Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Влияние димефосфона на внутриутробное развитие крысы и дифференцировку гладкомышечных клеток внутренних органов

На правах рукописи

БУРЫКИН ИГОРЬ МИХАЙЛОВИЧ

ВЛИЯНИЕ ДИМЕФОСФОНА НА ВНУТРИУТРОБНОЕ РАЗВИТИЕ КРЫСЫ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ ГЛАДКОМЫШЕЧНЫХ КЛЕТОК ВНУТРЕННИХ ОРГАНОВ

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология 03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Казань - 2004

Работа выполнена в ГОУ ВПО Казанском государственном медицинском университете

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор Хафизьянова Рофия Хафизьяновна

доктор медицинских наук, профессор Киясов Андрей Павлович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Данилов Валерий Иванович

доктор медицинских наук, профессор Ямщиков Николай Васильевич

Ведущая организация - Московский государственный медико-стоматологический университет

Защита диссертации состоится 2004 г.

в9.20 час. на заседании диссертационного Совета Д.208.034.01 Казанского государственного медицинского университета по адресу: 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Казанского государственного медицинского университета (420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49, корп. Б)

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук,

профессор /^"Э ¿^у А.П.Киясов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Проблема репродуктивной безопасности лекарственных препаратов является одной из важнейших проблем современной медицины. Ежегодно на фармацевтический рынок "выбрасываются" сотни новых лекарственных препаратов, часть из которых может быть назначена беременным женщинам для коррекции патологических состояний, тогда как другая часть, отпускаемая без рецепта, может воздействовать на развивающийся плод на ранних этапах эмбриогенеза, когда женщина может не знать о своей беременности (J.E.Polifka et al., 2002; W.S.Webster et al., 2003).

В последние десятилетия успешно идет синтез и внедрение препаратов из группы неантихолинэстеразных фосфорорганических соединений (Б.А. Арбузов, А.О. Визель, 1966; И.А. Студенцова, 1974; Р.С. Гараев, 1990; Л.Е. Зиганшина и др., 1992; Р.Х. Хафизьянова и др., 1993; В.И. Данилов, 1994 и др.). Димефосфон рекомендован Фармакологическим комитетом Минздрава СССР (протокол №19 от 20.12.90) и разрешен приказом Министерства здравоохранения РФ (№ 304 от 28.12.93) для медицинского применения и промышленного выпуска в качестве вазоактивного лекарственного средства, нормализующего функцию центральной и вегетативной нервной системы. Репродуктивная безопасность этой группы лекарственных веществ и, в частности, димефосфона остается невыясненной, что ограничивает его применение в практической медицине.

На настоящее время для исследования влияния лекарственных веществ на внутриутробное развитие млекопитающих (A. Kotwani et al., 1995; Р.С. Barrow et al., 2002) используется большое число различных, моделей. Однако. неоднозначность, получаемых в ходе исследования, данных требует дальнейшего совершенствования методологии тератологических исследований. Одним из ключевых моментов пренатального развития млекопитающих является становление дефинитивного строения сердечно-сосудистой системы и, в частности, гладкомышечных клеток сосудов. Выявление общих закономерностей становления сердечно-сосудистой системы в ходе развития позволит не только раскрыть механизмы развития ряда врожденных заболеваний, но и повысить информативность тератологических исследований, что даст возможность более эффективно решать вопросы оценки д е , лпгорртпанипго '"ррлгтт'п а

«ер

POd НАЦИОНАЛЬНАЯ

внутриутробное развитие млекопитающих.

Исследование репродуктивной безопасности димефосфона расширит показания к применению его в практической медицине и пополнит арсенал применяемых лекарственных препаратов, используемых в клинике акушерства и гинекологии.

Цель исследования. Изучение влияния димефосфона на процессы пренатального развития крысы и дифференцировку гладкомышечных клеток внутренних органов.

Задачи исследования:

1.Оценить влияние курсового введения димефосфона в период беременности на развитие плодов крыс.

2.Изучить влияние димефосфона на формирование и оссификацию костной системы плодов крыс.

3.Исследовать закладку и гистологическую структуру внутренних органов плода крыс при курсовом введении димефосфона.

4.Провести исследование динамики становления и дифференцировки гладкомышечных клеток внутренних органов крысы в ходе пренатального развития.

5.Изучить влияние курсового введения димефосфона в период беременности на становление и дифференцировку популяции гладкомышечных клеток внутренних органов плодов крысы.

Научная новизна. Впервые показано, что димефосфон при курсовом введении не нарушал гисто и органогенез крысы. Препарат не влиял на остеогенез и оссификацию костной системы.

Впервые определены временные и топографические закономерности экспрессии десмина, а- гладкомышечного актина и кальпонина в гладкомышечных клетках внутренних органов эмбрионов и плодов крысы. Установлено, что становление артериальной системы печени крысы начинается с фетальной стадии пренатального развития одновременно с развитием желчных протоков.

Выявлено, что димефосфон не изменяет закономерности экспрессии десмина, а-гладкомышечного актина и кальпонина в гладкомышечных клетках внутренних- органов плодов крыс и не влияет на процессы дифференцировки ГМК.

Научно-практическая ценность работы. Результаты исследования расширяют представления о становлении и дифференцировке гладкомышечных клеток в ходе пренатального развития и воздействии лекарственных препаратов. Экспериментальные данные могут быть использованы для дальнейших исследований, направленных на раскрытие механизмов изменения фенотипа гладкомышечных клеток сосудистой системы при различных патологических состояниях в период пренатального развития млекопитающих. Результаты исследования гистоструктуры внутренних органов могут быть использованы в прикладной тератологии для оценки репродуктивной безопасности лекарств. Итоги работы являются обоснованием возможности использования димефосфона в акушерстве и гинекологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Ежедневное введение димефосфона (в дозе 200 мг/кг) беременным крысам не сопровождается эмбриолетальным, эмбриотоксическим, тератогенным действием, нарушением гистоструктуры внутренних органов. Препарат не нарушает экспрессии десмина, а-гладкомышечного актина и кальпонина в гладкомышечных клетках внутренних органов плодов крысы.

