Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Вклад молекулярно-генетических маркеров супероксиддисмутазы, каталазы и параоксоназы в развитии окислительного стресса у подростков разных этнических групп с эссенциальной артериальной гипертензией

На пр

ПЕРВУШИНА Оксана Александровна

ВКЛАД МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ, КАТАЛАЗЫ И ПАРАОКСОНАЗЫ В РАЗВИТИИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА У ПОДРОСТКОВ РАЗНЫХ ЭТНИЧЕСКИХ ГРУПП С ЭССЕНЦИАЛЫГОЙ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ

14.03.03 — патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДЕК 2013

Иркутск - 2013

005542386

005542386

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (г. Иркутск).

Научные руководители:

доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН,

профессор Колесникова Любовь Ильинична

доктор медицинских наук Баирова Татьяна Ананьевна

Официальные оппоненты:

Коры шов Леонид Иннокентьевич, доктор медицинских наук, профессор, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Иркутский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой нормальной физиологией Осипова Елена Владимировна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, главный научный сотрудник лаборатории патофизиологии репродукции.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр клинической и экспериментальной медицины» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, г. Новосибирск

Защита состоится о.ш. ^1-ЛУ 2013 года часов на заседании

диссертационного совета ^ 001.03^02 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Автореферат разослан ^/{/2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Шолохов Леонид Федорович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы: В докладе ВОЗ «Мировая статистика здравоохранения 2012 г.» основное внимание уделяется растущей проблеме бремени хронических болезней, в том числе сердечно-сосудистых. Распространенность сердечно-сосудистых заболеваний удерживает лидирующее положение в экономически развитых странах [Health and Consumer Affairs Council Meeting, 2006]. Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смерти во всем мире [Мировой отчет по неинфекционным заболеваниям, 2010 г. Женева, ВОЗ]. 9,4 миллиона ежегодных случаев смерти, или 16,5% всех случаев смерти, обусловлено повышенным кровяным давлением [Lim S.S., 2012]. Не вызывает сомнения, что «истоки» сердечно-сосудистой патологии у взрослых находятся в детском возрасте [Беркович O.A., 2002; Ларионова В.И., 2005; Леонтьева И.В., 2005; Долгих В.В., 2011].

Патогенетические механизмы эссенциальной артериальной гипертензии (ЭАГ) многообразны. В ряду нейрогенной, ренинангиотензиновой, мембранной и других концепций, широкая признание получила теория окислительного стресса в формирование данной патологии [Колесникова Л.И., 2010; Натяганова Л.В., 2010]. Перекисное окисление липидов (ПОЛ) носит общебиологический характер и является метаболическим звеном при формировании ряда патологических состояний, в том числе ЭАГ, ишемической болезни сердца, атеросклероза, сахарного диабета, нарушений мозгового кровообращения, онкологических и нейродегенеративных заболеваний и т.д. [Зенков Н.К., 2001; Воробьева E.H., 2005; Меныцикова Е.Б., 2006; Колесникова Л.И., 2009, 2012; Ray, 2012], а также задействован в механизме старения организма и апоптоза [Ляхович В.В., 2005; Тодоров И.Н., 2007]. Контроль над активностью процессов ПОЛ осуществляет антиокислительная система организма. В физиологических условиях существует баланс между продукцией активных форм кислорода, прооксидантной системой, и их детоксикацией, системой антиоксидантной защиты [Воробьева E.H., 2005; Fariss M.W., 2005; Burton G.J., 2011].

Дизрегуляцшшые нарушения, недостаточность адаптационных и саногенетических механизмов, в том числе недостаточность деятельности антисистем, генетически детерминированы [Дизрегуляционная патология, 2002]. Описано ряд генов перекисного окисления липидов и антиоксиданоной системы: ген каталазы, гены супероксиддисмутазы, гены глутатионтрансферазы, гены параоксаназы и т.д. Однако данные о вкладе данных генов и их полиморфизмов в формирование сердечно-сосудистой патологии, в том числе артериальной гипертензии крайне противоречивы, что, возможно, обусловлено генетической гетерогенностью популяций, в которых проводились

3

исследования, а также особенностями метаболических процессов [Рязанов A.C., 2003; Баирова Т.А., 2009]. Фиксируются существенные этнические и расовые различия в частотах встречаемости аллелей и генотипов генов перекисного окисления липидов и антиоксидантной системы, что определяет актуальность исследования для каждой этнической и популяционной выборки.

Все вышеизложенное определило цель исследования - установить вклад генетических маркеров антиоксидантной системы в формировании процессов перекисного окисления липидов у подростков европеоидов и монголоидов с эссенциальной артериальной гипертензией.

Для реализации поставленной цели последовательно решали задачи:

1. Изучить особенности перекисного окисления липидов и антиоксидантного статуса у подростков европеоидов и монголоидов с ЭАГ.

2. Исследовать распределение частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов супероксиддисмутазы 2 (мутация С60Т и полиморфизм AlalóVal) каталазы, (полиморфизм — С262Т), параоксоназы 1 (полиморфизм Glnl92Agr) у подростков разных этнических групп.

3. Провести сравнительную оценку частот аллелей и генотипов генов супероксиддистумазы (мутация С60Т и полиморфизм AlalóVal), каталазы (С262Т)\ параоксоназы 1 (Glnl92Agr) у подростков с ЭАГ и подростков группы популяционного контроля в изучаемых этнических группах.

4. Установить ассоциации полиморфных маркеров с компонентами перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты в исследуемых группах.

