Автореферат и диссертация по медицине (14.00.23) на тему:Влияние атриопептидов на пролиферативные процессы в эпителиальной ткани белых крыс

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ ВЛАДИВОСТОКСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ГОНЧАРОВА Елена Николаевна

УДК 612.125.018:576.355

ВЛИЯНИЕ АТРИОПЕПТИДОВ НА ПРОЛИФЕРАТИВНЫЕ ПРОЦЕССЫ В ЭПИТЕЛИАЛЬНОЙ ТКАНИ БЕЛЫХ КРЫС

14.00.23 - гистология, цитология и эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Владивосток 1992

Работа выполнена в центральной научно-исследовательской лаборатории Хабаровского ордена Трудового Красного Знамени государственного медицинского института.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

С.С.ТИМОШИН

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Б.Я.РЫЖАВСКИЙ кандидат биологических наук А.А.ВАРАКСИН

Ведущая организация: 2-ой Московский ордена Ленина

государственный медицинский институт им. Н.И.Пирогова

Защита диссертации состоится "_" _1992 г. в _ часов на

заседании специализированного совета Д 084.24.01 при Владивостокском государственном медицинском институте (690600,г.Владивосток, пр.Остряко-ва, 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Владивостокского государственного медицинского института (г.Владивосток. пр.Острякова, 2).

Автореферат разослан "лУ" 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доцент

Г.М.ХОЛОДЕНКО

гдо , f АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Пролиферация клеток является одним -li^tlid основных биологических процессов, обеспечивающих жизнедеятельность и развитие организмов. Механизмы регуляции клеточного деления включают множество факторов, относящихся к различным уровням строения организма (внутритканевому, межтканевому, организменному) /Ю.А Романов и соавт.,1984/. Многочисленные регуляторы взаимодействуют между собой, образуя, в конечном счете, единый регуляторный континуум. Существенную роль в этом континууме выполняет система регуляторных пептидов /И.П.Ашмарин и соавт.,1988/. На процессы пролиферации способны влиять опиоидные пептиды /О.Б.Ильинский и соавт.,1985;С.С.Тимошин и соавт., 1987; Zagon I., 1987/, бомбезин /Rozengurt Е., 1989/, вазоактивный ин-тестинальный пептид /Hultgardh-Nilsson A. et al.,1988/, морфоген головы гидры /А.Ю.Хомичук и соавт.,1990/, кальцитонин-ген-родственный пептид /Umeda Y. et al.,1988/. Однако, в настоящее время невозможно создать целостное представление о роли пептидных регуляторов в поддержании структурного гомеостаза организма, поскольку сведения о влиянии многих групп регуляторных пептидов на процессы клеточного деления либо отсутствуют, либо имеют противоречивый характер.

В изученной нами литературе содержатся лишь единичные и противоречивые данные о воздействии предсердного натрийуретического фактора (ПНФ) на размножение культивируемых клеток /Л.А.Грачева и соавт.,1991; Horiba N. et а!.,1985; Appel R.G., 1988;Niskanen Е. et al.,1988/ и отсутствуют сведения о влиянии атриопептидов на процессы пролиферации в условиях целостного организма. Между тем, информация о внутриклеточных механизмах действия ПНФ /Anand-Srivastava М.В. et al.,1984; Weidmann P. et al., 1984; Leitman D.C. et al., 1987; McCarthy R.T. et al., 1990/ позволяет предполагать его выраженную активность в отношении клеточного деления. Экспериментальные данные о действии атриопептидов на пролиферативные процессы способны расширить представления об у частии регуляторных пептидов в поддержании структурного гомеостаза организма.

Подобное исследование является актуальным не только в теоретическом, но и в прикладном аспекте. В настоящее время в лаборатории синтеза пептидов Кардиологического научного центра РАМН осуществляется целе-

1

направленный синтез аналогов ПНФ с целью создания на их основе фармакологических препаратов диуретического и гипотензивного действия. Влияние атриопептидов на пролиферацию клеток может обусловить выраженные побочные эффекты лекарственных веществ этого класса.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель исследования состояла в выяснении характера влияния атриопептидов на пролиферативные процессы в различных клеточных популяциях. Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи:

1. Оценить влияние АР-II, типичного представителя семейства ПНФ, на процессы пролиферации в покровном эпителии белых крыс. Сопоставить реакцию эпителия на данное воздействие с эффектами, наблюдаемыми в структуре-мишени атриопептидов - клубочковой зоне коры надпочечников.

2. Провести сравнительный анализ действия 23-аминокислотного пептида АР-II. обладающего циклической структурой, и его 6-аминокислотного линейного фрагмента АР-Н-6-ОН на процессы пролиферации в условиях целостного организма.

3. Изучить характер влияния различных доз и режимов введения атриопептидов на процессы пролиферации в эпителиальной ткани белых крыс.

4. Изучить влияние АР-II и АР-Н-6-ОН на размножение культивируемых фибробластов эмбрионов человека.

