Автореферат и диссертация по медицине (14.01.07) на тему:Применение цитокинотерапии в комплексном лечении вирусных и травматических кератитов у детей

На правах рукописи

ДЖАМБИНОВА НАТАЛЬЯ СЕМЕНОВНА

ПРИМЕНЕНИЕ ЦИТОКИНОТЕРАПИИ В КОМПЛЕКСНОМ ЛЕЧЕНИИ ВИРУСНЫХ И ТРАВМАТИЧЕСКИХ КЕРАТИТОВ

У ДЕТЕЙ

14.01.07 - Глазные болезни 14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2010 год.

003493703

Работа выполнена на кафедре офтальмологии педиатрического факультета Российского Государственного Медицинского Университета федерального агенства по здравоохранению и социальному развитию ГОУ ВПО Росздрава.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор Ведущая организация:

Гусева Марина Раульевна Гаиковская Людмила Викторовна

Кочергин Сергей Александрович

Стенина Марина Александровна

Российский университет дружбы народов

Защита состоится « 6 » апреля 2010 года в 10 часов на заседании

диссертационного совета Д.208.071.03 в ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Росздрава по адресу: 123995, Москва, ул. Баррикадная, д. 2/1.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Росздрава (125445, Москва, ул. Беломорская, д.19).

Автореферат разослан «5» марта 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Мосин И.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Воспалительные заболевания переднего отрезка глаз являются серьезной медико-социальной проблемой, составляя более 40% всех амбулаторных больных (Каспаров A.A., 1994, Майчук Ю.Ф., 2000). Чаще всего поражение обусловлено вирусом простого герпеса. В структуре офтальмогерпеса преобладают поражения роговицы - кератиты (Каспаров A.A., 2005, Майчук Ю.Ф.,2005, Сомов Е.Е.,1996).

В настоящее время эта патология имеет широкую распространенность -от 20 до 57% всех воспалительных заболеваний роговицы (Каспаров А.А.,2005, Майчук Ю.Ф.,2007).

Среди детей герпетический кератит составляет 70-80% от числа всех воспалительных заболеваний роговицы и представляет собой серьезную проблему из-за широкой распространенности, склонности к рецидивам, трудностей в лечении и нередко тяжелых последствий (Ковалевский Е.И., 2003).

Удельный вес кератитов в структуре общей детской глазной заболеваемости составляет 0,2%, ко всем детским заболеваниям 0,04%. в г. Москва. В глазном стационаре Морозовской детской городской клинической больницы - до 15 % ко всем больным.

Другой частой причиной воспалительной патологии роговицы у детей является травма глазного яблока различного характера, сопровождающаяся повреждением роговицы в виде эрозий, ранений различной глубины, вплоть до проникающих ранений (Мошетова Л.К.,1993, Гундорова P.A.,1995,1996, Хватова A.B., 1996, Нероев В.В., 1998, Либман Е.С., 2003, Гусева М.Р., 2005, Кочергин С.А., 2006).

Повреждения глаз в детском возрасте составляют до 50% всей детской патологии и являются наиболее частой причиной слабовидения и слепоты (Акчурина Г.З., Гусева М.Р., 1981, Боброва Н.Ф., 2003, Дадамухамедова Ш.М., 2005).

Это вызвано тем, что при травмах и воспалительной патологии различного характера резорбция и замещение коллагена роговицы происходит в длительные сроки, приводя к замещению дефекта роговицы новообразованной тканью с развитием всех дифференцированных элементов. Лечебные мероприятия при указанной патологии всегда носят комплексный характер и предполагают назначение этиотропного, противовоспалительного, иммуннокорригирующего и симтоматического лечения.

В последние годы появились данные о важной роли врожденного иммунитета в защите органа зрения от различных патогенов. Решающую роль в" активации врожденного иммунитета играют То11-подобные рецепторы, которые экспрессируются на различных клетках организма (моноцитах, дендритных клетках, эпителии и др.) и эффекгорные молекулы -дефенсины, локализованные в нейтрофильных гранулоцитах и клетках эпителия слизистых оболочек (Akira S., 2004, Ebihara N. et al., 2007).

Доказано, что TLRs экспрессируются в роговице, конъюнктиве и сетчатке глаза (Song Р.,2001). Особую значимость при герпесвирусной инфекции представляет TLR9, который участвует в распознавании неметилированных CpG-повторов ДНК вируса ВПГ-1 (Takeda К, Akira S., 2005, Kaisho Т, Akira S., 2008). Взаимодействие TLR9 с лигандом приводит к активации МуВ88-зависимого и Му088-независимого сигнальных путей, к транслокации транскрипционных факторов NF-kB и IRF в ядро и последующей экспрессии провоспалительных цитокинов, противомикробных пептидов (ПМП), интерферонов 1 типа, играющих важную роль в противовирусной защите тканей глаза (Medzhidov R., Janeway Jr С.А., 2000).

Дефенсины - пептиды, обладающие выраженной антимикробной и антивирусной активностью, важный компонент фагоцитарной защиты организма. Дефенсины нарушают дыхание и рост микроорганизмов и грибков, повышают проницаемость капилляров, что способствует миграции нейтрофилов в ткань. Среди противомикробных пептидов особый интерес представляет HBD-2, который экспрессируется эпителиальными клетками роговицы при активации TLRs, а также под действием цитокинов и компонентов бактерий и вирусов (Ganz Т, 1997).

Имеются единичные работы о функции То11-подобных рецепторов и противопептидов при воспалительных заболеваниях глаз, практически не изучен механизм действия TLR9. Поэтому исследование механизмов врожденного иммунитета в тканях глаза позволит на ряду с разработкой новых диагностических технологий усовершенствовать методы лечения и прогнозировать течение воспалительных заболеваний роговицы.

Поиск и разработка новых препаратов, эффективных при рецидивирующем течении заболевания, является актуальной и важной медико-социальной задачей. Перспективным направлением в этой области является цитокинотерапия (Ковальчук JI.B., Ганковская JI.B., 2000).

Отечественный препарат Суперлимф представляет собой комплекс природных иммунопептидов (КПИ), активирующих механизмы врожденного иммунитета и функцию фибробластов (Ковальчук JI.B, Ганковская Л.В., 2000., Теплинская Л.Е., 2005).

Ранее КПИ применяли в эксперименте и в клинической практике у взрослых при лечении проникающих ранений роговицы, ожогах роговицы, после антиглаукоматозной операции, экстракции катаракты, кератитах и увеитах (Крайнова Т.А.,1994, Макаров В.П. 1995, Радыгина Т.В., 1999, Яковлева A.B., 2000, Теплинская Л.Е., 2005) а также при лечении хронического тонзиллита и гипертрофии миндалин у детей (Пчеленок С.В.,2007)

Для пролонгированного действия препарата Суперлимф мы впервые использовали кератопротектор Аппликолл.

В литературе имеются сообщения о близких аналогах «Аппликолла», которые применялись в лечении воспалительных заболеваний роговицы только у взрослых (Козлова Т.В.,1990, Адо М.С., 1994, Овчаренко Н.Г.,2002).

Кератопротекгор Аппликолл разработан ООО «МакМеди» и представляет собой сухую полупрозрачную пленку полусферической формы из коллагена, который активирует репаративные процессы и способствует коррекции рубцово-фиброзного процесса при воспалении и заживлении ран роговицы.

Учитывая многофакторное действие данных препаратов, которые избирательно действуют на регенеративные процессы в роговице, нами был разработан комплексный метод, сочетающий применение стимуляторов репарации, таких как цитокины и кератопротекгор.

Цель работы: оценить эффективность комплексного лечения кератитов вирусной и травматической этиологии у детей с использованием цитокинотерапии и кератопротекции.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние топической иммунотерапии препарата Суперлимф в комплексном лечении совместно с применением коллагенового кератопротекгора Аппликолл на регуляцию репаративных процессов в роговице при травматическом ее дефекте в эксперименте на кроликах.

2. Определить уровень экспрессии генов врожденного иммунитета (сигнального рецептора Т1Л9, противомикробного пептида НЕЮ-2, обеспечивающих противовирусную и антибактериальную защиту) в мазках с конъюнктивы и роговицы у здоровых детей и при герпетическом кератите.