5. Выявить универсальные и этнически дифференцированные молекулярно-генетические маркеры ПОД-АОЗ у подростков разных этнических групп.

Научная новизна н практическая значимость

Новыми являются данные о распространенности частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфизмов AlalóVal гена SOD 2, С262Т гена CAT, Glnl92Agr гена PON 1\ а также мутации С60Т гена SOD 2 в популяционных выборках контроля и пациентов с ЭАГ европеоидов и монголоидов, проживающих на территории Восточной Сибири. Результаты исследования дополняют спектр молекулярно-генетических маркеров ЭАГ, а также расширяют знания о разнообразии генофонда человечества, что, в свою очередь, важно как для изучения вопросов эволюции человечества, так и для исследования истории формирования конкретных этнических групп.

Впервые изучен вклад генетических маркеров антиоксидаитной системы в формирование биохимического фенотипа у подростков европеоидов и монголоидов в норме и при артериальной гипертензии.

Впервые по результатам молекулярно-генетического исследования показано наличие универсальных и этнически дифференцированных генетических маркеров перекисного окисления линидов и антиоксидаитной защиты у подростков с эссенциальной артериальной гипертензией в изучаемых этнических группах.

Выявленные генетические маркеры позволяют расширить молекулярно-генетическую панель предрасположенности к патологическим состояниям, в том числе к эссенциальной артериальной гипертензии у подростков разных этнических групп. Результаты исследования могут быть использованы при формировании групп риска окислительного стресса у пациентов с эссенциальной артериальной гипертензии. а также позволит обосновать патогенетическую направленность коррекцнонных и профилактических мероприятий.

Положения, выносимые на защиту

1. У подростков изучаемых популяций формирование ЭАГ сопровождается развитием окислительного стресса, интенсивность которого у подростков европеоидов выше, чем у подростков монголоидов.

2. Молекулярно-генетические маркеры антиоксидаитной системы имеют этническую дифференциацию. У подростков европеоидов аллель Г полиморфизма С.262Т гена CAT и аллель Gin полиморфизма Glnl92Arg гена PON 1 ассоциирован со снижением общей антиокислительной активности; у подростков монголоидов аллель Arg полиморфизма Glnl92Arg гена PON 1 ассоциирован с высоким содержанием ДК и восстановленного глутатиона.

3. К универсальным прогностическим маркерам окислительного стресса у подростков европеоидов и монголоидов с ЭАГ следует отнести полиморфизм AlalóVal гена SOD 2, аллель Val ассоциирован со снижением общей АОА. У подростков европеоидов аллель Gin полиморфизма Gin 192Arg гена PON 1 ассоциирован со снижением AÓA на фоне повышения ДК. Для подростков монголоидов с ЭАГ данный маркер индифферентен, что позволяет отнести полиморфизма GlnI92Arg гена PON 1 к этнически дифференцированным.

Апробация работы

Апробация материалов диссертации проведена на заседании ученого совета ФГБУ «НЦ ПЗСРЧ» СО РАМН, а также на заседаниях лаборатории клинической генетики; на заседании отдела педиатрии и кардиоваскулярных патологий ФГБУ «НЦ ПЗСРЧ» СО

5

РАМН (2012, 2013). Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на Международной интернет-конференции «Фундаментальная медицина: от скальпеля к геному, протеому и липидому», (Казань, 2011); VI Российском форуме «Здоровье детей: профилактика и терапия социально-значимых заболеваний. Санкт-Петербург - 2012» (Санкт-Петербург, 2012); II межрегиональная научно-практическая конференция молодых ученых - 2012, 2013 (Иркутск, 2012, 2013); VIII международной научно-практической конференции «Перспективные вопросы мировой науки - 2012», (София, 2012).

Публикации

По материалам выполненных исследований опубликовано 9 печатных работ, из них 6 — в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, характеристики материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 6 рисунками, 16 таблицами. Библиографический указатель включает 184 источников, из которых 104 публикаций иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

На базе клиники ФГБУ «Научного Центра Проблем здоровья детей и репродукции человека» СО РАМН (Иркутск) и Бурятского филиала (Улан-Удэ) проведено клинико-лабораториое обследование 261 подростков в возрасте 14-17 лет, из них 142 — с эссенциальной артериальной гипертензией.

Критериями включения в общую группу исследования:

• возраст от 14 до 17 лет;

• принадлежность к европеоидам (на примере подростков русской национальности) и к монголоидам (на примере подростков бурятской национальности);

• информированное согласие пациента на исследование.

Критерий включения в контрольную группу:

• отсутствие на момент обследования острого заболевания или обострение хронических заболеваний;

• отсутствие изменений уровня артериального давления, артериальной гипертензии различного генеза.

Критерий включения в основную группу:

6

• отсутствие симптоматического характера артериальной гипертензии.

Критерии исключения:

• несоответствие критериям включения;

• вторичная артериальная гипертензия;

• прием базисной терапии эссенциальной артериальной гипертензии.

Таким образом, исследуемые подростки разделены на четыре группы:

1-ю группу исследования составили 102 подростка европеоидов (русской национальности) с верифицированным диагнозом ЭАГ. Средний возраст - 15,82±1,06. В том числе 70 мальчиков (15,9±1,07) и 32 девочки (15,7±1,04).

2-я группа - контрольная группа европеоидов включала 65 подростков. Средний возраст 15,02±0,98, из них 33 мальчика (14,91±0,98) и 32 девочки (14,91±0,98).

3-я группа исследуемых - 40 подростков монголоидов (бурятской национальности) с ЭАГ, средний возраст (14,53±1,84). В том числе 33 мальчика (14,61±1,77) и 7 девочек (14,86±1,21).

