Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Цитогенетический статус, показатели пролиферации и апоптоза у детей с бронхиальной астмой, проживающих в условиях загрязнения атмосферного воздуха

На правах рукописи

Бяхова Мария Михайловна

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИИ СТАТУС, ПОКАЗАТЕЛИ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗА У ДЕТЕЙ С БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ, ПРОЖИВАЮЩИХ В УСЛОВИЯХ ЗАГРЯЗНЕНИЯ АТМОСФЕРНОГО ВОЗДУХА

14 00 07 -Гигиена

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

о 1> ¿вг?^

Москва - 2008

003445819

Работа выполнена в лабораториях генетического мониторинга и оценки и прогнозирования здоровья населения Государственного учреждения Научно-исследовательского института экологии человека и гигиены окружающей средним АН СысинаРАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Сычева Людмила Петровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук (ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды

им АН СысинаРАМН) Тепикина Лидия Анатольевна

доктор медицинских наук, профессор

(ФГУП Всероссийский научно-исследовательский

институт железнодорожной

гигиены Роспотребнадзора) Вильк Михаил Франкович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава им А Н Семашко, г Москва

Защита диссертации состоится 25 сентября 2008 г в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 001 009 01 в ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им АН СысинаРАМН по адресу 119992, г Москва, ул Погодинская, д. 10/15, строение 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им А Н Сысина РАМН

Автореферат разослан « А> ОЪ 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор '"Беляева Наталия Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Загрязнение окружающей среды вносит существенный вклад в ухудшение состояния здоровья населения, и особенно, наиболее уязвимых групп детей, людей пожилого возраста Особого внимания требуют дети, больные бронхиальной астмой В последние время во всем мире отмечается рост распространенности и тяжести бронхиальной астмы у детей, манифестация болезни в более раннем возрасте [Чучалин А Г, 2000, Мизерницкий Ю JI, 2002] В нашей стране, по официальным данным, число детей и подростков, больных бронхиальной астмой, превышает четверть миллиона человек Одной из причин роста заболеваемости считается влияние факторов окружающей среды, особенно загрязнение атмосферного воздуха [Пинигин M А, Сабирова 3 Ф , Тепикина JI А. и др, 2005], в связи с чем бронхиальную астму относят к экологически зависимым заболеваниям Важную роль в развитии атопической бронхиальной астмы играют воздействия аллергенов как внутри жилища, так и вне его [Дрожжев M Е с соавт, 2002] В ряде исследований показано увеличение частоты случаев бронхиальной астмы в условиях загрязнения атмосферного воздуха [Говалова СМ, 1997, Brauer M, 2007, Sun HL, 2006], и, особенно, увеличение частоты приступов при значительных выбросах загрязняющих веществ [Новиков С M с соавт, 2003, Новиков С M с соавт, 2001] Однако в настоящее время нет достаточно точного объяснения механизмов такого влияния

По современным представлениям атопическая бронхиальная астма (далее - БА) является воспалительным заболеванием дыхательных путей, пусковым сигналом которого является реакция иммунокомпетентрых клеток на аллергены [Чучалин А Г, 2000, Богданова AB с соавт, 2005] При воспалении наблюдается макрофагальная реакция и оксидантный стресс, дисбаланс которых оказывает прямое негативное действие на различные отделы бронхолегочной системы [White SR et al, 2002, Bumbacea d et al, 2004] По-видимому, химические загрязнения атмосферного воздуха усугубляют эти процессы, однако, в настоящее время данные о воздействии химических загрязнений атмосферного воздуха на молекулярно-клеточные процессы у больных БА противоречивы и механизмы их не ясны

Для решения этих вопросов необходимо комплексное обследование детей с проведением углубленных лабораторных исследований. Однако следует учесть, что в настоящее время в эпидемиологических работах трудно получить материал для прямой оценки молекулярно-клеточных реакций органов-мишеней с использованием инвазивных методов, поэтому усилия исследователей направлены на разработку и верификацию неинвазивных

методов, например, исследование эксфолиативных клеток и доступных биологических жидкостей (слюны, мочи) В ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды разработан и апробируется неинвазивный метод, позволяющий оценить цитогенетический статус, показатели пролиферации и апоптоза при исследовании эксфолиативных клеток буккального эпителия человека [Юрченко с соавт, 2007, Сычева Л П, Журков В С , Рахманин Ю А , Ревазова Ю А, 2007] Информативность этого метода для оценки влияния факторов окружающей среды и характеристики некоторых заболеваний показана в ряде исследований [Сычева Л П и соавт., 2005, Сычева Л П и соавт , 2008, Чистякова В П, 2008] Учитывая данные о повышении уровня хромосомных аберраций в лимфоцитах больных БА [Линцов А Е и соавт 1996, Семенов А В, 2003], мы предположили, что применение нового подхода может быть информативным для оценки клеточных реакций у детей с БА и особенностей влияния на них загрязнения атмосферного воздуха

В связи с этим целью исследования является оценка цитогенетических показателей, показателей пролиферации, апоптоза и местного иммунитета в слизистой рта детей, больных БА, и в группе сравнения, проживающих в условиях загрязнения окружающей среды г Тулы

Для ее достижения сформулированы следующие задачи

1 Определить цитогенетический статус, показатели пролиферации и апоптоза у детей с БА, их изменения в зависимости от периода и тяжести заболевания, провести сравнительный анализ по отношению к контрольной группе детей

2 На основании неинвазивного исследования б^А выделить группы с низким, нормальным и высоким содержанием иммуноглобулина у детей с БА и в группе сравнения Определить уровень кариологических показателей буккального эпителия в зависимости от состояния иммунитета

3 Определить сопряженность цитогенетических показателей, показателей пролиферации и апоптоза между собой и б^А у детей с БА и в группе сравнения для оценки их биологической значимости

4 Провести анализ загрязнения атмосферного воздуха г. Тулы, структуры заболеваемости детей и распространенности БА в зависимости от состояния окружающей среды

5 Определить влияние химического загрязнения атмосферного воздуха на цитогенетический статус и местный иммунитет, показатели пролиферации и апоптоза буккального эпителия у детей, больных БА, и в группе сравнения

Научная новизна Впервые

1 При проведении полного кариологического анализа буккального эпителия установлено, что у детей с атопической БА достоверно повышен уровень цитогенетических нарушений (суммарной доли клеток с микроядрами и протрузиями) и показателей апоптоза Более выраженные изменения отмечены в период обострения и при тяжелом течении заболевания

2 Направленность изменений буккального эпителия соответствует таковой для назального и бронхиального эпителия, выявленной другими исследователями, что свидетельствует об однонаправленных изменениях этих клеточных популяций при БА

3 Установлена зависимость кариологических показателей буккального эпителия детей из группы сравнения от состояния местного иммунитета У детей с низким уровнем б^А повышается частота клеток с цитогенетическими нарушениями на фоне снижения апоптического индекса, что является неблагоприятной тенденцией, характеризующей накопление генетически измененных клеток в популяции