2. Дифференцировка миогенных элементов различных отделов сердечнососудистой системы и пищеварительного тракта происходит неодновременно и характеризуется последовательным появлением в цитоплазме гладкомышечных клеток десмина, а-гладкомышечного актина и кальпонина.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены: на заседаниях проблемно-предметной комиссии КГМУ (2001); IV научно-практической конференции молодых ученых и специалистов республики Татарстан (Казань, 2001); научно-практической конференции, посвященной 40-летию ЦНИЛ КГМУ "Современные методы исследования в медицине и фармации" (Казань, 2002); VII научно-практической конференции молодых ученых КГМУ (Казань, 2002); V международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, 2002-2003); межвузовской конференции молодых ученых "Актуальные проблемы патофизиологии" (Санкт-Петербург, 2003); II съезде Российского Научного Общества фармакологов "Фундаментальные проблемы фармакологии" (Москва, 2003); \Ш научно-практической конференции молодых

ученых КГМУ (Казань, 2003); IX Конгрессе педиатров России "Актуальные проблемы педиатрии" (Москва, 2004); XI национальном конгрессе "Человек и лекарство" (первое место на конкурсе молодых ученых по специальности "клиническая фармакология" Москва, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ.

Структура диссертации. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка использованной литературы, включающего 175 отечественных и иностранных источников. Диссертация содержит 49 рисунка и 11 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучаемое вещество: димефосфон - субстанция, выпускаемая по 1,0 гр. для парентерального введения в Казанском предприятии по производству бактерийных препаратов. В работе были использованы 105 беспородных белых крыс. Животные содержались в стандартных условиях вивария.

Для оценки влияния димефосфона на развитие млекопитающих препарат ежедневно вводили беременным крысам. Для получения животных с датированной беременностью использовали стандартную методику (П. П. Гамбарян и др., 1955). Беременные крысы были разделены на две группы. Первая служила контролем, вторая получала димефосфон. Препарат вводили животным один раз в день с первого по девятнадцатый день гестации в дозе 200 мг/кг. Самки контрольной группы получали эквиобъем стерильной дистиллированной воды в аналогичные сроки. Ежедневно оценивали общее состояние и массу тела животных. На 20-й день гестации крыс под легким эфирным наркозом выводили из эксперимента. Выделяли органы для последующего взвешивания и определения коэффициента их массы. Извлекали плоды и осматривали матку для подсчета, мест имплантации и тел резорбции. Резорбции рассматривали как "ранние" в случае визуального наблюдения остатков зародыша и изменения стенки матки и, как "поздние" при выявлении остатков плаценты и плода. Затем оценивали число желтых тел в яичниках, количество живых и мертвых плодов в матке. Рассчитывали показатели эмбриональной гибели: индексы пред- и постимплантационной смертности по стандартным формулам (А.П.Дыбан, 1974;

J.C.Kim et al., 2001). Проводили взвешивания, измерение длины всех зародышей и их плацент. Далее, проводили их осмотр с целью выявления внешних аномалий развития, определения пола и величины аногенитальной дистанции. Часть помета крыс помещали в фиксатор Буэна для исследования по методу Вильсона - Дыбана, другую - фиксировали в 96° спирте для изучения костного скелета по методу Даусона - Дыбана (А.П.Дыбан, 1974). Фрагмент работы по оценке аномалий внутренних органов и скелета плодов крыс проводили совместно с Р.Ф.Гайнетдиновым.

Для оценки становления фенотипа гладкомышечных клеток на этапах пренатального гистогенеза использовали моноклональные антитела к десмину (DAKO, Дания), альфа гладкомышечному актину (DAKO, Дания) и кальпонину (Novocastra Lab. Ltd., UK). Для получения эмбрионов различных сроков гестации, начиная с 9-х суток беременности, ежедневно крыс выводили из эксперимента под эфирным наркозом и извлекали зародыши для последующего исследования. Для оценки влияния димефосфона на экспрессию белков на 20 день гестации опытных крыс выводили из эксперимента под наркозом и извлекали их плоды для последующего иммуногистохимического изучения тканей внутренних органов.

Эмбриональный материал фиксировали в 4% забуференном формалине и заливали в парафин по стандартной методике. После заключения в парафин из эмбрионов и плодов готовили серийные гистологические срезы. Каждое 10 стекло окрашивали гематоксилин - эозином. После оценки топографического расположения органов зародыша проводили серийную иммуногистохимическую окраску препаратов на исследуемы белки (А.П.Киясов, 1998).

Статистический анализ результатов исследования проводили с использованием параметрических (критерий Стьюдента) и непараметрических тестов (критерия Уилкоксона-Мана-Уитни). Проверку гипотез о различии выборок для данных, оцениваемых по альтернативной шкале, проводили с использованием точного критерия Фишера. Обработку проводили с использованием пакетов статистических программ Statistica (StatSoft, Inc. 2001, version 6).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование влияния димефосфона на течение беременности и развитие плодов крыс

Оценка общего состояния крыс не выявила каких - либо симптомов токсического действия димефосфона на беременных самок на всем протяжении эксперимента. Регистрация массы тела животных в период гестации показала, что препарат оказывал влияние на прирост этого параметра, начиная с 12 дня гестации. К 20 дню прирост массы в контрольной группе животных составил 27% от исходного уровня, тогда как у опытных крыс отмечалось повышение массы тела на 48% (р<0,05) (рис. 1).

Рис. 1. Динамика изменения массы тела на протяжении 20 дней гестации беременных контрольной ( —■—) и опытной ( —о-—) групп. (* - р<0,05)

Коэффициенты масс внутренних органов опытных крыс на 20 день беременности не были изменены (таб. 1). Отмечалось значимое повышение коэффициента массы яичников. Эти параметры для мозга, матки, печени, сердца, селезенки и надпочечников были равнозначными в обеих группах животных.

По данным литературы, введение бисфосфонатов беременным крысам с 6 по 16 день гестации приводит к развитию выраженных токсических эффектов: снижению прироста массы тела, диареи и заторможенности (D.H. Minsker et al., 1993). Как показали результаты наших экспериментов, димефосфон подобных эффектов не вызывал, что свидетельствуют о хорошей переносимости димефосфона крысами в период беременности.

Таблица 1

Влияние курсового введения димефосфона на прирост массы тела и коэффициенты массы внутренних органов беременных крыс.