3. Оценить клиническую эффективность применения иммуннотропного препарата Суперлифм в комплексном лечении герпетических кератитов с учетом показателей врожденного иммунитета.

4. Оценить лечебный эффект применения комплекса противомикробных иммунопептидов и его совместного использования с коллагеновым кератопротектором в комплексном лечениии герпетических и травматических кератитов у детей.

5. Разработать показания и метод применения цитокинотерапии и кератопротекции при комплексном лечении герпетического и травматического кератита у детей

Научная новизна.

1. Впервые изучена экспрессия генов сигнального рецептора Т1Л19 и противомикробного пептида НВВ-2 в конъюнктиве и роговице у

,детей.

2. При герпетическом кератите уровень экспрессии генов Т1Л19 в конъюнктиве и роговице значительно возрастает, что может приводить к увеличению выработки провоспалительных цитокинов и возникновению осложнений течения воспалительных заболеваний роговицы.

3. Впервые в эксперименте на кроликах и в клинике разработан новый подход к лечению воспалительной патологии роговицы у детей,

5

основанный на применении форсированных инсталляций иммунотропного препарата Суперлимф и совместно с кератопротектором Аппликолл. 4. Исследование молекул врожденного иммунитета позволило обосновать и доказать эффективность применения комплекса природных иммунопептидов в комплексной терапии герпетического . кератита у детей.

Практическая значимость.

Разработана схема- комплексного лечения, основанная на применении в виде форсированных инсталляций иммуннбтропного препарата Суперлимф и кератопротектора Аппликолл совместно с Суперлимфом в комплексном лечении герпетического и травматического кератита у детей.

Внедрен новый метод лабораторной диагностики - определение уровня экспрессии генов сигнального рецептора Т1Л19 и щэотивомикробного пептида ШЮ-2 в конъюнктиве и роговице у здоровых детей и при герпетическом кератите для контроля за течением воспалительного процесса и эффективности лечения.

Установлены показания для применения в комплексной терапии герпетических и травматических кератитов у детей иммунотропного препарата Суперлимф и при необходимости кератопротектора Аппликолл, позволяющих снизить уровень осложнений и добиться большего функционального эффекта.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Результаты морфологических исследований роговицы кролика показали, что цитокинотерапия оказывает стимулирующее влияние на заживление поврежденной роговицы кролика, а совместное использование с кератопротекцией способствует формированию более нежного рубца, близкого по структуре к здоровой роговице.

2. В* конъюнктиве и роговице здоровых детей выявлена экспрессия сигнального рецептора Т1Л9 и противомикробного пептида НВБ-2, регулирующих противовирусную и антибактериальную защиту тканей глаза.

3. При воспалительной реакции наблюдалась гиперэкспрессия генов Т1Л19 в клетках эпителия конъюнктивы и роговицы в 20 раз, вызванная вирусной инфекцией, тогда как уровень противомикробных пептидов НЕШ-2 достоверно не изменялся.

4. Использование препарата цитокинов Суперлимф и его совместное применение с кератопротектором Аппликолл при герпетических и травматических кератитах у детей способствует более быстрому купированию воспалительного процесса, снижению осложнений и достижению высоких функциональных исходов.

Внедрение результатов работы в практику.

Метод комплексного лечения герпетических и травматических кератитов у детей с применением иммуннотропного препарата Суперлимф и кератопротектора Аппликолл используется в работе 7-го и 12-го глазных отделений Морозовской детской клинической городской больницы и отделении офтальмологии Российской детской клинической больницы г.Москвы.

Апробация работы Основные положения диссертационной работы были представлены и обсуждены на: научно-практической конференции кафедры офтальмологии педиатрического факультета РГМУ (Москва, март, 2007г.); юбилейной конференции Поражения органа зрения (Санкт-Петербург, сентябрь, 2008г.); V международной научно-практической конференции «ПролиферативныЙ синдром в офтальмологии» (Москва, ноябрь, 2008г.); городской конференции детских офтальмологов (Москва, февраль, 2009 г.);

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ. Из них 4 в центральной печати.

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на 131 страницах машинописнным текстом, состоит из введения, обзора литературы, отражающих материалы, методы, результаты собственных исследований и их обсуждений, заключения, выводов-и списка литературы. Библиографический указатель включает 168 отечественных и 89 иностранных источников. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 10 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования.

Характеристика экспериментального материала

Экспериментальные исследования проведены на 18 кроликах (36 глаз) породы «Шиншилла». Прослежены стадии заживления роговицы на стандартной модели эпителиального дефекта роговицы (5мм). Стандартная экспериментальная модель дефекта роговицы проводилась по методике, разработанной Е.И. Сидоренко, В.В. Филатовым (1987). Эксперимент проводился в течение 15 дней.

Животных разделили на 3 группы: в первой группе (6 кроликов, 12 глаз) проводили форсированные инсталляции препаратом Суперлимф (по 1 капле через каждые 5 минут в течение 1 часа) одновременно с аппликациями кератопротектора Аппликолл. Во второй группе (6 кроликов, 12 глаз) проводили форсированные инсталляции препаратом «Суперлимф» (по 1 капле через каждые 5 минут), в третьей группе (6 кроликов, 12 глаз) применяли традиционный метод лечения капли левомицетина 0,25%, тетрациклиновая мазь 1%, солкосерил глазной гель.

Лечение дефекта роговицы начинали на следующий день после создания экспериментальной модели. При сравнительной оценке

7

эффективности проведенного лечения учитывали сроки начала и завершения эпителиз'ации, уменьшение выраженности перифокального отека роговицы, отделяемого из конъюнктивальной полости и воспалительного процесса.

Гистологическое исследование.

Для гистологических исследований кроликов выводили из эксперимента на 7-е и 15- е сутки методом воздушной эмболии. Глаза энуклеировали. Энуклеированные глаза фиксировали в 10% нейтральном формалине. Через 24 часа из целого глаза готовили центральную колодку, проходящую через центр диска зрительного нерва, которую в дальнейшем заливали в парафин и готовили срезы (толщиной 5-8 мкм). Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилин-эозином по Ван-Гизону.

Определение экспрессии генов сигнального рецептора TLR9 и противомикробного пептида HBD-2 в конъюнктиве и роговице у детей методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Исследование было выполнено на базе НИИ вакцин и сывороток им. Мечникова РАМН г. Москвы совместно с ведущим научным сотрудником лаборатории диагностики вирусных инфекций к.м.н. Ганковской O.A.

Выделение РНК из мазка выполняли с использованием набора «РИБО-сорб» (ИЛС, РФ), который предназначен для выделения РНК/ДНК из клинического материала. Выделение проводилось строго в соответствии с протоколом.

Определение уровней экспрессии исследуемых генов проводили с помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (Ганковская O.A., Бахарева И.В., Ганковская JI.B.,2009). Праймеры и зонды для последовательностей TLR9, HBD-2 и ß-актина были подобраны с помощью программы Vector NTI 8.0 и синтезированы фирмой Синтол^РФ.

Реакционную смесь готовили из реактивов «Набора доя проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I» с TaqMan зондами и «Набора для определения ß-актина человека» (Синтол, Россия), согласно рекомендациям фирмы-производителя.

После приготовления реакционных смесей пробирки помещали в амплификатор для ПЦР-РВ АНК-32 (Институт Аналитического Приборостроения РАН, РФ), позволяющий анализировать образцы ДНК/РНК в динамическом диапазоне от 1 до 109 копий и одновременно детектировать 4 флуоресцентных красителя (FAM SYBR Green, ROX, R6G, CY5), с заданной программой с числом циклов 35-40: 50°С - 5 минуты, 95°С -2 минуты, 64°С- 50 секунд, 95°С - 20 секунд.

Обработка полученных результатов проводилась с помощью программного обеспечения прибора АНК-32. Калибровочные прямые, используемые для определения количества копий кДНК были построены с применением контрольных образцов, синтезированных на фирме Синтол,

РФ. Количественный уровень кДНК исследуемых генов был получен относительно уровня экспрессии гена р-актина человека (106 копий).