5. Оценить роль тиреоидных гормонов и инсулина, как эндокринных регуляторов клеточного деления, в изменении процессов пролиферации при введении в организм атриопептидов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые изучено влияние атриопептидов на пролиферативную активность эпителиоцитов в условиях целостного организма. Показано, что введение пептидов семейства ПНФ вызывает существенные изменения процессов клеточного деления в эпителии роговицы, пищевода и двенадцатиперстной кишки. Кроме того, зарегистрированы сдвиги процессов синтеза ДНК в клубочковой и пучковой зонах коры надпочечников. Установлена сложная зависимость характера эффектов от вводимой дозы атриопептидов.

Впервые проведен сравнительный анализ действия циклического (AP-II) и укороченного ациклического (АР-Н-6-ОН) атриопептидов на клеточное де-2

ление. Выявлено сходное влияние обоих исследуемых веществ на пролифе-ративные процессы в ряде клеточных популяций. Показано наличие самостоятельной активности в отношении клеточного деления у ациклического аналога ПНФ - АР-Н-6-ОН.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Результаты проведенного исследования позволят внести соответствующие коррективы в показания и противопоказания к назначению фармакологических препаратов на основе атриопептидов при их внедрении в медицинскую практику. Полученные сведения об отношении "структура-активность" в ряду аналогов атриопептидов помогут направленному химическому синтезу веществ с заданными свойствами.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Пептиды семейства предсердного натрийуретического фактора при их экзогенном введении способны существенно изменять процессы пролиферации в покровном эпителии и коре надпочечников белых крыс.

2. В культуре эмбриональных фибробластов человека и в покровном эпителии белых крыс in vivo циклический атриопептид АР-II и его линейный аналог АР-Н-6-ОН оказывают сходяое влияние на пролиферативные процессы.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ. Основные материалы диссертации были доложены и обсуждены на научной конференции по проблеме "Экспериментальное и клиническое применение нейропептидов" (г.Хабаровск, 1991) и на совместном заседании ЦНИЛ, кафедр гистологии, патологической физиологии, топографической анатомии, нормальной анатомии ХоТКЗГМИ. ИОМиД и Хабаровского отделения ВРНОАГЭ (г.Хабаровск, 1992).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликованы 3 печатные работы.

ОБЪЕМ РАБОТЫ. Материал диссертации изложен на 108 страницах машинописного текста, иллюстрирован 11 микрофотографиями, 27 рисунками, включает 7 таблиц. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, полученные результаты, обсуждение результатов исследования, выводы. Список цитируемой литературы включает 326 названий работ (117 работ на русском и 209 - на иностранных языках).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В качестве представителей семейства ПНФ использовали циклический атриопептид AP-II (1) и ациклический укороченный аналог ПНФ АР-Н-6-ОН (2):

Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-lle-Asp-Arg-lle--Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser- (1)

-Phe-Arg

Arg-Ile-Asp-Arg-Ile-Gly (2)

AP-II обладает всеми основными структурными и биологическими свойствами нативных атриопептидов /Ж.Д.Беспалова и соавт., 1988/. Линейные аналоги ПНФ, подобные АР-Н-6-ОН, неспособны самостоятельно воспроизводить основные специфические эффекты натрийуретического фактора - действие на функции почек, надпочечников, сердечно-сосудистой системы /В.Н.Хирманов.1987; Mísono K.S. et al.,1984/.

Вещества получены в лаборатории синтеза пептидов Кардиологического научного центра РАМН под руководством д.м.н.,профессора Ж.Д.Беспа-" ловой.

Изучение эффектов атриопептидов в условиях целостного организма осуществляли на нелинейных белых крысах-самцах массой 160-220 г. В опытах было использовано 496 животных.

В качестве основной тестовой системы для изучения клеточного деления избрали эпителиальную ткань, как обладающую высокой пролифера-тивной активностью при относительной гомогенности клеточной популяции. Исследовали процессы пролиферации в переднем эпителии роговицы, эпителии пищевода и двенадцатиперстной кишки. Для первичной оценки участия специфических рецепторов в опосредовании влияния атриопептидов на пролиферативные процессы использовали корковое вещество надпочечников.

АР-II и АР-Н-6-ОН вводили внутрибрюшинно в дозах 1, 10 и 100 мкг/кг. Изучали воздействие атриопептидов при двух режимах введения: 4

однократном и многократном (5 инъекций на протяжении 5 суток). Животным контрольных групп вводили эквиобьемное количество растворителя -- стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Пролиферативную активность тканей оценивали через 4, 24 и 48 часов после инъекции (при многократном воздействии - после заключительной инъекции). Эвтаназию осуществляли посредством дислокации шейных позвонков у предварительно оглушенных крыс.

В сериях экспериментов по изучению митотической активности тканей для исключения изменения скорости самого митоза животным за 2 часа до эвтаназии внутрибрюшинно вводили колхицин в дозе 0,2 мг/100 г массы. Учитывая отсутствие прямого кровоснабжения роговицы, на глаз дополнительно апплицировали 0,02 мл 0,01% раствора колхицина. Тотчас после забоя биоптаты пищевода, двенадцатиперстной кишки и энуклеированный глаз фиксировали в жидкости Карнуа. Фрагменты пищевода и двенадцатиперстной кишки промывали, обезвоживали, заливали в парафин и готовили серийные срезы. Митотическую активность эпителия роговицы исследовали на тотальных препаратах. Гистологические препараты окрашивали гематоксилином Лилли-Майера и эозйном. Митотический индекс (МИкх) вычисляли путем деления числа митозов на общее количество клеток в регенеративной зоне эпителия и выражали в промилле.