Параметры контроль опыт

(диет, вода) (димефосфон)

прирост массы тела (гр.) 67,69+6,87 95,00+14,57*

коэффициент массы:

яичников 0,56+0,08 0,88+0,06*

матки 14,78±235 19,09+1,62

печени 61,43±5,81 7731+5,48

почки 7,52±0,47 7,42±0,71

сердца 4,92+0,40 432+0,40

селезенки 5,56+0,78 6,52+0,80

надпочечников 039+0,01 0,44±0,04

(* - р<0.05, результаты представлены как М±ш)

Сравнительная оценка выживаемости плодов беременных контрольных и опытных крыс

Как в опытной, так и в контрольной группах крыс не отмечалось появления крыс с мертвыми плодами. Подсчет количества желтых тел и числа мест имплантации показал отсутствие различий между исследуемыми группами. Последующее изучение показало, что в матках крыс опытной и контрольной групп регистрировались места ранней и поздней резорбции. Эти показатели были равнозначными в обеих группах (таб. 2).

По литературным данным, наиболее выраженное действие на процессы имплантации проявляют противоопухолевые препараты алкилирующего типа действия, одним из которых является циклофосфамид - препарат, имеющий в структуре фосфорсодержащий фрагмент (A.M. Чернух и др., 1969). Бисфосфонаты не оказывают влияния на процессы имплантации эмбриона в стенку матки крыс (D.H. Minsker et al., 1993). Расчет индекса предимплантационной гибели плодов показал, что 22% яйцеклеток контрольных самок не имплантируются в стенку матки. Введение димефосфона не оказывало влияния на этот показатель, что свидетельствует о его безопасности при введении в предимплантационный период развития эмбрионов крысы.

Таблица 2

Выживаемость плодов после курсового введения димефосфона

беременным крысам.

Параметры контроль опыт

(диет, вода) (димефосфон)

число беременных крыс 12 10

число крыс с живыми плодами 12 10

число крыс с мертвыми плодами 0 0

число крыс с полной резорбцией 0 0

число желтых тел 11,76+0,41 12,80±0,58

число мест ранней резорбции 0,50±0,33 0,60±0,60

число мест поздней резорбции 0,50±0,23 0

число мест обшей резорбции 1,00±0,46 0,60±0,60

Неблагоприятное действие ксенобиотиков в течении эмбрионального периода реализуется через нарушение закладки жизненноважных органов у эмбрионов и последующей их гибелью (А.А. Динерман, 1980). Введение димефосфона не вызывало повышения индекса постимплантационной смертности, что свидетельствует об отсутствии у препарата эмбриолетального действия (Рис. 2).

Рис. 2. Гибель эмбрионов (в %) в предимплантационном (□) и постимплантационном периоде развития.

Оценка влияния курсового введения димефосфона на фетометрические параметры плодов крыс

Фосфорорганические пестициды при воздействии на организм млекопитающих в период беременности замедляли рост и развитие эмбрионов (А.А Динерман, 1980), тогда как бисфосфонаты не обладали аналогичным эффектом (S.D. Vasikaran et al., 2001). Курсовое введение монофосфоната димефосфона не оказывало влияния на массу и длину плодов мужских и женских особей (Таб. 3). Результаты оценки массы и диаметра плацент крыс показали, что в обеих группах эти показатели были равнозначными. При внешнем осмотре было выявлено, что на 20 день гестации плоды как контрольной, так и опытной групп были хорошо сформированы и у них отсутствовали кровоизлияния, отеки кожных покровов и внешние аномалии развития.

Таким образом, димефосфон не вызывал задержки развития плодов крыс. Фетометрические показатели как в контрольной, так и опытной группе значимо не отличались. Эти факты свидетельствуют об отсутствии отрицательного действия монофосфоната димефосфона на пренатальное развитие крыс.

Таблица 3

Морфометрические показатели плодов контрольных крыс и опытных, получавших димефосфон в период беременности.

Параметры контроль опыт

(диет, вода) (димефосфон)

Масса плода (гр.)

мужского пола 2,81 ±0,20 2,61 ±0,12

женского пола 2,71 ±0,16 2,48±0,09

Длина плода (мм.)

мужского пола 38,61 ±0,77 38,51 ±0,67

женского пола 37,69±0,71 37,63±0,51

Масса плаценты (гр.)

мужского пола 0,62±0,02 0,62±0,03

женского пола 0,59±0,01 0,61 ±0,02

Диаметр плаценты (мм.)

мужского пола 14,38±0,27 13,64±0,10*

женского пола 14,08±0,28 13,68±0,29

(* - р<0.05, результаты представлены как М±ш)

Изучение влияния курсового введения димефосфона на закладку и морфологию внутренних органов и скелета плодов крыс

Формирование специфических пороков развития у потомства относится к основным характерным признакам отрицательного действия ксенобиотика, воздействующего на процессы пренатального развития млекопитающих (А.А. Динерман, 1980). Причем, каждому веществу свойственно наличие специфических, аномалии определенных частей тела, что позволяет выделить симптомокомплекс характерный для определенного тератогена. ФОС с антихолинэстеразным механизмом действия вызывают специфические аномалии сердечно-сосудистой системы у млекопитающих (А.П. Дыбан, 1959; С.Н. Голиков и др., 1964).

Димефосфон при введении беременным крысам не вызывал специфических врожденных аномалий развития внутренних органов плодов: головного мозга, сердца, легких, печени, селезенки. Частота встречаемости кровоизлияний была равнозначной в обеих группах животных (таб. 4). При макроскопическом исследовании у них не отмечалось внешних аномалий лицевого отдела и конечностей.

Частота кровоизлияний и полнокровия внутренних органов плодов контрольных и опытных, получавших димефосфон, крыс.

Таблица 4

Изучаемые параметры

контроль (диет, вода)

опыт (димефосфон)

кровоизлияния в:

левую половину шеи щитовидную железу головной мозг брюшную полость Надпочечники

О 0 0

4,34% 0

0 о о о о

полнокровие:

Предсердий желудочков сердца сагиттальных синусов

21,73% 0

17,39% 0 0

17,39%

5,55% 5,55% 5,55% 5,55%

0 0

сосудов вестибулярного аппарата сосудов легких _сосудов тела

Частота вариаций развития внутренних органов, таких как расширение почечных лоханок и мочеточников у контрольной и опытной групп плодов достоверно не различалась (таб. 5) и соответствовала показателям, описанным другими авторами (A.M. Чернух и др., 1969; А.П. Дыбан, 1974).

Таблица 5

Частота аномалий развития внутренних органов плодов контрольных и опытных, получавших димефосфон, крыс.