4-я группа — контрольная группа монголоидов без соматической патологии. Группу исследования составили 54 подростка, средний возраст которых 15,31±0,96; из них 28 мальчиков (15,14±0,89) и 26 девочек (15,48±1,01).

ЭАГ диагностирована в соответствии с современной классификацией, Всероссийского научного общества кардиологов (ВНОК) и Ассоциацией детских кардиологов России, утвержденной ВНОК. В качестве нормальных принимались показатели САД и ДАД 10-90 перцентиля, уровень САД и ДАД в пределах 90-94 перцентиля оценивался как «высокое нормальное АД», высоким считались значетш свыше 95 перцентиля [Автандилов А.Г., 2003].

Лабораторные методы исследования:

1. Биохимические исследования ПОЛ-АОЗ

В качестве материала для биохимических исследований использовали сыворотку, плазму крови и гемолизат. Забор крови проводили из локтевой вены, натощак с 8 до 9 часов утра в соответствии общепринятым требованиям.

Определение продуктов ПОЛ и компонентов системы АОЗ

Содержание ТБК - активных продуктов (малоновый диальдегид, мкмоль/л) измеряли по методу В.Б. Гаврилова с соавт. (1987); измерение активности супероксиддисмутазы (СОД, усл.ед.) по методу Misra Н.Р., Fridovich I. (1972); уровни восстановленного и окисленного глутатиона (мкмоль/л) по методу Hissin P.Y., Hilf R. (1976). Измерения проводили на спектрофлюорофотометре Shimadzu RT = 5000 (Япония).

Содержание диеновых конъюгатов (ДК, мкМ/л), проводили на спертрофотометре СФ-56 (Россия) по методу В.Б. Гаврилова с соавт. (1983) и И.А. Волчегорского с соавт. (1989). Оценку общей АОА крови (усл.ед.) проводили по методу Г.И. Клебанова с соавт. (1988).

2. Молекулярно-генетические методы

Выделение ДНК: Материалом для генетических исследований послужила геномная ДНК, выделенная из образцов цельной венозной крови. Венозная кровь забиралась из локтевой вены в вакутейнер с ЭДТА (раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты, ГОСТ 10652-73). Препараты ДНК получали с использованием коммерческих наборов, «ДНК-сорб-В», произведенного ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (Москва) и Пробоподготовка Универсальная производитель ООО «Лаборатория Изоген», на основе лизирующего агента — гуанидинтиоционат и силикатного ДНК-сорбента.

Амплификация ДНК: Амплификацию полиморфных участков генов PON 1, SOD 2, CAT проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) на амплификаторе Терцик производства компании «ДНК-Технологии» (Москва). В работе использовали коммерческие наборы реагентов для идентификации полиморфных маркеров SNP-экспресс-кардиогенетика (НПФ «Литех», Россия).

Детекция: ПЦР-продукты анализировали с помощью горизонтального электрофореза в 3%-ном агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием (0,05 мкг/мл).

Статистические методы обработки данных

Статистическая обработка данных проводилась на персональном компьютере с помощью электронных таблиц Excel и пакета прикладных программ Biostat и STATISTICA, версия 6.1 (StatSoftlns, США). Статическая обработка результатов проведена по общепринятой методике вариационной статистики. Рассчитывалась средняя арифметическая (М), квадратичная ошибка средней арифметической (s), стандартные отклонения (Std), медиана (Me), верхний и нижний квартили (С25 - С75). Проверка нормальности распределения осуществлялась с помощью критерия Шапиро-Уилка (а>). При распределении количественных признаков, отличного от нормального, значимость между двумя группами проверялась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Между тремя и более группами использовали метод Крускала — Уоллнса. Для сравнения двух групп по качественному признаку использовался критерий х", трех и более групп — точный критерий Фишера. Все различия считались статически значимыми при р<0,05 [Реброва О.Ю., 2006].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ Процессы ПОЛ и АОЗ у подростков разных этнических групп с ЭАГ

Интенсивность процессов ПОЛ и АОЗ оценивали по содержанию отдельных компонентов в сыворотке крови и гемолизате, а также по определению величины общей антиокислительной активности (АОА). В сыворотке крови определяли уровень: диеновых конъюгатов (ДК), ТБК — активных продуктов, общей антиокислительной активности. В гемолизате измеряли активность супероксиддисмутазы (СОД), концентрацию восстановленного (вЭН) и окисленного (0550) глутатионов.

Результаты определения содержания в крови продуктов перекисного окисления липидов (ДК и ТБК — активных продуктов) и антиоксидантного статуса у подростков европеоидов и монголоидов с ЭАГ и групп контролей представлены в таблице 1. Как свидетельствуют полученные данные, содержание продуктов ПОЛ у подростков с ЭАГ в обеих этнических группах имеют отличия от показателей контрольных групп.