Процессы синтеза ДНК исследовали с помощью авторадиографии с меченным тритием тимидином. Тимидин (молярная активность - 1570 ТБк/моль) вводили животным внутрибрюшинно в дозе 0,6 мкКи/г за 1 час до эвтаназии. Методика обработки биоптатов пищевода, двенадцатиперстной кишки и надпочечников для получения радиоавтографов была аналогична описанной выше. Роговицу тотчас после забоя инкубировали в среде 199, содержащей 2 мкКи/мл меченного тритием тимидина, в ультратермостате при 37,0° С в течение одного часа. По окончании инкубации роговицу промывали в среде 199, фиксировали в жидкости Карнуа, обезвоживали, заливали в парафин и делали серийные срезы. Приготовление радиоавтографов осуществляли по стандартной методике /О.И.Епифанова и соавт., 1969/. При подсчете ядро считали меченым, если над ним проецировалось не менее 5 треков. Индекс меченых ядер (ИМЯ) - отношение числа ДНК-

5

-синтезирующих ядер к общему количеству ядер - выражали в процентах. Интенсивность метки (ИМ) - среднее число треков над ДНК-синтезирующим ядром - вычисляли на основании подсчета зерен серебра над 20-30 мечеными ядрами.

Для оценки непосредственного действия атриопептидов на процессы пролиферации использовали культуру эмбриональных фибробластов человека. АР-II и АР-Н-6-ОН в конечной концентрации 10 пМ вносили в среду на третьи сутки после пересева клеток. В контрольные образцы добавляли эк-виобьемное количество изотонического раствора хлорида натрия. Через 24 часа после введения в среду атриопептидов монослой фибробластов фиксировали в жидкости Карнуа. За час до фиксации в среду вносили меченный тритием тимидин (1 мкКи/мл). Пролиферативную активность фибробластов оценивали по ИМЯ и средней плотности клеток в монослое.

Кариометрическое исследование клубочковой и пучковой зон коры надпочечников белых крыс проводили на телевизионном анализаторе изображения "Интеграл-2МТ" в режиме маркера.

Определение уровня гормонов (альдостерона, инсулина, тироксина и трийодтиронина) и активности ренина в плазме крови белых крыс осуществляли радиоиммунным методом на установке "Гамма-800" с помощью стандартных наборов Института биоорганической химии АН Белоруссии и фирмы Sonn (Италия).

При статистическом анализе результатов использовали стандартные методы вычисления средних и их отклонений, исключение "выскакивающих" вариант из выборки по критерир Шовене, а также оценки достоверности различий между группами по t-критерию Стьюдента и F-критерию Фишера /Д.Сепетлиев, 1968/. Различие между группами считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Влияние однократного введения атриопептидов на процессы пролиферации в эпителиальной ткани белых крыс

Основные серии экспериментов были проведены с использованием дозы атриопептидов 10 мкг/кг, являющейся базовой для тестирования веществ этого класса в отношении специфических эффектов /Ж.Д.Беспалова 6

и соавт.,1988; Garcia R. et al.,1985/.

Введение AP-II - атриопептида, обладающего характерной для ПНФ кольцевой структурой, - вызывало существенные изменения пролифератив-ных процессов в эпителиальной ткани всех исследованных органов (табл.1).

В эпителии роговицы при данном воздействии было зарегистрировано угнетение процессов пролиферации: через 4 часа после введения пептида наблюдалось достоверное уменьшение интенсивности метки (в 1,5 раза), а через 24 часа - значительное (в 2,5 раза) снижение митотического индекса ткани. По-видимому, эти эффекты связаны между собой: ингибирование процессов синтеза ДНК могло обусловить последующее снижение митоти-ческой активности эпителия.

В эпителии пищевода введение АР-II также вызывало депрессию процессов клеточного деления, выразившуюся в достоверном уменьшении МИкх (в 2,2 раза) через 24 часа после воздействия.

Изменения пролиферативной активности эпителия двенадцатиперстной кишки после введения атриопептида имели иную, чем в эпителии роговицы и пищевода, направленность. В эпителии кишки была зарегистрирована стимуляция процессов синтеза ДНК: наблюдалось достоверное увеличение ИМЯ и ИМ как через 4, так и через 24 часа после инъекции.

Таким образом, введение белым крысам атриопептида АР-II в дозе 10 мкг/кг приводило к разнонаправленным сдвигам пролиферативных процессов в эпителии различной локализации. Группировка эпителиев по характеру реакции на воздействие, по-видимому, не тождественна классификации по морфологическому или онтофилогенетическому признаку. В исследованиях, результаты которых опубликованы ранее /С.С.Тимошин.Е.Н.Гончарова, М.И.Радивоз,1991/, нами были установлены сходные изменения процессов пролиферации в однослойном энтеродермальном эпителии двенадцатиперстной кишки и многослойном эпидермальном эпителии языка при введении атриопептида белым крысам. Разнонапрапвленность эффектов, вероятно, определяется различиями в доступности действующих агентов для эпители-оцитов, что в свою очередь, может зависеть от особенностей кровоснабжения, местной ферментативной модификации веществ, специфической рецепции.