Изучаемые параметры контроль опыт

(диет, вода) (димефосфон)

дефект желудочков головн. мозга 0 0

гидронефроз 13,04% 22,22%

гидроуретер 4,34% 0

дистопия мочевого пузыря 0 0

гидроцефалия 0 0

дефект диафрагмы 0 0

гипоплазия внутренних органов 0 0

дефект твердого неба 0 0

Учитывая, что бисфосфонаты вмешиваются в метаболизм кальция, наиболее важным моментом в исследовании влияния сходных с ними препаратов на процессы эмбриогенеза, считается изучение скелета и его оссификации у плодов, рожденных от матерей, получавших их в период беременности. Ранее, в ряде работ было показано, что препараты этой группы имеют неоднозначное влияние на процессы остеогенеза. С одной стороны, они не вызывали формирование грубых пороков развития, тогда как с другой, при исследовании процессов оссификации отмечалась задержка развития ряда костей (Р. Огаере1 й а1., 1992; N. РагЫ й а1., 1999; 8.Б. Уа81кагап й а1., 2001).

В настоящем исследовании мы не выявили признаков нарушения анатомической структуры скелета плодов крысы под влиянием димефосфона. При изучении размеров точек окостенения в опытной группе не было отмечено значимого уменьшения длины зачатков костей и числа их точек оссификации (таб. 6).

Таким образом, курсовое введение димефосфона в период беременности крысам не вызывало каких-либо специфических пороков развития и не повышало частоту спонтанных аномалий у их плодов.

Таблица 6

Длина и количество точек оссификации костей у плодов контрольных и опытных, получавших димефосфон, крыс.

Параметры контроль опыт

(диет, вода) (димефосфон)

длина зачатков костей (мм.)

локтевая кость 2,62±0,08 2,34±0,09

бедренная кость 1,82±0,08 1,55±0,07

плечевая кость 2,45±0,08 2,08±0,05

болыиеберцовая 2,05±0,07 1,83±0,08

малоберцовая 1,87±0,09 1,7110,06

количество точек окостенения

запястье 2,7710,12 2,43±0,31

стопа 3,23±0,21 2,86±0,22

Влияние курсового введения димефосфона на процессы половой дифференцировки плодов крыс

Ксенобиотики могут оказывать влияние на процессы половой дифференцировки плодов. Показано наличие взаимосвязи аномальной половой дифференцировки некоторых видов животных, проявляющееся стерильностью мужских и женских особей и концентрацией полихлорированных бифенилов, проявляющих эстрогенные свойства (J.C. Kim et al., 2001). В доступной литературе отсутствуют сведения о влиянии бисфосфонатов и монофосфонатов на процессы половой дифференцировки при их использовании в период беременности.

Оценка соотношения плодов разных полов показал, что как в контрольной, так и в опытной группе крыс эти показатели были равнозначными (таб. 7).

Измерение аногенитальной дистанции у плодов выявило, что исследуемый препарат не влияет на эту величину; как в контрольной, так и опытной группе крыс эти показатели были равнозначными. Сравнительная оценка показателей аногенитального индекса позволил выявить, что препарат не изменял как абсолютной величины, так и относительной величины аногенитальной дистанции.

Таким образом, введение димефосфона с 1 по 19 день беременности не приводило к изменению половой дифференцировки плодов крыс.

Таблица 7

Показатели половой дифференцировки плодов контрольных и опытных крыс.

Параметр контроль опыт

(диет, вода) (димефосфон)

индекс муж/жен 1,14 1,23

аногенитальная дистанция:

муж. (мм.) 2,07±0,06 2,1110,06

жен. (мм.) 1,12±0,02 1,0610,02

аногенитальный индекс

муж. 1,47±0,02 1,53Ю,02

жен. 0,81±0,008 0,7810,02

Считается, что нарушение эмбрионального развития может реализовываться по трем основным путям, регистрируемым исследователем: эмбриолетальность; общая задержка развития; аномалии наружных и внутренних органов и скелета (А.П. Дыбан и др., 1986). Результаты наших исследований свидетельствуют, что введение димефосфона с 1 по 19 день гестации не приводит к нарушениям, как на уровне организма беременной крысы, так и на уровне пренатального развития ее плодов. Оценка результатов выживаемости зародышей показала, что в опытной группе показатели предимплантационной и постимплантационной гибели не превышают контрольного уровня. Эти факты свидетельствуют об отсутствии влияния изучаемого препарата, как на процессы имплантации бластоцисты в стенку матки, так и ее дальнейшего развития до фетальной стадии. Димефосфон не вызывал увеличения числа мест ранней и поздней резорбции в матке крыс, что указывает на отсутствие у него способности вызывать гибель эмбрионов. В эмбриональном периоде, когда идет закладка всех внутренних органов, димефосфон не нарушал органогенез. Оценка морфометрических параметров плодов крысы на 20 день гестации позволяет оценить рост органов и тканей в течение фетального периода (J.C. Kim et al., 2001). Препарат не изменял эти показатели, как у женских, так и у мужских особей, что позволяет сделать заключение об отсутствии побочного эффекта препарата на развитие зародыша в этот период.

Введение димефосфона с 1 по 19 день гестации не вызывало формирования уродств внешних и внутренних органов; отмечаемые спонтанные

аномалии были равнозначными как в опытной, так и в контрольной группе. Препарат не вызывал аномалий скелета и замедления оссификации у плодов крыс. Это позволяет предположить, что димефосфон не вызывает развития специфических морфологических аномалий, характеризующих тератогенное действие лекарственных веществ.

Таким образом, можно полагать, что исследуемый препарат не оказывает эмбриотоксического действия на модели пренатального развития крысы по всем трем составляющим. Результаты наших исследований свидетельствуют о репродуктивной безопасности димефосфона при введении его в суточной терапевтической дозе на всем сроке беременности крысам.

Однако, представленные параметры эмбриогенеза являются важными, но исследование дифференцировки клеток в органах эмбриона, позволяет дополнить информацию о действии лекарственного вещества на развитие плода.

Сравнительная оценка экспрессии миогенных маркеров в ходе пренатального онтогенеза крыс в норме и при введении димефосфона

Несмотря на то, что морфология эмбрионов крысы на различных сроках гестации изучена достаточно хорошо, ряд вопросов все же остаются не решенными. Одними из таких вопросов являются закономерности становления фенотипа ГМК на этапах пренатального развития.