4 В условиях химического загрязнения атмосферного воздуха у детей с БА отмечен более высокий уровень цитогенетических нарушений и показателей апоптоза и низкий уровень в^А, что характеризует их как более уязвимую группу по сравнению со здоровыми детьми

Практическая значимость. Кариологический анализ буккального эпителия, включающий оценку цитогенетического статуса, показателей пролиферации и апоптоза, может быть рекомендован как дополнительный неинвазивный несложный метод морфологического контроля состояния эпителиев воздухоносных путей (в том числе бронхиального) у больных БА Он может быть полезен и для контроля лечения БА, учитывая, что новые методы лечения этого заболевания направлены на коррекцию уровня апоптоза и пролиферации различных клеточных популяций

Материалы исследования использованы при подготовке Методических рекомендаций «Полиорганный кариологический тест для оценки цитогенетического и цитотоксического действия факторов окружающей среды при обследовании людей»

Работа выполнена в ГУ НИИЭЧиГОС им АНСысина РАМН, в лабораториях генетического мониторинга и оценки и прогнозирования здоровья населения в рамках плановых тем «Разработка методологии исследований неинвазивных методов оценки связи «окружающая среда -здоровье человека» (№ госрегистрации 0120403237, 2005-2007), «Разработка полиорганного кариологического теста для оценки цитогенетического и цитотоксического действия факторов окружающей среды при обследовании людей» (№ госрегистрации 0120060335, 2006-2008) Часть исследований

проведена совместно с сотрудниками лаборатории биохимии с группой иммунологии, с отделом санитарно-гигиенического мониторинга Управления Роспотребнадзора по Тульской области и доцентом кафедры аэрологии, охраны труда и окружающей среды Тульского государственно университета д т н, член корр МАН Е А Машинцовым Личный вклад автора - 80%

Апробация работы. Апробация диссертации проведена 17 июня 2008 года на совместном заседании межотдельческой комиссии по апробации докторских и кандидатских диссертаций ГУ НИИ ЭЧиГОС им А Н Сысина РАМН Материалы диссертации доложены и обсуждены на 39-ой научной конференции «Хлопинские чтения» «Здоровье населения в современной среде обитания» (Санкт-Петербург, 2006), научной сессии «Экологические риски здоровью населения на Крайнем севере» (Надым, 2007), III Всероссийском форуме «Здоровье нации - основа процветания России» (Москва, 2007), XII Педиатрическом конгрессе (Москва, 2008), Международном экологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 2 - в центральной печати

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, вывода и списка литературы Текст изложен на 130 страницах машинописи, иллюстрирован 42 таблицами и 27 рисунками Указатель литературы содержит 138 источника, из них 65 отечественных и 73 иностранных авторов

Основные положения, выносимые па защиту:

1. У детей с БА повышен уровень цитогенетических нарушений и апоптоза клеток буккального эпителия Эти изменения более выражены в приступный период и при тяжелом течении БА.

2. На фоне снижения б^А, характеризующего местный иммунитет, повышается уровень цитогенетических повреждений и снижается уровень кариологических показателей апоптоза у детей в группе сравнения

3 В условиях загрязнения атмосферного воздуха отмечается более высокий уровень цитогенетических нарушений и показателей апоптоза, низкий уровень б^А у детей с БА по сравнению с контролем, что характеризует их как более уязвимую группу по сравнению со здоровыми детьми

Материал, методы и объем исследований. В октябре 2005 г. проведено обследование детского населения г Тулы, включавшее анкетирование, обследование детей врачами, приготовление мазков клеток буккального эпителия, взятие слюны для оценки местного иммунитета по уровню б^А

Обследовано 70 детей с атопнческой БА различной тяжести, при различном периоде течения болезни 90 детей, не имеющих хронической воспалительной патологии, патологии органов дыхания и аллергических заболеваний, вошли в группу сравнения (условный контроль)

Распределение детей в группах было сходно по полу и возрасту (8-14 jiei) Для оценки влияния загрязнения атмосферного воздуха на состояние здоровья детей они были подразделены на группы в соответствии с районами проживания Данные по загрязняющим веществам в атмосферном воздухе г Тулы по районам и заболеваемости предоставлены отделом санитарно-гигиенического мониторинга Управления Роспотребнадзора по Тульской области1

Препараты эпителиальных клеток буккального эпителия готовили и анализировали в соответствии с методическими рекомендациями «Оценка цитологического и цитогенетического статуса слизистых оболочек полости носа и рта у человека» (2005) В качестве интегральных показателей цитогенетического действия определяли суммарную долю клеток с микроядрами и протрузиями, пролиферации - сумму клеток с центральной ядерной перетяжкой и двумя и более ядрами, апоптоза - апоптический индекс, который рассчитывали как сумму клеток с кариопикнозом, кариорексисом и кариолизисом [Сычева JIП, 2007]

Количественное определение slgA в слюне человека проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием набора «sIgA-ИФА-БЕСТ» Ранжирование детей с нормальным, низким или высоким уровнем slgA проводили в соответствии с Методическими указаниями (1998) и публикациями Петровой ИВ с соавторами (1998,2001)

На основании проведенных исследований создана база данных по 160 детям, включающая анкетные данные, показатели цитогенетического статуса, пролиферации и апоптоза, концентрацию slgA, район проживания, концентрации веществ, загрязняющий атмосферный воздух и ИЗА по районам По критериям расположения промышленных предприятий, превышения ПДК химических веществ в атмосферном воздухе и с учетом розы ветров Привокзальный район был выделен как более «чистый» район города и Пролетарский район, как более «загрязненный»

Для обработки данных использовались следующие компьютерные программы геоинформационная система Maplnfo Professional 6,5 SCP2, Statistica for Windows 6 0

1 Выряжаем глубокую благодарность отделу санитарно-гигиенического мониторинга Управления Роспотребнадзора по Тульской области и лично Гельштейну Вадиму Соломоновичу и Сухаревой Ирине Валерьевне за предоставленные данные по загрязнению атмосферного воздуха и заболеваемости в г Туле

2 Выражаем глубокую благодарность дтн, член корр MAH Машинцову Евгению Арсеньевичу, доценту кафедры Аэрологии, охране труда и окружающей среды, Тульского Государственно Университета, за предоставленную электронную карту г Тулы и геоииформациоиной системы Maplnfo Professional 6,5 SCP

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Цитогенетический статус, показатели пролиферации и апоптоза у детей в группе сравнения и детей с БА, их изменения в зависимости от периода и тяжести заболевания. У детей с БА повышен уровень цитогенетических нарушений по отношению к группе сравнения (табл 1 1) Суммарная доля клеток с микроядрами и протрузиями достоверно в 1,3 раза выше, чем в группе сравнения Показатели апоптоза клеток буккального эпителия также достоверно выше у детей с БА на 30-45% Показатели пролиферации не отличалась у детей с БА и в группе сравнения

Таблица 1.1.

