявлении особенностей в действии препаратов способствовало использование нормоксичаских условий исследования, позволившее, устранив неблагоприятные аффекты гипероксии, выявить Слизкие к действительным эффекты препаратов на процессы иитохонд-риального окисления.

Анализ полученных результатов с известных позиций формирования адаптивной реакции организма на уровне lix СКондрашова Ы.Е , 1975] указывает на усиление под действием эмоксипина и натрия ок-

сибутирата компенсаторных реакций оргаяелл, направленных на активацию прежде всего системы окисления янтарной кислоты. На это указывает и оценка вклада окисления ЗЯК. В гипероксии этот показатель оба препарата достоверно повышают относительно значений ишемкзиро-ванных животных до контрольного уровня. Определение его в нормок-сии, исключившее иягибирувцэе действие кислорода, показало, что под действием эмоксипина и оксибутирата он превосходит на 141 и 35| соответственно, таковой в гипероксии и существенно превышает значения контрольных, устойчивых и неустойчивых к ишемии животных в этих условиях (рис.а). Причем, при введении зиоксипина вклад ЗЯК более выражен и превосходит на 77%. таковой под действием натрия оксибутирата (рис, в).

Таким образом, вновь видим, что нормоксия способствует раскрытию, маскируемых в традиционных условиях исследования, близких к реальному состоянию особенностей митохондриаяьных процессов окисления, в данном случае, такого важного показателя как вклад продукции ЭЯК, отражаюоргс характер адаптивных процессов в энергопро-дуцируквдзй системе СКондрашова М.Е, Маевский Е.И. и др., 1973; Кондрашова И Н., 1975].

Исходя из приведенных выше данных, запдатное действие натрия оксибутирата, по-видимому, можно объяснить с позиции превращения его в цикле Робертса - обходного пути между двумя членами цикла Кребса: кэтог.ьотаровой и янтарной кислотами. Как известно £ Багрова Т. А., 1976; Кондрашова И Е , Ыаевский Е. И. и др., 19731, это является важнейшим метаболическим путем адаптации системы мито-хондриального окисления к гипоксическому воздействию.

Особенность воздействия на функции Мх эмоксишша заключалась: во-первых, в большей выраженности, по сравнения с натрия оксибути-ратс , эффекта на митохондркальное окисление несмотря на значительно меньшую концентрацию. Во-вторых, в повысении резерва активности сукцинат-зависимого окисления, что проявлялось в росте скоростей дыхания при внесении как <Л- ГФ и^-ОЫ, так и Глу и отражено в увеличении коэффициента т-СДГ. Зтот показатель как при окислении сукцината в присутствии «¿-ГС5 иЦ, так и Глу под действием эмоксипина был статистически выке, чем у ложнооперироваяных крыс, устойчивых и неустойчивых к кзамии животных, и животных получавших натрия оксибутират. Третья особенность - это большая выраженность реакции органалл на "слабый" активатор СДГ глутамат, как в гипер-, так и в нормоксии (ряс.6, 7). причем, как видно иэ рис.7 в нормоксии, в условиях максимально приближенных к внутриклеточный, она была более вырааэна и значительно превосходила аналогичную у всех кослэдуемых групп зетоткшс, з такта, выявляемую а

егой группе крыс, реакция на внесение Глу в гтероксии.

Наличие столь выраженного эффекта Глу,' который даже в гипе-роксических условиях эксперимента способствовал более эффективному, чем "сильные" активаторы фермента «¿-ГФ и^-ОИ, удалению ингибитора СДГ ОДА в Ш получавших эмоксилиз крыс; чувствительность дыхания к АОА и увеличение вклада в окисление ЭЯК (о чем свидетельствует и выявляемое в нормоксии снижение, при окислении совместно с сукцинатом и-ГО и _/-0И или Глу, коэффициента АДФ/О (р<0.05), наиболее выраженное при использовании Глу) подтверждает положенное в основу работы предположение об усилении под действием эмоксипина компенсаторных реакций их, направленных на активацию системы окисления сукцкната и, прежде всего, трансаминазных реакций его образования. Вероятно, препарат и за счет известных анти-оксидантных свойств СВурлакова Е.Б. и др., 1965; Каган ЕЕ., Брат-ковская Л. Б. и др., 1983; Шзедова А. А., 1986), предохраняя мембранные структуры Их от повреждения, способствует поддержанию процессов окислительного фосфорилярования на данной стадии патологии.

Выявленные штохондриальные эффекты препаратов в значительной маре обусловлены и снижением явлений лактацидоза (табл.1), что может Сыть связано с выявляемым при введении препаратов, усилением продукции ЭЯК, которая оказывает активное гнтиацидотическое действие С Ким ЕЕ, 198?; Ыаевский Е. Я идо., 19841.

Итак, профилактическое введение эмоксигоша и натрия оксибути-рата препятствовало развитию судорог, нарастанию явлений лактаци-доза в ткани мозга ишевдсзировааньк животных и предотвращало возникновение неблагоприятных сдвигов в показателях мктохондриадьного дыхания. Выявленная активация системы окисления сукцината, на фоне слабо изменяющегося окисления НАД-эависимых субстратов и наличие защитного аффекта у препаратов, усиливающих ату активацию, позволяет сделать заключение о компенсации и даже суперкомпенсации кии кизкоанергетического сдвига оря ивемия шага путей перехода Ш на преимущэствешюе окислэикэ Як. Сравнительная оценка натрия океибу-тирата и амоксишша показывает, что несмотря ка определенную схожесть в действии препаратов ка энергетический метаболизм дазга выраженность и механизм этих аффектов различны. Натрия океибутират компенсирует ниакоанергетичаский сдвиг сохраняя показатели мито-хондриального дыхания на уровне близком к контрольному. Эизксигаш способствует суперкомленсации иизкоэнергетического сдвига существенно стимулируя дыхание Их, через повышение сопряженности окислительного фосфорилирования и усиление поставки ЭЯК, посредством стимуляции "быстрого" траксаыиназкого пути окисления, и таким об-

разом, в .большей степени, несмотря на значительно меньшую концентрацию, влилаз на реактивность систем! окислительного фосфорштро-вания, чем натрия оксибутират.

