Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Влияние экспрессии чумным микробом железорегулируемых высокомолекулярных белков внешней мембраны на функциональное состояние макрофагов

«а

гг '

-г

На правах рукописи О

ТИХОНОВ СЕРГЕИ НИКОЛАЕВИЧ

ВЛИЯНИЕ ЭКСПРЕССИИ ЧУМНЫМ »МИКРОБОМ ЖЕЛЕЗОРЕГУЛИРУЕМЫХ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ БЕЛКОВ В11Е1ШЕЙ МЕМБРАНЫ НА ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ МАКРОФАГОВ

14.00.36 - аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискании ученой степени кандидата модшршских наук

Саратов - 1995

- г -

Работа выполнена в Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб".

Научный руководитель: доктор Медицинских наук, профессор Ледванов М.Ю.

Офшдеальние оппоненты: чл.-корр. РАШ, проф. Адамов А.К.

к.м. н., старший научный сотрудник Саяяина Л.В.

Подущая организация: Ростовский-на-дону научно-исследо-

вательский противочумный институт.

на заседании диссертационного совета

В Российском научно-исследовательском противочумном

институте "Микроб" (410071, г. Саратов, ул. Университетская, 4(

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке института "Микроб"

Автореферат разослан " 1996 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Девдариани З.Л.

1996 г. В ^ ч,

часов

л-Ч ГУАЗЬВОСТЬ KPOüíl-lSI. Важное значение « сиет*?мо проткио') ігидомі.ческш мер по отиошеюто к чумкой инфекции имеет с:ірці;?'-і-пМектинпость которой непосредотченпо снч-гпіі’і с ;тостижешкіми в области иммунологии чуми (Анисимова Т.М. с солит., 1083; Слі..л'ловз Л.В. <: соавт., 1080, 190?; Горькова /.В. с eenгг., l&öl, 1987. 1.990, Шанина Л. Н. о сочит.,

1935,І9В9; Иохин IT. Ií. с соавт. , 1987; H.;y пі ;ь H.H. <: co:;ft. ,

Я95)0; Наумов Л.В. о сопт.с. , 1992). Течение инфекционного )і ваН-ЦЛШШГО ГфОЦОССОВ ПРИ Чуііе Б 3!П1ЧИТЄЧЬН0Й СТС.'ІКМІН ЗРЙИСИТ от исхода ісз.іімодєїіс.гвия в? .(будите ли с клетками ноноцитрнс-^ыо-цитарноЯ системи (Mí-С) (Пустсвалов В. Л. , 1 Í'-Pi. Ш>Ь; .’Іеднньоп

Н.Ю. с соавт. , 1989, 1992). 1!з всех физиологически .іктїпііі!«

микроэлементов, способная влиять па результат такого взаимодействия, наиболее важнуи рол'> зіграет жлезо. Это гвлзано о тем, что, как и болылшстЕо бдитepffft, чумной микроб является феррозависимим (Burrov/s І.Ь'., I960). Для его роста абсолютно

необходимо железо (Кравцов В.Н. с соавт., 1937; Тянянова ВЛІ. с соавт., 1983). Концентрация этого катиона определяет по только

интенсивность размножения чумного микроба, но и ого вирулентное свойства (Лваняк Л. Л. с соавт., 19G5; Кутмрев В. К. с co¿‘i>r. , 1989; Ввдяева H.A., 1992). Иехдчизм», иоддерлзтачіщие і-.пииентр.і-Ц)ііо свободных ионов железа в макрофагах на минимальном уропііс, запредельном для утилизации микробом, могут рассматриваться как бактершрїдіше (Ледванов М.Ю. с соавт., 1990; Cohen M.S. et a!; 1908). В плетках ítíC имеется ряд специалмзированчнх ,гелкикчт-зі-шаю^ріх белков, конкурирующих с воабуянтелем чумы за гони железа. По существующим представлениям снижение свободных ионов железа в макрофагах является сигналом для зкспрессш: микроорганизмом', в том числе и чумним микробом, т.н. железо-регулируемых белков, E. Carniel et al. (1987) показали продукции вирулетними штаммами чумного мироба in vitro нескольких высоко^олеиулярнмх мембранних Зелков, обеспечивающих, по зеей видимости, выживание вирулетних штаммов в клетках системи фагоцитирующих мононуклеа-роз. Однако роль этих белков в иммунопатогенезе чумной ни *ек~ цин, условия их экспрессии in vivo практически не известии. Но изучено влияние экспрессии этих белков ка функциональную активность макрофагов - клеток играющих ключевую эффекторнуи роль в

o'n-^r'.'vjüHíi .'^ivniii! vwíiii■ Wi'iiCH f‘ нфічфгаїїхїма :*

чуми. Тії л-,..' - ьр> .'n.v.'i ;>:koc ь ó.Vi.'O ! '

IX,;’, ЧЛ'ГГ^г.Х'Ч. иго'чнть ь'.'^пімзиу влияния

:c;¡w чуміН1».: : ."¡{¡/Oí'O-i дкшомюну/ lyiivx • !-‘Ji ^о-рргул.;руь— мих 6,?.іі'.оч ві!;;шя»;і' нонбс-.і." н их о'.’і.чоіпіі’;: препаратов на ?>унч-пночмінук- nwLvnv- ухь »*;* •.роілгсж.

ot'MOPHb’û ;«•

і. иссл.дозї.\и« экспрессии) ;к'Л.Р'ЧіМ;.ш штабами чум».оіо *»ш-І»< >»»и г «місзо- регулируемых и'хої’.оі.ч.теї.ул'ірш.г. белков вимаїи-й M*«t:üi>3'iu in vitro и in vivo.

Ü. і!олуч;іГЬ o'lKi.vtie.’.ti г.'ренлр.'.'ги №лег<с-р'?гулпругмілї нь»;о-комоле:-:уля;>>іьи белкой д.чєсіїієп ¡!í;i Оилі'н чумного мікроба і‘ изучит'; ІГХ lip'JTOiîTHEr’CCTb.

3. Определят;, илччниг \л«:іірессии чумні-’м микробом ішсономс-ле>'.ул5;рШ4* й;рлук'.-і>игу.'ілг.унннк белпин ішети:?». мембрани ііа ціушч-циіз гполород-завискі-іі.'х бактерицидних систем маї-.рофаток.