Клинические исследования.

Клинические исследования проводили на базе кафедры офтальмологии педиатрического факультета ГОУ ВПО РГМУ в глазных отделениях Морозовркой детской городской клинической больницы и Российской детской клинической больницы г. Москвы.

Под нашим наблюдением находились 142 пациента (142 глаза) с древовидным герпетическим и травматическим кератитом, в возрасте от 2 до 14 лет. В зависимости от проводимого комплексного лечения пациентов разделили на две основных и контрольную группу (табл. 1). С герпетическим кератитом в первой основной группе наблюдали 19 детей, из них мальчиков - 8 (42,1%), девочек -11 (57,9%), во второй основной группе ~28детей, из них мальчиков -12 (42,8%) и девочек - 16 (57,2%). С травматическим кератитом в первой основной группе наблюдали 18 детей, среди них мальчиков -10 (52,9%) и девочек - 8 (37,1%), во второй основной группе -27 детей, среди них мальчиков -16 (59,2%) и девочек -11 (40,8%). В контрольной группе с герпетическим кератитом наблюдали 25 детей, мальчиков - 10 (40%), девочек 15 (60%), с травматическим кератитом - 25 детей, м'альчиков - 14 (56%), девочек - 11 (44%).

Таблица 1

Распределение пациентов на группы в зависимости от нозологии.

N. Группы Нозология 1-я основная Суперлимф+ Аппликолл 2-я основная Суперлимф Контрольная Итого

Герпетический Кератит 19 13,4% 28 19,7% 25 17,6% 72 50,7%

Травматический кератит 18 12,7% 27 19% 25 17,6% 70 49,3%

Всего больных 37 26,1% 55 38,7% 50 35,2% 142 100%

Чаще герпетический кератит наблюдался у девочек - 42 ребенка, а с травматический кератит - у мальчиков - 40 детей.

В 1-ой основной группе - в комплексном лечении применяли препарат Суперлимф в виде форсированных инсталляций по 1 капле через каждые 5 минут в течение 1 часа 1 раз в день на аппликацию кератопротектора Аппликолл. Во 2-ой основной группе - в комплексном лечении применяли форсированные инсталляции Суперлимфа (по 1 капле через каждые 5 минут в течение 1 часа 1 раз в день). В 3-ей контрольной группе - применяли традицинное лечение (офта^ьмоферон, зовиракс, корнерегель, тобрекс, тетрациклиновая мазь, аскорутин, супрастин и др.)

У всех пациентов собирали анамнез, фиксировали жалобы, осуществляли тщательное клиническое наблюдение. Учитывали наличие аллергических реакций на введение медикаментозных средств. На каждого пациента заводили индивидуальную карту.

Исследование уровня экспрессии генов сигнального рецептора TLR9 и противомикробного пептида HBD-2

Уровень экспрессии генов сигнального рецептора TLR9 и противомикробного пептида HBD-2 в мазках с конъюнктивы и роговицы у 16 здоровых детей и 24 пациентов с герпетическим кератитом до и после лечения, у 12 пациентов после применения препарата Суперлимф и у 12 больных - после традиционного лечения.

У детей с герпетическим кератитом брали мазок с конъюнктивы и роговицы двухкратно: до лечения и через 7 дней после лечения.

Пациентов с герпетическим кератитом разделили на 2 группы:

1 группа - в комплексном лечении которых применяли форсированные инсталляции препарата Суперлимф

2 группа - применяли только традиционное лечение.

Статистическая обработка результатов клинического исследования.

В связи с малым объемом выборки и разным числом наблюдений в каждой из групп для оценки статистической достоверности различий экспрессии генов в исследуемых группах использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (Гланц С., Медико-биологическая статистика, М., Практика, 1999).

Для статистической обработки клинического материала мы использовали метод Primer of Biostaîistics Version 4.03 by Stanton A. Glantz. Среднее значение вычисляли по критерию t Стьюдента. Различия считали статистически достоверными при уровне вероятности р<0,05

Результаты собственных экспериментальных исследований.

Влияние топической иммунотерапии препаратом Суперлимф в комплексном лечении и совместно с кератопротектором Аппликолл на регуляцию репаративных процессов изучали на эксперементальной модели травматического дефекта роговицы кролика. Ежедневный контроль скорости регенерации эрозий проводили с помощью флюоресцеина и фотодокументации. Качество заживления проверяли с помощью гистологического контроля на 7-е и 15-е сутки.

В первые сутки эксперимента, мы не обнаружили разницы в клинической картине между контрольной и опытной группами.

На вторые сутки постепенно нарастала воспалительная реакция глаза: усилилась инъекция конъюнктивы, появилось обильное слизистое

отделяемое, отек роговицы, размеры эрозии оставались на том же уровне во всех группах.

На третьи сутки в первой и во второй опытной группах отмечали умеренную перикорнеальную инъекцию глазного яблока, уменьшилось слизистое отделяемое, сокращался дефект роговицы (рис. 1). В контрольной группе воспалительная реакция была более выражена.

Рис. 1 Динамика эпителизации травматического дефекта в эксперименте р<0,05 уровень значимости по критерию Стъюдента

Таблица 2

Эффективность применения монотерапии Суперлимфом и в комплексе с кератопротектором Аппликолл при лечении травматического поверхностного дефекта роговицы в

Группа

1-я Суперлимф +Алшшкол, Дни 2-я Супер лимф, Дни Контрольная, Дни Уровень достоверности

Отсутствие 3,8+0,4 4,8+0,3 6,8+0,4 Р<0,05

слизистого

отделяемого

Купирование 4,2+0,3 4,9+0,5 7,1+0,3 Р<0,05

отека роговицы

Исчезновение 4,1+0,2 5,1+0,3 7,2+0,2 Р<0,05

перикорнеальной

инъекции

Полная 6,1+0,4 7,4+0,5 10,4+0,5 Р<0,05

эпителизация

На четвертые сутки в первой опытной группе наблюдали выраженную положительную динамику, исчезновение слизистого отделяемого на 4,2+0,4 суткя, купирование отека роговицы на 4,1+0,3 сутки, исчезновение перикорнеальной инъекции глазного яблока 4,3+0,4 сутки, что произошло на

сутки быстрее, чем во второй опытной группе, и на 2,5 суток - чем в контрольной.

Полная эпителизация травматического дефекта роговицы произошла на 6,1+0,4 сутки в первой опытной группе, иа 7,4+0,5 сутки во второй опытной группе и на10,4+0,5 сутки - в контрольной (рис. 3).

Экспериментальные исследования показали, что форсированные инсталляции препарата Суперлимфа и их совместное применение с кератопротектором Алпликолл сокращали сроки заживления и эпителизации поверхностного дефекта роговицы кролика по сравнению с контрольной группой Гтабл.2).

Гистологическое исследование роговицы кроликов на 7-е сутки: полное замещение эпителиального дефекта отмечалось лишь в первой опытной группе, где использовали Суперлимф с аппликациями кератопротектора Алпликолл. Сформированный пласт эпителия представлен 2-3 рядами клеток без признаков послойной дифференцировки. Наряду с участками плотного эпителиально-стромального сращения встречаются места более слабой адгезии (рис.2А),

Во второй опытной группе, где одновременно выполняли инсталляции Суперлимфа, растущий эпителиальный слой также состоял из 2 слоев клеток, недостаточно плотно прилежащих друг к другу, но с хорошей адгезией базального слоя к подлежащей строме (рис.2Б).

В третьей группе, леченной по стандартной схеме, эпителиальный пласт .из 1-2 слоев занимал сравнительно меньшую плошадь послеоперационного дефекта. В этой же груше в деэпителизированной поверхностной строме была отмечена более выраженная воспалительная реакция в виде лейкоцитарной инфильтрации на фоне умеренной неоваскуляризации. Сама строма роговицы выглядела отечной с нечеткими межпластинчатыми границами (рис.2В).

* А Б В

Рис.2. 7 день после операции. А - реэпителизация в I группе. Пограничный край растущего эпителия в группах II (Б), контрольной группе (В). Парафиновые срезы. Окраска гематоксилин-эозином. Ув.А-х250, Б,В- х125.