Проведенные нами исследования позволили установить, что дифференцировка гладкомышечных клеток начинается не сразу во всех органах и первым из них, экспрессирующим миогенные белки, является сердце, кардиомиоциты которого экспрессируют десмин, а-гладкомышечный актин и кальпонин, начиная с 11 дня гестации. Это согласуется с исследованиями других авторов, в которых было показано, что в сердце эмбриона мыши наблюдается транзиторная экспрессия а-гладкомышечного актина (D.M. Noden et al., 1995). Однако, исследований по экспрессии кальпонина в доступной нам литературе мы не выявили. Результаты наших исследований показывают, что кардиомиоциты сердца проходят стадию не только ранней дифференцировки, но и поздней дифференцировки, характерной для гладкомышечных клеток сосудов. Таким образом, мышечная ткань сердца имеет гладкомышечный фенотип в течение эмбрионального периода развития.

Если сердце является начальной точкой миогенной дифференцировки, и,

как мы установили, кардиомиоциты имеют характерный для ГМК фенотип, то каковы закономерности дифференцировки периферических сосудов? Играет ли роль в дифференцировке сосуда его функциональное состояние? Мы обнаружили, что экспрессия десмина, а-гладкомышечного актина и кальпонина начинается с гладкомышечных клеток пупочной вены и аорты. Более того, дифференцировка ГМК пупочной вены происходила на 12 день гестации, тогда как аорты - на 13 день. Мы полагаем, что оксигенация и трофические факторы могут играть важную роль в процессах дифференцировки сосуда, тогда как его тип (артерия или вена) не является определяющим фактором.

Нами было обнаружено, что дифференцировка миогенных элементов разных участков аорты происходила неодновременно. Отделы, располагающиеся наиболее близко к сердцу, начинали экспрессировать десмин, а-ГМА и кальпонин, начиная с 13 дня гестации. В каудальных частях аорты исследуемые белки появлялись, начиная с 14 - 15 суток гестации. Подобные закономерности были обнаружены и при исследовании дифференцировки средней оболочки ветвей аорты, клетки которой начинали экспрессировать а-ГМА и кальпонин начиная с 17 дней гестации. Учитывая, что в процессе пренатального развития происходит последовательное повышение давления в аорте, причем, от ее центральных отделов к периферическим имеется градиент этой величины, можно предположить, что в процессах становления фенотипа гладкомышечных клеток сосуда функциональные характеристики, такие как давление, играют важную роль. В пользу этого предположения свидетельствуют результаты исследования, посвященного выявлению корреляции между нарастанием давления в постнатальном периоде развития крысы и уровнем экспрессии кальпонина МзЫёа й а1., 1993).

Таким образом, в процессе эмбриогенеза дифференцировка аорты происходит градиентно от центральных отделов к периферическим и решающим фактором ее дифференцировки может быть функциональная характеристика кровотока.

Следует отметить, что в зрелом организме артерии делят на два типа -мышечного (контрактильные) и эластического (синтетические) типа (А. С. вйХепЬе^-ёе вгоо1 й а1., 1999). Мышечная оболочка первых характеризуются высоким уровнем экспрессии контрактильных белков (а-ГМА и кальпонина),

тогда как вторых - низким (У. 8. Ко й а1., 1999). К сосудам эластического типа относится аорта и легочная артерия (Л.И. Фалин, 1976). В литературе отсутствуют сведения относительно закономерностей становления фенотипа ГМК этих сосудов на этапах пренатального развития. По результатам наших исследований в аорте наблюдался высокий уровень а-ГМА и кальпонина с 13 по 20 день гестации, что свидетельствует о контрактильном фенотипе этого сосуда на этапах пренатального развития. Таким образом, начиная с ранних этапов пренатального развития, фенотип гладкомышечных клеток строго не детерминирован, а последовательность начала и уровень экспрессии контрактильных протеинов в них подчиняются универсальной закономерности. На ранних стадиях эмбриогенеза в клетках появляются десмин и а-ГМА, а на поздних - кальпонин.

На настоящий момент становление сосудистого русла печени является до конца не решенной проблемой. Авторы ранних исследований, посвященных развитию печени, выполненных с использованием классических гистологических методов, выдвинули концепцию, что система артериальных сосудов существует, начиная с ранних этапов эмбриогенеза этого органа. Более того, было показано, что желчные протоки в печени также закладываются с ранних этапов (Л.И. Фалин, 1976). Изучение эмбриогенеза печени с использованием иммуногистохимических методов позволили выявить противоречивость этой концепции (А.Р. Етзоу й а1., 1996). Результаты наших исследований показали, что становление сосудистого русла печени начинается с 13 дня гестации с формирования сети венозных сосудов и синусоидов не имеющих гладкомышечной оболочки. Экспрессия а-ГМА была выявлена лишь в крупных венах только с 16 дня гестации. В тоже время, сосудов, экспрессирующих кальпонин, до этого срока нами обнаружено не было. Лишь на 17 день рядом с портальной веной появлялась печеночная артерия, ГМК которой экспрессировали кальпонин. Артерия располагалась рядом с прорастающими желчными протоками. Таким образом, становление артериальных сосудов печени начинается лишь с фетальной стадии пренатального развития крысы. На основании полученных результатов, можно предположить, что становление портальной системы - желчных протоков и артериальных сосудов в печени идет параллельно. Учитывая, что печеночная артерия является одной из ветвей аорты,

которые начинают экспрессировать кальпонин, начиная с 16 дня гестации, можно сделать вывод, что печеночная артерия появляется, начиная с фетальной стадии развития. Поскольку желчные протоки также появляются на этом этапе пренатального развития; можно предположить, что данные процессы идут параллельно.

Другими важными структурами, в которых гладкомышечные клетки играют важную роль, являются органы желудочно-кишечного тракта. Становление сократительных элементов стенок желудочно-кишечного тракта происходит на поздних этапах эмбриогенеза и, в отличие от сосудистой системы, гладкомышечные клетки органов пищеварения не играют значительной роли в патологии пренатального периода. Может быть поэтому, становление фенотипа гладкомышечных клеток желудочно - кишечного тракта, остается малоизученным вопросом (E.N. Olson et al., 1992). Не исследованным остается сходство закономерностей становления фенотипа гладкомышечных клеток этих органов с органами сосудистой системы. В нашей работе было выявлено, что дифференцировка гладкомышечных клеток желудочно - кишечного тракта начинается с 16 дня гестации, что соответствует началу фетального периода. Более того, наблюдался градиент экспрессии исследованных миогенных белков. Начиная с 17 дня гестации оболочка желудка имела двухслойный характер и в последующие сроки наблюдалось последовательное приобретение "двухслойности" и другими отделами желудочно-кишечного тракта. На основании полученных данных, можно говорить о градиенте дифференцировки ГМК желудочно-кишечного тракта на этапах фетогенеза крысы. Учитывая, что аналогичные закономерности были получены в ходе исследования органов сердечно-сосудистой системы можно сделать вывод, что наблюдаемые закономерности имеют универсальных характер.