4. ИпуЧЛЇЬ РЛЯЯІІИе экспресс»!', чумси.ч «ИКрОбОМ ІШСОНОМОЛО-

г.у/иіпііьтх мыто-рогу jDipyouws бел .¡an пт;ш;иії «ембракы па a ¡vdiv-ность хроматика - центрального генетического аппарата макрофагом. '

5 Установить механизмы клияния зкспресгачі чумним ммкроОоь високомолег.улярнкх желеао-регулируемкх белкон унеичеії мембрат иа состояние долгое опального аппарата макрофагов.

ILW^ELAil НОВІША. Впорвиэ с использованием метода ДНК-зон-дигрсгпгшм :і природних очагах чуми (бившего СССР) обнаружен! штамма, имеющие run, кодирующш'і синтез яелезс-регулируемогі ме;.ібраі:::оіо белка с молекулярной массой 130 кДа. Изучена эко иресопя in vitro в оптимизированных условиях дефицита желез; мембранній белков с молекулчрноії массой 190 и 240 кДа. Новик являются даши/е о способности синтеза .т.елазо - регулируемых вмсо комоленулярних мемб ¡>аниих бел кон in vivo в имплантиропзшш внутрибркштно морским скинкэм диффузионных камерах. С помощь модифицированного метода гель-хроматографки получен« очищенні; препарати железо-регулируемых белкой чумного микроба.

Впервые с использованием метода хемилюмииесценции обнару жена способности желе?е-регулируе>мііх высокомолекулярных белке • чумного микроба (очищенных препаратои и штаммои, экспрессирук щих данире белки) нарушать продукция макрофагами кислородааву енмых Факторов баг. ч еркцкд н о сти. Очищенные препараты мелезо-pt

гулируени.т (ie.TjhOB способность к1 надушать «¡юдумцім б:\л -ГО-ПЛЦИЦНЬ'Х раДЧИГ>’;ОВ lUlCjJOpCTVl, СХОЖУЮ С ,!К:ІЇСТШ!ЄМ И.ЧІіСу ':і,Ч0ГО ппгзггсип чумного miispoPa.

¡b £ °

S

?

й

b:

2

* *

-Г5 2£

iZ X

12 ■5 ¿=ч

2? г: Ä., X

ГС ж ÍT ц

К г- 2

•г*

>> о Ci

X к н 5

С - І* •Z л

o' X

r § с, 1C 0 £

5: s; с. х Ь

о •í^ rj Sí

о *3 Ci

z¿. г* X О *■*

С*3

W н •*3 £

ч“ а tr

y. X о

ГІ ■5? .-3 £ X

г О с.

р=, п ix X

>» 'О « *-f РЗ

О. >. /X о 2

К с* н

ГЭ с ч

>, с.

L с? •ТЗ Л

С’ ‘О U X er

¿X О 4-5 о

1 О, ГЇ '2Ы

х > Ç- С

f: ¿3

& г. ?з

4 с Г

О о ff :5

» с- X

о ID 5

з; « И і:

X о С С2

>• Pt С*

О !»• а. X V«.

О л Ci

с ІГ о s к

С-* О Р S

с 5С

U и X К 2J

X о я >, г-

г. о ІС 0

с о о с

г і. -- Г'

Г л О zi

о ü.; -» .1«

І5 т, •X ir ч. с;

Г о ?» г_

ч5- С.

ГС а. £ D- £ с

t. 5Т

с к X Z¡

,н "Z у

і.” м '‘ГГ г» »

У 1, л о

О ф !Г

с« ІД >> ¿“•ч

О Сі іҐ

• •X С г ІН

-Г b

s X

2 Û) и H

ш i¿ W м с

5 Ci з

Г4 J;. 1 X

ч: X" en с і

с сь S fn >, о

Ь- X с 7

г' J' ч î<

£ 5 IL V

s -í *1 -r

Z і.4. Ї ô-

*4^ Сг >1 о г:

X f-, ?

X

C. Ci. £ p

X 0) X ъ Г> в о V.

> ь; Ü *-

¡Г «; f-í X p

Г~- a uL t'

X з: CÇ

гг; С- iS 2;

О

“X г_- г;

п î-ч •

С О Р1 ;л ■ ~j S

X 0. О « a

Ч т As

С íí г- V

Cr ■-вг C«

С) 0 CI cr

к Сч V

5С її с

іП t-* ‘-Î

о С к

s;

X Ci Г- Е" Г. X

О Ci 1 п >» а- tí

О *í 3 с*

О ?: с 2; й' PS

о С, íij сс ü

0-

¡.\ с

I к

L> <X

x p\

О ~

«

- G -

МіііДРЕШІЯ !5 ПРАКТИКУ. По матерїіалам ьксперпменталыпи исс-ледовa;íj¿l состгалеїш методические рекомендации: "Ііолучоїтое »

очистка Fe - рогу .та ipy е м ілг вузоконолгиулярнш; баллов нзруинаЯ иембраїш (lü.MPs) чумного микроба," которые били обсуждеїш » одобрєни Учєни.: Солетон PHKÍJ4J! 'Тгиіроб" (протокол 114 от 23 мая 19tÆr. ■

ЛПГОЯАЩШ РАБОТЫ. і,!зтср;іали диссертации дзломены ií обсулі-денн lia Pocciûciioii конференции "Гепетина и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций”, Волгоград, 1092; на Российской конференции "Иммунология зі специфическая профилактика особо опаснш инфекций", Саратов, 19S3; j:a итоговой научной конференции, в F1DÜ14Î1 "Микроб", Саратов, 1QÜÍ;

ПУВЛ!Е\АЦ!Ш. По материалам диссертации опубліковано 5 работ.

ОБЪЕМ !! СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертация шло,г,єна на 132 стр. моашшписпого текста и содерлагт: введение, натериали и методи,

шесть глав, паписанных по монографическому тїіпу (включаюче: литературную справіїу, собственнее исследования л обсу»деіп:з), общее заключение, виводи и библиографический список, которий вклмчает 101 отечаствсшш;; и 119 иностранных источников. Работа иллюстрирована 30 рисунками î: 5 таСл>и^мл.

ОСНОВНЫЕ ¡ШОДНЕШ, SbSîOClOSE 1ІД ЗАЩИТУ.

