Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Цитогенетические и иммунологические изменения больных клещевым энцефалитом

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОХСР НОВОСИБИРСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЕНАШНИ

эдвдгаский институт

На правах рукописи УДК 616.988.25:616-092

ЗАПШОВ ЕВГЕНИЙ ЮРЬЕВИЧ

ЦИТОГЕНЕТШЕСКИЕ И ШМПШОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНИ» БОЛЬНЫХ КЛЕЩЕВЫМ ЭНЦЕФАЛИТОМ

14.00.10 - инфекшонныэ болезни

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кавдвдвга мадицлнскях наук

Новосийирсв - 1991

Работа выполнена в Томском ордена Трудового Красного Знамени Государственном медицинском институте Министерства здравоохранения РСФСР.

Научные руководители: кандидат медицинских наук, доцент А.В.Лепехин;

доктор биологических наук, профессор Н.Н.Ильиноких

Официальные оппоненты: доктор медшшнских наук, профессор А.Ф.Колесникова; кандидат медицинских наук Л.О.Черяишяа

Ведущее учревденяв - Военно-медицинская академия им.С.М.Кирова, Санкт-Петербург

Защита состоится _в_часов па

заседании специализированного совета к 084.52.01 по присуждению ученой степени кандидата медшшнских наук при Новосибирском ордена Трудового Красного Знамени медицинском институте (630091, г.Новосибирск, Красный проспект, 52, тел. 99-16-20).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского, ордена Трудового Красного Знамени медицинского института. Автореферат разослан ^-У 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

Н.С.Семьянова

' Актуальность проблема. Клещевой энцефалит (КЗ) регистрируется в СССР о частотой 1:10000 населения (А.Н.Шаповал, 1980). Имеется четко выраженная тенденция к увеличению числа заболевшие клещевым энцефалитом. Так, в Сибири и Предуралье с 1970 года заболеваемость клещэвш звдефалитом увеличилась в 2-4 раза. В Томской области за эшщеезоп 199Q года 30000 человек подвергались нападению клещей, ОТО из них било госпитализировано с диагнозом хлещевой эшефалит (О.А.Сакаряна, 1990).

В связи с особой тяжестью и нередкой пнваяэдпзшшей переболевших КЭ, предупреждение я лечение его является важной задачей практического здравоохранения, решение которой невозможно без четких знаний в области патогенеза КЭ на субклеточном и молекулярном уровнях.

Известно, что многие вирусы способны вызывать значительные изменения в .генетическом аппарате клотки (piAula , 1963; W.W.Nlobola,A.X.evan, 1955; Е.Ф.Бочароз, 1968; Г.М.Тимоаек, 1969; H.Bernard et.att. , 1970; Н.Т.Кучэрова о сссвт«, 1972; E.Geisoler, Н.Thelie, 1983; HJi.Ильинских, 1984). Такие данные имеются я о впрусе КЭ, которая как в условиях in vitro {Н.И.Гордеева, 1979; Т.Л.Мирвтова, 1S81), так а в условиях in vivo (в системе Г-лш.фцнтоз) способен индуцировать значи-тельяне патогенетические яерусенля (Г.М.Тимошек, 1969).

В организме существуют различнка защитные систеш, обсспо-чивашще ого устойчивость к мутагенному действии sapycá КЭ. В первую очередь это относится к Т-эвепу иммунитета, сг-^собного как предупреждать развитие ш?$энцна, так п злимапироэать ыутант-по измененные клетки при арбовируеннх инфекциях (A.Hapei , 1975). Кроме того, вирус КЭ оказывает значительное Т-иммунооуп-ресснвное действие и ингибирует в условиях . ia vitro некоторые этапы процесса репарации да (Н.Н.Еогомолова с соавт., 1974). Очевидно, что для состояния здоровья больного далеко пе' безразличным является целостность генетического аппарата клеток а возможность его восстановления, та есть должна существовать зависимость меаду юшндчгскец состоянием больного в тем изменениями, которые индуцирует вирус КЭ на молекулярном и клеточном уровнях. В связи о эта! стимуляция процессов, способных

пне, в этой св.ои, привлекает действие интерферона. В настоящее время показано лечебное действие шгеерферонов при сачих рааллч- _ них вирусных инфекциях (T.C.Merlgan , 1933; C.Kassianides efc.all., 1337; А.Ф.Фролов с соавт., 1938). B-дастз с тем имеются данные о снижении способности лейкоцитов больных КЭ лвдей к выработка интерферона (Л.БЛеботаев, Л.С.Субботина, 1972). .С нашей точки зрения привлекает внимание способность интерферона стимулировать Т-пммунитет (Л.'.¡.Сорокин с соавт.г 1986) и активность нормальных киллеров (S.Serdexigecti et.all.,1981), являющихся пор-. вой линией защити при вирусных инфекциях (R.B.Herberman et.all., 1980). При ото.-.! интерферона являются хорошими стимуляторами ДНК-репаративных процессов (Т.П.Швецова, 1983).

В связи с вышеязлоадннш проблема изучения генетических а иммунологических изменений у больных клещевым энцефалитом и возможность проведения иммунокоррекшш приобретает особую актуальность.