В литературе имеются противоречивые сведения относительно закономерностей становления фенотипа гладкой и поперечно - полосатой мускулатуры.(1.И. Chamley-Campbell et al., 1981; F. Babai et al., 1990; G.M. Smythe et.al., 2001). Ряд исследователей высказали мнение, что мышечные клетки обоих типов имеют единую программу дифференцировки (А. С. Gittenberg-de Groot et al., 1999). В наших экспериментах исследование экспрессии десмина, а-ГМА и кальпонина в мышцах поперечно-полосатого типа

показало, что экспрессия десмина и а-ГМА наблюдается в скелетной мускулатуре в течение 16-19 дней гестации, в противоположность кальпонину, который не выявлялся в них. Таким образом, а-ГМА, так же как и десмин, являются универсальными маркерами всех миогенных клеток в течение пренатального развития крысы. Это подтверждается результатами исследований других авторов, также выявивших стадию гладкомышечного фенотипа поперечно-полосатых мышечных волокон на этапах пренатального развития млекопитающих (Н.В. Ямщиков и др., 2000; Г.Н. Суворова, 2001). Более того, транзиторная экспрессия гладкомышечных маркеров в поперечно - полосатой мускулатуре затрудняет выделение универсального маркера гладкомышечной дифференцировки на этапах эмбрио- и фетогенеза. В литературе отсутствуют сведения об экспрессии кальпонина в мышцах поперечно-полосатого типа на этапах пренатального развития (Н. Weintraub et al., 1991). На основании наших исследований можно сделать вывод, что только кальпонин является белком -маркером гладкомышечной дифференцировки.

Для некоторых лекарственных препаратов, влияющих на функционирование сердечно-сосудистой системы млекопитающих, установлена их способность модулировать фенотип гладкомышечной клетки (J.H. Chamley-Campbell et al., 1981). Подобные свойства выявлены у ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента (S. Clement et al., 2001), доноров NO (T. Aizawa et al., 2003), талидомида (F.A. Luzzio et al., 2003). Однако информация о характере воздействия этих препаратов на гладкомышечную ткань в период эмбриогенеза отсутствует. Анализ результатов наших исследований позволил выявить, что введение димефосфона с 1 по 19 день гестации не оказывало влияния на локализацию и характер экспрессии а-ГМА и кальпонина у эмбрионов на 20 день гестации. Введение димефосфона не меняло толщину слоя гладкомышечных клеток органов как сердечно-сосудистой системы, так и желудочно-кишечного тракта. Не отмечалось отсутствия или изменение сроков экспрессии десмина, а-ГМА и кальпонина в этих органах. Эти результаты работы свидетельствуют об отсутствии повреждающего действия димефосфона при курсовом введении на развитие и дифференцировку гладкомышечных клеток в ходе пренатального развития крыс. Таким образом, введение димефосфона с 1 по 19 день гестации не только не вызывает тератогенный эффект, но и не проявляет

повреждающего действия на организм эмбрионов и плодов и не изменяет закономерностей дифференцировки ГМК внутренних органов.

В экспериментальных работах ряда исследователей имеются данные о морфологических изменениях гистоструктуры печени при воздействии лекарственных веществ: метотрексата, парацетамола, амитриптилина и др. В ткани печени животных после воздействия указанных выше лекарственных средств обнаруживали дистрофию гепатоцитов, некрозы, снижение числа паренхиматозных элементов, отек и активацию соединительнотканной стромы (В.В. Серов и др., 1989; AJ. Barak et al., 1984; R. Campos et al., 1989; J.C. Davila et al., 1989). На настоящий момент имеются лишь разрозненные сведения по морфологическим исследованиям ткани печени эмбриона животных и человека в период беременности, подвергавшихся воздействию лекарственных средств (С.Н. Голиков и др., 1964; A.M. Чернух и др., 1969; А.П. Кирюшенков и др., 1990).

Печень является важным органом в течение всего внутриутробного развития и выполняет кроветворную, желчевыделительную, барьерную, обезвреживающую, метаболическую, гомеостатическую, депонирующую и регуляторную функцию. Основная масса крови проходит через этот орган и, безусловно, печень является тем органом, который берет на себя удар ксенобиотиков. Компенсаторно приспособительные реакции со стороны гепатоцитов позволяют печени выдержать этот удар. Установлено, что одним из критериев оценки повреждающего действия любого вещества на печень, может быть состояния синусоидных клеток печени и, в частности, клеток Ито, которые у крыс экспрессируют десмин. При любом повреждении печени увеличивается количество клеток Ито и может произойти их трансдифференцировка в клетки, синтезирующие компоненты соединительной ткани, а именно миофибробласты, которые содержат в своей цитоплазме еще а-гладкомышечный актин.

Димефосфон при курсовом введении в период беременности не оказывал влияния на морфологическую структуру печени эмбрионов, что свидетельствует об отсутствии у исследуемого препарата гепатотоксического действия. Нами не было обнаружено увеличения количества десмин-позитивных клеток ИТО, которые всегда сопровождают повреждения клеток паренхимы. Также, как и в группе контрольных плодов -ГМА обнаруживался только в стенке крупных вен

и прорастающих в печень артерий. Другими словами не было выявлено трансдифференцировки клеток Ито в миофибробласты, что еще раз подтверждает отсутствие альтерации печени плодов крысы при введении беременным самкам димефосфона.

Таким образом, на основании результатов исследований, посвященных влиянию димефосфона в период беременности на организм крыс и формирование и рост их эмбрионов, а также базируясь на данных иммуногистохимических исследований различных тканей плодов 20 дневного возраста можно заключить, что препарат не оказывает отрицательного действия на внутриутробное развитие крыс.

ВЫВОДЫ

1. Димефосфон при введении в период беременности с 1 по 19 сутки не вызывает аномалий пренатального развития крысы.