Таблица 1

Влияние атриопептидов на пролиферативные процессы

'I

в эпителиальной ткани белых крыс

АР-И АР-Н-6-ОН

МИкх (%„) ИМЯ (%) ИМ МИкх (%0) ИМЯ (%) ИМ

Э п и т е л и й р о г о в и ц ы

Контроль 14,5 + 1,7 8,0 + 0,8 14,1 + 1,6 14,5 + 1,7 8,0 ± 0,8 14,1 + 1,6

4 часа 16,2 + 1,5 7,7 + 0,8 9,4 + 0,5(*) 14,4 + 2,0 5,8 + 0,3(*) 11,9 + 1,3

24 часа 5,9 + 0,4(*) 9,4 + 0,7 17,5 + 1,8 7,8 + 0,9(*) 9,0 + 1,0 18,6 + 1,6

Э п и т е л и й пи щ е в о д а

Контроль 15,7 + 2,7 1,4 + 0,2 19,8 + 0,9 15,7 + 2,7 1,4 + 0,2 19,8 + 0,9

4 часа 11,3 + 1,8 1,5 + 0,2 23,3 + 1,4 - 1,0 + 0,1 18,6 + 0,9

24 часа 7,0 + 0,7(*) 1,6 + 0,3 23,1 + 2,9 7,5 + 1,1(*) 1,8 + 0,3 18,8 + 1,5

Э п и т е лий две н а д ц а т и перстной к и ш к и

Контроль 142,4 + 6,8 27,4 + 1,0 16,6 + 1,0 142,4 + 6,8 27,4 + 1,0 16,6 + 1,0

4 часа 142,3 + 2,3 30,8 + 1Д*) 23,6 + 1,3(*) ,, 141,4 + 4,1 29,0 + 1,1 18,9 + 1,5

24 часа 146,0 + 4,9 37,9 + 1,3(*) 27,5 + 1,4(*) 154,7 + 5,4 34,7 + 1,7(*) 25,0 + 1,7(*)

(*) - отличие от контроля статистически достоверно по ькритерию при р<0,05

Введение белым крысам укороченного ациклического аналога ПНФ, АР-Н-6-ОН, вызывало изменения процессов клеточного деления, аналогичные результатам действия АР-II (табл.1). Незначительные различия в регистрируемых эффектах, по-видимому, обусловлены особенностями биотрансформации действующих агентов.

2. Влияние введения различных доз атриопептидов на процессы пролиферации в эпителиальной ткани белых крыс

Характерной чертой влияния регуляторных пептидов на физиологические процессы в условиях целостного организма является сложная зависимость регистрируемых эффектов от вводимой дозы /В.Г.Смагин и соавт., 1983; Е.И.Чазов и соавт.,1984/. В связи с этим для выяснения характера действия вещества принято изучать его эффекты в диапазоне доз не менее трех порядков величин /В.Г.Смагин и соавт.,1983/. Согласно этой рекомендации мы предприняли дополнительное исследование влияний АР-II и АР-Н-б-ОН на процессы пролиферации при их введении в дозах 1 и 100 мкг/кг.

Введение АР-II в дозе 1 мкг/кг не вызывало каких-либо сдвигов ми-тотической активности эпителия.

Введение АР-II в дозе 100 мкг/кг приводило к изменениям пролифе-ративной активности эпителиальной ткани не всегда сходным по направленности с эффектами дозы 10 мкг/кг (табл.2).

В эпителии роговицы при данном воздействии было зарегистрировано достоверное повышение МИкх (в 1,3 раза) через 4 часа после иньекции. Через 24 часа митотическая активность эпителия в 1,4 раза превышала контрольную величину, однако это увеличение было статистически недостоверно (р-0,09) вследствие значительного разброса индивидуальных показателей в экспериментальной группе.

В эпителии пищевода введение 100 мкг/кг АР-II вызывало отсроченную (через 48 часов после инъекции) стимуляцию синтеза ДНК: наблюдалось достоверное возрастание интенсивности метки. Причины столь длительного латентного периода эффекта требуют дальнейшего изучения. Следовательно, в эпителии пищевода, как и в эпителии роговицы, повышение дозы ат-риопептида на порядок (с 10 до 100 мкг/кг) приводило к инверсии направ-

9

Таблица 2

Влияние атриопептида АР-II в дозе 100 мкг/кг на пролиферативные процессы в эпителиальной ткани белых крыс

МИкх (%0)

ИМЯ (%)