Цель работы - изучить патогенетические и иммунологические изменения при клещевом энцефалите и обосновать возможность коррекции таких изменений.

Основные задачи исследования;

1. Изучить уровень вдтогенетичэских нарушений в клетках крови и исследовать репаративный синтез ДНК лейкоцитов периферической крови ЙОЛЬНЬ'Х КЭ.

2. Бровести анализ уровня Т- и В-лимфоштов, субпопуляций Т-лимфоиитов (Tjj , Ts ), активности нормальных киллеров в динамике болезни КЭ.

3. Провести комплексную клиническую оценку выявленным патогенетическим а иммунологическим изменениям и обосновать необходимость их коррекции интерфероном юга его индукторами.

'4. Разработать более чувствительный, чем существующие, способ определения антител к вирусу КЭ в сыворотке крови больных КЭ и внедрить его в медипинскув практику.

Научная новизна

1. Впервые проведено комплексное изучение основных систем, призванных поддерживать цитагенетический гомеостаз организма (ЛНК-репаративной и иммунной), в динамике болезни КЭ у человека.

<:. выявлена спосооность интерферона влиять на ЛЕК-"рёпара-тивнив процессы и активность нормальных киллеров; научно обос-. новано его применение при лечении (Зольных клещевым энцефалитом.

3. Впервые разработана и. приоритетно защищена авторским свидетельством новая более чувствительная реакция аятителозави-симой клеточноопосредоваяяой китотоксичности для определения антител к вирусу клещевого энцефалита.

Практическая значимость работы

1. Показана необходимость определения патогенетических нерушений в клетках и репаративяого синтеза ДНК лейкоцитов периферической крови больных клещевым энцефалитом для оценки клинического состояния пациентов.

2. Результаты изучения влияния интерферона на ДИК-ропара-тивные процессы и активность нормальных киллеров позволяют рекомендовать его в клиническую практику при лечении больных клещевым энцефалитом. ■

3. Внедрена в медицинскую практику новая, приоритетно защищенная, реакция определения антител к вирусу КЗ в сыворотке крови.

По результатам выполнениях исследований на защиту выносятся следующие положения:

1. Отсутствие степени выраженности связи онтогенетических нарушений в клетках, изменение репаративного синтеза ДНК-лейхо-Ш1тов периферической крови, тяжестью а формой течения заболевания у больных клещевым энцефалитом.

2. Наличие прямой связи между тяжестью инфекционного процесса и уровнем Т- и В-лим$оцитов, субпопуляиий Т-лгофоцитов (Ть , Т3 ), активностью нормальных киллеров в динамике болезни КЗ.

3. Целесообразность комплексной клинической оценки выявленных патогенетических и иммунологических изменений и обоснование необходимости проведения их коррекции интерфероном или его индукторами.

4. Разработка нового более чувствительного способа опреде-тэния антител к вирусу КЭ в сыворотке крови с внедрением в ме-ншнскую практику.

Работа выполнялась в 1987-1991 гг. на кафедре инфекционных 5олезяей и кафедре биологии и генетики Томского ордена Трудового

Г. ..тт^дозательских работ института.

Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам обеих кафодр за оказание помощи в выполнении настоящих исследований.

Апробация диссертация. Материалы диссертации доложены и обсуждена на:

1. городском обществе генетиков. Томск, 1988 г.;

2. научно-практической конференция по актуальным вопросам эпидемиологиидиагностики и профилактики вирусных инфекций совместно с рабочим совещанием научно-производственного совета по республиканской проблеме "Вирусология и вирусные заболевания Свердловск, 198В г.;

3. Всесоюзной конференции "Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний". Звенигород, 19ЭО г.;

4. Республиканской научно-практической конференции "Актуальные вопросы изучения клещевого энцефалита и геморрагической лихорадки в их природных очагах". Ижевск, 1990 г.;

5. конференции молодых ученых "Актуальные проблемы эпидемиологии, диагностики и клиники инфекционных заболеваний". Москва, 1991 г.

В завершенном виде диссертационная работа апробирована на заседании кафедр инфекционных болезной лечебного и педиатрического факультетов НОТКЗ'М.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ и получено одно авторское свидетельство (К 1597726 от 19.07.1908 г.).

Структура и обьом диссертации. Диссертационная работа состоит из введешя, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов к списка использованной литературы. Диссертация изложена на 114 страницах»машинописного текста, иллюстрпровака 9 рисунками в 13 таблицам!. Список цитируемой литературы включает 176 источника (129 отечественных и 47 зарубежных работ).

Материала и методы. Под клиническим наблцденлем находилось 97 больных клещевнм энцефалитом. Из них стертой формой - 35, менингеальной - 35, очаговой - 27 человек. Среди заболевших преобладали лица мужского иола - 12,2%, пзнцины составили 21, от общего числа больных. Возраст больных в средней составил при стертой форме - 38,4*2,3 лет, при менингеальной - 32,0*2,1 и при очаговой - 33,7*2,1 лет.

С применением генетических и итауиологдчсских методик обследовано 65 болышх различима формами КЗ. 1?з них: 36 большое со стертой, 20-е менингеальной и 9 - с очаговой формой КЗ. Среди больных с очаговой формой отмочено 3 с полиоэпцефаломие-литической, 4 с монингоэяиефалитической и 2 с рэдикулоноврити-ческой формами заболевания.