1. иілшлеіше продукции Psb+ Еггакмахк Y.pestis железо-регу-лпруеміа комбранних белков с уолекуляркой массой 190 » 240 кДа. в железоде$зщктних УСЛОВИЯХ iii vitre и в імплднпфованніЕг виут-рибркошио морским свиккам диффузионная камерах (in vivo).

2. Получение очищенной ípartiyas яилгзо-регулируемия болмов нарулхой мембрани с молекулярной мзсссії 1С0 и 240 кДл.

3. Доказательства способности чумного киз'роба, экспрессирующего кеяего-регулкруечиэ зысоксуолекулярш-’е мембранное белки, a так».« очищенных препаратов дынных белков (ISO и 240 кДа) нарушать продукцию макрофагами кислсфодгагнсомьл $зктсроз бзк-TÙ püJCIÇHOCTîi.

4. Хг-рактер^стми основна накономерностей изменения фуик-íVHOiiarbiiorо состояли макрофагов по цлтофлуоримегрическш пока-:;ne;iiiv активности хроматина к лнзосомалыюЯ системи при ззаи-

і:о,~',>Псї/:-!г.;і с жолозо-регу.тфуемп!?! висонг/колоиулярнаии мсмбран-i;uia¡ баллами чудного >ая;робз.

5. Колічестпзніїгіі оце::;<а прохектизнссти яэлезо-рогутаруо--HU/t висскомолскулярнія ыембра'шнх Селиоз чумного кіікрогЗа.

СОДЕР^ІГЖ РАБОТУ

і. ¡'лторпали и методи.

Рзбоїа выполнена п експериментах на ТО норс:'кг: свинках к 320 белик мзіая. {іатерпллом для исследолзіпія слукили у яитотшп: перитсьоальні/о макрофаги, содержимое m* іі ла;; т: грона нн ігл кэдер (НК). .

В работе использовались следукщке дтамми чумного W'ir.potfa: Yersinia psstis EB, 231 Psb+. 231 Psb-. KM 793. 1VJ Psbt-, T,vJ Psb-, KM 541. IQ! 638. ЯН 1570, KM 8t6. Я-1996, L'-^бЗЙ, И-2353, Н-2І22, A-1435, A-1249, 0357, П-Б34 Штаммы вирадазались на

агаре Хотетгагера pH 7.2 при 28"С в течения 24 часоз.

Для изучешія акспрессж лилезо-регулкруемчх аисокомолеку-лярних болков наружной мгмбракм чумного ю-m роба итанм Y.yestis TOJ ліфаирпзался в жидкой LB сі>оде с добавлением до 0,-1 кК. хе-латора давеза EDDKA ("Sigina”, C!JL\). з зїом случае но.’іуонтрация Fo в ередо составляла менее 1 мкМ., а таї і же без добавления яо-ллторг при 28° О з течеігие 5 суток.

Для получения достаточного количества Сио.чзсси виращтанмн штамма TWJ Y.pestis проводили no методу би$азиого ку*ьт» шарования. Элентро$оряз мембранних белиов в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях стззилп по методу U. К. Laenrali (1У70). ДНК микробных клеток для. подготовки проб к ДНК-зондирсваїпсс за-деляли в СООТБЄТСТІПШ с рекомендациями H.C.Bimboim, J.D^li (1S7S). Очищенные препараты KMWPs получал?! с использованием гель-прониначяцей хроматографии на сефадексе G230.

В качестве иммунизирующих агентов применяли живую чумнук вакцину ЕВ ИИЭГ и очкценный препарат IDíWPs йез адьввалтов и на полном адьншанте Срейзвда. Экспериментэльинм жгеотним указанные препараты вводились подкодзго.

В работе использовался капсульный антител (F1), выделенный по методу Baker Е. et al. (1952) из солевого экстракта ацетон-высушенных клеток чумного микроба в процесе íра)¡трюнировд ни? сульрагом аммония.

- о -

С целью ИСС-ЛСДОВГЛКП LiKCIipcCCj31 ÜCí'TS in vivo W'l n^MMCinUJ* модель ш;. предложенную Day S.E. с еоаг.ї. (1980), модиф;:цируо-wyis Кулешом Г.Ю. с соавт. (1901). Камери заполнят» суспензией Y.pcstis TWJ Psb+ или Y.pestis TWJ Psb- выргценних na arape Хстт)йігера при 28°С, и приготовленной i¡a бульоне Хотхіаігера в коицситр:.1г.:о1 10- нл/мл. И.чтралер;:тоиеаль.чо под ¡¡аркозом

группе морских свинок зводили 0-10 камер. Кязопшх забіївал.п' ¡¡з

3. 5 к 7 сутки, извлечённую >з ИК взвесь бактерий использовали для определения экспрессии Ре-регу.т.’.руемих високомолеііуллрііік Оелкоч наружной мемйр;нш методом диск-злектрофоре;за в 7.5Z полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-ПЛАГ) по Ьзегптіі U.K. (1970).

Определение активности хроматина перотомеальшк макрофагоз морских свинок пр'тшдили с использованием флуоресцентного ме-таяроматического красителя акриди^оЕ^о оранжевого (АО). Связывание АО с ДИі? макрофагов сопровождалось формированием комплекса А0-ДІІК, обладавшего стечением в области спектра 530-Е80 нм.

Определение активности хроматина макрофагов проводил;; ло методу ftelamed Ы.R.(1974). В работе использовали индуцированные макрофаги, которые получали путём инъекции за 5 суток до зайера перитонеальных макрофагов мор.ким свинкам внутрибрюшинко 3 мл/ стерильного 2Z раствора печтона. После получения перитонеальных макрофагов их окраїливали АО в конечной концентрации 0,2 мкг/мл В ТеЧОНИИ 8 fL’KiyT.

Спределени состояния лизосоыального аппарата лей;оц>ггов проводили этим же методом, поскольку краситель связывается с ДНК и поглощается лизосомами одновременно. При окраске цитоплазмы (преимущественно лизосомальных гранул) возтиала красная флуоресценция в интервале спектра 030-700 нм (htelaroed 1J.R. et al., 1974). .

В дальнейшем клетки & забуференном физиологическом растворе пропускали через проточную камеру цмтофлуоримстра со средней скоростьк 1000 клеток/сек.