ИМ

Контроль 4 часа 24 часа

Контроль 48 часов

Контроль 4 часа 24 часа

Контроль 48 часов

Эпителий 18,1 + 1,2 24,2 + 2,3(*) 26,4 + 3,4

32,4 + 4.9 28,9 + 2,3

Эпителий 7,3 + 1,5

7.7 + 0,7 8,0 + 1,8

11,4 + 3,2

8.8 + 2.1

роговицы

8,3 + 1,4 13,6 + 1,9

9,0 +1,9 15,8 + 3,2

8,8 + 1,2 17,1 + 2,4

8,3 + 1,4 5,3 + 0.6-

13,6 + 1,9 11,1 + 1,1

пищевода

3,9 + 0.6 15,8 + 0,8

3.5 + 0,9 18.4 +.J.2

3,2 + 0.5 16,9 + 1,0

3,9 + 0,6 3,7 + 0,6

15,8 + 0,8 " 20,7 + 1,5(*)

Эпителий

Контроль 4 часа 24 часа

Контроль 48 часов

двенадцатиперстном кишки

178,3 + 5,2 206,6 + 10,1(*) 240,5 + 8,1(*)

162,3 + 8,2 175,5 + 4,2

29,2 + 0,8

31,8 + 1,1

34.1 + 1,0(*)

29.2 + 0,8 34,6 + 1,7(*)

18,9 + 1,6

25.4 + 1,0(*)

19.5 + 0,9

18,9 + 1,6 23,0 + 2.1

(*) - отличие от контроля статистически достоверно по t-критерию при р<0,05.

ленности эффекта.

Лишь в эпителии двенадцатиперстной кишки характер сдвигов проли-феративных процессов после иньекции 100 мкг/кг АР-II был сходным с изменениями, имевшими место при введении пептида в дозе 10 мкг/кг. На всех сроках исследования наблюдалась активация процессов синтеза ДНК. Кроме того, через 4 и 24 часа после воздействия было зарегистрировано достоверное повышение митотической активности эпителия.

Таким образом, уменьшение дозы АР-II с 10 до 1 мкг/кг приводило к "исчезновению" регистрируемых эффектов, а увеличение дозы атриопеп-тида с 10 до 100 мкг/кг - к нивелированию различий в реакциях эпителиев различной локализации и к формированию более или менее однотипного сдвига: стимуляции процессов пролиферации.

Укороченный ациклический аналог ПНФ АР-Н-6-ОН практически полностью повторял активность циклического атриопептида АР-II как в отношении дозы 1 мкг/кг (отсутствие регистрируемых влияний на процессы клеточного деления), так и в отношении дозы 100 мкг/кг (стимуляция пролифера-тивной активности эпителиоцитов). Следовательно, на всех изученных дозах (1, 10 и 100 мкг/кг) влияние линейного пептида АР-Н-6-ОН было сходно с эффектами циклического пептида АР-И.

3. Влияние многократного введения атриопептидов на клеточное деление в эпителиальной ткани белых крыс

Перспектива создания на базе ПНФ фармакологических препаратов определяет необходимость исследования действия атриопептидов на биологические процессы при различных режимах введения. Значительная длительность некоторых сдвигов процессов пролиферации после введения атриопептидов белым крысам позволяет предположить, что их эффекты могут видоизменяться при повторных воздействиях.

Пятикратное (с 24-часовым интервалом) введение АР-II в дозе 10 мкг/кг," как и однократное воздействие пептида в аналогичной дозе, приводило к достоверному снижению МИкх эпителия роговицы через 24 часа после заключительной инъекции и не изменяло митотическую активность эпителия двенадцатиперстной кишки на исследуемых сроках. Сходство результатов однократного и повторного воздействий АР-II косвенно свидетель-

11

ствует об отсутствии кумуляции вещества (или его эффектов) в организме животных.

В отличие от АР-II, влияние укороченного ациклического аналога ПНФ АР-Н-6-ОН на митотическую активность эпителия при однократном и повторных введения было различно. Наблюдавшееся при однократном введении АР-Н-6-ОН в дозе 10 мкг/кг снижение МИкх эпителия роговицы в данной серии экспериментов не воспроизводилось, а стимуляция митотической активности эпителия двенадцатиперстной кишки сдвигалась на более ранний срок (с 48 на 4 и 24 часа). Оба зарегистрированных отличия, возможно, обусловлены кумуляцией пептида или его эффектов. 4. Влияние атриопептидов на размножение фибробластов in vitro

Серия экспериментов на культуре клеток была проведена для оценки прямого действия атриопептидов на процессы пролиферации. 24-часовая инкубация фибробластов с АР-II и АР-Н-6-ОН индуцировала- ряд изменений в состоянии клеточной культуры.

Добавление АР-II в культуральную среду приводило к повышению среднего показателя ИМЯ в 1,5 раза и умеренному возрастанию средней плотности фибробластов в монослое. Оба сдвига оказались статистически недостоверны по t-критерию Стьюдента в связи с значительным разбросом индивидуальных данных в экспериментальной группе. Применение F--критерия Фишера обнаружило достоверное увеличение варьирования индивидуальных значений, по сравнению с контролем, по обоим исследуемым показателям.

АР-Н-6-ОН по характеру воздействия на культуру фибробластов оказался сходным с АР-II. Ациклический аналог ПНФ повышал среднее значение ИМЯ в 1,4 раза. По индексу меченых ядер данная эксприментальная группа не отличалась от контроля при сопоставлении по t-критерию Стьюдента и имела достоверные отличия по F-критерию Фишера. Сопоставление с контролем средней плотности клеток в монослое выявило высокодостоверное возрастание показателя.