Пробы крови забирали в динамике: з разгар заболевания -на 3,9*0,6 сутки от начала заболевания, в период ранней рекон-валесценции - на 12,6*2,5 сутки заболевания, перед выпиской -на 23,7*3,0 сутки и через 3 месяца посла выписки из стационара.

Т- и В-лимфоциты в периферической крови определяли методой розеткообразованпя (К.Д.Новиков, В.И.Новикова, 1979). Субпопуляции Т-лимфоцнтов по чувствительности и устойчивости к обработке теофиллином (S.Limatibul efc.all., 1378; Р.В.Потров с соавт., 1986; Й.Д.Пошшина и др., 1983) в модификации Е.Б.Хра-вец и др. (1933).

Определение показателей гемограммы проводили по ме- дшее, описанной Е.А.Кост, Л.Г.Смирновой (1964).Определение актявнос-тп носильных киллеров (КС) проводили по методу М.П.Рык„вой и др., (1981). Определение.содержания антител в сыворотке крови больных КЗ - по методу Э.А. Clarice, J.Cacalo (1958) с учетом Методических рекомевдаддй та лабораторным п юлевыи нсслсдоза-ниям арбовирусов (1975).

Анализ генетических измснсщ:/', мжроядорныа анализ, определение уровня ропаратяввого спятсза ДЛС осуществлено е использованием стандартных методик (R.Sehi.cgoi, JJ.'-fiLcGre^cr г 1932; П.Н.Ильинских и др., 1987; Г.Д.Засухю'л а др., 1382, 1836, 1987). В работе использовался рзЕомбин-зетш;! /э -(А) ш-repje-рон (реаферои) человека, нодзгчеяпнй ул-гадсм г^т.оаЩптши хроматографии на экспсриг:зкуал£к<ш лдс |ЗК> "Флр'-г-;:?"

.«■«».»»Ш,» «и^таиимл* ал^иврименгальшт данных проводш по общепринятым методам, используя стандартные программы (И.П. Апмарин,. А.А.Воробьев, 1961).

Результаты исследований и их обсуждение. Из обследованных 97 больных клещевым энцефалитом в 87 случаях (89,7$) зарегистрл рован-трансмиссивный путь передачи инфекции. В 5 случаях (5,15? заболевшие снимали с себя неприсосавшихся клещей, в 5 (5,15$) -причину заболевания установить не удалось. 2,1% всех заболевших были привиты полным курсом шактивироватшой культуральной вакциной против клещевого энцефалита, а 40,2?! - получали с профила тической целью гомологичный иммуноглобулин (3-6 мл). Диагноз клещевого энцефалита устанавливался комиссионно: невропатологом инфекционистом, эпидемиологом и подтверждался во всех случаях нарастанием титра антител в реакции торможения гемагглютинашш с. антигеном вируса КЭ п характерной клинической картиной развит заболевания.

Длительность инкубационного периода в целом по группе колебалась от 1 до 36 дней и составила в среднем 7,0^1,1 суток при стертой; 9,1±1,9 при мениягеальной и 7,4*1,3 при очаговой форме КЭ. Достовер их различий в продолжительности инкубашгонно го периода при различных формах заболевания нами не выявлено. У больных со стертой формой КЭ острое начало отмечено в 71,4/? случаев; с менантеальной - в 91,4$ а с очаговой - в 74,1$. Для КЗ в целом был характерен выраженный, но непродолжительный лихорадочный период (табл.1).

Значения максимальной температуры у больных стертой формой КЭ колебались от 36,6 °С до 40 °С,в среднем составляя 38,I-0,2 °С, что достоверно ниже аналогичной величины у больных менантеальной формой - 39,1±0,1 (Р <0,001) (колебания от 37,4 до 40 °С), Значения максимальной температуры у больных очаговой формой составило в среднем 38,7*0,2 °С, что не отличалось от менантеальной, но достоверно превышало аналогичную величину у больных стертой формой заболевания (?<0,02), Необходимо отметить, что общеклинические проявления заболевания (в количественном и качественном отношении) были наиболее ярко выражены у больных очаговой г менингеальной формой КЗ (табл.2).

больных с КЭ в стационаре

Показатели Стертая форма Р1 Менкнгеальная Р? ■Зорма Очаговая форма

(сутки) 4+

Инкубационный период 7,0±1,1 (1-35) >0,05 9,1-1,9 (1-36) >0,05 7,4-1,3 (1-27)

Длительность 6,7*1,О <0,02 10,5±1,1 >0,05 13,5^2,155

температурной реакции (1-25) (2-32) (2-45)

Улучшение состояния 7,9±1,0 (2-32) >0,05 10,7±1,0 (3-30) >0,05 14,4*1,0* (4-32)

Длительность 14,0±0,8 <0,001 24,3*1,7 <0,01 О+О О—'^ р О ^ t и

госпитализации (3-31) (13-57) (11-73)

Примечание: Р^ и - значения для сопряженных величин. Одной звездочкой отмечены значения показателей при Р<0,01; двумя - при Р<0,С01 - отличия очаговой формы от стертой. В скобках дача вариабельность показателей.