Гистологическая картина на 15-е сутки показала, что в первой опытной группе произошла полная реэпителизация с дифференцировкой 4-5 слоев на

всем протяжении. В подлежащей строме не было признаков воспаления, нарушения архитектоники коллагеновых пластин (Рис.ЗА).

Ве- второй опытной группе, после форсированных инсталляций Суперлимфа, также наступила полная реэпителизация, эпителий имел равномерную толщину и завершенную послойную дифференцировку клеток. Обращали на себя внимание участки перинуклеарного отека в базальном слое эпителия, что могло отражать состояние трансцеллюлярного транспорта жидкости (Рис.ЗБ).

В контрольной группе, несмотря на полную реэпителизацию отмечали неравномерный по толщине пласт эпителия, незавершенную послойную дифференцировку клеток, включая базальный слой. Эпителиальная гиперплазия в центральной зоне (в виде фасеток) сочеталась с умеренной фибропластической пролиферацией с образованием нежной рубцовой ткани.

у I г.. ■«•,.,

А Б В

Рис.2. 15денъ после операции. Различная степень дифференцировки эпителия в зоне нанесенного дефекта в зависимости от метода лечения. А - I группа, Б - II группа, В - контрольная группа, Парафиновые срезы. Окраска гематоксилин-эозином. Ув.х250.

Таким образом, применение форсированных инсталляций Суперлимфа ускоряло процесс восстановления оптических свойств роговицы кролика по сравнению с контрольной группой. Совместное применение иммунно'тропного препарата Суперлимф и кератопротектора Аппликолл способствовало к более качественному восстановлению прозрачности эпителиального дефекта роговицы кролика без нарушения архитектоники коллагеновых структур и помутнения.

Анализ экспрессии генов ТЫ19 и НВО-2 у здоровых детей и больных герпетическим кератитом.

Методом полимеразной цепной реакции были определены уровни экспрессии генов ТЬЯ9 и НВО-2 в эпителиальных клетках конъюнктивы и роговицы детей с диагнозом герпетический древовидный кератит по сравнению со здоровыми детьми. В эпителиальных клетках конъюнктивы и роговицы здоровых детей экспрессировались гены Т1Л9 и НВО-2. У детей больных герпетическим кератитом наблюдалось достоверное увеличение экспрессии гена ТЬЯ9 в 20 раз и более (р<0,05) по сравнению с нормой (Рис ,4а). Уровень экспрессии гена Р-дефенсина НВО-2 при герпетическом

кератите практически не отличается от уровня экспрессии у здоровых детей

| 8 [ [

1 П Р|||||||| 11111111 '. ...' ". .

! { ; ШЯйШ ^¡ШШрШ Ш иорш

! 11 шшш Инн

1 - 1

! 7

I 4 3

1 644 ..................

ШШШШШт

шшш

ж

! ШШШШШ-: - 4 ^

111111

ш норма

ж герпетический хеъагиТ

Рис. 4. Уровень экспрессии генов ТЬЯ9 (а) и НВО-2 (б) в конъюнктиве глаза здоровых детей и больных герпетическим кератитом до лечения р<0,05 уровень значимости по критерию Маина-Уитни

по оси ординат ^ числа копий генов относительно экспрессии гена р-актина по оси абсцисс - исследуемые группы

В работах ряда авторов показано увеличение выработки провоспалительных цитокинов, интерферонов при вирусных кератитах (Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Долгина Е.Н., 2003). На основе полученных нами данных можно предположить, что гиперэкспрессия гена Т1.К9 при вирусном кератите не индуцирует экспрессию противомикробных пептидов, а приводит к увеличению выработки ИНФ а/(3 и провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, и ФНО-а), которые наряду с противовирусным действием могут вызывать глубокие повреждения роговицы и склеры.

Необходимость коррекции гиперэкспрессии гена ПК9 в конъюнктиве детей с вирусным кератитом, послужила основанием для применения в

комплексном лечении препарата Суперлимф, представляющего комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов. Механизм действия Суперлимфа связан с регуляцией клеток врожденного иммунитета, снижением восп&чительной реакции, усиление процессов репарации роговицы.

Включение в комплексное лечение препарата Суперлимф, обусловлено также его прямым противовирусным действием и протективным эффектом на неинфицированные клетки (Ковальчук Л.В., Лавров В.Ф., Ганковская Л.В., 2005). Нами проводился сравнительный анализ уровня экспрессии генов ТЬК9 и НВВ-2 в эпителиальных клетках конъюнктивы у детей с герпетическим древовидным кератитом через 7 дней после начала лечения (рис 5а,б).

4 4 3,5 3

2.5 -

г -

1,5 1 ■ 0,5 -О

% 6

5 -г

зл?

ШШШШМш «¡■¡¡ш

11 аНИШ

......М!......

ЩШШШШ

||1;|81111 1111?:

К

$ чйздационида: лечдая

шнорм Жтераетич« й: дадкционкое леч««

б

Рис. 5. Уровень экспрессии генов ТЫ19 (а) и НВВ-2 (б) в конъюнктиве и роговице глаза больных герпетическим кератитом после лечения. р<0,05 уровень значимости по критерию Манна-Уитни

по оси ординат ^ числа копий генов относительно экспрессии гена р-актина по оси абсцисс - исследуемые группы

Было показано, что традиционное лечение больных с герпетическим кератитом ведет к статистически значимому угнетению экспрессии гена Т1Л9 по сравнению со здоровыми детьми (2,31 ±0,6 ^ кДНК относительно 3,67±1,2 кДНК). В группе детей, получавших комплексную терапию, включающую препарат Суперлимф, наблюдали снижение уровня экспрессии гена Т1Л9 до показателей уровня здоровых детей (рис.5а). Эти данные могут свидетельствовать об иммуномодулирующем действии препарата Суперлимфа на уровень экспрессии гена Т1Л9. Достоверных отличий в экспрессии гена НЮ-2 при всех вариантах лечении нами не было выявлено (рис. 56).

На основании проведенных исследований можно сделать заключение, что применение в комплексной терапии иммунотропных препаратов, регулирующих врожденный иммунитет, оправдано, т.к. позволяет добиться клинически значимой эффективности проводимого лечения герпетического кератита.

В дальнейшем, результаты данного исследования помогут понять роль механизмов врожденного иммунитета глаза в защите от вирусной инфекции, разработать новые подходы к диагностике иммунных нарушений и к адекватной иммунотерапии.

Результаты клинических исследований.

Лечение больных с герпетическим кератитом.

Анализ эффективности применения цитокинотерапии в комплексном лечении герпетического кератита проведен у 55 больных (55 глаз) на основании клинического наблюдения и результатов лечения. Среди больных значительно преобладали лица школьного возраста от 11 до 15 лет - 19 (40,4%) в основной группе и в контрольной 10 (40%) (табл.3).

Таблица 3

Распределение больных по возрасту с герпетическим кератитом

Возраст пациентов Группа

1-я Супер лимф+ Аппликолл 2-я Суперлимф Контрольная

Абс. % Абс. % Абс. %

2-5 5 27,8 8 28,6 7 28

6-10 6 32,4 9 32,1 8 32

11-15 8 38,8 11 39,3 10 40

Всего 19 100 28 19 100 25 100

Клинический диагноз устанавливали по следующим признакам: частая связь офтальмогерпеса с общим инфекционным заболевание, наличие сопутствующих герпетических высыпаний на коже лица и слизистой оболочке губ, нейротрофический характер поражения - понижение чувствительности роговицы при кератите, замедленная регенерация, безуспешность антибактериальной терапии, склонность к рецидивам.

На основании клинической картины этиологический диагноз достаточно твердо установливали с помощью метода биомикроскопии при наличии древовидного изъязвления роговицы. В 95 % случаев наблюдали древовидный герпетический кератит.

Клинический диагноз всегда подтверждали исследованием анализа крови: определение антител (1§0, к вирусу простого герпеса

методом ИФА в вирусологической лаборатории Морозовской детской городской клинической больницы и Российской детской клинической больницы.