Оба параметра измерялись с помощью протеіногс цитофлуори-метра 1С? 2? фирмы FWYWE (5РГ) с использованием анализатора импульсов CANBERRA и программы "Cyto" приема и обработки даньиК на персональном компьютера, специально разработанной для этих целе'- (Составле»ше программы проводилось совместно с Борисовым В.В.).

Статистический анализ данных гистограмм проводился путбм

вкчислешія процентного содержания светп^ился клеток в группах по 10 каналов анализатора от общего числа светяідпсся плеток.

Перитоаоапьиак» лдкрофаги корскїгх свикек получали по истоду

Н. Я. Учитала (1973) лроунзаннэн бргсшнсй полости логтотньк раствором Хейнса pH 7,4 без индикатора и солей кальция и наг'пгя, содержащим 10 ).:М НЕГЕ5, 5 ЕТІ/мл ronnpma атакой раствор гспользо-зался з дальнейшем для постановки спито. ).

Оценку степешг гктлзности кислородзавнсикия бактер'эддн’Я сг.аіем $агсц;гтоп пр^однли из основании шмереіа-л уровня геми-лкмянесценцкм. 3 работе лспользсвался хэмилимжюиотр ХЛИ-Ц-01. Постакогна зємилимиярсцєнт/іого хсследсвания проводилась при ин-»уб?*їгаі перитонеальн’Сі макрофагов с фагоцитируема материалом. Для усилэния хемилиминесцентного сигнала бій кспользозаи раствор лимииола "Serva" в д:і*чсгчлсульфокс:іде с концантрацибЯ 150x10"5 Я .

Для определения протоктизнсЯ активности KbTs в качестве модели чуынсго инфекционного процесса ки использовали белігх мишей. . Iis подаояно їжмунизкроваля препаратом Fe-регулкруенгс; ви-сокоиолокулярншс белкоз нерудной мембрану з полном адакванте Фрейнда и без него в объёме 0.2 ¡о. Доза KMi^s составляла 10, Б0 н 100 мкг. На каяду» дозу брали б mz^cñ. Через 21 сутки ми-аей заражали зысонсвзфуле.чтным кгачмои Y.Pestis 231 с LT5Q 25 м. к. Проводи ¿ли танго кымукиззции мітаей гелево-регулируемши бэлиакп (в дозе .SO >:яг) совместно с romoñ чумчой загасшей ЕВ. которая пр:іменялась з кратних десяти дозах, начиная с 100 «..t. и заканчивая 1 млн. м.к. для определения ED50. Заражение проводили на 21 сутіп. н>.»іу!п:згцим высокозирулентикм штаммом Y. pastis 231 в дозе 1СС0 и. 15., a t¿kwí дозачк, «ратними десяти начиная с 100 и.к. и заканчивая імли. для определения LD50. ED50 и LUS? начисляли'по методу Керберл (Наумов A.B., Ледсанои М.Ю., Дроздов Н.Г. 1G92).

Статистический ана~из получи lux даншгх прогоріли с использованием методов вычисления средни! арифметической (М), средней ояибки средней арифметической (п), коэффициента rocío-р рсости (t) и уровня достовернсоти СР) по Роннцкоку U.Q. (1973). Использовался танке метод апьтернзтипкого варьирования и разиостнь-й метод (Асатиани B.C. 1SG5).

- 10 -

2. Ренулї.ТЕти работы и их пбсуздеш;«

В результате выполненных исследившсій получена лредстаз-Л01ШЫЗ 1ЮМС В ОбОбіДОКЮК вндо следукздэ основные результати.

На коллекции музея живідс пузіьгур РНШЧЯ "»МироО" бьизї отобраны штампи, циркулирующие в различных яр>фодншс очагах чуми на тарр:іторіаі бившего СІЇСР, а тал,г,е штам ми, рагизг-іаіациеся ао зі;спрасс5п! детерминант вирулентности и патогенности. Для тсси:-рования наличия гепав, коднруюіцнх синтез Ш^'л’Рз, ДШС этих ьтгх-Аоп, осалячкняя на нлїроделліолозиіп: фшл>трак, Сила стпраали;а £. Сзтіе] в Парижский Институт Пастера. В лаборатории Е. Оагпіеі имелся Д!І?.-зонд, роапфу:ощй с геном, кодирующим балон с мояекудярной кассой 190 кДа. С эти* ДНІЇ-ззвдон спсциалзісїаїм лаборатории шетитуга Пастера проведена габридмзацкя образцов ДНК 18 отобранных наук итаммоз. У 13 етаммов бнл обперугьен геп, кодгірухадій синтез 190 нДа ИІНР. У вакцинного плгамма У.резіія ЕВ гена, иодирующего 190 ¡(Да ІШР не виявлено, что согласуется с ранее опубликованными данюш Е. Сатіеі (ІЕВЗ), а у вцеоиогнру-лентного штамма ї.резііз 231 он присутствовал.

Из числа позїгяівло реагируют с зондом пггамиог. наші бил вкбран штамм У.резііх ТШ для паслозгукіцого изучения экспрессии г^лезо-регулируемш: балков. Дан ній штамм представлял ¡¡албояьглй) интерес а связи с тем, что, будучи •чкірулоктінді, он имел ген, кодируыщий 190 кДа ІИИР, а тагае бик бесплазкияаым. Водсдспио чего, продукти, иодируемые плазшдаьи! чумного икнроба, не зносили дояоллителышэ трудности в игучоние иммунобиологических свойств ї»ИРз У. резиз. Птамм У. резііг ТИЛ нираздівался б тегчо-иу.е 5 суток в жидкой среде с добавлением гакгтора железа ЕОЭНА. Концентрация Ио в среде составляла меыео 1- мкМ. С помощью электрофореза в полиакриламидном гело бала обнаружена экспрессия НМКРя. На фореграым-эх идентифицировались дзэ полоси, соотЕетсхвушдае белкам с молекулярчой массой 100 и 240 «Да. Б отсутствие де$иц>п’з »елеза эти белки но выявлялись. При вира-иссвашт ї.резІІБ ТИ-Т на дийреренцальной среде с Конго мраскш отвечалась далссциаіиія бактерій по прмлаї^у пигмонтсорбцізі (Рг>Ь). При таучекии экспрессии белнов обнарувезлось ш наличке у штамма У.резиз ТйЗ РаЪ+, вкрлщенкого на иелеаодо$ицнткоЛ среде, >і отсутствие у ї.резНз ТШ РзЬ-. Полученные результати, т-езмоздо, сікли езкзани с теа, что гени, кодчрукщке ІС-МРя, близко рздпилолдани с генами, ответеглевким за признак гшгкеитсорб-

Xpff*.