Таблица 2

Менингеальные симптомы при различных клинических формах клещевого энцефалита

Симптомы

Форма заболевания стертая менкнгеальная очаговая

абсол. В0ЛИЧ. % абсол. велнч. % абсол. велпч. %

- - 33 94,3 23 85,2

1С 28,6 23 65,7 18 66,7

1 2,9 2 5,7 6 22,2

8 22,9 18 51,4 13 48,2

12 34,3 17 48,6 12 44,4

3 3,6 о 25,7 15 56,6'

Ригидность мышц звтылка

Симптом Кернига

Симптом Брудзииского

Светобоязнь

Боль при давлении па глазные яблоки

Голь точек выхода черепно-мозговых корнов на липе

нииге&льной и очаговой фортах заболевания. Ригидность шда затылка исчезала у больпых менингеальной формой КЭ в среднем на 14,4-1,1 деаь от момента заболевания, очаговой - на 18,0*3 день, Практически при всех формах КЭ паблапалисъ боли в мышцах различной локализации. Закономерны былл поражения черепно-мозговых нервов. Кроме того, отмечалась общешзговыа симптомы: головная боль, головокружение, тошноте, рвота, расстройство сна. Центральное место в неврологической симптоматико заболевания занимали двигательные нарушения. Зарегистрированы патологические рефлексы: Бабкнского, Россолимо, Чуковского, Гордона, Шаффера, Яуссепа, рефлексы орального автоматизма.

Все больные, находящиеся на лечении в стационара, получали этпотропное лечение гомологичным специфическим иммуноглобулином, патогенетическую и симпто«датическун> терапии.

Весьма интересно было проследить за изменениями показателе! клеточного и гуморального иммунитета у больных КЭ. Нами установлено, что у больных разлктеыми фортами КЭ б разгар заболевания содержание Т-ликг|одатов снижено по сравнению с контрольной гругпой (здоровые доноре) как в относительных, так и в абсолютных значениях (рис.1). Зарегистрированы статистически достоверные различия (Р<0,01) меяогу абсолютным количеством Т-лиьфоцито! у больных стертой гО,93*0,08 г/л) и менингеальной (0,63*0,04 г/л) Формами заболевания. Аналогичные изменения уровня Т-лим$о-питов установлены в период ранней реконвалесценции. Относительный уровень Т-лн'йоиятов в периферической крови у больных очаговой формой заболевания был достоверно вншз этого показателя у больных стертой формой КЭ (50,2±3,9^ и 37,2±2,8$, р<0,05 соответственно).

В период выписки из стационара установлено увеличение уровня Т-лимЬопятов у больных всеми формами заболевания КЭ как в относительных, так и абсолютных величинах. Не отмечено достоверных отличий в количестве Т-лимфопятов у больных различными формул* заболевания КЭ в этот период. Подобная картина регистрируется, и в период поздней рекоязэлеспеннии (рис.1). Уровень

(Q

форме КЭ установлено статистически значимое снпяение относительного и абсолютного количества Т-хелперов (14,9*0,9$, р<0,01 и 0,26*0,02 г/л, р<0,001) по сравнению с показателями у больных стерто* формой КЭ (22,3*2,3* и 0,50*0,05 г/л). У больных очаговой формой заболевания количество Т-хелперов достоверно ниже (р<0,05 и р<0,001), чем у больных стертой формой КЭ как в относительных, так и в абсолютных величинах. Следует отметить, что уровень Т-хелперов у больных всеми формами КЭ в динамике инфекционного процесса (даже через 3 месяца после выписки из стационара) не нормализовался, за исключением показателя в относительных величинах у больных очаговой формой КЭ.

В период разгара заболевания у больных стертой формой КЭ различий в уровне Т-супрессоров как в относительных, так и в абсолютных величинах в отличии от показателей контрольной группы выявлено на было. У больных менпкгеальной формой в этот же период заболевания уровень Т-супрессоров в относительных величинах (22,8*С,Бл, р<0,001) превышал аналогичный показатель у здоровых доноров (17,7*1,15?). Несмотря на стабильность относительного уровня Т-супрессоров при очаговой форме КЭ, абсолютное значение этого показателя достоверно снияалось. В динамике развития заболевания отмечена тецленпля к нарастанию количества Т-сугрессоров у больных всеми формами КЭ. Возможно, что зарегистрированный погашенный уровень Т-супрессоров нарушает диф-ферс:щировку прекиллерных хлеток в киллергое (Р.Й.Атауллаханов и др., 1978), и тзм са;лым мояет приводить к снижении их способности контролировать генетический гомеостаз и индуцировать накопление клеток с патогенетическими нарушения!®!.

7 больных различшши формами КЭ в разгар заболевания содер-гшиие В-ли;.'£оцитов в относительных величинах было достоверно повышено по сразнени» с контрольной группой, в то время как аб-^оллтные значения этого показателя имели лишь незначительную тенденции к увеличению. В период ранней рекопвалесценции уровень В-клегок у больных всеми формами КЭ был также повышен, в то же время у больных очагово/ формой заболевания количество В-клеток в ьбеолгатных величинах отличий от показателей контрольной группы не имело. Обнарукено наибольшее увеличение количества В-кле-

B период выписки из стационара уровень В-лимфоци-it ных различнтта формами заболевания достоверно превышал значь-контрольных величин как в относительных, так и абсолютных показателях. Через 3 месяца после выписки уровень В-лимфогагов достоверно превышал (р<0,05) контрольные величины у больных стертой (27,1*1,2«) и очаговой (26,0*3,1^) формами КЭ. Абсолютное количество В-клеток превышало показатели контрольной группы только • у больных очаговой формой КЭ (0,58*0,06 г/л, р<0,02). В этот период отмечены достоверные различия в уровне В-лимфоаитов (относительные величины) у больных стертой (27,1*1,2$, р<0,01) и менингеальяой формами КЭ.