Таблица 1

Содержание компонентов ПОЛ-АОЗ у подростков европеоидов и монголоидов,

Ме (С25-С75)

Показатель Европеоиды Контроль Европеоиды с ЭАГ Монголоиды контроль Монголоиды с ЭАГ

ДК, мкМ/л 1,36 1,06-1,78 2,37* 1,60-3,06 0,72 0,54-0,96 2,25 * 1,97-2,55

ТБК-АП, мкМ/л 0,64 0,45-1,03 2,29 * " 1,51-2,99 0,93 0,71-1,28 0,96 0,73-1,34

АОА, усл.ед 12,45 10,03-14,62 9,21 * 7,97-10,84 7,69 7,16-9,41 9,47 6.81-12,36

СОД, усл.ед 1,56 1,42-1,65 1,66 " 1,55-1.75 1,64 1,57-1,72 1,81 1,73-1.87

ОвН, мкМ/л 2,23 1,97-2,45 2,24 1,92-2,56 2,02 1,83-2,32 2,18 1,88-2,56

ввЗО, мкМ/л 1,98 1,81-2,15 1,83 * 1,56-2,16 2,22 2,01-2,39 1,80 * 1,62-2,36

Примечание: * - р<0,05 внутри этнической группы, по отношению к контрольным показателям

" - р<0,05 между этническими группами

Установлено, что у подростков с ЭАГ и у европеоидов и монголоидов содержание первичных продуктов ПОЛ - ДК в крови статистически значимо выше аналогичного показателя контрольных групп (11=1195,5; р=0,000 и 11=16,000; р=0,000 соответственно). Содержание же ТБК — активных продуктов, конечных продуктов процесса ПОЛ, у подростков европеоидов с ЭАГ статистически значимо выше, чем в контроле (11=372,0; р=0,000), а у подростков монголоидов статистически значимых различий по содержанию

ТБК - активных продуктов не выявлено. При этом наблюдается существенное снижение ТБК — активных продуктов в группе подростков монголоидов с ЭАГ по сравнению с аналогичным показателем в группе подростков европеоидов с ЭАГ (0,96мкМ/л против 2,29мкМ/л соответственно, и=390,0; р=0,000).

Для поддержания процессов перекисного окисления липидов на определенном оптимальном уровне в организме существует антиоксидантная система. Активность антиоксидантной системы обеспечивает устойчивость живых клеток к свободнорадикальному повреждению. Общая антиокислительная активность (АОА) крови характеризует суммарную активность ингибиторов радикального окисления крови и определяет ее буферную емкость. Общая антиоксидантная активность крови включает большое количество антиоксидантов различной природы. В работе исследована активность супероксиддисмутазы (СОД) и компоненты глутатионовой системы (йЗН, СвБв).

Результаты исследования показали, что у подростков европеоидов с ЭАГ общая антиокислительная активность статистически значимо ниже, чем у подростков контрольной группы (9,21 усл.ед. против 12,45 усл.ед. соответственно, и=1570,0; р=0,000). У подростков монголоидов, наоборот, показатели общей АОА снижены в контроле в сравнении с больными, но данное различие статистически не значимо.

Супероксиддисмутаза играет ключевую роль, обеспечивая первичное антиокислительное звено, благодаря способности регулировать уровень супероксида, который является основным прооксидантом клетки. Активности СОД достаточно для того, чтобы инактивировать активные формы кислорода вместе их образования. В группе подростков монголоидов с ЭАГ уровень активности супероксиддисмутазы статистически значимо выше, чем у подростков европеоидов с ЭАГ (1,81 усл.ед. против 1,66 усл.ед. соответственно, и=891,5; р=0,000).

Во всех исследуемых группах существенных различий по содержанию 0511 не выявлено. Вместе с тем обнаружены статистически значимые различия содержания окисленного глутатиона в эритроцитах крови в обеих этнических группах: в группах контроля содержание окисленного глутатиона выше, чем у подростков с ЭАГ (11=1667,5; р=0,000 для европеоидов, и=662,5; р=0,0014 для монголоидов).

Таким образом, процессы перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты у подростков европеоидов и монголоидов с ЭАГ различны. Для суммарной оценки состояния перекисного окисления липидов и антиоксидантной активности использован коэффициент окислительного стресса (КОС). Коэффициент окислительного стресса оценивает степень дисбаланса между системами ПОЛ и АОЗ по соотношению

10

прооксидантов и антиоксидантов на различных этапах липопероксидадии [Матвеев С.Б.,

2005; Натяганова Л.В., 2010].

С целью индивидуальной оценки окислительного стресса у подростков с ЭАГ

использовали модифицированную формулу расчета коэффициента окислительного

стресса (КОС), с использованием следующих показателей ПОЛ-АОЗ: ДК (мкМ/л), ТБК-

АП (мкМ/л), активность СОД (усл.ед.), содержание восстановленного глутатиона (мкМ/л)

и общую антиоксидантную активность АОА (усл.ед.).

_ (АЁЬАЁп) * (РАЕ - АШОШ - А1п) ~ (ЙШ/ШАп ) * (08ШЛ35Нп ) * (А1А1/А1Ап ) '

где [ — уровни показателей обследуемых пациентов; п — уровни показателей контрольной

группы, при КОС>1 регистрируют развитие окислительного стресса

В формуле рассчитывается отношение показателей системы ПОЛ-АОЗ пациента с

артериальной гипертензией к средним значениям показателей контрольной группы. В

норме коэффициент окислительного стресса стремится к условной 1. Значение КОС>1

рассматривается, как нарастание степени окислительного стресса. Чем больше величина

КОС, тем более интенсивны процессы ПОЛ и менее эффективна система АОЗ у

обследуемых подростков.

В группе подростков монголоидов средний показатель КОС значительно ниже

(2,60), чем у подростков европеоидов (5,31) (и=754,0; р=0,000) (рис. 1).

0 монголоиды Н европеоиды

Рис. 1. Коэффициент окислительного стресса у подростков изучаемых групп

В сравнении с группой контроля у подростков монголоидов активация ПОЛ происходит на этапе образования первичных продуктов (ДК). Однако установленная у них повышенная активность ключевого компонента ферментативного звена антиоксидантной защиты - супероксиддисмутазы, свидетельствуют о надежном функционировании адаптационно-защитных механизмов организма. У подростков европеоидов активация ПОЛ отмечается на стадии образования конечных продуктов (ТБК — активные продукты).