2. Димефосфон не вызывает нарушения закладки, роста и оссификации костной системы у плодов крыс при курсовом введении его с 1 по 19 день гестации.

3. Димефосфон не нарушает органо- и гистогенеза внутренних органов плода крыс: сердца, аорты, желудка, пищевода, почек, печени при курсовом введении его беременным крысам

4. Все миогенные клетки плодов крысы экспрессируют а-ГМА. В сердечной и скелетной мускулатуре эта экспрессия транзиторная:

первым органом проявляющим миогенную дифференцировку являются сердце, кардиомиоциты которого, экспрессируют десмин, а-ГМА и кальпонин начиная с 11 дня гестации;

дифференцировка клеток среднего слоя аорты начинается от сердца, до приобретения синтетического фенотипа ГМК аорты имеют контрактильный фенотип;

становление артериального сосудистого русла печени идет начиная с 17 дня гестации и идет вдоль желчных протоков;

экстраэмбриональная часть пупочной вены является наиболее дифференцированной веной начиная с эмбрионального периода развития крысы;

дифференцировка гладкомышечных клеток ЖКТ идет не одновременно, а начиная от желудка и последовательно распространяется к каудальным отделам.

5. Димефосфон не нарушает становление и дифференцировку гладкомышечных клеток различных внутренних органов в ходе пренатального онтогенеза

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАТЦИИ

1. Бурыкин И.М. Экспрессия десмина и гладкомышечного актина в ходе пренатального онтогенеза сердца и скелетной мышцы / И.М. Бурыкин., А.А. Гумерова, А.П. Киясов // IV научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов республики Татарстан.- Казань, 2001.- с. 7.

2. Бурыкин И.М. Формирование портальных трактов в эмбриогенезе крысы / И.М. Бурыкин, В .А Киясова, А.А. Гумерова, А. П. Киясов // Научно-практическая конференция, посвященная 40-летию ЦНИЛ КГМУ "Современные методы исследования в медицине и фармации".- Казань, 2002.- с. 9-10.

3. Бурыкин И.М. Экспрессия десмина в различных тканях крысы на ранних этапах эмбриогенеза / И.М. Бурыкин, В.А. Киясова, Т.С. Сметанникова // VII научно-практическая конференция молодых ученых КГМУ.- Казань, 2002.- с. 30.

4. Бурыкин И.М. Состояние плодов крыс под воздействием димефосфона, введенного в поздние сроки беременности / И.М. Бурыкин, Г.Н. Алеева, Р.Х. Хафизьянова // международная практическая конференция "Здоровье и образование в XXI веке",- Москва, 2003.- с. 111.

5. Бурыкин И.М. Сравнительная оценка действия димефосфона при различных схемах его введения на репродуктивную функцию крыс / И.М. Бурыкин, Р.Х. Хафизьянова // международная практическая конференция "Здоровье и образование в XXI веке".- Москва, 2003.- с. 112.

6. Бурыкин И.М. Оценка действия димефосфона на предимплантационный период развития зародышей крыс / И.М. Бурыкин, Э.Р. Галимуллин, К.А. Малхасян, Р.Н. Камалетдинов, А.В. Захарова, Р.Ф. Гайнетдинов, Р.Х.

Хафизьянова // Межвузовская конференция молодых ученых "Актуальные проблемы патофизиологии".- Санкт-Петербург, 2003.- с. 12.

7. Хафизьянова Р.Х. Влияние димефосфона на репродуктивную функцию и перинатальное развитие плодов / Р.Х. Хафизьянова, И.М. Бурыкин, Э.Р. Галимуллин // 2-й съезд Российского Научного Общества фармакологов "Фундаментальные проблемы фармакологии".- Москва, 2003.- Часть II.- с. 263.

8. Бурыкин И.М. Ремоделирование сосудистой стенки пупочной вены в процессе эмбрионального онтогенеза / И.М. Бурыкин // VIII научно-практическая конференция молодых ученых КГМУ.- Казань, 2003.- с. 11.

9. Хафизьянова Р.Х. Воздействие монофосфоната - димефосфона на течение беременности и развитие плодов крыс / Р.Х. Хафизьянова, И.М. Бурыкин, Г.Н^ Агеева, А.П. Киясов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.- т №3.-с. 426-429.

10. Бурыкин И.М. Итоги сопоставления монофосфоната димефосфона и эталонных тератогенов: циклофосфамида и натрия салицилата на развитие эмбрионов крысы / И.М. Бурыкин, Р.Ф. Гайнетдинов, Г.Н. Алеева, Р.Х. Хафизьянова // XI Российский национальный конгресс "Человек и лекарство".-Москва, 2004.- с. 769.

11. Бурыкин И.М. Становление фенотипа гладкомышечных клеток сердечно-сосудистой системы на различных этапах эмбриогенеза / И.М. Бурыкин // IX Всероссийская научно-практическая конференция "Молодые ученые в медицине".- Казань, 2004.- с. 117-118.

Лицензия ПД № 7-0157 от 21.05.2001г. Отпечатано с готового оригинал-макета в ООО "ДИАЛОГ-КОМПЬЮТЕРС"

Подписано в печать 28.04.2004 г. Заказ № 04/217. Тираж 100 экз. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Объем 1,0 п.л. Печать ризографическая.

Казань, Толстого, 6. Тел. 36-73-80.

#-92 49

Актуальность исследования. Проблема репродуктивной безопасности лекарственных препаратов является одной из важнейших проблем современной медицины. Ежегодно на фармацевтический рынок "выбрасываются" сотни новых лекарственных препаратов, часть из которых может быть назначена беременным женщинам для коррекции патологических состояний, тогда как другая часть, отпускаемая без рецепта, может воздействовать на развивающийся плод на ранних этапах эмбриогенеза, когда женщина может не знать о своей беременности [140, 142, 169].

В последние десятилетия успешно идет синтез и внедрение препаратов из группы неантихолинэстеразных фосфорорганических соединений [2, 7, 10, 11, 12, 18, 19, 38, 43, 44]. Димефосфон рекомендован Фармакологическим комитетом Минздрава СССР (протокол №19 от 20.12.90) и разрешен приказом Министерства здравоохранения РФ (№ 304 от 28.12.93) для медицинского применения и промышленного выпуска в качестве вазоактивного лекарственного средства, нормализующего функцию центральной и вегетативной нервной системы. Репродуктивная безопасность этой группы лекарственных веществ и, в частности, димефосфона остается невыясненной, что ограничивает его применение в практической медицине.