Вирус КЭ способен вызывать поражения цитогенетичоского аппарата не только у Т-лимфопагрв (Г.Тимошек, 1969), но а у Ш-хслеток, тем самим приводя к снижению их цитотоксичности. Так, J.F.Loutit et.all. (1336)обнару:я1ля, что при повреждении некоторых хромосом у НХ-клеток значительно .страдает их функциональная активность. Было проведено тестирование активности нормальных киллеров у больных различными фермами клещевого энцефалита. Установлено, что активность нормальных киллеров у здоровых доноров (контроль) составила 63,8*3,3%. Сравнительное исследование активности НК у здоровых доноров и больных различными формами КЭ показало, что у больных стертой формой в разгар заболевания этот показатель достоверно снижен 52,0*2,1$ (Р<0,01). Еще большее подавление активности НК наблюдалось у больных ко— нингеальной - 28,4*3,81? (Р<0,001) и особенно у больных с очаговой формой КЭ - 10,5*5,(Р<0,001) по сравнения с показателя- ' ми контрольной группы.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что показатель активности НК у больных различны?® формами КЭ достоверно отличается т-агу собой. Так, активность НК у больных стертой формой почти в 5 раз вше, чем у больных очаговой формой КЭ. (Р<0,001) а в 2 раза выше, чем у больных монингеальной формой (Р<0,001). В свою очередь, у больных очаговой (формой КЭ активность НК Золее чем в 2 раза гогхе, чем у больных менвнгеашюй формой заболевания (Р<0,05). Наши исследования показали значительное

нормализация их активности отмечалась лишь к л месяцу пос выписки больных из стационара, совпадая по времени с норма лпзацией уровня клеток с патогенетическими нарушениями. Возмо но это связано с пониженной способностью клеток, больных КЭ, синтезировать интерферон, который оказывает активирующее влия ние на цдтотоксачность .нормальных киллеров ( £оЬпо1йег Ргапэ-Jooof и. , 1986). В свете сказанного весьма интересно было проследить за изменением активности нормальных киллеров у бол пых клещевым'энцефалитом под влиянием интерферона. В результа проведенных исследований установлено, что добавление интерфер в концентрации 1Х103 ед/мл в реакционную смесь вызывает увели ше активности ПК у больных стертой форшй КЭ с 52,0^2,1%' до 60,2*3,СЙ (Р<0,05), а при использовании интерферона в концен рации 2х1Сг ед/мл - до 62,7*3,3$ (Р<0,02).

При изучении влияния интерферона на активность нормально киллеров больных менингеальной формой клещевого энцефалита ус ' тсловлено, что интерферон в концентрации 1х103 ед/мл вызывае1 повышение активности НК от 28,4*3,8^ до 39,1*2,7? (Р<0,05), а в концентрации 2х103 ед/мл - до 37,6*2,7^. Кроме того, обо; довано 2 больных с очаговой формой клещевого энцефалита. До введения в реакционную смесь интерферона цвтотоксичаский инд« равнялся соответственно 16 и 5%. После добавления интерфероне в концентрации 1х103 ед/глл индекс цитотоксичности составил сс ветственно 25 и 31$, добавление ¡¡се его в концентрации 2х103 ед/мл приводило к. увеличении цитотоксического индекса до ЗС$ в обоих случаях (рис.2).

Были проведены исследования с применением микроядерного -. (Ш) ■ теста в периферической крови больных, страдающих различ! формами клещевого энцефалита (рис.З). Наш данные показали, ^ в начале заболевания КЭ уровень эритроцитов был достоверно ы чем в контрольной группе. В период нахождения больных в сташ наре у пациентов с различными формами КЭ отмечен статистичес] достоверно (Р<0,001) высокий уровень изучаемого показателя. Перед выпиской из стационара- зарегистрировано снижение коллч! т эритроцитов с МЯ по сравнению с достигнутым уровнем. Одна) полное восстановление патогенетической нормы мы наблодащ то. ко через 3 месяца после клинического выздоровлешш (рис.З).

to зо 20 W

50 jo *0

30

20 10

50 50 (0 50 2d Ю 0

a

Ш

ztbJ

3

JJ&

Ф.хч

r/x

XX

v'x

\у x

¿iX

0<МЬКЫ4 Cnspmoil ©JíMíil КЗ

У)

1

fr

X

¡ZX

5&лнм игицкггальнсй фогнойкэ

Г

яоШьш емру iusm¡}№}

аист с.-а№й e¿;.43ii и.

Ркс.2, Bnifrae {пэедояа ЕокцектрадкЯ jmepJepoHa «a вкттатсть

HopKSJjbiÜCt KifSiCJWB.