Содержание ТБК — активных продуктов увеличено и снижается общая антиокислительная активность, что определяет нарушение равновесия между системами ПОЛ и АОЗ.

Сравнительный анализ распространенности генетических маркеров антиоксидантной системы у подростков исследуемых групп

Нами изучено 4 полиморфизма генов ПОЛ-АОЗ: ген супероксиддисмутазы 2 {AlalóVal), параоксоназы (Glnl92Arg) и каталазы (С262Т).

По результатам генотипирования полиморфизма AlalóVal гена SOD 2 выявлено, что частота встречаемости аллеля Val преобладает над частотой встречаемости аллеля Ala, в обеих этнических группах нашего исследования. Аллель А/а полиморфизма AlalóVal гена SOD 2 в группе подростков европеоидов встречается на 15% чаще, чем в группе подростков монголоидов и эти различия статистически значимы (0.492 против 0,343 соответственно; %2=4,82; р=0,0282). Генотип Ala/Ala у подростков европеоидов встречается на 20% чаще, чем у подростков монголоидов (27,7% против 7,4% соответственно) и эти различия статистически значимы (х2=6,76; р=0,0093) (рис. 2).

60 50 40 30 20 10 о

Рис. 2. Распределение генотипов полиморфизма AlalóVal гена SOD 2 в исследуемых группах

Анализ ассоциации полиморфизма AlalóVal гена супероксиддисмутазы 2 с ЭАГ показал, что в исследуемых группах контроля и пациентов с ЭАГ подростков европеоидов с наибольшей частотой встречается гетерозиготный генотип Ala/Va! (43,1% и 50% соответственно). Вторым по частоте встречаемости был генотип Val/Val (29,2% и 25,5%). С наименьшей частотой генотип Alai Ala встречается в группе контроля - 27,7% и 24,5% у подростков с ЭАГ европеоидов. При этом статистически значимых различий частот встречаемости генотипов и аллелей между контролем и подростков с ЭАГ не обнаружено.

В группе подростков монголоидов с ЭАГ с наибольшей частотой встречается гомозиготный генотип Val/Val (45%). Второй по частоте встречается гетерозиготный генотип Ala/Val (37,5%) и с наименьшей частотой встречается генотип Ala/Ala (17,5%). Так у подростков монголоидов частота гомозиготного генотипа Val/Val у подростков с

□ Ala/Ala В Ala/Val ED Val/Val

европеоиды контроль европеоиды с ЭАГ монголоиды контроль монголоиды с ЭАГ

ЭАГ выше на 6%, чем в контроле (45% против 38,9%), но статистической значимости не выявлено.

По результатам генотипирования мутации С60Т гена супероксиддисмутазы 2 у подростков монголоидов с ЭАГ и групп популяционного контроля не встречается мутантный аллель Т. Частота встречаемости аллеля С и генотипа С/С составила 100%.

Вместе с тем в группе подростков европеоидов аллель Т встречается у пациентов с ЭАГ - 0,103 в группе контроля - 0,085. Гетерозиготный генотип в группе подростков с ЭАГ встречается чаще, чем у подростков европеоидов контрольной группы (14,7% против 7,7%), а генотип Т/Т у подростков с ЭАГ, встречался реже, чем в контроле (2,9% против 4,6%). При этом сравнение частот встречаемости аллелей и генотипов у подростков группы контроля с больными не выявило статистически значимых различий (рис. 3).

ас/с ШС/Т Q Т/Т

европеоиды контроль европеоиды с ЭАГ монголоидыконтроль монголоидыс ЭАГ

Рис. 3. Распределение генотипов мутации С60Тгена SOD 2 в исследуемых группах

Результаты генотипирования популяционных групп полиморфизма С.262Т гена каталазы показало, что частота встречаемости генотипов у подростков европеоидов С/С, С/Т и Т/Т составляет 44,6%; 41,5% и 13,9% соответственно. Аллель С у подростков европеоидов зарегистрирована в 0,654 случаях, а аллель Т в 0,346. У подростков монголоидов генотипы С/С, С/7" и Т/Т встречались с частотой 53,7; 42,6% и 3,7%; аллели С и Г зарегистрированы в 0,75 и 0,25 случаях соответственно.

При сравнении частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфизма С262Т гена CAT между контрольными группами подростков европеоидов и монголоидов статистически значимых различий не обнаружено. У подростков европеоидов в группе контроля аллель Т и генотип Т/Т встречается на 10% чаще, чем у подростков с ЭАГ (0,346 против 0,250 аллели; 13,9% против 8,8% генотипы, контроль и больные соответственно). Сравнение частот встречаемости аллелей и генотипов между группами подростков европеоидов с ЭАГ и контролем статистически значимых отличий не выявило.

В группе контроля подростков монголоидов аллель Т на 14% встречается чаще, чем

у подростков с ЭАГ (0,250 против 0,113; х2=4,76; р=0,029). У подростков монголоидов с

13

ЭАГ частота встречаемости гомозиготного генотипа С/С на 30% выше, чем в контрольной группе и имеет статистическую значимость (85.0 против 53,7; %3=8,82; р=0,003) (рис. 3).