Цитогенетические показатели, показатели пролиферации и апоптоза

у детей с БА и в группе сравнения (хср ±гп)

Показатели Группа сравнения (90 человек) Бронхиальная астма (70 человек) Р*

Цитогенетические показатели

Доля клеток с микроядрами в %о 0,66±0,09 0,94±0,13 0,0507

Доля клеток с протрузиями в %о 0,99±0,12 1,30±0,21 0,0655

Доля клеток с микроядрами и протрузиями В %о 1,66±0,16 2,22±0,27 0.0109

Доля клеток с ядром атипичной формы В °/оо 0,66±0,11 0,89±0,17 0,0965

Показатели пролиферации

Доля клеток с двумя ядрами в %о 4,32±0,25 4,59±0,31 0,4073

Доля клеток с тремя ядрами в %о 0,10±0,03 0,07±0,03 0,5444

Доля клеток с центральной перетяжкой ядра в %о 1,33±0,13 1,33±0,14 0,9777

Сумма всех клеток с двумя и более ядрами в %о 5,76±0,31 6,0010,35 0,5444

Показатели деструкции ядра

Доля клеток с кариопикнозом в %о 1,34±0,15 1,94±0,27 0,0025

Доля клеток с кариорексисом в %о 3,86±0,41 5,44±0,7 0.0000

Доля клеток с кариолизисом в %о 5,76±0,61 б,95±0,62 0.0031

Апоптический индекс в %о 11,0±0,87 14,3±1,21 0,0000

-и--1---1 ---- 1 -

Примечание *Р- достоверные отличия между группами по % , Р<0,01 подчеркнуто

Более выраженные изменения отмечены в период обострения (табл 1 2) и при тяжелом течении (табл 1 3 ) заболевания Но и при легком течении БА в периоде ремиссии отмечено достоверное повышение в 1,6 раза суммарной частоты клеток с цитогенетическими нарушениями и в 1,3 раза апоптического индекса

Кариологические показатели клеток буккального эпителия у детей с бронхиальной астмой _в период ремиссии и обострения и в группе сравнения__

Показатели Период ремиссии (38 чел) Период обострения (32 чел) Группа сравнения (90 чел)

Цитогенетические показатели (х сп±ш)

Доля клеток с микроядрами в %о 1,04±0,19а 0,81±0,18 0,66±0,0 9

Доля клеток с протрузиями в %о 1,11 ±0,22 1,51±0,39а 0,99±0,12

Доля клеток с микроядрами и протрузиями В%0 2,12±0,33 2,33±0,45а 1,66±0,16

Доля клеток с атипичным ядром в %о 0,78±0,16 1,01 ±0,32 0,66±0,11

Показатели пролиферации

Доля клеток с центральной перетяжкой ядра в %0 1,4±0,20 1,24±0,20 1,33±0,13

Доля клеток с двумя ядрами в %> 4,88±0,45 4,27±0,42 4,32±0,25

Доля клеток с тремя ядрами в %о 0,08±0,04 0,06±0,04 0,1±0,03

Сумма всех клеток с двумя и более ядрами В%0 6,36±0,50 5,57±0,50 5,76±0,31

Показатели деструкции ядра

Доля клеток с кариопикнозом в %о 1,99±0,35а 1,89±0,43а 1,34±0,15

Доля клеток с кариорексисом в %0 4,06±0,52 7,08±1,36а'6 3,86±0,41

Доля клеток с кариолизисом в %о 7,09±0,9Г 6,78±0,84а 5,76±0,61

Апоптический индекс в %о 13,1±1,34а 15,8±2,10а'6 11,0±0,87

а - достоверно отличается от группы сравнения, Р<0,05 б - достоверно отличается от группы ремиссии, Р<0,05

Наркологические показатели клеток буккального эпителия у детей

_в зависимости от тяжести течения бронхиальной астмы__

Показатели Легкое течение (15 чел) Среднетяжелое течение (48 чел) Тяжелое течение (7 чел) Группа сравнения (90чел)

Цитогенетические показатели (х „ ±т)

Доля клеток с микроядрами в %о 1,41±0,37а 0,68±0,12ь 1,7^0,47^ 0,66±0,09

Доля клеток с протрузиями в %о 1,33±0,42 1,24±0,27 1,57±0,57 0,99±0,12

Доля клеток с микроядрами и протрузиями в %о 2,68±0,67а 1,91±0,32 3,29±0,57а'в 1,66±0,16

Доля клеток с атипичным ядром в %о 0,64±0,25 0,97±0,23 0,86±0,40 0,66±0,11

Показатели пролиферации (х ср ±ш)

Доля клеток с центральной перетяжкой ядра в %о 1,28±0,31 1,33±0,17 3,71±0,60 1,30±0,13

Доля клеток с двумя ядрами в %о 5,4±0,62 4,78±0,40 0 4,32±0,25

Доля клеток с тремя ядрами в %о 0,13±0,09 0,06±0,04 1,43±0,57 0,10±0,03

Сумма всех клеток с двумя и более ядрами в %о 6,81±0,59 5,94±0,46 5,14±0,91 5,76±0,31

Показатели деструкцией ядра (х ср±т)

Доля клеток с кариопикнозом в %а 1,7±0,38 2,11±0,37 а'6 1,29±0,52 1,34±0,15

Доля клеток с кариорексисом в %о 4,57±0,93 5,76±0,97а 5,14±1,39 3,86±0,41

Доля клеток с кариолизисом в %о 7,59±1,35а 6,89±0,803 6,00±1,07 5,76±0,61

Апоптический индекс в %о 13,9±1,92а 14,76±1,613 12,4±2,80 11,0±0,87

а - достоверно отличается от группы сравнения, Р<0,05 б - достоверно отличается от легкого течения, Р<0,05 в — достоверно отличается от среднетяжелого течения, Р<0,05

Наши данные подтверждаются исследованиями, полученными на других клеточных популяциях Уровень цитогенетических нарушений в лимфоцитах у больных БА при легком течении был в 1,8 раза выше, чем в группе сравнения, а при усугублении тяжести заболевания выявлены более выраженные нарушения [Семенов А В , 2003, Линцов А Е с соавт, 1996] У больных БА отмечено повышение ДНК-поврсждсний назальных эпителиоцитов [БоЛои1 ТI й а1, 2003] Апоптоз лимфоцитов периферической крови также повышен [Оггедогсгук I й а1, 2002], возможно, как ответ на повреждение ДНК Висс1пеп Б с соавторами (2002) полагают, что повреждение бронхиального эпителия больных БА и потеря цилиндрических эпителиальных клеток происходит благодаря апоптозу ТгаШтапп А с соавторами (2002) показали, что, бронхиальные эпителиальные клетки больных БА подвергаются цитокин-индуцированному апоптозу, характеризующемуся фрагментацией ДНК и морфологическими признаками апоптоза, и этот процесс опосредован Т-лимфоцитами и эозинофилами

2. Анализ 51ёА у детей с БА и в группе сравнения. Кариологические показатели буккального эпителия у детей с нормальным, низким и высоким уровнем з^А. При определении концентрации б^А в слюне выявлено, что в общей группе детей с БА данный показатель в два раза ниже, чем в контроле (249,77±25,42 и 529,09±39,98 соответственно, табл 2 1) Этот показатель также в 2 - 4 раза ниже в группах детей с различным периодом и течением болезни по отношению к группе сравнения Такое снижение отмечают и другие исследователи [Ва1гаг Б й а1, 2006] Предполагают, что при БА воспаление в слизистой бронхов обуславливает дефект местной защиты и нарушение местного синтеза э1§А [Саликова Ю О с соавт, 2000 РикивЬтаС е1 а1,2005]

Таблица 2 1.