У детей в группе от 0 до 5 лет определялись как антитела

- 85,2%, так и антитела - 80,9%.

В возрасте от 6 до 15 лет в большинстве случаев определялись антитела ^ - 95,6%.

У всех больных с герпетическим кератитом в основной и контрольной группе имелись одинаковые клинические проявления роговичного синдрома (слезотечение, светобоязнь, блефароспазм, невралгическая боль), а также снижение зрения, степень которого зависела от локализации и тяжести процесса, снижении чувствительности роговой оболочки. При биомикроскопии определяли слизистое отделяемое, выраженную смешанную или перикорнеальную инъекцию, на роговице различной формы инфильтраты (в виде «веточки», пузырьков, звездочки, снежинки, в форме диска).

Клиническая картина показала, что при применении цитокинотерапии Суперлимфом купирование отека роговицы произошло на 4,8+0,4 сутки, а совместно с кератопротектором Аппликолл - на сутки раньше (3,7+0,3), тогда как в контрольной группе купирование отека роговицы наблюдали лишь на 7,1+0,2 сутки. Перикорнеальная инъекция исчезла в 1-ой основной группе на 3,8+0,4 сутки, во 2-ой основной группе - на 4,6+0,3 сутки, в контрольной - на 2-3 суток позже. Полная эпителизация произошла в 1-ой основной группе на 6,2+0,4 сутки, во второй основной группе - на 7,4+0,4 сутки, тогда как в контрольной - на 4 дня позже (р<0,05).

Сокращение продолжительности воспалительного процесса привело к сокращению сроков пребывания пациентов в стационаре. В основной группе койко-день сократился практически в 2 раза (табл. 4).

Таблица 4

Показатели клинической эффективности Суперлимфа и совместно с

кератопротектором Аппликол при лечении _г.__герпетического кератита у детей._

Критерии 1-я Суперлимф+ Аппликолл (сутки) 2-я Суперлимф (сутки) Контрольная (сутки) Уровень достоверности

Купирование отека роговицы 3,7+0,3 4,8+0,4 7,1+0,2 р<0,05

Исчезновение перикорнеальной инъекции 3,8+0,4 4,6+0,3 6,8+0,4 р<0,05

Купирование роговичного синдрома 4,3+0,4 5,4+0,4 7,2+0,4 р<0,05

Полная эпителизация 6,2+0,4 7,4+0,4 12,3+0,6 р<0,05

Койко-день 7,5+0,5 8,9+0,5 14,4+0,4 р<0,05

Показатели эффективности лечения в основной группе обследованных были лучше, чем в контрольной и разница статистически достоверна (р<0,05).

Острота зрения у детей с герпетическим кератитом до лечения составила в большинстве случаев от < 0.1 до 0.4 (рис.6)

Восстановление прозрачности роговицы обеспечило высокую остроту зрения в 1 -й и во 2-ой основных группах по сравнению с контрольной (рис. 7).

<0,1 •■!.> о а с..-; а.г, о.у-о.я 0.9-1. о -Лс-и»

Рис. 6. Острота зрения у детей с герпетическим кератитом до лечения

1 группа (С+А) ж 3 группа (к)

Рис. 7. Острота зрения у детей с герпетическим кератитом после

лечения

Таким образом,, в ходе клинических наблюдений за результатами лечения I пациентов нами подтверждён высокий эффект препарата Суперлимф в комплексном лечении герпетического кератита, который усиливался при совместном использовании с кератопротектором Аппликолл.

Лечение травматического кератита

Травматический кератит наблюдали у детей после непроникающих ранений роговицы, внедрения в роговицу инородного тела, ношения контактных линз.

Субъективная симптоматика при поступлении', боль в глазу, слезотечение, светобоязнь, блефароспазм, снижение остроты зрения.

В большинстве случаев травматический кератит наблюдали в возрасте от 6 до 10 лет, в первой основной группе - 50%, во второй основной группе 51,9%, в контрольной группе - 48% (табл. 5)

Сравнительный анализ результатов лечения показал, что купирование отека роговицы произошло в первой основной группе на 2,7+0,4 сутки, во второй - на 3,6+0,3 сутки, в контрольной группе - на 5,1+0,5 сутки. Болевой синдром исчезал на 2 суток раньше в первой основной группе, и на сутки - во второй в отличие от контрольной группы, в которой болевой I синдром купировался на 4,8+0,4 сутки.

Купирование роговичного синдрома произошло в основной группе на 2-суток раньше, чем контрольной.

Койко-день пребывания в стационаре детей с травматическим кератитом | сократился на 3-е суток в первой основной группе и на 2-е суток во второй основной группе по сравнению с контрольной группой (табл. 6).

Таблица 5

Распределение больных по возрасту с травматическим кератитом

Возраст пациентов Группа

1-я Суперлимф+ Алпликолл 2-я Суперлимф+ Контрольная

Абс. % Абс. % Абс. %

2-5 4 22,2 6 22,2 5 20

6-10 9 50 14 51,9 12 48

11-15 5 27,3 7 25,9 8 32

Всего 18 100 27 100 25 100

Таблица 6

Показатели клинической эффективности Суперлимфа и совместно с кератопротектором Аппликол при лечении

Критерии 1-я группа Суперлимф+ Аппликолл (сутки) 2-я группа Суперлимф (сутки) Контрольная группа (сутки) Уровень достоверности

Купирование отека роговицы 2,7+0,4 3,6±0,3 5,1+0,5 р<0,05

Купирование болевого синдрома 2,8+0,4 3,7+0,3 4,8+0,4 р<0,05

Купирование роговичного синдрома 2,6+0,4 3,8+0,5 5,6+0,4 р<0,05

Полная эпителизация 3,5,+0,4 4,3+0,4 6,8+0,5 р<0,05

Койкр.-день 4,8+0,5 5,7+0,5 9,6+0,4 р<0,05

Острота зрения до лечения у детей с травматическим кератитом составила в основном 0.1-0.4 (рис. 9).

® 1. группа а» г группа в* 3 I руппа

Рис. 8. Острота зрения у детей с травматическим кератитом до лечения

Восстановление остроты зрения до 0.9 -1.0 в первой основной группе произошло в 83,3% случаев, во второй опытной группе в 71,4% случаев, в контрольной - 30,6 % случаев (рис. 9).

т ^группа (е+А)

«2 группа ¡о

«3 группа (К) :

Рис. 9. Восстановление остроты зрения у детей с травматическим кератитом после лечения

Таким образом, клиническая картина показала, что применение форсированных инсталляций препарата Суперлимф и совместно с кератопротектором Аппликолл в комплексном лечении травматического кератита у детей, положительно влияет на процессы регенерации, значительно сокращает сроки эпителизации роговичного дефекта, сокращает сроки лечения, улучшает исходы травм по сравнению с контрольной группой, где применяли только традицинное лечение.

Выводы

1. Применение цитокинотерапии Суперлимфом в лечении экспериментального травматического дефекта роговицы кролика приводило к ускорению репаративных процессов, быстрому купированию воспалительной . реакции по сравнению с традиционным лечением. Совместное применение цитокинотерапии Суперлимфом с кератопротором Аппликолл способствовало более качественному восстановлению эпителиального дефекта роговицы без нарушения архитектоники коллагеновых структур.

2. Впервые изучены в конъюнктиве и роговице здоровых детей показатели врожденного иммунитета сигнального рецептора Т1П9 и противомикробного пептида р - дефенсина ШЮ-2, обеспечивающих противовирусную и антибактериальную защиту тканей глаза. Уровни экспрессии ТЬИ9 и НВБ-2 в группе здоровых детей и группе с герпетическим кератитом не зависят от возраста и пола детей.

3. Установлено достоверное увеличение экспрессии генов рецептора Т1Л19 в 20 раз (р<0,05) у детей с герпетическим кератитом до лечения, уровень экспрессии генов ШШ-2 достоверно не отличается от уровня экспрессии генов в группе здоровых детей.

4. Разработаны показания и схема применения препарата Суперлимф (форсированные инсталляции по 1 капле через каждые 5 минут в течение часа 1 раз в сутки) на аппликации кератопротектора Аппликолл в комплексном лечении герпетического и травматического кератитов у детей.