Таким образом, сдиги пролиферативных процессов в клеточной культуре, зарегистрированные при добавлении в среду изучаемых пептидов, имели, преимущественно, характер стимуляции. При этом, воздействие 12

АР-Н-6-0Н приводило к более значительной активации размножения культивируемых фибробластов. Достоверное увеличение варьирования индивидуальных показателей в обеих экспериментальных группах, по сравнению с контролем, может свидетельствовать о модулирующем действии атриопеп-тидов на пролиферативные процессы.

5. Влияние атриопептидов на морфофункциональное состояние коры надпочечников белых крыс

Корковое вещество надпочечников содержит выделяемые на светооп-тическом уровне популяции клеток с различной представленностью рецепторов к ПНФ: на плазмолемме адренокортикоцитов клубочковой зоны имеются многочисленные специфические участки связывания атриопептидов /Мап-tyh C.R. et al.,1986/, тогда как на клетках пучковой зоны они, по разным оценкам, либо отсутствуют /Mantyh C.R. et al.,1986/, либо имеются в незначительном количестве /Дж.Теппермен и соавт.,1989/. Упомянутая особенность делает корковое вещество надпочечников, на наш взгляд, оптимальным объектом для первичной оценки участия специфических рецепторов в действии атриопептидов на пролиферативные процессы.

Введение белым крысам АР-II в дозе 10 мкг/кг приводило к стимуляции синтеза ДНК адренокортикоцитами клубочковой зоны через А часа после иньекции (табл.3). Зарегистрированный эффект, по-видимому, является следствием прямого влияния атриопептида на адренокортикоциты, поскольку аналогичную реакцию первичной культуры клеток клубочковой зоны коры надпочечников быка наблюдали N.Horiba et а\. /1985/ при воздействии ПНФ. По данным литературы, связывание атриопептидов с специфическими рецепторами на адренокортикоцитах клубочковой зоны приводит к угнетению стероидогенеза /DeLean А. et al.,1984/. В наших исследованиях активации физиологической регенерации в клубочковой зоне коры надпочечников предшествовало достоверное снижение (в 3,2 раза) уровня альдостеро-на в плазме крови животных через 1 час после введения 10 мкг/кг АР-И. При повышении дозы атриопептида до 100 мкг/кг мы наблюдали характерный для многих регуляторных пептидов феномен ускользания эффекта /В.А.Виноградов и соавт.,1985; Е.Д.Гольдберг и соавт.,1990/: как показатели синтеза ДНК в клубочковой зоне коры надпочечников, так и плазменная

13

Таблица 3

Влияние атриопептидов в дозе 10 мкг/кг на процессы синтеза ДНК и размер ядер клеток клубочковой и пучковой зон коры надпочечников белых крыс

АР-11 АР-Н-6-ОН

ИМЯ (%) ИМ Площадь ИМЯ (%) ИМ Площадь

сечения ядра сечения ядра

(мкм*) (мкм^)

Клубочко в а я зо н а

Контроль 0,43 + 0,04 19,0 + 0,9 32,1 + 0,5 0,43 + 0,04 19,0 + 0,9 32,1 + 0,5

4 часа 0,66 + 0,06(*) 20,1 + 1,6 32,6 + 0,9 0,34 + 0,10 19,7 + 1,0 32,1 + 0,9

24 часа 0,34 + 0,03 20,4 + 1,3 32,5 + 0,6 0,47 + 0,06 21,0 + 0,7 32,7 + 0,3

П у ч к о в а я . з она

Контроль 0,33 + 0,05 21,3 + 2,2 37,3 + 1,1 О.ЗЗ'й 0,05 21,3 + 2,2 37,3 + 1.1

4 часа 0,43 + 0,07 20,6 + 1,1 38,4 + 1,3 0,34 + 0,06 21,1 + 0,9 37,4 + 1,5

24 часа 0,25 + 0,04 22,7 + 1,0 39,8 + 0,4 0,36 + 0,08 23,9 + 1,1 39,9 + 0,6

(*) - отличие от контроля статистически достоверно по Ькритерию при р<0,05.

концентрация альдостерона не отличались от контроля.

На физиологическую регенерацию пучковой зоны коры надпочечников введение АР-II оказывало иное влияние. Инъекция пептида в дозе 10 мкг/кг не приводила к сдвигам изучаёмых показателей синтеза ДНК ни через 4, ни через 24 часа после воздействия (табл.3). При введении 100 мкг/кг АР-II было зарегистрировано достоверное снижение ИМЯ через 4 часа после иньекции.

По данным кариометрического исследования АР-II в дозах 10 (табл.3) и 100 мкг/кг не влиял на размеры ядер клеток обеих зон коры надпочечников.

Таким образом, реакции на воздействие атриопептида АР-II клеточных систем с различной представленностью рецепторов ПНФ - клубочковой и пучковой зон коры надпочечников - существенно различались.