100 so 60 40 20 о

Рис. 4. Распределение генотипов полиморфизма С262Т гена CAT в исследуемых группах

По результатам генотипирования полиморфизма Gin ¡92Arg гена параоксоназы 1 выявлено, что во всех исследуемых группах наибольшая частота встречаемости у гетерозиготного генотипа Gin/Arg, наименьшая частота встречаемости зарегистрирована для генотипа Arg/Arg. Таким образом, частота встречаемости генотипов Gln/Gln. Gin/Arg и Arg/Arg в группах подростков популяционного контроля зарегистрирована в 33,8%; 58,5% и 7,7% у европеоидов, и 20,4%; 72,2% и 7,4% случаях у монголоидов соответственно. Аллели Gin и Arg встречаются с частотой 0,701 и 0,299 случаях у европеоидов, и 0,587 и 0,413 у подростков монголоидов соответственно.

80 60 40 20 о

Рис. 5. Распределение генотипов полиморфизма Glnl92Arg гена PON 1 в исследуемых группах

Сопоставление частот аллелей между пациентами с ЭАГ и здоровыми подростками монголоидов выявило схожесть. Генотип Gin/Arg у подростков монголоидов контрольной группы на 15% встречается чаще, чем в группе подростков с ЭАГ (72,2% против 57,5%). При сравнении частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфизма Glnl92Arg гена

□ С/С В С/Т 0 Т/Т

*

ill

-------- .i i . . 1 , .. J ... ,

европеоиды контроль европеоиды с ЭАГ монголоиды контроль монголоиды с ЭАГ

□ Gln/Gln 0 Gin/Arg □ Arg/Arg

параоксоназы 1 в группах контроля и больных по этнической принадлежности статистически значимых различий не выявлено (рис. 5).

Анализ ассоциаций полиморфизмов аитноксидаитной системы в формирование окислительного стресса у подростков с эссенциальной артериальной гипертензией

С целью определения вклада данных полиморфизмов в формирование окислительного стресса проведен сравнительный анализ показателей ПОЛ-АОЗ у носителей различных генотипов изучаемых полиморфизмов (табл. 2). В данной таблице представлены только статистически значимые результаты.

Таблица 2

Ассоциация полиморфизма исследуемых локусов с показателями ПОЛ-АОЗ в

исследуемых группах

Полиморфизм Показатель Генотипы (Группа) Р

Ala/Ala \ Ala/Val \ Val/Val

Европеоиды с ЭАГ

SOD 2 AlalóVal ТБК-ап 2,47 2,20-3,46 1,85 1,36-2,37 2,37 1,54-3,40 0,016

Монголоиды с ЭАГ

АОА 9,11 7,34-9,71 9,76 9,54-13,04 7,54 5,66-11,64 0,013

SOD 2 С60Т С/С С/Т Т/Т

Европеоиды с ЭАГ

GSSG 1,89 1,56-2,17 1,62 1,31-1,82 2,17 2,01-2.51 0,012

САТ С262Т С/С С/Т Т/Т

Европеоиды контроль

ТБК-ап 0,51 0,39-0,71 0,80 0,55-1,51 0,77 0,48-0.87 0,007

АОА 12,45 10,45-14,85 13,57 12,12-15,21 9,47 8.84-10,70 0,019

PON 1 GlnI92Arg Gln/Gln Gln/Arg Arg/Arg

Ев оопеоиды с ЭАГ

ДК 2,46 1,74-3,38 2,46 1,60-3,16 1,58 1,23-1.99 0,038

АОА 9,03 7,37-9,76 9,62 8,09-11,21 9,86 9,62-15,18 0,049

Европеоиды контроль

ДК 1,23 0,96-1,72 1,43 1,12-1,86 0,76 0,72-1,12 0,017

Монголоиды контроль

ГБК - ап 0,77 0,62-0,93 0.99 0,77-1,28 2,25 1.78-2,76 0,001

GSH 2.02 1,83-2,55 1,95 1,76-2,17 2,61 2,33-3,07 0,040

В группе подростков европеоидов с ЭАГ выявлена связь полиморфизма AlalóVal гена SOD 2 с прооксидантными компонентами ПОЛ-АОЗ: носители генотипа Ala/Ala имеют высокое содержание ТБК — активных продуктов, по сравнению со значениями носителей других генотипов (2,47 мкМ/л против 1,85 мкМ/л и 2,37 мкМ/л, Н=8,27; р=0,016). В группе подростков монголоидов с ЭАГ, напротив, данный полиморфизм ассоциирован с компонентами антиоксидантной системы: у носители генотипа Ala/Ala общая АОА статистически значимо выше в сравнении с аналогичными показателями у носителей генотипа Val/Val (9,11 усл.ед. против 7,54 усл.ед. соответственно: Н=8,68; р=0,013).

Параметры ПОЛ-АОЗ значительно отличается у носителей разных генотипов мутации СбОТ гена SOD 2, однако статистически значимые различия выявлены только по содержанию окисленного глутатиона в группе подростков европеоидов с ЭАГ. Так, носители гомозиготного мутантного генотипа Т/Т имеют высокий уровень окисленного глутатиона в сравнении с носителями генотипов С/С и С/Т (2,17 мкМ/л против 1,89 мкМ/л и 1,62 мкМУл соответственно, Н=8,28; р=0,015).

Полиморфизм С262Т гена CAT имеет связь с компонентами ПОЛ-АОЗ у подростков европеоидов группы контроля. У носителей аллеля Т и генотипа Т/Т общая АОА ниже, чем у носителей аллеля С и генотипа С/С (9,47 усл.ед против 12,45 усл.ед, Н=7,88; р=0,019). При этом первые имеют статистически значимо выше показатели ТБК -активных продуктов, чем носители аллеля С и генотипа С/С (0,77 мкМУл против 0,51 мкМ/л, Н=9,85; р=0,007). Для подростков монголоидов данная зависимость не выявлена. Более того, не выявлена данная взаимосвязь у пациентов с ЭАГ обеих этнических групп.