5. Применение в комплексном лечении детей с герпетическим -Кератитом иммуномодулятора Суперлимф вызывает нормализацию уровня экспрессии гена ТЫ19 в конъюнктиве и роговице глаза. Тогда как традиционная противовирусная терапия герпетического кератита приводит к достоверному снижению уровня экспрессии гена Т1Л9 (более, чем на два порядка) по сравнению со здоровыми детьми (р<0.05).

6. Включение цитокинотерапии в комплексное лечение герпетического кератита привело к быстрому и стойкому купированию локального воспалительного процесса, сокращению сроков лечения на 3-4 суток по сравнению с контрольной группой (8,9+0,5, р<0.05).

Совместное применение цитокинотерапии Суперлимфом и кератопротекции Аппликоллом ускорило сроки полной эпителизации роговицы у детей с герпетическим кератитом на 4-5 суток, сокращению койко-дня на 5-6 суток (7,5+0,5). В то время как в контрольной группе пациентов, получающих традиционную противовирусную терапию койко-день составил 14,4+0,4 суток. Комбинированное лечение травматических кератитов с использованием Суперлимфа и Суперлимфа в сочетании с Аппликоллом вызывало более быстрое купирование

22

воспалительной реакции, формирование нежного помутнения роговицы, сокращение сроков лечения до 5,7+0,5 к/д и 4,2+0,5 к/д соответственно. В контрольной группе койко-день составил 9,6+0,4 (р<0.05).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для ускорения процессов эпителизации и предупреждения стромальных дефектов, уменьшения воспалительной реакции, профилактики осложнений, сокращения сроков и улучшения исхода лечения рекомендуется совместное использование цитокинотерапии и кератопротекции.

2. Способ применения: форсированные инсталляции комплекса природных цитокинов (по 1 капле через каждые 5 минут в течении 1 часа) на аппликацию кератопротектора Аппликолл

3. При лечении пациентов с герпетическим и посттравматическим кератитом, послеоперационных внутриглазных вмешательств рекомендуется включить в комплекс лечебных мероприятий цитокинотерапию и кератопротекцию в течение первых суток после

'Повреждения роговицы.

4. Показания к цитокинотерапии и кератопротекции герпетические и посправматические кератиты, эрозии роговицы, для улучшения заживления корнеосклеральных разрезов после любых внутриглазных операций, послеоперационных осложнений.

5. Противопоказания к цитокинотерапии и кератопротекции индивидуальная непереносимость препарата Суперлимфа и кератопротектора Аппликолл.

Список опубликованных работ.

1. Раднаева Д.Ц., Сидоренко Е.И., Павлюк Е.Ю., Бадинова Н.С.. Федоров A.A., Христофоров В.Н. Влияние магнитно-инфракрасно-лазерного излучения на репаративную регенерацию роговицы (экспериментальное исследование) // Российская педиатрическая офтальмология. - 2007. № 2. - С. 45 - 48.

2. Гусева М.Р., Дубовская Л.А.. Бадинова Н.С.. Бесланеева М.Б.. Мищенко Н.П. И зучение клинической эффективности препарата Гистохром в комплексном лечении внутриглазных кровоизлияний у детей с контузиями глаз // Х1УРоссийский национальный конгресс «Человек и лекарство» - М. - 2007. - С. 281.

3. Гусева М.Р., Бадинова Н.С.. Бесланеева М.Б., Горбунова Е.Д., Кузнецова Ю.Д., Кан И.Г. Научно-практический анализ травм глаз у детей по данным глазного стационара Морозовской детской клинической городской больницы // Российская педиатрическая офтальмология. - 2008. - № 2. - С. 6 -10.

4. Джамбинова Н.С.. Гусева М.Р., Ганковская JI.B., Маклакова И.А., Федоров A.A., Раднаева Д.Ц. Цитокинотерапия «Суперлимфом» и

кератопротекция «Аппликоллом» в улучшении регенерации роговицы при травматическом кератите (экспериментальное исследование) // Российская педиатрическая офтальмология. - 2008. № 3. - С. 42 - 44.

5. Джамбинова Н.С.. Гусева М.Р., Ганковская JI.B., Маклакова И.А., Федоров A.A., Раднаева Д.Ц. Влияние цитокинотерапии «Суперлимфом» и кератопротекции «Аппликоллом» на регенерацию травматического дефекта роговицы // Юбилейной конференции Поражения органа зрения. Санкт -Петербург. - 2008. - С.59

6. Джамбинова Н.С. Регенеративные подходы к лечению травм и воспалительной патологии роговицы (экспериментально-клиническое исследование) // V международной научно-практической конференции «Пролиферативный синдром в офтальмологии». Москва. - 2008. - С. -74-75.

7. Джамбинова Н.С.. Гусева М.Р., Сидоренко Е.И., Ганковская J1.B., Ковальчук JI.B., Федоров A.A., Кузнецова Ю.Д., Горбунова Е.Д. Цитокинотерапия в регуляции репаративных процессов роговицы (экспериментально-клиническое исследование) // Вестник офтальмологии. - Т. 125. - №6. - 2009.

В 2007 году фамилия автора была изменена с Бадиновой Н.С. на Джамбинову Н.С.

Заказ № 193. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз. Отпечатано в ООО «Петроруш». г.Москва, улЛалиха 2а.тел.250-92-06 www.postator.ru

Воспалительные заболевания переднего отрезка глаз являются серьезной медико-социальной проблемой, составляя более 40% всех амбулаторных больных. Чаще всего поражение обусловлено вирусом простого герпеса. В структуре офтальмогерпеса преобладают поражения роговицы - кератиты [4, 8, 39, 41, 84, 177].

Рецидивирующий офтальмогерпес часто является основной причиной прогрессирующего ухудшения зрения. Обострение воспалительного процесса возникает после первой атаки в 25 - 33% случаев, а после второй -в 43-50%[197].

Среди детей герпетический кератит составляет 70-80% от числа всех воспалительных заболеваний роговицы. Офтальмогерпес у детей из-за широкой распространенности, склонности к рецидивам, трудностей в лечении и нередко тяжелых последствий представляет собой серьезную проблему. По данным многих авторов [63, 83, 84, 89] после перенесенного офтальмогерпеса у большинства детей снижается зрение в связи с формированием до 50% случаев астигматизма и амблиопии.

Удельный вес кератитов в структуре общей детской глазной заболеваемости составляет 0,2%, ко всем детским заболеваниям 0,04%. в г. Москва. В глазном стационаре Морозовской детской городской клинической больницы - до 15 % ко всем больным.

Другой частой причиной воспалительной патологии роговицы у детей является травма глазного яблока различного характера, сопровождающаяся повреждением роговицы в виде эрозий, ранений различной глубины, вплоть до проникающих ранений [16, 27, 28, 72, 85, 87,107, 108, 110].

Повреждения глаз в детском возрасте составляют до 50% всей детской патологии и являются наиболее частой причиной слабовидения и слепоты [1,3, 11,27,31,72].

Это вызвано тем, что при травмах и воспалительной патологии в области дефекта роговицы в связи с недостаточной дифференцировкой коллагена у детей младшего возраста в отличие от взрослых резорбция и замещение коллагена роговицы происходит в длительные сроки, приводя к образованию соединительной ткани. Лечебные мероприятия всегда носят комплексный характер и предполагают назначение этиотропного, противовоспалительного, симтоматического лечения.

В связи с незрелостью тканей глазного яблока у детей и несовершенством его местной врожденной иммунологической защиты лечение патологии роговицы всегда должно быть дополнено назначением иммуннотропных препаратов.

Поиск и разработка новых препаратов, эффективных при рецидивирующем течении заболевания, является актуальной и важной медико-социальной задачей. Перспективным направлением в этой области является цитокинотерапия [19, 44, 45, 48, 49, 74].

В последние годы появились данные о важной роли врожденного иммунитета в защите органа зрения от различных патогенов. Решающую роль в активации врожденного иммунитета играют То11-подобные рецепторы, которые экспрессируются на различных клетках организма (моноцитах, дендритных клетках, эпителии и др.) и эффекторные молекулы -дефенсины, локализованные в нейтрофильных гранулоцитах и клетках эпителия слизистых оболочек [59, 60, 61, 169, 187, 240].