Введение белым крысам укороченного ациклического аналога ПНФ, АР-Н-6-ОН, в дозе 10 мкг/кг не вызывало регистрируемых изменений синтеза ДНК в клубочковой и пучковой зонах коры надпочечников (табл.3). 6. Влияние атриопептидов на некоторые звенья эндокринной регуляции пролиферативных процессов в организме белых крыс

В рамках анализа механизмов, способных при воздействии ПНФ вызывать опосредованные сдвиги процессов клеточного деления мы исследовали влияние АР-II и АР-Н-6-ОН на содержание в плазме крови тиреоидных гормонов (трийодтиронина (ТЗ) и тироксина (Т4)), а также инсулина - наиболее универсальных стимуляторов пролиферации клеток /Ю.А.Романов и соавт.,1968; С.И.Кусень и соавт., 1985/.

Введение белым крысам атриопептидов в дозе 10 мкг/кг не изменяло плазменную концентрацию тиреоидных гормонов и инсулина в исследуемые сроки.

Воздействие АР-II в дозе 100 мкг/кг приводило к умеренному (в 1,3 раза) • снижению концентрации Т4 и достоверному увеличению содержания ТЗ в плазме крови белых крыс через 1 час после инъекции. Через 4 часа уровень ТЗ не отличался от контроля, а концентрация Т4 была достоверно (в 2,1 раза) ниже контрольной величины. Введение АР-II в дозе 100 мкг/кг вызывало значительное (в 3,3 раза) падение содержания инсулина в

15

плазме крови животных через 4 часа после воздействия.

При введении АР-Н-6-ОН в дозе 100 мкг/кг не было зарегистрировано достоверных изменений уровня тиреоидных гормонов в плазме крови крыс, наблюдалась лишь тенденция к снижению концентрации Т4 на первом сроке исследования (р-0,06). Определение содержания инсулина в плазме крови после воздействия АР-Н-6-ОН в дозе 100 мкг/кг выявило резкое падение концентрации гормона через 4 часа после введения атриопептида: в7 из 8 образцов плазмы крови этой экспериментальной группы уровень инсулина был ниже порога чувствительности набора для радиоиммунного исследования.

Таким образом, введение АР-II и АР-Н-6-ОН способно вызывать существенные сдвиги уровней тиреоидных гормонов и инсулина. Однако, изменения плазменной концентрации указанных гормонов, по-видимому, не определяют характера регистрируемых эффектов атриопептидов в отношении клеточного деления: в дозе 10 мкг/кг АР-II и АР-Н-6-ОН не влияли на содержание тиреоидных гормонов и инсулина, но значительно изменяли пролиферативную активность эпителия: в дозе 100 мкг/кг пептиды снижали плазменный уровень исследуемых стимуляторов размножения клеток, но активировали процессы пролиферации.

Значение и механизмы возможной опосредованной компоненты влияния атриопептидов на клеточное размножение в условиях целостного организма требуют дальнейшего исследования.

ОБСУЖДЕНИЕ

Сопоставление результатов, полученных в сериях опытов In vitro и in vivo позволяет предположить, что влияние атриопептидов на пролиферативную активность тканей организма, по крайней мере частично, обусловлено их непосредственным действием на клетки-мишени.

По-видимому, в реализации эффектов атриопептидов в отношении процессов пролиферации участвуют специфические рецепторы. Во-первых, сдвиги процессов синтеза ДНК в клубочковой зоне коры надпочечников при введении АР-II как в дозе 10, так и в дозе 100 мкг/кг происходили параллельно заведомо .рецептор-опосредованным изменениям продукции IG

альдостерона. Обнаруженное при повышении дозы атриопептида до 100 мкг/кг ускользание эффекта также косвенно свидетельствует о вовлечении рецепторов в передачу внеклеточного сигнала /Е.И.Чазов и соавт.,1984/. Во-вторых, реакции на введение АР-II систем клеток с различной плотностью рецепторов к ПНФ (клубочковая и пучковая зоны коры надпочечников) значительно варьировали. В-третьих, влияние АР-II и АР-Н-б-ОН на про-лиферативные процессы в клеточных системах с различной представленностью В- и С-рецепторов ПНФ точно согласовывались с данными Spear K.L. et al. /1989/ об аффинности подобных пептидов к В- и С-рецепто-рам. Так, на адренокортикоцитах клубочковой зоны представлены преимущественно B-рецепторы ПНФ /DiMalo J. et al.,1990/, взаимодействующие только с циклическими атриопептидами. Соответственно, на процессы синтеза ДНК в клубочковой зоне влиял только циклический пептид АР-II. На культивируемых фибробластах доминируют С-рецепторы ПНФ /DiMaio J. et al.,1990/, связывающие и циклические, и ациклические атриопептиды. В этой клеточной системе сдвиги пролиферативных процессов при воздействии АР-II и АР-Н-б-ОН были сходны.

В наших исследованиях импульсное воздействие атриопептидов приводило к длительным изменениям пролиферативной активности эпителиоци-тов. В некоторых экспериментальных сериях сдвиги клеточного деления были обнаружены даже спустя 48 часов после инъекции. Известные специфические эффекты ПНФ кратковременны: диурез, натрийурез, уровень артериального давления, плазменная концентрация ренина и альдостерона нормализуются в течение 1 часа после введения атриопептидов экспериментальным животным /Kramer H.J.,1988; Atlas S. et al.,1986; Genest J. et al.,1987/. Таким образом, влияние изучаемых пептидов на процессы клеточного деления существенно отличается по временным характеристикам от специфических эффектов ПНФ.