Далйкейяк^ эталон пгасй работы било вцдєлетіо нзучзьнкх белков В З'ЖЦОУНСМ кмдэ. Для получения ДОСТДГО'ЛНОІ'О КОЛГІОСТВа бнснасск гирздоЕгнкэ Еі?>мма TWJ '/.pestis проводяшг по методу бнфггнаго пулатавирогшс/я (при 23°С з зечсик» 4 суток). Очистку HnWPs £к;уц;ссгзлл.е? ітутзм улъураглукгаого лзокс2 бкоїіасом, цеит-гсііулфсва.'пгл (при SOOCO к), дигиотяэ и хроматограйли на колонно, заполкснкоЯ сефлдексги G2C0. Степень очксткн бклз установ-леза с псисцім злелтро5оое?г n RUT с SDS. фракция, содержащая 1ШРэ соотаетсдатвала на куглвсй элкцш восходя лиям первого raaia. На ^срограммах обнару.теїзалксь только ;;вэ полоса, вдентнч-ккэ подосаи болюз о мол. . массой 100 и 24С кЛа. Таккч образом, послэ гельфїіяьтряЕСШ .чи поліглот: очкдеіпзігй ррепэргт Fe-регулируема зі;со:;о«алскуляр!ііп бол::оз нарузшоЯ мембрани Y.pestis.

Прзтсдзішке uaxepnsovj еввдзтєльитвуют о способности чумного шзфоба продуцировать in vitro в условиях де^ицгїта желзза вікокомолекуляркке мекбралнхо белки.

Для определения возможности Y.pestis акспрессжовато iWPs . In vivo бил мсполъаовап одзяї из обц&прмиятш: способов іюделігро- . закня услзгкЯ зиутрокиой среди организма - юф$/зиоішкє ііміілап-тирозаннвэ кгмерк (UK) (Day З.Е. et.al. 1S80; Duncan J.L. 1033; Finn Т.К. et.al. 1382), которко били апройирсвалм :j в omrr.ux с Y.postir- (Skamik М., 1S85; Ворсисва Г.А. с, соав., 1&£8; Самойлова С.В. с соавт., 1SS9; Екдаена 15.Л., Ку.ътл Г.ІС. с соаз..

1951). С пзлъп исслгдовалия экспрессии НИЛ*? in vivo применялась ксдоль НХ, предложенная Day S.E. с согвт. (J.CS0), и модм-фтгцнрозгниая Кулешом Г.». с соавт. (1391). ИзвльЧёньто после кул&тшжрования хз Ж взноси бактерия при соотаетст.ву.'оцеЛ обработке кспользозгли для определения экспресс;« Fe-рогулиуусш« висококолекулярмш; белхов нарухзюй момбранл чумного микроба.

Проведеннь» иоследованія показал», что штгим Y.ptstis TWJ Psb* начинал зясирэссировать Ре-регулз?руемие вцеоиомолекулярнвд белі їй наружной менбр-аш кг 3 сутки его культнекровшта в К<, з иганм Y.pestis ТО Psb- ке зксягессирозал liKiiPs нм з одзш іга ероиоз наблюдения, чго соответствовало результатам »есяедовзниЯ экспрессзж IWWPs in vitro. Получешше данные позволили сделать предположение, чко в манрооргаїиігмє чумноЛ mmvob скнадаиэтся с Ре-дефициткимн усланкяил. з'гиуххаю&ик его экспрессировать Ре-регул>іруоуцо в w о к ом о л lm у л: і р:; .та белки иг.'утип г<смбрляа.

Для покидання №муноОиалсп:чєскоД роли I WiSiTs і;?і с:ю? з паче-

і;на имеет исследоглгше >п взаимодействия с «акробатом, клп центральной фигурой иммунитета (Р.В. Петров, 1S37), в том число и ьрн чу..ш, поскольку именно в нем рзоітріївактся процессы, от которых зависит исход инфекции (ІІаумог А. В., Ледвалов 1,!.Ю.. Дроздов И.Г., 1932).

Зазоршонносіа фагоцитоза обусловлена з$$екгнвкость» фуик-циошфодоївія в макрофагах ккслород-зависнмьн; балтерїодгдніа: j;с-твм (Стумова Н.Ю., 1G31). Среди многс>й:агеі;:;іЕ;іледродов, пазво-ЛЯ1КЦИХ оценить состояние этих систем фагоцитоз при взаимодействуй: с іші«цирукдам агентом, важное место занимает кзучэшгэ ре-зитизннх сдвигов в системе окислительного метаболизма, с которыми но міг том связала реалігзацкя з$фекторная возиоишостеЯ фагоцитоз” (Зенішв К. К., Куликов В.Ю.. 1985; Земсков В.М., 1S39; Allen R.C. , 1972; ВаЫог В.М., 1D&1; СатрЬэИ А.К., lS05;Frido-vicb I., 1986; Thomas V.L., 1933). В качестве интегрального показателя функционирования кислородзазисимід; бактерицидних систем макрофагов бил использован метод лммниолзаззисиыоа 2гі:л.ч:.сі-нисце.чции СХЛ). Исследозашія показали, что хемильлпиесцентокй ответ макрофагов морскюг свинок при воздействія: Y.pestis TWJ РзЬ+ занимал промежуточное положение ме;кду отезтом на ав::ру-лектнійі бссплазнкдний штамм Y.pestis КМ 218 ;< зксокозирулвнтний Еггамйм Y.pestis 231 СГис.І). Учитивал, что от станка Y.pestis К 218 штамм Y.pestis TV.’J отливается i:aja?Bian признана пигыопт-сорбцгш, которыу, как грозило, обладают віхскозіїрулентпііо таы-