Пршвчаиот : 04ззк&чекм стгпгта статистической aoeîosaj«ocTa по ср»шекга е контрольной группой -* - Р<0,05; »*-Р«,01; а«л - Р<0,03Ц

Услогияа грофшзеет.е овсзначеккя -

■ кнтектгаз ypvf.no впианаетк Ж;

■ китахтиЯ уровень Ш t K¡rte^JíJ»n г «оядаятрм»!* 2 I ÏJ* ед/вя; I I - iwtawiœû урстадь НХ « ииг^рач а кидалрма* I х Я® «дЛги.

я

ГГ

о. О

<• ' о

R" <=■

egg

§ 2 g OUÏ

s?as aç^s

s g,

5 o i & &. 8, о ч

I

в.

S 8

s ч

= & Р

в» Sí О

© о а

a sa

>» » es

■е- 5

s s

8. Я

an Ci ® У

* s ä

il El

□

хша вируса лз на хромосомный аппарат клеток человека. Об отсутствии отличий в уровне патогенетических нарушены» у больных ра: личными формами заболевания свидетельствуют также мшыв Г.М.Тимошек (19СЭ).

Известно (Н.И.Улкяревич, 1971), что в условиях организма вирус КЭ индуцирует значительные нарушения углеводного, белкового и липвдного обмена, что кокет, в свою очередь, вызывать изменения в биосинтезе Д!!К и ахроматинового аппарата клеток и как следствие приводить к патогенетическим абберациям. Механизм уменьшения числа клеток с МЯ в кровотоке больных КЭ, наблюдаемый нами у Быздоровевпих, по-видимому, объясняется тем, что незрелые формы эритроцитов исчезают из кровотока (К.И.Гитель-зон, И.А.Тероков, 1959) и единственным механизмом элиминации и разрушения эритроцитов является деятельность иммунной системы (ЯЛ?.Пухова, 1979), Согласно данным ( 7.сьаге1гв апй ;т.Вась, 1975) именно Т-лимфоциты элиминируют патологические формы эритроцитов. Наши данные по увеличению числа Т-лнмфоцитов с одновременным уменьшением количества эритроцитов с микроядрами подтверждает высказанное выше положение. Устойчивость клетки к экзогенным воздействиям, в том числе и к вирусу КЭ, обеспечивается работой ДШ-репаративных систем, элиминирущих индуцированные повреждения ДНК.

Повышение устойчивости клетки к экзогенным мутагенным воздействиям - важнейшая задача медицины. Существуют два пути повышения устойчивости клетки: защита ее на уровне первичных повреждений ДНК и активация ДНК-регаративннх процессов (Г.Д.За-сухина, 1979). Нами, для стимуляции ДНК-репаративных процессов с целью ослабления последствий мутагенного действия вируса КЭ был использован интерферон, представляющий собой один из продуктов самой клетки (Г.Д.2зсухияа, 1971, 1983; Т.А.Сииолывдяо-ва, 1983). Интерферон сказывает пустективное действие как до, рак и посла действия мутагенов, что особенно ваяю в наших ¡сследоваииях, так гак в случае инфекционного мутагенеза пре-шптивное введение антимутагепа невозможно, Еило изучено алия-ие интерферона на уровень рзпаративкого оклтоза (РС) ДПК,

щего уровень РС рк в лейкоцитах крови, установили, что он сс тавнл 2,7*0,4 хсл.ед. у здоровых доноров, в то время как у бс щ стертой нормой - 0,03*0,11 усл.ед. (Р<0,001 в отличии 01 показателя в контрольной группе), у больных менингеальной фо]; мой - 1,00*0,18 усл.ед. (Р<0,01) и 1,08*0,41 усл.ед. - при очаговой форме КЭ (Р<0,02). Посколысу не было установлено от личий в величине ивдекса стимуляции РС ДНК, при ицлукшш 4-Ю у больных различными фордами клещевого энцефалита (Р=0,5 при всех возможных сочетаниях), мы сочли возмотлым в дальнейшем все значения КС объединить в одну группу независимо от формы заболевания. В большинстве (69,652) случаев ИС репаративного синтеза ДНК возрастал под влиянием интерферона от 0,89*0,15 усл.ед. до 1,67*0,24 (Р<0,01). В 30,4!? случаев стимуляции не наблюдалось. Индекс стимуляции репаративного синтеза ДНК был равен 1,23*0,15 усл.ед. до добавления интерферона и 0,78*0,1' усл.ед. после.

Таким образом показано, что интерферон, добавленный «'ли фоцитам больных КЭ после воздействия 4—11X0, вызывал дерепресс ДНК-репаративной пстемы и индуцировал увеличение активности ДНК-репарации в 69,6/5 случаев. Это дает основание сделать пр« положение об участии интерферона в процессах клеточной репарг шш. Механизм этих процессов представляется нам в следующем виде: интерферон, обладая эндо- и экзонуклеазной активностью, ыозмт участвовать в репарации ДНК или стимулировании энзимов, активирующих процессы восстановления индуцированных поврезде-иий и целостности ДНК-клвток, в том числе ДЛК нормальных кош ров и, вероятно, что эти процессы приводят к восстановлению исходно сниженной активности нормальных киллеров в крови бол! ных клещевым энцефалитом.