Проведена оценка показателей ПОЛ-АОЗ у подростков изучаемых групп, являющихся носителями разных генотипов полиморфизма Glnl92Arg гена PON 1. Показала взаимосвязь данного полиморфизма с содержанием ДК у подростков европеоидов, как в группе контроля, так и у пациентов с ЭАГ. У носителей гомозиготного генотипа Arg/Arg этот показатель ниже, чем у носителей других генотипов (1,58 мкМ/л против 2,46 мкМ/л: Н-6,53; р=0,038). В контроле наблюдается схожая ассоциация: у носителей генотипа Arg/Arg показатель ДК ниже, чем у носителей других генотипов (0,76 мкМ/л против 1,23 мкМ/л и 1,43 мкМ/л: Н=8,107, р=0,017).

У подростков монголоидов носители аллеля Arg имеют статистически значимо высокие показатели ТБК - активных продуктов и GSH: уровень ТБК - активных продуктов у носителей генотипа Arg/Arg составил 2,25 мкМ/л против 0,77 мкМ/л. у носителей генотипа Gln/Gln и 0,99 мкМ/л у носителей генотипа Gin/Arg (Н=13,85, р=0,0010).

Заключение: Перекисное окисление липидов является универсальным метаболическим звеном, как в норме, так и при патологии. Оно связано с процессом постоянного обновления липидного слоя клеточных мембран, синтеза гормонов, медиаторов, активностью ряда ферментов. Контроль над активностью процессов ПОЛ осуществляет сложная многоуровневая антиокислительная система организма. В физиологических условиях существует равновесие между системой перекисного окисления и антиоксидантной защитой. Функциональная активность компонентов ПОЛ-АОЗ генетически детерминирована. Поиск генов-кандидатов данной системы, ассоциированной с многочисленными мульти факторным и заболеваниями, должен проводиться внутри каждой этнической группы/расы. Результаты комплексного исследования процессов ПОЛ-АОЗ и их генетических составляющих у подростков разных этнических групп, представляющих основные расы (европеоиды — русские и монголоиды - буряты) представлены на рисунке 5.

этнических групп

Сравнение результатов оценки процессов ПОЛ-АОЗ указывают на более выраженную дизадаптацию у подростков европеоидов с ЭАГ. Так коэффициент окислительного стресса в данной группе составил 5,31 против 2,60 - у подростков монголоидов (и=754,0; р=0,000). Изученные гены-кандидаты позволяют идентифицировать генетические предикторы дисбаланса ПОЛ-АОЗ, предрасполагающие к формированию патологических состояний у представителей, изучаемых этнических группы, в том числе предикторы дисбаланса ПОЛ-АОЗ у пациентов с ЭАГ.

К универсальным генетическим маркерам окислительного стресса у подростков европеоидов следует отнести полиморфизм Glnl92Arg гена PON 1 и полиморфизм С262Т гена CAT. При этом носительство аллеля Gin и аллеля Т является рисковым в плане формирования окислительного стресса. Для подростков монголоидов к универсальным генетическим маркерам окислительного стресса следует отнести полиморфизм Glnl92Arg гена PON 1. Рисковым является аллель Arg, ассоциированный с высоким содержанием ТБК - активных продуктов.

Ген супероксиддисмутазы 2 (полиморфизм AlalóYal) следует классифицировать как универсальный генетический маркер ЭАГ, который как у подростков европеоидов, так и монголоидов, ассоциирован с содержанием ТБК - активных продуктов и общей антиокислительной активностью. Носители аллеля Ala имеют высокое содержание ТБК -активных продуктов, сочетающееся с повышением общей антиоксилительной активности, что может свидетельствовать о напряжении в системе ПОЛ-АОЗ.

ВЫВОДЫ

1. У подростков европеоидов и монголоидов с ЭАГ в сравнении с подростками группы контроля установлены общие закономерности повышения содержания продуктов перекисного окисления липидов ((ДК у европеоидов - 2,37 мкМ/л против 1,36 мкМ/л (U=l 195,5; р=0,000); у монголоидов - 2,25 мкМ/л против 0,72 мкМ/л (U=16,00; р=0,000); ТБК - активные продукты у европеоидов 0,64 мкМ/л против 2,29 мкМ/л (U=372,0; р=0,000)). При этом у подростков монголоидов с ЭАГ содержание ТБК - активных продуктов достоверно ниже, чем у подростков европеоидов с ЭАГ (0,96 мкМл/л против 2,29 мкМл/л, U=390,0; р=0,000).

2. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты у подростков европеоидов и монголоидов с ЭАГ различна. В группе подростков монголоидов КОС ниже 2,60, чем у подростков европеоидов - 5,31 (U=754,0; р=0,000).

3. В популяционных выборках выявлена этническая дифференциация распространенности генотипов и аллелей полиморфизма AlalóVal гена SOD 2: среди европеоидов частота встречаемости аллеля Ala - 0,492, у монголоидов — 0,343 (%2=4,82; р=0,028). По другим Генетическим маркерам различий не выявлено.

4. Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей генетических маркеров ПОЛ-АОЗ у подростков группы популяционного контроля и подростков с ЭАГ выявил достоверное преобладание аллеля С и генотипа С/С полиморфизма С262Т гена CAT у пациентов с ЭАГ группы монголоидов (х2=8,82; р=0,003). По другим генетическим маркерам различий в частотных характеристиках между здоровыми и больными различий не выявлено в обеих этнических группах.