Средние концентрации б^А в слюне у детей в сравниваемых группах

Количество Содержание

Группы обследованных в^А

детей (Хер±т)

Группа сравнения 90 529,09±39,98

Дети с БА, из них- 69 249,77±25,42а

легкое течение, ремиссия 14 143,93±27,70а

среднетяжелое течение, ремиссия 24 245,62±34,41а

среднетяжелое течение, обострение 24 320,28±55,62а

тяжелое течение, обострение 7 231,67±74,00а

а - достоверные отличия от группы сравнения по Манна-Уитни (Р<0,05)

Таблица 2 2

Кариологические показатели в группе здоровых детей __с разным уровнем __

Показатели Дети с низким уровнем б^А (18 человек) Дети с нормальным уровнем э^А (21 человек) Дети с высоким уровнем (51 человек)

Цитогенетические показатели (х ср ±ш)

Доля клеток с микроядрами в %о 0,67±0,18 0,69±0,21 0,65±0,12

Доля клеток с протрузиями В %о 1,63±0,32а 0,83±0,17 0,83±0,15

Доля клеток с микроядрами и протрузиями В %о 2,31±0,41 1,52±0,24 1,47±0,2

Доля клеток с атипичным ядром В %о 0,8б±0,29 0,7б±0,24 0,54±0,13

Показатели пролиферации

Доля клеток с центральной перетяжкой ядра В %о 1,45±0,34 1,18±0,18 1,35±0,17

Доля клеток с двумя ядрами в %о 4,74±0,42 4,5±0,51 4,1±0,35

Доля клеток с тремя ядрами в %о 0,22±0,1 0,1±0,06 0,07±0,04

Сумма всех клеток с двумя и более ядрами в %а 6,42±0,68 5,78±0,б 5,52±0,42

Показатели деструкции ядра

Доля клеток с кариопикнозом в %0 1,33±0,29 1,48±0,3б 1,28±0,19

Доля клеток с кариорексисом в %0 2,53±0,5а 4,88±1,22 3,91 ±0,48

Доля клеток с кариолизисом в %а 6,02±1,72 б,8±1,31 5,25±0,71а

Апоптический индекс в %о 9,89±1,91а 13,1б±2,07 10,43±1,09а

а - достоверно отличается от нормального уровня, Р<0,05

Для оценки зависимости кариологических показателей от состояния местного иммунитета дети из группы сравнения были подразделены на три подгруппы с нормальным, низким и высоким уровнем б1§А В каждой подгруппе детей определяли средние значения цитогенетических показателей, показателей пролиферации и апоптоза Оказалось, что в подгруппе детей со сниженной концентрацией в^А уровень цитогенетических нарушений буккального эпителия (доли клеток с

протрузиями) был достоверно выше, чем в подгруппе детей с нормальной концентрацией б^А (табл 2 2) Эта закономерность подтверждается достоверной обратной связью между уровнем б^А и цитогенетическими нарушениями, которая выявлена при корреляционном анализе Подобная тенденция выявлена НеггБйот Р С соавторами (1998) при анализе зависимости между частотой В-лимфоциюв с микроядрами и й^А

3. Сопряженность цнтогенетических показателей, показателей пролиферации и апоптоза между собой и б^А у детей с бронхиальной астмой и в группе сравнения. В ходе исследования установлена слабая значимая связь между цитогенетическими показателями микроядрами и протрузиями (11=0,17, Р=0,034), микроядрами и атипичной формой ядра (11=0,22, Р=0,005), протрузиями и атипичной формой ядра (11=0,26, Р=0,001) Связь средней силы выявлена при анализе суммы клеток с микроядрами и протрузиями и атипичной формой ядра (11=0,32, Р<0,000)

Корреляционный анализ выявил связи между цитогенетическими показателями и показателями пролиферации (увеличения плоидности) микроядрами и двуядерными клетками (11=0,21, Р=0,009), микроядрами и суммой клеток с двумя и более ядрами (11=0,25, Р=0,002), протрузиями и клетками с центральной перетяжкой ядра (11=0,21, Р=0,009) Более высокая корреляция отмечена между интегральными показателями этих двух групп суммой клеток с микроядрами и протрузиями и суммой клеток с двумя и более ядрами (11=0,25, Р=0,001) Эти корреляции показывают, что формирование ядер атипичной формы, ядер с центральной перетяжкой, двуядерных клеток, по-видимому, осуществляется по тем же механизмам, что и микроядер и протрузий при повреждении как ДНК, так и белков веретена деления

Показатели деструкции ядра также коррелируют между собой кариорексис и кариопикноз (11=0,24, Р=0,003), кариорексис и кариолизис (11=0,39, Р<0,000)

В целом следует отметить две важные закономерности Во-первых, корреляционные связи обосновывают корректность группирования показателей и, во-вторых, указывают, что показатели, условно называемые показателями пролиферации в какой-то степени, как и цитогенетические, могут отражать повреждающее действие на аппарат деления клетки [Сычева Л П, 2007] Увеличение доли двуядерных клеток и суммы клеток с двумя и более ядрами происходит на завершающей стадии клеточного деления при нарушении цитотомии Сдвоенные ядра образуются при разрушении белков веретена деления, что приводит к незавершенной кариотомии Один из механизмов образования микроядер также связан с нарушением веретена деления, вследствие чего часть хромосом не попадает в основное ядро и формирует дополнительное маленькое ядро в клетке Можно предположить, что химические вещества оказывают повреждающее действие на различные клеточные белки, а частично, и ДНК, в целом оказывая цитотоксическое

действие с различными неблагоприятными последствиями для здоровья ребенка

4. Влияние загрязнения атмосферного воздуха г. Тулы на кариологические и иммунологические показатели у здоровых детей и детей с БА. Четвертая и пятая задачи направлены на оценку влияния загрязнения атмосферного воздуха г Тулы на исследуемые показатели здоровых и больных БА детей В промышленном центре России город Тула -один из самых индустриально развитых городов По степени суммарной техногенной нагрузки в Центральной России город Тула уступает только Москве и Московской области

Город разделен на 5 районов Зареченский, Привокзальный, Пролетарский, Советский и Центральный В Туле преобладают западные ветра Основными источниками загрязнения окружающей среды являются предприятия черной металлургии, суммарный вклад которых по объему выбросов составляет 72%, и 28% приходится на автотранспорт Большая часть предприятий расположена в Пролетарском районе Именно здесь расположен АК "Тулачермет", вклад которого в выбросы от стационарных источников составляет 86,3% [Госдоклад, 2002]