Вышеизложенное позволяет рекомендовать интерферон для ю нических испытаний при лечении и реабилитации больных клещев! энцефалитом. Был проведен корреляционный анализ генетических иммунологических изменений при клещевом энцефалите. При сраы нии показателей микроядерного теста и иамунореактивности у бс ных стертой формой и менингеальной формой заболевания вшголв!

изменениями в Т-звене иммунитета у больных менингеалыгаш и очаговыми формами заболевания. Надо полагать, что более глубокое поражение лимфоцитов при тяжелых формах КЗ вызывает и соответствующие по тяжести расотройства функции иммунной системы и организма. В настоящее время весьма актуальным является отработка оптимального способа определения антител в сыворотке крови больных клещевым энцефалитом, позволяющего- повысить чувствительность и сократить время определения. Сущность разработанного способа заключается в том, что определение антител против вируса КЗ проводили в реакции антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичяостл, в которой в присутствии исследуемой сыворотки, сорбированной на клетках-мишенях, происходит их разрушение под воздействием клетск-эффакторов.

В качества клеток-шшеней использованы гусиные эритроциты, обработанные раствором танина, сенсибилизированные диагностику-ком клещевого энцефалита для РТГА РСК, меченные хроматом натрия (Сг В качестве клеток-эффекторов - мононуклеарные клетки (лимфоциты и моноциты) периферической крови здоровых доноров. Клетки-эффекторы добавляли к клеткам-мишеням в соотношении 5:1, которое было нами экспериментально подобрано и позволяло выявить антитела к вирусу КЗ в низких титрах.

Способ определения антител к вирусу КЭ в общем виде заточается в следующем: приготавливали последовательные разведения исследуемой сыворотки, инкубировали их с антигеном, с использованием гусиных эритроцитов, которые обрабатывали вышеуказанным способом и метили хроматом натрия - Сг затем обрабатывали исследуемой сывороткой, добавляли мононуклеары периферической крови в оптимальном соотношении 5/1, дополнительно инкубировали, брали из каздогЧ душей супернатапт и исследовали радиоактивность пробы на гамма-счетчпке "Гаша-12". Определяли процент специфического высвобождения меченного хрома из разрушенных клеток-мкшеней и. при его зиачишя большем 12^ делали вывод о присутствии в сыворотке антител к вирусу КЭ.

Таким образом, прадлог.ешшй способ повышает чувствительность определения антител по сравнению с РТГА в 32 раза, результат при этом оценивается по цифровому материалу, что гошшает точность и исключает субъективность определения. На способ по определению антител получено авторское свидетельство Г 15Э7726

следующие закономерности. Если у больных менингеальной формой • КЭ отмечена обратно-пропоридонаяьная зависимость между уровнем мшсроядер и количеством Т-лимфоцятов (в абсолютных величинах) в разгар заболевания ( г= -0,85, Р<0,01), то у больных стертой формой тенденция к данному соотношению отмечается лишь в период разгара заболевания ( г= -0,54, Р>0,1). У больных менингеаль-ной формой КЗ в период разгара заболевания отмечается обратно-пропорциональная зависимость мезду уровнем шшроядер с одной стороны и количеством Т-супрессоров в абсол!этных величинах к В-лим£оцитов в абсолютных величинах с другой ( г= -0,84; Р<0,01 в первом и г = -0,68; р<0,05 во втором случав соответственно) . У больных стертой (формой КЭ в период разгара заболевания отмечена обратно-пропорциональная связь - зависимость метку уровнем Т-хелпероз в абсолютных величинах и уровнем микроядер (г = -0,82, р<0,01). Обращает на себя внимание, что в динамике инфекционного процесса мевду генетически?® и иммунологическими показателя® наблтадется переход значений отрицательной корреляции в положительную и наоборот, хотя корреляция свидетельствует о зависимости этих показателей. Очевидно механизм связи иммунной системы и генетическим аппаратом гораздо сложнее, чем простая зависимость типа "больше-меньше". Не исключено, что в эту корреляционную связь вносит свою "ленту" и центральная нервная система, существенно страдающая при КЭ (А.Е.Иапо-вал, 1984).

Таким образом, анализируя полученные материалы, следует' отметить, что в остром периоде заболевания КЭ наблюдается увеличение числа клеток с ттогенетическимн нарушениями. К концу . острого периода число Т-лимЬоцитов увеличивается с одновременным уменыаонием количества эритроцитов с микроядрада. Имеется тесная корреляция ие.гду уровнем клеток с мшероддраади и количеством Т-лжфоцктов, причем, если при менингеальной и очаговой формах заболевания обратно-пропорциональная связь наблэдалась в ранние сроки инфекшга, то при стертых - она регистрировалась позке - в разгар заболевания. Полученные данные подтвертдают . важность Т-звена иммунитета в штогенетических последствиях КЭ. Очевидно, с позиций развития аутоиммунных состояний при любых инфекциях, в том числе и при КЭ (В.Я.Карамшева, 1978), следует рассматривать более тякелуа картину КЭ с существенными

синтез ДНК в лейкоцитах а активность нормальных киллеров, что позволяет рекомендовать интерферон для клинических испытаний при лечении и реабилитации больных клещевым энцефалитом.