МU ЧУМНОГО ІЛ.КрСбЛ, МОЖНО ПреДЛОЛОЛІКТЬ, ЧТО ПРОДУКТА ГРОІ.'ССОМ-

ного локуса pgm имеют большое значение при взаимодействии возбудителя чумы с макрофага»»! для. рсг'пящв; биосшітсза последіаасі бактерицидні’; радикалов кислорода. .Что подтверждается стмі исследованиями хеми-^оминесцентмого ответа макрофагов на Psb+- и Psb- варианти итамма Y.pestis TWJ, селекцион’фпваннііх ка диффс-ри:здеалі>нсй среде Джексона-Берроуза. Та«, у. івень ХЛ макрсф^гсв в отвс ? ка Psb+ вариант штамма Y.pestis TWJ бык достоверно ниже, чем уровень яеиилммииесцеїщші макрофагов при вгзимодейстшш с Psb- вариантом этамма Y.pestis TWJ (Рис.2). Кап известно, признак пигмзнтсарбции хораг.тийгзуется способность» мзіиробев сорбировать некоторое красители и велезосодерлзіфіе соединения .акке как гемкл. ферриткн. Стукова Н.Ю. (1991) показала, что добавлеіаід к смеси макрофаг-чуккой микроб гешша или фсрриткна, а также Фагсцитсз штаммов Y pestis , вирачоннкх на среде Длек-сона-Берроуза с добавлением этлг соед>^еипД вызовали сшіженио

КМ 218..............231 -------TS7J

Рис.1. Дхпаютп нзменешгя интенсивности хемилиминесцешдем

при гзгшмодейстп.чи макрофагов с штаммами Y.pestis различной вирулентности.(Z сдвига по сравнении с исход. уровнем, принята, за 100Х).

•----TWJ Psb+ .........TWJ Psb-

Рис. 2. Динамика изменения интенсивности земилимипесценцин при взаимодействии макрофагов с штампами Y.pestis TWJ Psb+- и Y.pestis TWJ Psb-. (Z сдвига no сравн. с ¡sc-ход. уровнем, принятом за 100%).

ХА ответа к'акроЗ агоз.

Учитьгпая BL'^e)üi-’.o*o:i:ioc, представлялось валики вняснять дол) ¡it'i.Ob-p.'/jGníOf'fiorc участия Ре-рвгулируоышс иисокяхолспуляр-ьш: Оел:;ог, нару/шой мембраны 2 пскавлешда генерации баитврицид-нк: радикалов кислорода, поскольку уже подчеркивалось, что эти белки такм; или м гпсгмекасорбиия кодируются ло^усом рр.та хромосомы. Для этого прсггдено сравнение XJÍ ответа уакро£\агов морской cbhíuüj ¡:pi: ьзчимодейстаии со чггаммом Y.pestis TWJ Psb*, вх-рашении** в Ре-деф'л^ггиьЕХ условиях и энсгрессируюашм ffií.fPs. з; штампом Y.pestis TWJ Ps)>*-, выращенным л обычных усло£икх я не сиитеаируюцим НMIPs (Рис. 3). Показано, что экспрессия Fe-peгу-л>Фувлип шисоконолекуляранх белков наружной мембраны вызывал?! подавление ХЛ макрофагоЕ. Приведённые факты сшдэтельстьуот о тон, ЧТО С1ШТ63 чумном ЮШробОУ НШ?з, очевидно, является 0ДЮ1М iru факторов ингибирования га;слородзавксимкх бакторгцидпах систем фагоцитирующих здеток.

К желозо -дефицитных услохшях чумной микроб экспрессирует ев;& несколько полипептидов (двух белков с молекулярной массой 81 и 79 кД). Одновременно происходит такяе и увеличение количество четыре« белков с молекулярной массой 89; 70; 58; и 27.5 кД - 1ЯРз (Carniel Е., 1987). Чтобы нсклжэпъ и их влияние на кислород-зависимье бактерицютше системы клеток МФС необходимо било изучить прямое действие HMWPs на макрофаги. По данным наши ксследсваикй очищенная фракция Fe-регулируемых високомоло-куларных белков внешней мембраны окааизала ка хемилшошесцеш'ч» макрофагов подавляющее действие. Обнаруживалось сходство этого действия с влиянием капсульного антигена, хотя уровень иигиби-розанкя XJÍ макрофагов был киле (Рис. 4).

Таких, обргвоы. представленные факты свидетельствуют о том, что ге-регулируемыя высокомолекулярные белки наружной мембрану ¡шлются однкн из факторов, позволяющих противостоять важнейшим системам бактериального клллкнга в фагоцитах (кисдородзависимиы бактерицидным системам). что обеспечивает внутриклеточное вкш-ваяне м паразитирование чумного микроба. :

Наряду с изучением вилянкл HMWPs на основнш кислород-за-виооше бактерицидное системы, особый интерес представляло исследование изменений под их воздействием состояния генетического и лизосомальнсго аппаратов макрофагов. Методом проточной цитоф-луориметрии определялась активность хроматина макрофагов при взаимодействии с чумным микробом, экспрессирующем и не экспрес-

ib .5 ГО 15 20 . 30

■;ш|.

-----hmv/ps+..........jiw/рз-

Piic.3. Динамика нзмоненпя интенашнэстл х^мнлкгмчмс'сцентс! при лзанмодеистви» макрофагов с штаммам» Y. post is, рззлмчыа-щимчса no эчспрессми HKWrs. V- сдвига no cpamiemm с походным уровнем, принятие за 100%).

о 5 ю :s 20 25 jo у; 4о -;s

...... FI -------------- IIiWVPs

Рис.-*. Динпчикз шменекпя мгг-гчогекооти ирг.

добавление и >,'а)'ро]аг.~м HMWPs ч со'дмнього 'Н)'.-;1Г:р"та капсульного niiTiif«H;s чумного микроб,!, (i i.JWTa п:> cp.vi-

С Ж.’ЛО^Н V4 ypo'O't.^i. b'p}i!‘^T^M 3d iOO-'-l.

- iß -

скруиаз*’ Ні.ГЛ}з, а талпе с с^цєіншьіи препаратами данннх белков Зіс.ісльзопіглагь сукравиталміал окраска ісіьток £<л<ссро.г:рзмом а.чрл-7*ншді:ім орзнлаьии (ЛО). Одновременно с оцошіоЛ актіишосга гро-и;ши:а проведано тесгнровснко состаяш:я лмносомального аппарата ).:ГіірО}аГ02. .