Доказано, что TLRs экспрессируются в роговице, конъюнктиве и сетчатке глаза [242]. Особую значимость при герпесвирусной инфекции представляет TLR9, который участвует в распознавании неметилированных CpG-повторов ДНК вируса ВПГ-1 [202, 242]. Взаимодействие TLR9 с лигандом приводит к активации МуБ88-зависимого и Му088-независимого сигнальных путей, к транслокации транскрипционных факторов NF-kB и IRF в ядро и последующей экспрессии провоспалительных цитокинов, противомикробных пептидов (ПМП), интерферонов 1 типа, играющих важную роль в противовирусной защите тканей глаза [242, 245].

При инфицировании вирусом простого герпеса путем слияния оболочки вириона и цитопоплазматической мембраны клетки, либо за счет реализации механизма рецепторного эндоцитоза, происходит проникновение вирусных частиц в клетки слизистых оболочек, и нуклеокапсид вируса оказывается в цитоплазме клеток [212].

Дефенсины - пептиды, обладающие выраженной антимикробной и антивирусной активностью, важный компонент фагоцитарной защиты организма. Дефенсины нарушают дыхание и рост микроорганизмов и грибков, повышают проницаемость капилляров, что способствует миграции нейтрофилов в ткань [171, 179, 187, 188, 189, 227]. Среди противомикробных пептидов особый интерес представляет HBD-2, который экспрессируется эпителиальными клетками роговицы при активации TLRs, а также под действием цитокинов и компонентов бактерий и вирусов [187].

Имеются единичные работы о функции То11-подобных рецепторов и противомикробных пептидов при воспалительных заболеваниях глаз у взрослых, у детей не изучена роль TLR9 и HBD-2 [202, 257] Поэтому исследование показателей врожденного иммунитета в тканях глаза позволит усовершенствовать методы лечения и прогнозировать течение воспалительных заболеваний роговицы.

Особую значимость при герпесвирусной инфекции представляет Toll-подобный рецептор 9 (TLR9), который участвует в распознавании ДНК вируса простого герпеса 1типа и способствует экспрессии провоспалительных цитокинов и противомикробных пептидов (HBD-2), интерферонов 1 типа, играющих важную роль в противовирусной защите тканей глаза.

Таким образом, избыточная экспрессия провоспалительного TLR9 может усугубить воспалительный процесс и привести к развитию осложнений с одной стороны, с другой стороны в результате сложных иммунологических каскадных реакций происходит усиление выработки противомикробных пептидов и интерферонов.

В этом аспекте для клиницистов важным является своевременное выяснение роли экспрессии распознающих рецепторов системы врожденного иммунитета То11-подобных рецепторов и противомикробных пептидов, что способствует разработке, на основе полученных данных, новых подходов к терапии кератитов [60].

В связи с этим в нашей работе был применен иммунотропный препарат Суперлимф, активирующий механизмы врожденного иммунитета и представляющий собой комплекс природных иммунопептидов, которые состоят из противомикробных белков и цитокинов [52, 54, 55].

В настоящее время продемонстрировано прямое антибактериальное действие комплекса природных цитокинов (Суперлимфа) на стафилококки (St.aureus), стрептококки (Strep, haem.), E.coli. Суперлимф угнетает репродукцию вируса герпеса 1 и 2 типа, вызывая лизис оболочки вириона [57, 61].

Ранее комплекс природных цитокинов применяли в эксперименте и в клинической практике при лечении проникающих ранений роговицы, ожогах роговицы, после антиглаукоматозной операции, экстракции катаракты, кератитах и увеитах у взрослых [20, 24, 25, 34, 73, 103, 123, 124, 143, 167], а также при лечении хронического тонзиллита и гипертрофии миндалин у детей [122].

Программа клинических исследований и отчет о проведении клинических испытаний препарата Суперлимф (регистрационный номер 000516/01-2001, лицензия № 42/176/2002 центр ООО «Иммунохел») в комплексном лечении вирусных и травматических кератитов у детей рассмотрены и одобрены на заседаниях Этического комитета РГМУ (протокол №66).

Для пролонгированного действия препарата Суперлимф мы впервые использовали кератопротектор Аппликолл (регистрационный номер ФСР 2009/05861, протокол Этического комитета РГМУ №89).

В литературе имеются сообщения о близких аналогах Аппликолла, которые применялись в лечении воспалительных заболеваний роговицы только у взрослых [5, 65, 117]

Кератопротектор Аппликолл разработан ООО «МакМеди» и представляет собой сухую полупрозрачную пленку полусферической формы из коллагена, который активирует репаративные процессы и способствует коррекции рубцово-фиброзного процесса при воспалении и заживлении ран роговицы.

Учитывая многофакторное действие данных препаратов, которые избирательно действуют на регенеративные процессы в роговице, нами был разработан комплексный метод, сочетающий применение стимуляторов репарации, таких как цитокины и коллаген.

Цель работы.

Цель работы: оценить эффективность комплексного лечения кератитов вирусной и травматической этиологии у детей с использованием цитокинотерапии и кератопротекции.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние топической иммунотерапии препарата Суперлимф в комплексном лечении совместно с применением коллагенового кератопротектора Аппликолл на регуляцию репаративных процессов в роговице при травматическом ее дефекте в эксперименте на кроликах.

2. Определить уровень экспрессии генов врожденного иммунитета (сигнального рецептора TLR9, противомикробного пептида HBD-2, обеспечивающих противовирусную и антибактериальную защиту) 9 в мазках с конъюнктивы и роговицы у здоровых детей и при герпетическом кератите.

3. Оценить клиническую эффективность применения иммуннотропного препарата Суперлифм в комплексном лечении герпетических кератитов с учетом показателей врожденного иммунитета.

4. Оценить лечебный эффект применения комплекса противомикробных иммунопептидов и его совместного использования с коллагеновым кератопротектором в комплексном лечениии герпетических и травматических кератитов у детей.

5. Разработать показания и метод применения цитокинотерапии и кератопротекции при комплексном лечении герпетического и травматического кератита у детей

Научная новизна

1. Впервые изучена экспрессия генов сигнального рецептора TLR9 и противомикробного пептида HBD-2 в конъюнктиве и роговице у детей.

2. При герпетическом кератите уровень экспрессии генов TLR9 в конъюнктиве и роговице значительно возрастает, что может приводить к увеличению выработки провоспалительных цитокинов и возникновению осложнений течения воспалительных заболеваний роговицы.

3. Впервые в эксперименте на кроликах и в клинике разработан новый подход к лечению воспалительной патологии роговицы у детей, основанный на применении форсированных инсталляций иммунотропного препарата Суперлимф и совместно с кератопротектором Аппликолл.

4. Исследование молекул врожденного иммунитета позволило обосновать и доказать эффективность применения комплекса

10 природных иммунопептидов в комплексной терапии герпетического кератита у детей.

Практическая значимость.

Разработана схема комплексного лечения, основанная на применении в виде форсированных инсталляций иммуннотропного препарата Суперлимф и кератопротектора Аппликолл совместно с Суперлимфом в комплексном лечении герпетического и травматического кератита у детей.

Внедрен новый метод лабораторной диагностики - определение уровня экспрессии генов сигнального рецептора TLR9 и противомикробного пептида HBD-2 в конъюнктиве и роговице у здоровых детей и при герпетическом кератите для контроля за течением воспалительного процесса и эффективности лечения.

Установлены показания для применения в комплексной терапии герпетических и травматических кератитов у детей иммунотропного препарата Суперлимф и при необходимости кератопротектора Аппликолл, позволяющих снизить уровень осложнений и добиться большего функционального эффекта.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Результаты морфологических исследований роговицы кролика показали, что цитокинотерапия оказывает стимулирующее влияние на заживление поврежденной роговицы кролика, а совместное использование с кератопротекцией способствует формированию более нежного рубца, близкого по структуре к здоровой роговице.