4. Разработанный и внедренный наш способ определаяия антител к вирусу клещевого энцефалита с помощью реакция антитело-зависимой клеточноояосредованной цитотоксичности повышает чувствительность определения.антител в несколько раз по сравнению с РТГА, что улучшает диагностику клещевого энцефалита.

СПИСОК РАБОТ, ОПУЕЛИКОВАгБЬК ПО ТВ® ДИССЕРТАЦИИ

1. Загромов Е.Ю., Ильинских H.H. Изменение пмчунороактивности и.способности яимфоидннх плеток а ДНК-репарации при клещевом энцефалите //Теэ.докл.научн.конференции "Экспериментальная

ц клиническая ихтиология на Босгоке страны". - Красноярск. -1983. - с.130, т.1.

2. Загромов Е.Ю., Ильинских H.H., Лепехин A.B. Анализ некоторых показателей иммупореактивкости и уровня микроядер у больных клецевым энцефалитом. Тез.облает,научпо-практ.конфер. "Иммунологическая недостаточность. Клинические и лабораторные методы выявления. Иммунокоррекцяя." Томск. - 1983. с.16.

3. Загромов Е.Ю., Ильинских H.H. йшунологяческие и патогенетические изменения у лвдей, вакцинированных против клещевого энцефалита. Тез. 4 научно-практич.конференции "Здоровье человека вСибири". - Красноярск. - 1988. с.50-51. "Молодые ученые -практическому здравоохранению".

4.'Загромов ЕЛО., Ильинских H.H. Влияние/2 (альфа)-ре-комбикантного интерферона на ДНК-репаративные процессы клеток и спонтанную цитотоксячность лимфоцитов больных клещевым энцефалитом. Всес.конф. "Молекулярные механизмы развития инфекционных заболеваний". - Звенигород. -4.1990. о.162.

5. Загромов Е.Ю., Ильинских H.H., Лепехин A.B. «С2 -реком-бинантный интерферон (реаферон) - препарат, активно влияющий

на процессы ДНК и аитотоксичность нормальных киллеров. - В сб. "Актуальные вопросы изучения клещевого энцефалита и геморрагической лихорадки в'их природных очагах".' - Ижевск. - 1990. с.93-95. Чаоть 1,

6. Альбицкая Н.Б., Богдашина Е.В., Полторацкая Т.Н., Загро-

от 19.07.1988 г. Метод внедрен в клинике инфекционных болезней Томского Государственного медицинского института (акт внедрения 17,07.1989 г.).

Таким образом, впервые на большом клиническом материала проведено комплексное изучение основных систем, призванных поддерживать генетический гомеостаз (ДНК-ропаратиЕНОй и иммунной систем) организма больных в динамике развития клещевого энпейа-лита. В результате исследований установлено увеличение числа клеток с цитогенетачеезшш нарушениями и угнетение способности лимфоцитов крови в ДНК-репарации с существенным угнетением ак- • тивяоета НК-клеток п Т-системи иммунитета. Обнаружена прямая связь между тяжестью инфекционного процесса и активностью нормальных киллеров, уровнем Т-лим$ош1тов и соотношениями Т-хелпе-ров и Т-супрессоров в крови больных клещевым энцефалитом. Комплексный анализ генетических и иммунологических изменений при КЭ позволил обосновать необходимость проведения их коррекции интерфероном, влияющим на ДНК-репаративныо процессы и актнв-ность нормальных киллеров. Кроме того, научно обоснована рекомендация по применению интерферона в клинической практике при лечении и реабилитации больных КЭ. Разработан новый болзе чувствительный способ (реакция антителозависимой клэточноопоерэ-дованной Ш1Т0Т0КСИЧН0СТИ) определения антител к вирусу клещевого энцефалита, приоритетно защэдошшй авторским свидетельством; «етод внедрен в клиническую практику.

ВЫВОДЫ

1. При клещевом энцефалита ваблэдается увзличокиз числа слеток с патогенетическими нарушениями (микродцорный тост) и чгнетение способности лимфотатов крови к ДЩ-ропарации, что юпровоедается существенным угнетением активности НК-клаток а '-системы иммунитета.

2. Цитогёнетические и ДНК-рзларативнно измаяеная клеток ериферической крови наблздаотся з;рз всех форглх к вариантах -ечения ¡теневого энцефалита, но сгсуень угнетения'активности

К, снижение количества Т-лаи|оцатов а измананпа соотношения ' ■ -хелперов/Т-супрессороз ассоциирована с ?,®отьв инфекционного роцесса.

3. Йнгер$ерон 1а гПго способеп сглч/^розак. репаратавинй -

мов Е.Ю., Еогдашн И.В. "Способ определения антител к вирусу клещевого энцефалита в сыворотке крови". Авторское свидетельство № 1597.726 от 19.07.88 г. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений СССР 8 игая 1990 г. . -

7, H.N.Ilyinekllch, Е,Ju.Zagromov, A.V.LepekMn. (The analysis of sone indices of immune response, DBA repair, and nicronuclei content in cells from tick-borne encephalitis patients. Acta virol. 554-562, 1990."

Заказ 528 Тираж .100 Ротапрзпт ТИАСУРа