При доОавлешл к гакро&агам отаvна Y.pestis TWJ, s.scnpeccii-ру.:ч’у0і'0 .'¡;^лозо-р;;гул';іруо>!і:о высокомолекулярные 6опш наружной м«;»іОра’ги, сліочоис уі;онь;иеїг>ю числа клеток с вкссгаш уразкем зеленой зшуорзсцсиц’ш (комплекса ЛО-ДІІК), по сравпечям с роак-днзй iaroTcrrni; :іа етамм Y. pestis TV.’J, не? продуцирую!?:;; Iß'iPs.

Изучению состоять яроиатзша макрофагов при вэакуодеЛстиш с очэщгзг^ыи препаратом IL'EiPs такие показало уиекьаэлле процзнта Еиоочсст-этнсрггся в услонсл области спектра клеток.- ■

3 0055039 аігашздил гро»ат.ш?і. пан згазестно, ломя частичное- ссі;сбо>.а;еюі£* ßK ог свяї ;vi о баллами и переход Д5К в более о’хир’ііу!;, доступную для осушгстплсти процессов трзне.-ф; стріл uoHiopMupus. Число учгстков, сіїос:чіл::х ор.чзнватб ЛО, возрастает, есдодсгшів чего уъе.тачзгваотся іаїїеізсзянгьст:;, А0--5луоресце;і-цзіл ягура iwibTiai у аело:!0« ойлаииі егектра (Григорович II.A., 1SÜ4; лэдваков ü.И.„ 1937; Лаззв-.іиіЯ 50. Іі., liiD-i). З уславзв:~

наши: олілол, напротив, наблюдалось уивпохаш:? ?луг.расцеітагі !\о;.!ГЛс;;са АО-ДМК, что евз до'толь сівояало, по-внюшоыу, о сшгаз-»F3i актаашостл хрематиюа хакрофагов. ,

Анализ распределения $агоцитирук.га: клеток по кнгансшч:ос-тл краской #луороице:>цш (количество лизосомальнах гранул) позволил зарешстрзіровать увелк^еико ¿йзуоресцеіаояі в областе спектра свіпо C4G ни как прл вгакмгдоЛствли макрофагов с штампом Y.pc-^tj.s TWJ, знспроссзірук^іа ІШлРь, так и с очісцєннкл препаратом белков. •

В сывэрдетш работ изучена прохективная активность ШЇРз на модели чумного гафггарзоииого процесса. Иквотиш: (белше кы-ыой) подложно зіммушкшровали препаратом Fe-рсгуюіруємш высокомолекулярных белков наружной мембраны в полном адъюванте Срсйн-да з; Оса него. Через 21 сутки хилей заражзлл високовлрулантним ытпмюм Y.pestis 231 (LD50 25 u.r,.). Резулг.тати проведезіньк

з:сс:лздоваіпш показали отсутствзіс способности даннкх препаратов лм.’:цкирозахь раапшзю акткшфгіаїиоішой резксхсютости нозгвкси-мо от волгйши довн ffif.'/Ps к при;^еііокия адызвэпта Фрсйвда. Однако іш;.(уш!лаірш ккаеЯ железо-регулвфуемыки Селз^ами (в дозо Ю *;r.r) совместно с тазой чудной вааизіноії ES счзпровоид^їась увалм-

s

CL.

;î

N

* §

'< U5 О

Пс >»

л 1,

о

о

~t 10

¡I

Я ¿5

*■ 4

g К •л .J ¿4

.4 ti і'і К 5

?; V. ^ f0 Г- Ь t; «

SC *л гН s ы С.;

Ы Ь

О СО н *;

О • гз й» гз

Г’ р ¡* из

S- <

о л ъ b

Л2 и о ы О g: о

н *г q Γ» о =3 fi

о '-І й о £ і

л а о fí Ц и В. о Si Я І

t. 5^ Í3 Ä к

», Ü о • -І

ft С.' sü g

<íj ч S р, г< гз о с.

н С5 ~

■Н * гз .4

3 5? , 2

с? ? S СП о

- у *,<s ä п ;5 Ui ы

» J ^ ; ГС п

С *3 V« Ö' §

* • о

м ¿V rt;

v¡ • О ЇГ» ÍÍ5

І*' ?•» р !

«ï Л

‘‘S с

>> с

Я ~ P pe. £ g

PJ

о

ГГ H

іч

п

► З Р'

Ґ\

о

й

о

п

о

У й

о

f>> * & СЗ

о

й

£

О

Й о

S §

о Й

'* О

5і Л гї ГС

с;

^ •

Í-3 і',

о о, и г-ч

к

>1

tí

ф

о.

І

о

г;

CJ

<с К о

о

а з: і: о

у гз «

р; о с w

ч >>

З íw

Fh

. Р ІІ> н .< Ä су и

їч <V G &

о r.

&

о s

Я Г5

H

g 5 й Й Q¿ s

о

»h

»

о

Й rj

? £ . ¿г гг

О ^ й>

V 5 *-

ó г,

■Н fu «ЗІ

Э о ё

£ % >

О Гі. X cz

3 S

Сі fl:

О ‘О

я .

£4 -2

? ‘1 С,' С

Ь Э Б 5s Г о о ñ ->е- сэ о W п.

■2 И —1 СГ *'

К "> К £>

?а сз

Р

э о

о о ь ~

У Ф

у

л

с:

о

к « £ о

Q.

стз ї: Я Гі СО

ГО ч

і? О Г)

ó 5 X

Ч Й }Ч О ГС с: с. ü ß ”

JE S tí

В а

* о

Й « н

о- о

^ i Û)

о н

Г)

Í0 ?

§

Ö

в Я

о о & -* ё" д о

S s

'5 >. ~ <? О ^5

К

П

« 3

«X >ч р ^ § с.

д п

і I - £ >, а о

О fi О О

О п

П *н

H

о

о

й

§

сэ

1. Среди воабудиге.тсР. чума, вэдолешнл: в природч^;,- очагаг; зтоЯ wi.jjoKmai, обнаружены итанми. шекдае но данным ДОХ-асндм-por.njD/Я ГСП, КОДИруКЩйЛ синтез гелезсрегул1руектп'0 бел»;* наружной мембраны с молекулярной нассой 120 ;\Да.

2. D яэлозо-дефишгиса усдоЕячк in vitro (при кснцентращз!

» N > о 1 ь 1

5^ о о 5^

с5 К а, о о W

‘О 3 о ÏC о g X: >ч г‘

о § р о 5> Q £*; Ci.