Для непосредственного воздействия атриопептидов на функции почек, надпочечников и сердечно-сосудистой системы необходимо наличие в молекуле, как минимум, 17-аминокислотного цикла (7-23) /В.Н.Хирманов,1987; Misono K.S. et al., 1984/. Сходство влияний AP-II и АР-Н-б-ОН на пролифе-ративные процессы в ряде клеточных популяций свидетельствует, что для

данного вида активности ПНФ достаточен его 6-аминокислотный фрагмент (11-16). Следовательно, структура, "определяющая" действие атриопептидов на клеточное деление, не совпадает с активным центром молекулы, "обеспечивающим" известные специфические функции веществ этого класса.

Приведенные данные свидетельствуют о принципиальных различиях между специфической активностью атриопептидов в отношении водно-солевого обмена и влиянием веществ семейства ПНФ на процессы пролиферации. По-видимому, реализация названных эффектов осуществляется через различные механизмы.

Наличие у пептидов семейства ПНФ выраженной активности в отношении клеточного деления следует учитывать при использовании этих веществ в медицинской практике в качестве фармакологических препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Введение белым крысам атриопептидов вызывает существенные изменения процессов пролиферации в эпидермальных и энтеродермальных покровных эпителиях.

2. Характер эффектов, регистрируемых в покровных эпителиях при воздействии атриопептидов, зависит от вводимой дозы. Пептиды в дозе 1 мкг/кг не влияют на размножение эпителиоцитов. Воздействие веществ в дозе

10 мкг/кг вызывает разнонаправленные сдвиги в различных эпителиях: стимулирует процессы пролиферации в эпителии двенадцатиперстной кишки и угнетает клеточное деление в эпителии роговицы и пищевода. В дозе 100 мкг/кг атриопептиды активируют процессы пролиферации в покровных эпителиях всех исследованных локализаций.

3. Введение белым крысам циклического атриопептида АР-II вызывает изменения процессов синтеза ДНК в клубочковой и пучковой зонах коры надпочечников. Популяции адренокортикоцитов клубочковой и пучковой зон дифференцированно реагируют на воздействие: сдвиги процессов синтеза ДНК, регистрируемые в названных зонах, различаются по направленности

и характеру зависимости от дозы атриопептида.

4. Циклический 23-аминокислотный пептид АР-II и ациклический 6-аминокислотный пептид АР-Н-6-ОН при их однократном введении белым крысам вы-18

зывают сходные изменения пролиферации клеток в каждом из исследованных покровных эпителиев. Реакции процессов синтеза ДНК в клубочковой зоне коры надпочечников на введение АР-II и АР-Н-6-ОН носит дифференцированный характер.

5. Ациклический 6-аминокислотный аналог предсердного натрийуретического фактора АР-Н-6-ОН обладает самостоятельной активностью в отношении клеточного деления: в культуре эмбриональных фибробластов человека пептид вызывает пролиферативный эффект. В отличие от специфических

ъ

эффектов натрийуретического фактора (действие на функции почек, надпочечников и сердечно-сосудистой системы), для реализации его влияния на клеточное деление достаточен 6-аминокислотный фрагмент (11-16).

6. Возникающие при введении атриопептидов сдвиги уровней инсулина и тиреоидных гормонов в плазме крови белых крыс не определяют характера действия изучаемых пептидов на клеточное деление. АР-II и АР-Н-6-ОН в дозе 100 мкг/кг уменьшают плазменную концентрацию названных эндокринных стимуляторов пролиферативных процессов, но активируют размножение эпителиоцитов.

7. Атриопептиды оказывают дифференцированное воздействие на процессы пролиферации в клеточных системах с разной представленностью рецепторов к предсердному натрийуретическому фактору. Реакция пролиферативных процессов варьирует в клеточных популяциях с различным количеством рецепторов к атриопептидам и с различным соотношением подтипов рецепторов к атриопептидам.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние предсердного натрийуретического пептида АР-II на процессы пролиферации в эпителиальной ткани белых крыс // Бюлл.эксперим.биологии и медицины,- 1991.- N 9.- С.303-305. Совместно с С.С.Тимошиным. М.И.Радивозом, Ж.Д.Беспаловой.

2. Влияние предсердного натрийуретического пептида АР-II на морфофунк-циональное состояние коры надпочечников белых крыс // Деп. в ВИНИТИ 18.02.92 N 549-В92.- 9 с. Совместно с С.С.Тимошиным, Ж.Д.Беспаловой,

19

Н.Б.Мурзиной.

3. Влияние ациклических аналогов предсердного натрийуретического фактора на процессы клеточного деления // Деп. в ВИНИТИ 18.02.92 N 550-В92. - 14 с. Совместно с С.С.Тимошиным, С.Г.Выборовым, Ж.Д.Беспаловой, Н.М.Ивахнишиной.