Среднесуточные концентрации загрязняющих веществ в воздухе по районам города, усредненные за 5 лет (с 1999 по 2003 г), предоставлены отделом санитарно-гигиенического мониторинга Управления Роспотребнадзора по Тульской области Во всех районах города в этот период определяли концентрацию 13 веществ

В основном, концентрация веществ в атмосферном воздухе варьировала в пределах ПДК Однако во всех 5 районах города отмечено двух-трехкратное превышение ПДКс0 по формальдегиду, а в Зареченском, Пролетарском и Центральном районах превышение ПДКСС по аммиаку в 1,31,9 раза В Советском районе отмечено превышение ПДКСС по пыли в 1,1 раза и сероводороду в 1,3 раза Превышение максимально-разовых ПДК отмечено в Пролетарском районе по взвешенным веществам, аммиаку и диоксиду серы, в Советском районе по формальдегиду, взвешенным веществам, оксиду углерода, в Центральном и Привокзальном районах по взвешенным веществам В указанный период времени концентрации химических веществ и их соотношение по районам варьировали незначительно, поэтому можно предполагать, что эти же концентрации веществ характерны для периода обследования детей

По данным отдела санитарно-гигиенического мониторинга Управления Роспотребнадзора по Тульской области первое место по заболеваемости принадлежит патологии органов дыхания (1140,2%о) Следует отметить, что среди этой патологии ведущее место занимает Б А (16,2%о) Кроме того, в Привокзальном районе заболеваемость детского населения г Тулы в 20032004 году не менялась, а 2005 не было зарегистрировано не одного нового случая БА Тогда как, в Пролетарском районе в течение этих трех лет отмечено удвоение новых случаев БА (рис 4 1)

J

о

^ 1 I J

ЖиЗ.. I -Г/

2003r

2004r

2005Г

Рис 4 1. Заболеваемость БА в %> в Привокзальном (столбики с косой штриховкой) и Пролетарском (столбики с вертикальной штриховкой) районах г Тулы

В группе здоровых детей, проживающих в Пролетарском районе, цитогенетические показатели и показатели пролиферации были достоверно выше, а показатели апоптоза достоверно снижены, чем у детей Привокзального района (табл 41), что свидетельствует о нарушениях клеточной кинетики, при которых снижается удаление генетически неполноценных клеток

У детей с БА в Пролетарском районе отмечено значительное в 1,98 раза повышение уровня цитогенетических нарушений при невысоком (в 1,38 раза), но значимом повышении апоптического индекса (табл 4 2) по сравнению с детьми Привокзального района Относительный риск развития цитогенетических нарушений у здоровых детей в загрязненном районе составляет 2,4, у детей с БА - 1,97, при этом наиболее высокие уровни цитогенетических показателей и апоптоза отмечены в группе детей с БА, проживающих в загрязненном районе

Причиной этих изменений может быть повышенная чувствительность эпителиальных клеток больных БА к действию химических веществ Об этом свидетельствует исследование in vitro эпителиальных бронхиальных клеток, в котором показана более высокая чувствительность клеток больных БА к действию Н2О2, индуцирующей апоптоз, по сравнению с клетками контрольных людей Эти данные показывают, что чувствительность бронхиального эпителия астматиков к оксидантам выше, чем в контроле Считают, что в связи с этим возможно повышение частоты случаев или приступов астмы, связанных с загрязнением воздуха [Bucchien F et al, 2002]

В Пролетарском районе у здоровых детей отмечено достоверное снижение концентрации slgA в слюне, характеризующего снижение местного иммунитета, по сравнению с Привокзальным районом Вещества,

загрязняющие атмосферный воздух, по-видимому, могут повреждать эпителий воздухоносных путей и нарушать процессы синтеза б^А, снижая местную иммунную защиту и индуцируя воспалительный процесс [Напс1ге1 г Т., 2000, Беляева Н Н , 2001]

Вторым подходом к оценке влияния загрязнения атмосферного воздуха на показатели цитогенетического статуса, пролиферации, апоптоза и местного иммунитета было применение непараметрического корреляционного анализа Спирмена Анализ позволил выявить ряд невысоких, но достоверных корреляций между кариологическими показателями и концентрацией отдельных химических загрязнений атмосферного воздуха, причем взаимосвязи отмечены даже в отсутствии превышения ПДК.

В группе здоровых детей выявлена корреляционная связь цитогенетических показателей с загрязнением атмосферного воздуха аммиаком (11=0,24, Р=0,023), что, по-видимому, связано не с самим веществом, а с воздействием продуктов его трансформации

Увеличение количества двуядерных клеток в буккальном эпителии, косвенно отражающих пролиферативные процессы в ткани, отмечено при повышении в атмосферном воздухе концентрации таких веществ как диоксид серы (11=0,25, Р=0,019), свинец (11=0,25, Р=0,019) и формальдегид (11=0,22, Р=0,034)

У детей с БА выявлена корреляция доли клеток с центральной перетяжкой ядра с концентрацией сажи (11=0,26, Р=0,031) и, также, как и в группе здоровых детей, с диоксидом серы (11=0,24, Р=0,043) Показатели апоптоза (кариопикноз) у детей с БА связаны с загрязнением атмосферного воздуха фенолом (11=0,24, Р=0,043)

Уровень у здоровых детей прямо пропорционально коррелирует с загрязнением атмосферного воздуха ацетоном (11=0,29, Р=0,006), бензолом (11=0,28, Р=0,007), сероводородом (11=0,26, Р=0,013) и обратно пропорционально с аммиаком (11=- 0,28, Р=0,007)

Уровень б^А у детей с БА связан с загрязнением атмосферного воздуха диоксидом азота (11=0,29, Р=0,014), оксидом углерода (11=0,31, Р=0,009), аммиаком (11=0,33, Р=0,006), формальдегидом (Я= -0,28, Р=0,018), фенолом (11= -0,33, Р=0,005), сероводородом (Я= -0,33, Р=0,005), ацетоном (Я= -0,24, Р=0,048), диоксидом серы (Я= -0,31, Р=0,009), бензолом (11= -0,33, Р=0,005), метилбензолом (11= -0,29, Р=0,017)

Таблица 4 1

Кариологические показатели буккального эпителия у здоровых детей по районам_

Показатели Зареченский район (16 чел) Привокзальный район (12 чел) Пролетарский район (32 чел) Советский район (20 чел) Центральный район (10 чел)

Цитогенетические показатели (х с0±ш)

Доля клеток с микроядрами в %о 0,81±0,19а 0,08±0,08 0,89±0,17а 0,7±0,2 а 0,33±0,17

Доля клеток с протрузиями в %о 1,19±0,33 0,67±0,26 0,91±0,19 1,1 ±0,24 1,11 ±0,41

Доля клеток с микроядрами и протрузиями в %о 2,00±0,38а 0,75±0,3 1,8±0,29а 1,8±0,32 " 1,44±0,4