2. В конъюнктиве и роговице здоровых детей выявлена экспрессия сигнального рецептора TLR 9 и противомикробного пептида HBD -2, регулирующих противовирусную и антибактериальную защиту тканей глаза.

3. При воспалительной реакции наблюдалась гиперэкспрессия генов TLR9 в клетках эпителия конъюнктивы и роговицы в 20 раз, вызванная вирусной инфекцией, тогда как уровень противомикробных пептидов HBD-2 достоверно не изменялся.

4. Использование препарата цитокинов Суперлимф и его совместное применение с кератопротектором Аппликолл при герпетических и травматических кератитах у детей способствует более быстрому купированию воспалительного процесса, снижению осложнений и достижению высоких функциональных исходов.

Внедрение результатов работы в практику

Метод комплексного лечения герпетических и травматических кератитов у детей с применением иммуннотропного препарата Суперлимф и его совместное применение с кератопротектором Аппликолл применяется в работе 7-го и 12-го глазных отделений Морозовской детской клинической городской больницы и глазном отделении Российской детской клинической больницы г.Москвы.

Апробация результатов исследования

Основные положения диссертационной работы были представлены и обсуждены на:

Научно-практической конференции кафедры офтальмологии педиатрического факультета РГМУ (Москва, март, 2007г.); - Юбилейной конференции Поражения органа зрения (Санкт-Петербург, сентябрь, 2008г.);

V международной научно-практической конференции «Пролиферативный синдром в офтальмологии» (Москва, ноябрь, 2008г.); - Городской конференции детских офтальмологов (Москва, февраль, 2009 г.)

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ. Из них 4 в центральной печати.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 таблицами, 25 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы (167 - отечественных, 90 - иностранных).

Выводы

1. Применение цитокинотерапии Суперлимфом в лечении экспериментального травматического дефекта роговицы кролика приводило к ускорению репаративных процессов, быстрому купированию воспалительной реакции по сравнению с традиционным лечением. Совместное применение цитокинотерапии Суперлимфом с кератопротором Аппликолл способствовало более качественному восстановлению эпителиального дефекта роговицы без нарушения архитектоники коллагеновых структур.

2. Впервые изучены в конъюнктиве и роговице здоровых детей показатели врожденного иммунитета сигнального рецептора TLR9 и противомикробного пептида Р - дефенсина HBD-2, обеспечивающих противовирусную и антибактериальную защиту тканей глаза. Уровни экспрессии TLR9 и HBD-2 в группе здоровых детей и группе с герпетическим кератитом не зависят от возраста и пола детей.

3. Установлено достоверное увеличение экспрессии генов рецептора TLR9 в 20 раз (р<0,05) у детей с герпетическим кератитом до лечения, уровень экспрессии генов HBD-2 достоверно не отличается от уровня экспрессии генов в группе здоровых детей.

4. Применение в комплексном лечении детей с герпетическим кератитом иммуномодулятора Суперлимф вызывает нормализацию уровня экспрессии гена TLR9 в конъюнктиве и роговице глаза. Тогда как традиционная противовирусная терапия герпетического кератита приводит к достоверному снижению уровня экспрессии гена TLR9 (более чем на два порядка) по сравнению со здоровыми детьми (р<0.05).

5. Включение цитокинотерапии в комплексное лечение герпетического кератита привело к быстрому и стойкому купированию локального воспалительного процесса, сокращению сроков лечения на 3-4 суток

93

8,9+0,5, р<0.05) по сравнению с контрольной группой (14,4+0,4, р<0.05).

6. Совместное применение цитокинотерапии Суперлимфом и кератопротекции Аппликоллом ускорило сроки полной эпителизации роговицы у детей с герпетическим кератитом на 4-5 суток, сокращению койко-дня на 5-6 суток (7,5+0,5). В то время как в контрольной группе пациентов, получающих традиционную противовирусную терапию койко-день составил 14,4+0,4 суток. Комбинированное лечение травматических кератитов с использованием Суперлимфа и Суперлимфа в сочетании с Аппликоллом вызывало более быстрое купирование воспалительной реакции, сокращение сроков лечения до 5,7+0,5 к/д и 4,2+0,5 к/д соответственно. В контрольной группе койко-день составил 9,6+0,4 (р<0.05).

7. Разработаны показания и схема применения препарата Суперлимф (форсированные инсталляции по 1 капле через каждые 5 минут в течение часа 1 раз в сутки) на аппликации кератопротектора Аппликолл в комплексном лечении герпетического и травматического кератитов у детей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Предложен для практического здравоохранения метод лечения глазных заболеваний. Метод позволяет усилить медикаментозное лечение, приносит экономический эффект за счет сокращения койко-дня в стационаре.

2. Для ускорения процессов эпителизации и предупреждения стромальных дефектов, уменьшения воспалительной реакции, профилактики осложнений, сокращения сроков и улучшения исхода лечения рекомендуется совместное использование цитокинотерапии и кератопротекции.

3. При лечении пациентов с вирусным и травматическим кератитом рекомендуется включить в комплекс лечебных мероприятий цитокинотерапию и кератопротекцию в течение первых суток после повреждения роговицы.

Показания к цитокинотерапии и кератопротекции

Герпетические и травматические кератиты, эрозии роговицы, для улучшения заживления корнеосклеральных разрезов после любых внутриглазных операций, послеоперационные осложнения.

Противопоказания к цитокинотерапии и кератопротекции

Индивидуальная непереносимость препарата Суперлимфа и кератопротектора Аппликолл.

Публикации по теме диссертации.

1. Раднаева Д.Ц., Сидоренко Е.И., Павлюк Е.Ю., Бадинова Н.С. Федоров А.А., Христофоров В.Н. Влияние магнитно-инфракрасно-лазерного излучения на репаративную регенерацию роговицы (экспериментальное исследование) // Российская педиатрическая офтальмология. - 2007. № 2. - С. 45 - 48.

2. Гусева М.Р., Дубовская Л.А., Бадинова Н.С. Бесланеева М.Б., Мищенко Н.П. И зучение клинической эффективности препарата Гистохром в комплексном лечении внутриглазных кровоизлияний у детей с контузиями глаз // Х1УРоссийский национальный конгресс «Человек и лекарство» - М. - 2007. - С. 281.

3. Гусева М.Р., Бадинова Н.С., Бесланеева М.Б., Горбунова Е.Д., Кузнецова Ю.Д., Кан И.Г. Научно-практический анализ травм глаз у детей по данным глазного стационара Морозовской детской клинической городской больницы // Российская педиатрическая офтальмология. - 2008. - № 2. - С. 6 - 10.

4. Джамбинова Н.С., Гусева М.Р., Ганковская Л.В., Маклакова И.А., Федоров А.А., Раднаева Д.Ц. Цитокинотерапия «Суперлимфом» и кератопротекция «Аппликоллом» в улучшении регенерации роговицы при травматическом кератите (экспериментальное исследование) // Российская педиатрическая офтальмология. - 2008. № 3. - С. 42 - 44.

5. Джамбинова Н.С., Гусева М.Р., Ганковская Л.В., Маклакова И.А., Федоров А.А., Раднаева Д.Ц. Влияние цитокинотерапии «Суперлимфом» и кератопротекции «Аппликоллом» на регенерацию травматического дефекта роговицы // Юбилейной конференции Поражения органа зрения. Санкт -Петербург. - 2008. - С.59

6. Джамбинова Н.С. Регенеративные подходы к лечению травм и воспалительной патологии роговицы (экспериментально-клиническое исследование) // V международной научно-практической конференции

Пролиферативный синдром в офтальмологии». Москва. - 2008. — С. -74-75.

7. Джамбинова Н.С., Гусева М.Р., Сидоренко Е.И., Ганковская JI.B., Ковальчук JI.B., Федоров А.А., Кузнецова Ю.Д., Горбунова Е.Д. Цитокинотерапия в регуляции репаративных процессов роговицы (экспериментально-клиническое исследование) // Вестник офтальмологии. - Т. 125. - №6. - 2009,- С. - 18 - 21.

В 2007 году фамилия автора была изменена с Бадиновой Н.С. на Джамбинову Н.С.