На настоящее время для исследования влияния лекарственных веществ на 1 внутриутробное развитие млекопитающих используется большое число различных моделей [57, 114]. Однако неоднозначность, получаемых в ходе исследования, данных требует дальнейшего совершенствования методологии тератологических исследований. Одним из ключевых моментов пренатального развития млекопитающих является становление дефинитивного строения сердечно-сосудистой системы и, в частности, гладкомышечных клеток сосудов. Выявление общих закономерностей становления сердечно-сосудистой системы в ходе развития позволит не только раскрыть механизмы развития ряда врожденных заболеваний, но и повысить информативность тератологических исследований, что даст возможность более эффективно решать вопросы оценки действия лекарственного средства на внутриутробное развитие млекопитающих.

Исследование репродуктивной безопасности димефосфона расширит показания к применению его в практической медицине и пополнит арсенал применяемых лекарственных препаратов, используемых в клинике акушерства и гинекологии.

Цель исследования. Изучение влияния димефосфона на процессы пренатального развития крысы и дифференцировку гладкомышечных клеток внутренних органов.

Задачи исследования:

1. Оценить влияние курсового введения димефосфона в период беременности на развитие плодов крыс.

2. Изучить влияние димефосфона на формирование и оссификацию костной системы плодов крыс.

3. Исследовать закладку и гистологическую структуру внутренних органов плода крыс при курсовом введении димефосфона.

4. Провести исследование динамики становления и дифференцировки гладкомышечных клеток внутренних органов крысы в ходе пренатального развития.

5. Изучить влияние курсового введения димефосфона в период беременности на становление и дифференцировку популяции гладкомышечных клеток внутренних органов плодов крысы.

Научная новизна. Впервые показано, что димефосфон при курсовом введении не нарушал гисто и органогенез крысы. Препарат не влиял на остеогенез и оссификацию костной системы.

Впервые определены временные и топографические закономерности экспрессии десмина, а-гладкомышечного актина и кальпонина в гладкомышечных клетках внутренних органов эмбрионов и плодов крысы. Установлено, что становление артериальной системы печени крысы начинается с фетальной стадии пренатального развития одновременно с развитием желчных протоков.

Выявлено, что димефосфон не изменяет закономерности экспрессии десмина, а-гладкомышечного актина и кальпонина в гладкомышечных клетках внутренних органов плодов крыс и не влияет на процессы дифференцировки ГМК.

Научно-практическая ценность работы. Результаты исследования расширяют представления о становлении и дифференцировке гладкомышечных клеток в ходе пренатального развития и воздействии лекарственных препаратов. Экспериментальные данные могут быть использованы для дальнейших исследований, направленных на раскрытие механизмов изменения фенотипа гладкомышечных клеток сосудистой системы при различных патологических состояниях в период пренатального развития млекопитающих. Результаты исследования гистоструктуры внутренних органов могут быть использованы в прикладной тератологии для оценки репродуктивной безопасности лекарств. Итоги работы являются обоснованием возможности использования димефосфона в акушерстве и гинекологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Ежедневное введение димефосфона (в дозе 200 мг/кг) беременным крысам не сопровождается эмбриолетальным, эмбриотоксическим, тератогенным действием, нарушением гистоструктуры внутренних органов. Препарат не нарушает экспрессии десмина, а-гладкомышечного актина и кальпонина в гладкомышечных клетках внутренних органов плодов крысы.

2. Дифференцировка миогенных элементов различных отделов сердечно-сосудистой системы и пищеварительного тракта происходит неодновременно и характеризуется последовательным появлением в цитоплазме гладкомышечных клеток десмина, а-гладкомышечного актина и кальпонина.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены:

- на заседаниях проблемно-предметной комиссии КГМУ (Казань, 2001);

- IV научно-практической конференции молодых ученых и специалистов республики Татарстан (Казань, 2001);

- научно-практической конференции, посвященной 40-летию ЦНИЛ КГМУ "Современные методы исследования в медицине и фармации" (Казань, 2002);

- VII научно-практической конференции молодых ученых КГМУ (Казань, 2002);

- 5-й международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, 2003);

- межвузовской конференции молодых ученых "Актуальные проблемы патофизиологии" (Санкт-Петербург, 2003);

- 2-м съезде Российского Научного Общества фармакологов "Фундаментальные проблемы фармакологии" (Москва, 2003);

- VIII научно-практической конференции молодых ученых КГМУ (Казань, 2003);

- IX Конгрессе педиатров России "Актуальные проблемы педиатрии" (Москва, 2004);

- XI национальном конгрессе "Человек и лекарство" (первое место на конкурсе молодых ученых по специальности "клиническая фармакология" Москва, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ.

Структура диссертации. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка использованной литературы, включающего 175 отечественных и иностранных источников. Диссертация содержит 49 рисунка и 11 таблиц.

выводы

1. Димефосфон при введении в период беременности с 1 по 19 сутки не вызывает аномалий пренатального развития крысы.

2. Димефосфон не вызывает нарушения закладки, роста и оссификации костной системы у плодов крыс при курсовом введении его с 1 по 19 день гестации.

3. Димефосфон не нарушает органо- и гистогенеза внутренних органов плода крыс: сердца, аорты, желудка, пищевода, почек, печени при курсовом введении его беременным крысам

4. Все миогенные клетки плодов крысы экспрессирую а-ГМА. В сердечной и скелетной мускулатуре эта экспрессия транзиторная:

- первым органом проявляющим миогенную дифференцировку являются сердце, кардиомиоциты которого, экспрессируют десмин, а-ГМА и кальпонин начиная с 11 дня гестации;

- дифференцировка клеток среднего слоя аорты начинается от сердца, до приобретения синтетического фенотипа ГМК аорты имеют контрактильный фенотип;

- становление артериального сосудистого русла печени идет начиная с 17 дня гестации и идет вдоль желчных протоков;

- экстраэмбриональная часть пупочной вены является наиболее дифференцированной веной начиная с эмбрионального периода развития крысы;

- дифференцировка гладкомышечных клеток ЖКТ идет не одновременно, а начиная от желудка и последовательно распространяется к каудальным отделам.

5. Димефосфон не нарушает становление и дифференцировку гладкомышечных клеток различных внутренних органов в ходе пренатального онтогенеза