Доля клеток с атипичным ядром в %о 0,812±0,31а 0,16±0,11 0,71±0,21а 0,55±0,17 1,03±0,3а

Показатели пролиферации

Доля клеток с центральной перетяжкой ядра в %о 1,44±0,3 0,92±0,35 1,49±0,2 1,35±0,25 1,12±0,45

Доля клеток с двумя ядрами в %о 3,5±0,52 3,66±0,48 5,23±0,43а 3,75±0,58 4,68±0,54

Доля клеток с тремя ядрами в %о 0,19±0,1 0 0,1±0,06 0,1 ±0,07 0,1 ±0,1

Сумма всех клеток с двумя и более ядрами в %о 5,12±0,67 4,58±0,53 6,82±0,54а 5,2±0,69 5,9±0,91

Показатели деструкции ядра

Доля клеток с кариопикнозом в %о 1,06±0,27 1,08±0,29 1,53±0,28а 1,45±0,37а 1,23±0,46

Доля клеток с кариорексисом в %о 2,63±0,76а 5,25±1,2 3,57±0,6 а 3,45±0,73 а 5,92±1,99

Доля клеток с кариолизисом в %о 4,68±0,9 5,92±2,16 4,33±0,69а 7,45±1,57 8 49±2,41 а

Апоптический индекс в %о 8,38±1,27а 12,25±2,5 9,44±1,24а 12,35±1,96 15,64±4,01 а

а - достоверно отличается от Привокзального района, Р<0,05

Таблица 4 2

Кариологические показатели буккального эпителия у детей с БА по районам _

Показатели Зареченский район (15 чел) Привокзальный район (8 чел) Пролетарский район (23 чел) Советский район (8 чел) Центральный район (16 чел)

Цитогенетические показатели (х со±т)

Доля клеток с микроядрами в %о 0,8±0,26 0,53±0,2 1,26±0,3 0,37±0,18 1,07±0,19

Доля клеток с протрузиями В %а 0,87±0,23 0,91 ±0,48 1,63±0,54 1,12±0,35 1,49±0,36

Доля клеток с микроядрами и протрузиями В %о 1,66±0,35 1,44±0,61 2,85±0,68 а 1,5±0,4 2,59±0,42

Доля клеток с атипичным ядром в %о 0,96±0,26 0,5±0,26 1,03±0,45 0,88±0,29 0,81±0,25

Показатели пролиферации

Доля клеток с центральной перетяжкой ядра в %о 1,2±0,24 1,56±0,54 0,99±0,21 1,25±0,25 1,88±0,39

Доля клеток с двумя ядрами в %о 3,07±0,47а 5,16±1,2 4,65±0,56 4,5±0,65 5,73±0,6б

Доля клеток с тремя ядрами в %> 0,13±0,09 0 0,09±0,06 0 0,06±0,06

Сумма всех клеток с двумя и более ядрами в %о 4,4±0,57 6,73±1,36 5,72±0,58 5,75±0,79 а 7,68±0,75

Показатели деструкции ядра

Доля клеток с кариопикнозом в %а 2,59±0,8б 1,63±0,5 1,16±0,26 2,13±0,93 2,53±0,59

Доля клеток с кариорексисом в %о 4,67±1,46 3,48±0,82 5,9±1,31 а 5,75±0,56 а 6,2±2,0 а

Доля клеток с кариолизисом в %о 8,42±1,5а 4,94±1,31 6,71±1,11 7,0±2,04 6,89±1,25

Апоптический индекс в %а 15,68±3,35 а 10,04±1,9б 13,8б±2,12а 14,88±2,86а 15,64±2,51а

а — достоверно отличается от Привокзального района, Р<0,05

В работе Richter J et al (1996) показано, что у детей, изначально проживающих в условиях загрязнения атмосферного воздуха, повышен уровень slgA и лизоцима в слюне Однако через две недели после переезда в более чистый район наблюдается нормализация повышенных иммунологических показателей В то же время в работе Мизерницкого Ю JI (2002) выявлено снижение slgA у детей дошкольного возраста, проживающих в условиях интенсивного загрязнения окружающей среды древесной пылью и формальдегидом Таким образом, загрязнение окружающей среды может вызывать как повышение slgA, что скорей всего является компенсаторной реакцией, так и его снижение в слюне в результате повреждающего действия поллютантов атмосферного воздуха, приводящего к нарушению местной защиты слизистых [Handzel Z Т, 2000]

В пяти районах г Тулы определены близкие значения ИЗА1Э варьирующие в пределах 7,77-8,79 Не выявлено корреляций ИЗА с кариологическими показателями или уровнем slgA у обследованных детей

Таким образом, оба подхода показали выраженное влияние химических загрязнений атмосферного воздуха на исследованные показатели, отражающее цитотоксическое и цитогенетическое действие этих загрязнений на организм ребенка, что по-видимому, является одной из причин высокой бронхо-легочной заболеваемости детей г Тулы

ВЫВОДЫ

1. Впервые при проведении полного кариологического анализа буккального эпителия у детей с БА установлено статистически значимое повышение уровня цитогенетических нарушений на 34% и апоптического индекса на 30% по сравнению с показателями в контрольной группе Эти изменения более выражены у детей в период обострения (повышение на 40% и на 44% соответственно) и, особенно, у детей с тяжелым течением БА (повышение на 98% и 13 %) по отношению к контролю

2 Показано, что среди детей с БА преобладают дети с низким уровнем slgA, отражающим состояние местного иммунитета Средняя концентрация slgA в группе детей с БА в 2,1 раза ниже, чем в группе сравнения (249,77±24,42 мг/л и 529,09±40,0 мг/л соответственно, Р<0,05)

3 Впервые выявлена зависимость кариологических показателей буккального эпителия от состояния местного иммунитета В группе условно здоровых детей с низким уровнем slgA отмечено повышение доли клеток буккального эпителия с цитогенетическими нарушениями (1,63±0,32%о при низком уровне slgA против 0,83±0,17%о при нормальном уровне, Р<0,05) на фоне снижения апоптического индекса (9,89±1,91%о при

низком уровне против 13,16±2,07%о при нормальном уровне, Р<0,05) У детей с БА, имеющих высокий уровень slgA, отмечено повышение частоты клеток с атипичной формой ядра в 2,1 раза, а при низком уровне увеличение частоты клеток с двумя и более ядрами в 1,3 раза.

4 Выявлено влияние загрязнения атмосферного воздуха г Тулы на детей с БА и в группе сравнения.