н »'*< «а ï С5 Га г г о ГЗ X Û)

л о « я ГЗ S о ni

о et» »4 ы Е} о «I

S 5 о S 5 п п d го I

п м nÎ с. •

о нч S? S 5 « из я

s п х н о о

g а >£> я о о Й

Û тН н s >е= ZZ

• о « С £3 о о о

>, о ri й s с. н

о о О О о & 5 р s о гч х; -ti & в X S о G

о 5 2 3; >> <D

о н о С Л а £? 2

и о, у гз 5» £ CÜ

fi CÎ ¿1 о » W Л ц ь tî

о о ÎÎ п и ГЗ

и а р я о ?ч ГЗ

о G» ÏÎ «л Ü и п

с H с о rî

£> Ü о Sï а, о g *Л X

? г> о п S с С} с >%

V о a о о •t $ гз

к я п я Ù, m

о о о с о 1

15 _*v Й о /—S 5С

2 р* rç. « ч о. W

& о § £? 1? 5 3 о о с; н Сч 3»

гз о £Э Р о е о я W

+ Х5 I О М & о X S я р о

¿2 VTJ д: д & п il

/■"S ÇJ гз 3 R 2 о Й R н к 'А ё

о о о ГЗ о t5

££ ’О ч тЧ > с. 2

у «к Э о W о Ci о о

о о 3 N с о ч

ЧН 3$ îr й о о

Cl « w с* S

С) N В H « »Î гз с к о

а р. o и • Л • о с м

2 гз g- r3 о о G. ь

CJ о. о о о

X« о В Ci “ к

> У ££ '■Z s о

О •г-1 n ГЗ о ч -ч W

р* X > к ч 2 si »> о

сульного антагена.

5. Вгайкидейстшге макрофагов с телозорегу-Тфусмтал Оелип;1!!

- IS -

лічило:', м'л/оіх-лі. 'О’иного i!;:::pofla (к.'ачкз.ім. з<і акспр>>сс.фук,ц;:-ш:, м рчіслс-ііпішіі препаратами) визклаот сшег.єккіі активности хро-магіїна, что вцрйлаогся в умепмиєчжо урсоня £.’<>оі>ссцєі-.ц;іл хоиіі-j.juoa АО-ДШ; иокр&їггоп н иарсстг.ішг !.р^д;.';;тього содержали клеток со слабим ciwjcmjük! и зеленой обжата c.rjuvpa.

6. В процессе ваапмодеЛсттш маирофагоі. с колгзо-рсгулііру-ок>ми болиами ваепке« момбраяи чумного микроба (ияаамгии )л ^исгіресс>:пуі:і.;;імі; и очвдеїшюш г.рапьрат»ж) иг;'шдаотся тиоп^ пял функционального состояния лнзосомгілліюго агшзрата. Пролсхо длт угдошчешю >£.тсшсиышсти (5лу»»рьсцв.іідаи опргшшшв ЛО кл> го/, в краевой области спектра с одаоврсмсиішн г.ерорзспредолоіаі ом макрофагов б сторону повиютія чиода с большей вирзконность красного свсченда.

7. Введение келези-регулирузмия вілсокомолскулярнця йодне иару,мной мембрани чумного микроба совместно с адьввантон Срои: да -*іо защищает белах мшіей от зараження вирулентиим штамме Y.pestis. Лммушяация кшгй препаратам дачних болков codiocti; с rarncii чумной иакціяюй Eß повкшаег аіігикіі£Зіщно!іуі: рсгпстеїп гость более, чем в 3 разз (по сравнешм с ваніраюй ЕБ).

0. Келсзо-регулируемио ішсскоколекулярніїе беліоі лноаиг иеибрали явля.адск важным фактором вирулентности її тиуиогоигик ти чумного микроба.

9. Определите хемидшмиесцеицик макрофагов, а также aj тивности хромат>та и лизосомалыюго аяпгрзта илгсгок (исход! проточной цкто&луоржетрии) могут использоваться и иомпле: тестов оцешс-і нммупобиологичесіиа свойств а:гаггеі:ов чумна ьихроба.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Тихонов С.Н.. Ледоанов M.J0., Попов Ю.Л.. Куличенко А.І]

Киреев H.H., Стукова ІІ.Ю., Лоцмакова Е.Ю. Изучеішо экспрессы получение її иммунологические свойства JBWPs чумного VDstpoöa Генетека и биохимия вирулентности возбудителей особо опасд инвенций: Матер. Рос. науч. нон ф.— Волгоград, 1S92.

Є.137-138.

2. Кігреез М.іІ., Тихонов С.Н., Коровкзж С.А., Ледваиов tJ.i Попов Ю.А., Кулнчзнко А.Н. Применение ВЭИХ для детекцші xsej ао-регулкруемых белков внешней мембраны чумного микроба при виделешад // Иммунология и спец. проф. особо опасных инф.: 1

- 19 -

тер. Рос. маучн. kohJi. — Саратов, 1993.-- C. 33-34.

3. Стукова Н.Ю., Дроздов И.Г.. Попов Ю.А., Ерандзииевский К).В., Тихонов С.П., Киреев М.H.. Куличенко А.П.. Ледванов М.Ю. Влияние ЛГ Y.pestis на Іюрммроьание бактерицидного потенциала макрофагов, процесом активации хроматина и состояние лизосомно-го аппарата // Иммунология и спец. проф. особо опасных инф.: Иатер. Рос. научн. попф,— Саратов, 1993.— 0.68-69.

4. Тшсонол С.Н., Стуиовэ Л.М., Попов Ю. Л., Кулмченио A.1J.,

Киреев М.H., Ледванов Н.Ю. Желеао-регуляруемио белки внешней

мембраны Y. pestis н из: иммунобиологические свойства // Иммунология и спец. проф. особо опасных гм$.: Матер. Рос. иаучн.

конф.— Саратов. 19Ö3. — С.72-73. .

5. Стуком Н.Ю., Емельянова Н.В., Дроздов И.Г., Шпеду.ч Г.П.,

Брандзишевский Ю.В.. Тараненко Т.Н.. Тихонов С.Н.. Ледванов

М.Ю. Влияние штаммов и антигенов чумного микроба на кислородный метаболизм фагоципгрукидах мононуклеаров и продукция илторлейіш-на 1 // Пробл. особо опасти юіф,- 1934, Саратов,- С. 104-112.

ь. мм. т.го.