5. У подростков европеоидов группы контроля к рисковым аллелям, ассоциированным с окислительным стрессом следует отнести аллель Gin полиморфизма Glnl92Arg гена параоксаназы 1 (носители диаллеля GlnGln имеют статистически значимо высокий уровень ДК, чем носители диалллея ArgArg (Н=8,107; р=0,017) и аллель Т полиморфизма С262Тгена каталазы (носители диаллеля 7Тимеют статистически значимо высокий уровень ТБК - активных продуктов и общую антиокислительную активность, чем носители диалллея СС (Н=9,85; р=0,007 и Н=7,88; р=0,019 соответственно).

6. У подростков монголоидов к рисковым аллелям ассоциированным с окислительным стрессом следует отнести аллель Arg полиморфизма Glnl92Arg гена параоксаназы 1 (носители диаллеля ArgArg имеют достоверно выше уровень ТБК — активных продуктов, чем носители диалллея GlnGln (Н=13,85; р=0,001).

7. У подростков европеоидов с ЭАГ к рисковым аллелям, ассоциированным с окислительным стрессом следует отнести аллель Gin полиморфизма Glnl92Arg гена параоксаназы 1 (носители диаллеля GlnGln имеют статистически значимо высокий уровень ДК, чем носители диалллея ArgArg (Н=6,53; р=0,0038)) и аллель Ala полиморфизма AlalóVal гена SOD2 (носители диаллеля AlaAla имеют достоверно выше уровень ТБК-активных продуктов, чем носители диаллеля ValVal (Н=8,27; р=0,016).

8. У подростков монголоидов рисковым аллелям, ассоциированным с окислительным стрессом следует отнести аллель Ala полиморфизма AlalóVal гена SOD2 (носители диаллеля AlaAla имеют статистически значимо высокий уровень антиокислительной активности, чем носители диаллеля ValVal (Н=8,68; р=0,0013)).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнаукн РФ (6)

1. Этногенетические маркеры антиоксидантной системы / Л.И. Колесникова, Т.А. Баирова, O.A. Первушина // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2013 г. - №4 (92) - С. 166-170.

2. Нутрициогенетика и факторы риска сердечно-сосудистой патологии: ассоциативные исследования в популяции Восточной Сибири / Т.А. Баирова, В.В. Долгих, O.A. Первушина [и др.] // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2013 г. - № 4. - С. 87-92.

3. Особенности антиоксидантной системы у подростков Восточной Сибири в зависимости от тендерной и этнической принадлежности / Л.И. Колесникова, H.A. Курашова, O.A. Первушина // Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2013 г. - № 4. - С. 136-140.

4. Изменчивость минисателлитного маркера АроВ 3' эвенков Катангского района Иркутской области / И.Ю. Урыбин, O.A. Первушина, Т.А. Астахова // Бюл. ВСНЦ СО РАМН.

5. Полиморфизм генов глутатион - S - трансфераз у детей разных этнических групп / Е.В. Беляева, O.A. Первушина// Бюл. ВСНЦ СО РАМН. - 2012 г. - № 3-1. - С. 9-11.

6. Показатели состояния здоровья детей эвенков проживающих на Севере Иркутской области / В.В. Долгих, Т.А. Астахова, О.А Первушина [и др.] // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. — 2010 г. - Т. 12.-№ 1-7.-С. 1668-1672. Публикации в прочих изданиях

1. Частотные характеристики полиморфизма Glnl92Arg гена параоксоназы 1 (PONI) в разных этнических группах, проживающих на территории Восточной Сибири / Л.И. Колесникова, Т.А. Баирова, O.A. Первушина // Материалы VIII международной научно-практической конференции «Перспективные вопросы мировой науки - 2012» — София. — 2012 г.-T.33.-C.53-55

2. Полиморфизм генов глутатион - S - трансфераз класса PI в этнических группах, проживающих на территории Восточной Сибири / Е.В. Беляева, O.A. Первушина // Материалы VIII международной научно-практической конференции «Перспективные вопросы мировой науки - 2012» — София. — 2012 г. - Т.ЗЗ. — С.50-52

3. Полиморфизм гена АРОВ у эвенков Восточной Сибири / Л.И. Колесникова, И.Ю. Урыбии, O.A. Первушина [и др.] // Материалы I международной конференции «Фундаментальная медицина: от скальпеля к геному, протеому и липидому». — Казань, 2011 г.- С. 49-50.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ артериальная гипертензия

АОА антиокислительная активность

АОЗ антиоксидантная защита

ДК диеновые конъюгаты

ПОЛ перекисное окисление липидов

СОД (SOD) супероксидцисмутаза

Agr аргинин

Ala аланин

CAT катал аза

Gin глутамин

GSH глутатион восстановленный GSSG глутатион окисленный PON параоксоназа Val валин

ПЕРВУШИНА Оксана Александровна

ВКЛАД МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ, КАТАЛАЗЫ И ПАРАОКСОНАЗЫ В РАЗВИТИИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА У ПОДРОСТКОВ РАЗНЫХ ЭТНИЧЕСКИХ ГРУПП С ЭССЕНЦИАЛЬНОЙ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ

АВТОРЕФЕРАТ

Подписано в печать 22.11.2013. Формат 60x90 1/16 Бумага офсетная. Печать трафаретная. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 70 экз. Заказ 28211.

Изготовлено в ООО «Репроценгр А1» г. Иркутск, ул. Александра Невского, 99/2 тел.: 540-940