ЕНЕОДН

1. Чэрез 3. Б часа после двусторонней перевязки сонных артерий у неустойчивых к неполной генерализованной кетмии мозга крыс наблюдается глубокий пизкоэнергетичэскяй сдвиг, характеризуемый выраженным угнетением дыхания митохондрий, разобг^нием окисления и фосфорилирования; у устойчивы:: к игэюн ливотя энергопродуцирую-е?ш функция срганэлл находится на уровне начальной стадии дизкоэ-нергетического сдвига, з состоянии комлепсаторпой активации.

2. Состояние системы' сукцинат-зависимой зиергопродукции играет доминирующую роль в формировании адаптивней реакции органа на кяэ-мию и поддерживается эа счет поставки эндогенной янтарной каеяотн реакциями переаминирования.

3. Предварительно введенные крысам эмоксипин и натрия оксибутяраг препятствуют развитию при ишемии патологических сдвигов в энергетическом метаболизме шзга поддерживал процессы китохондриалького окисления на разных уровнях начальной стадии низкоэнергетического сдвига. Иориализупцэе действие эмоксипияа более выражено по сравнению с натрия оксибутиратом.

4. Механизм нормализующего действия эмоксипина и натрия оивибути-рата на процессы митохондриального окисления при циркуляторяой гипоксии связан с активацией образования и окисления эндогенной янтарной кислоты.

Б. Эмоксипин и натрия оксибутират устраняют ингибированиэ НАД -ваг -оимого дыхания митохондрий мозга крко при циркуляторшзй гипоксии, поддерживая его на уровне такового у ¡азнтролышх яшоттле.

6. Применение разработанного паыи нового мэтода получения и исследования препарата митохондрий мозга способствовало сохранности сукцдаат-зазясикой и трансюлшазкой фракций дыхания ерганелл, ограничивать гиперакгквацип НАД-вагяспиого дыхания, что позволила выявить вклад реакций переашигроязппя в ютохондриальное окисление при циркуляториой ГИВОКСШ1 И Д9ЙСТГТ!Э СКИВППИНа И нзтрш 0!!-сибутирата

- 24-СПИСОЙ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ Ш ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Поборекий А. Е Исследование дыхательной активности митохондрий шага крыс в условиях регулируемого состава газовой среды/ Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов. - Томск, 1990.- Т. 4.- С. 200-201.

2. Казанов В. А., Панина О. П., Поборекий A. R Фармакологическая коррекция нарушений энергетического гошостааа головного мовга крыс при ишемии/ Актуальные проблемы фармакологии и поиска новых лекарственных препаратов. - Томск, 1990. - т. 4. - с. 220 -222.

3. Хазаиов а А., Поборекий Д. Е Регуляция кислородом метаболических реакций митохондрий мозга/ Тез. докл. Всесоюзного совещания 'Ч&лекулярные механизмы и регуляция энергетического обдана".- Пу-щино, 1990.

4. Хазанов Е А., Панина 0. П.Поборекий А. Е Исследование функционального состояния митохондрий мозга крыс при циркуляториой гипоксии/ Тез. докл. Всесоюзного совещания "физиология и биоэнергетика гипоксии".- Яузяно,1990.- е. 18.

В. Поборекий А. Е , Хааачоа В. А. Предупреждение амокзипинои нарушения энергетического метаболизма митохондрий мозга крыс при церебральной нхэмии/ ?аа. дока Всесоюзного совещания по результатам клинического и экспериментального исследования препаратов 1 и 31 эмоксипина и иексидола. - ¡¿осква,1891.

В. Хазанов Е А., Поборекий А. Е Сункциональноэ состояние митохондрий мозга крыс при острой циркуляторной гипоксии и профилактическом введений зшксипина/ Фармакологическая коррекция гипокси-чееккх состояний (материалы 2-ой всесоюзной конференции).- Гродно, 1991.- 0.183-164.

7. Itaborsky А. N., КЬагапоу У. A. Rats brain mitochondria functional condition under metabolic lantecidosis; antilsohemto drugs treatment action/ з-rd Con&. ¿ss of the Bulgarian pharrracological Society: abstracts. - Sofia, 1990.- p. 351.

8. КПагапоу V. A., Panina 0.P., Poborsky A.N., Oleimk N.6. grain mitochondrial reactions under circulation ischemia/ 20th Meeting of the FEBS: abstracts.- Budapest, Hungary, 1990.- p.30.

0. №агзпо/ V.A., Kondrashova IAN., Poborsky A.N. The correlation of Krefcs oyole and transamination reactions in rat brain mitochondria under normoxia and hyperoxia conditions/ 16 -th International Congr-ess or Biochemistry: abstracts.- Jerusalem, Israel, August 4-8,1991.

Заказ ОБО Тираж 100 '"V"".