- У детей с БА в «загрязненном районе» достоверно повышен уровень цитогенетических нарушений и апоптический индекс У детей из группы сравнения достоверно повышен уровень цитогенетических показателей и показателей пролиферации на фоне снижения апоптического индекса

- Относительный риск развития цитогенетических нарушений в «загрязненном» районе по отношению к «чистому» составляет 2,4 у здоровых детей и 1,97 у детей с БА, при этом наиболее высокие уровни цитогенетических показателей и апоптоза отмечены в группе детей с БА, проживающих в «загрязненном» районе

- У здоровых детей выявлено достоверное снижение (на 70%) уровня секреторного иммуноглобулина в «загрязненном» районе У больных БА в обоих районах уровень иммуноглобулина был приблизительно одинаковым, но значительно ниже (в 2-4 раза), чем в контрольной группе детей

5 Дети, больные БА являются более уязвимой группой по сравнению со здоровыми детьми при воздействии загрязнения атмосферного воздуха, что выражается в более высоком уровне цитогенетических нарушений и показателей апоптоза и наиболее низком уровне slgA.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Беляева Н Н , Сычева JIП , Коваленко М А , Шереметьева С.М, Алтаева А А , Олесинов А А , Александрова В П, Пономарева О Ю, Бяхова М М., Юрченко В В Необходимость использования морфофункциональных и цитогенетических исследований при анализе воздействия на организм факторов окружающей среды. //Гигиена и санитария - 2007 - №5. - С 63-65.

2 Бяхова М М, Сычева Л П, Ревазова Ю А , Соболев В А, Машинцов Е А Апоптоз и цитогенетические нарушения в эпителии детей, больных бронхиальной астмой //Вестник Российской Военно-медицинской Академии Приложение 2 часть 1 - 2008 - №3(23) - С 35-36

3 Бяхова М М, Сычева Л П, Земляная Г М Исследование кариологических показателей буккального эпителия у детей, больных бронхиальных астмой, проживающих в условиях загрязнения окружающей среды г Тулы //Здоровье населения в среде обитания. Материалы XXXIX научной конференции Хлопинские чтения. Под. Ред А П Щербо - С -П - 2006 - С 84-86

4 Бяхова М М. Анализ кариологических показателей у детей с бронхиальной астмой и в группе сравнения в г Туле //Материалы II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» - 29 мая - 1 июня 2007г ,-г. Рязань - С 13-14

5 Сычева Л П , Коваленко М А, Бяхова М М , Стацук Т А, Алтаева А А. Оценка цитогенетического статуса человека с использованием неинвазивного микроядерного метода //В кн "Экологические риски здоровью населения на Крайнем Севере" Материалы научной сессии Надым, 25 апреля2007 - Изд-во Сибпресс -Тюмень - С 127-130

6 Ревазова Ю А, Сычева Л П , Журков В С , Жученко Н А , Субботина Т И , Бяхова М М , Коваленко М А Генетические и цитогенетические аспекты донозологической диагностики эколого-зависимой патологии у детей //Сборник материалов XII Конгресса педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии» Москва, 19-22 февраля 2008 — С 508

Бяхова Мария Михайловна ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ СТАТУС, ПОКАЗАТЕЛИ ПРОЛИФЕРАЦИИ И АПОПТОЗА У ДЕТЕЙ С БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ, ПРОЖИВАЮЩИХ В УСЛОВИЯХ ЗАГРЯЗНЕНИЯ АТМОСФЕРНОГО ВОЗДУХА

Автореферат

Подписано в печать 11 08 2008 г

Формат 60x84/16 Уч изд л 1 0

Тираж 100 экз Заказ № 3 2

Издательско-полиграфическое отделение ФГУП «ЦНИИАТОМИНФОРМ» 127434, Москва, а/я 971

Загрязнение окружающей среды вносит существенный вклад в ухудшение состояния здоровья населения, и особенно, наиболее уязвимых групп: детей, людей пожилого возраста. Особого внимания требуют дети, больные бронхиальной астмой. В последние время во всем мире отмечается рост распространенности и тяжести бронхиальной астмы у детей, манифестация болезни в более раннем возрасте [Чучалин А.Г., 2000, Мизерницкий Ю.Л., 2002]. В нашей стране, по официальным данным, число детей и подростков, больных бронхиальной астмой, превышает четверть миллиона человек. Одной из причин роста заболеваемости считается влияние факторов окружающей среды, особенно загрязнение атмосферного воздуха [Пинигин М.А., Сабирова З.Ф., Тепикина Л.А. и др., 2005], в связи с чем бронхиальную астму относят к экологически зависимым заболеваниям. Важную роль в развитии атопической бронхиальной астмы играют воздействия аллергенов как внутри жилища, так и вне его [Дрожжев М.Е. с соавт., 2002]. В ряде исследований показано увеличение частоты случаев бронхиальной астмы в условиях загрязнения атмосферного воздуха [Говалова С.М., 1997, Brauer М., 2007, Sun H.L., 2006], и, особенно, увеличение частоты приступов при значительных выбросах загрязняющих веществ [Новиков CJVI. с соавт., 2003; Новиков С.М. с соавт., 2001]. Однако в настоящее время нет достаточно точного объяснения механизмов такого влияния.

По современным представлениям атопическая бронхиальная астма (далее — БА) является воспалительным заболеванием дыхательных путей, пусковым сигналом которого является реакция иммунокомпетентрых клеток на аллергены [Чучалин А.Г., 2000, Богданова А.В. с соавт., 2005]. При воспалении наблюдается макрофагальная реакция и оксидантный стресс, дисбаланс которых оказывает прямое негативное действие на различные отделы бронхолегочной системы [White S.R. et al., 2002, Bumbacea d. et al., 2004]. По-видимому, химические загрязнения атмосферного воздуха усугубляют эти процессы, однако, в настоящее время данные о воздействии химических загрязнений атмосферного воздуха на молекулярно-клеточные процессы у больных Б А противоречивы и механизмы их не ясны.

Для решения этих вопросов необходимо комплексное обследование детей с проведением углубленных лабораторных исследований. Однако следует учесть, что в настоящее время в эпидемиологических работах трудно получить материал для прямой оценки молекулярно-клеточных реакций органов-мишеней с использованием инвазивных методов, поэтому усилия исследователей направлены на разработку и верификацию неинвазивных методов, например,' исследование эксфолиативных клеток и доступных биологических жидкостей (слюны, мочи). В ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды разработан и апробируется неинвазивный метод, позволяющий оценить цитогенетический статус, показатели пролиферации и апоптоза при исследовании эксфолиативных клеток буккального эпителия человека [Юрченко с соавт., 2007; Сычева Л.П., Журков B.C., Рахманин Ю.А., Ревазова Ю.А., 2007]. Информативность этого метода для оценки влияния факторов окружающей среды и характеристики некоторых заболеваний показана в ряде исследований [Сычева Л.П.и соавт., 2005; Сычева Л.П.и соавт., 2008; Чистякова В.П., 2008]. Учитывая данные о повышении уровня хромосомных аберраций в лимфоцитах больных БА [Линцов А.Е. и соавт. 1996; Семенов А.В., 2003], мы предположили, что применение нового подхода может быть информативным для оценки клеточных реакций у детей с БА и особенностей влияния на них загрязнения атмосферного воздуха.

В связи с этим целью исследования является оценка цитогенетических показателей, показателей пролиферации, апоптоза и местного иммунитета в слизистой рта детей, больных БА, и в группе сравнения, проживающих в условиях загрязнения окружающей среды г. Тулы.

Для ее достижения сформулированы следующие задачи:

1. Определить цитогенетический статус, показатели пролиферации и апоптоза у детей с БА, их изменения в зависимости от периода и тяжести заболевания, провести сравнительный анализ по отношению к контрольной группе детей.

2. На основании неинвазивного исследования slgA выделить группы с низким, нормальным и высоким содержанием иммуноглобулина у детей с БА и в группе сравнения. Определить уровень кариологических показателей буккального эпителия в зависимости от состояния иммунитета.

3. Определить сопряженность цитогенетических показателей, показателей пролиферации и апоптоза между собой и slgA у детей с БА и в группе сравнения для оценкк их биологической значимости.

4. Провести анализ загрязнения атмосферного воздуха г. Тулы, структуры заболеваемости детей и распространенности БА в зависимости от состояния окружающей среды.

5. Определить влияние химического загрязнения атмосферного воздуха на цитогенетический статус и местный иммунитет, показатели пролиферации и апоптоза буккального эпителия у детей, больных БА, и в группе сравнения. Научная новизна. Впервые

1. При проведении полного кариологического анализа буккального эпителия установлено, что i у детей с БА достоверно повышен уровень цитогенетических нарушений (суммарной доли клеток с микроядрами и протрузиями) и показателей апоптоза. Более выраженные изменения отмечены в период обострения и при тяжелом течении заболевания.

2. Направленность изменений буккального эпителия соответствует таковой для назального и бронхиального эпителия, выявленной другими исследователями, что свидетельствует об однонаправленных изменениях этих клеточных популяций при БА.

3. Установлена зависимость кариологических показателей буккального эпителия детей из группы сравнения от состояния местного иммунитета. У. детей с низким • уровнем slgA повышается частота клеток с цитогенетическими нарушениями на фоне снижения апоптического индекса, что является неблагоприятной тенденцией, характеризующей накопление генетически измененных клеток в популяции.

В условиях химического загрязнения атмосферного воздуха у детей с БА отмечен более высокий уровень цитогенетических нарушений и показателей апоптоза и низкий уровень slgA, что характеризует их как более уязвимую группу по сравнению со здоровыми детьми.

Практическая значимость. Кариологический анализ буккального эпителия, включающий оценку цитогенетического статуса, показателей пролиферации и апоптоза, может быть рекомендован как дополнительный неинвазивный несложный метод морфологического контроля состояния эпителиев воздухоносных путей (в том числе бронхиального) у больных Б А. Он может быть полезен и для контроля лечения БА, учитывая, что новые методы лечения этого заболевания направлены на коррекцию уровня апоптоза и пролиферации различных клеточных популяций.

Материалы исследования использованы при подготовке Методических рекомендаций «Полиорганный кариологический тест для, оценки цитогенетического и цитотоксического действия факторов окружающей среды при обследовании людей».

Работа выполнена в ГУ НИИЭЧиГОС им А.Н.Сысина РАМН, в лабораториях генетического мониторинга и оценки и прогнозирования здоровья населения в рамках плановых тем «Разработка методологии исследований неинвазивных методов оценки связи «окружающая среда -здоровье человека» (№ госрегистрации 0120403237, 2005-2007); «Разработка полиорганного кариологического теста для оценки цитогенетического и цитотоксического действия факторов окружающей среды при обследовании людей» (№ госрегистрации 0120060335, 2006-2008). Часть исследований проведена совместно с сотрудниками лаборатории биохимии^ с группой иммунологии, с отделом социально-гигиенического мониторинга

Управления Роспотребнадзора по Тульской области и доцентом кафедры аэрологии, охраны труда и окружающей среды Тульского государственно университета д.т.н., чл.-корр. МАНЭБ Е.А. Машинцовым.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 39-ой научной конференции «Хлопинские чтения» «Здоровье населения в современной среде обитания» (Санкт-Петербург, 2006); научной сессии «Экологические риски здоровью населения на Крайнем севере» (Надым, 2007); III Всероссийском форуме «Здоровье нации - основа процветания России» (Москва, 2007); XII Педиатрическом конгрессе (Москва, 2008); Международном экологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, из них 2 - в центральной печати.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, вывода и списка литературы. Текст изложен на 130 страницах машинописи, иллюстрирован 42 таблицами и 27 рисунками. Указатель литературы содержит 138 источника, из них 65 отечественных и 73 иностранных авторов.

выводы

1. Впервые при проведении полного кариологического анализа буккального эпителия у детей с БА установлено статистически значимое повышение уровня цитогенетических нарушений на 34% и апоптического индекса на 30% по сравнению с показателями в контрольной группе. Эти изменения более выражены у детей в период обострения (повышение на 40% и на 44% соответственно) и, особенно, у детей с тяжелым течением БА (повышение на 98% и 13 %) по отношению к контролю.

2. Показано, что среди детей с БА преобладают дети с низким уровнем slgA, отражающим состояние местного иммунитета. Средняя концентрация slgA в группе детей с БА в 2,1 раза ниже, чем в группе сравнения (249,77±24,42 мг/л и 529,09±40,0 мг/л соответственно; Р<0,05).

3. Впервые выявлена зависимость кариологических показателей буккального эпителия от состояния местного иммунитета. В группе условно здоровых детей с низким уровнем slgA отмечено повышение доли клеток буккального эпителия с цитогенетическими нарушениями (1,63±0,32%о при низком уровне slgA против 0,83±0,17%о при нормальном уровне, Р<0,05) на фоне снижения апоптического индекса (9,89±1,91%о при низком уровне против 13,16±2,07%о при нормальном уровне, Р<0,05). У детей с БА, имеющих высокий уровень slgA, отмечено повышение частоты клеток с атипичной формой ядра в 2,1 раза, а при низком уровне увеличение частоты клеток с двумя и более ядрами в 1,3 раза.

4. Выявлено влияние загрязнения атмосферного воздуха г.Тулы на детей с БА и в группе сравнения.

• У детей с БА в «загрязненном районе» достоверно повышен уровень цитогенетических. нарушений и апоптический индекс. У детей из группы сравнения достоверно повышен уровень цитогенетических показателей и показателей пролиферации на фоне снижения апоптического индекса.

• Относительный риск развития цитогенетических нарушений в «загрязненном» районе по отношению к «чистому» составляет 2,4 у здоровых детей и 1,97 у детей с Б А, при этом наиболее высокие уровни цитогенетических показателей и апоптоза отмечены в группе детей с БА, проживающих в «загрязненном» районе.

• У здоровых детей выявлено достоверное снижение (на 70%) уровня секреторного иммуноглобулина в «загрязненном» районе. У больных БА в обоих районах уровень иммуноглобулина был приблизительно одинаковым, но значительно ниже (в 2-4 раза), чем в контрольной группе детей.

5. Дети, больные БА являются более уязвимой группой по сравнению со здоровыми детьми при воздействии загрязнения атмосферного воздуха, что выражается в более высоком уровне цитогенетических нарушений и показателей апоптоза и наиболее низком уровне slgA.