Автореферат и диссертация по медицине (14.01.24) на тему:Трансдермальная терапевтическая система бромокаина на основе биосовместимой микроэмульсионной композиции

На правах рукописи

У

Рыжикова Варвара Андреевна

ТРАНСДЕРМАЛЬНАЯ ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА БРОМОКАИНА НА ОСНОВЕ БИОСОВМЕСТИМОЙ МИКРОЭМУЛЬСИОННОЙ КОМПОЗИЦИИ

14.01.24 - трансплантология и искусственные органы

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 ИЮН 2015

005569826

Москва - 2015

005569826

Работа выполнена в ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздрава России

Научный руководитель: Доктор биологических наук, профессор

Севастьянов Виктор Иванович

Официальные оппоненты:

Крыжаповский Сергей Александрович - доктор медицинских наук, заведующий лабораторией фармакологического скрининга ФГБУ "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В. В. Закусова" РАН.

Сычева Людмила Петровна - доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией генетического мониторинга ФГБУ «Научно-исследовательский институт экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научный центр сердечно-сосудистой хирургии имени А. Н. Бакулева» РАН

Защита диссертации состоится «30» июня 2015 г. в 1500 часов на заседании Диссертационного совета Д 208.055.01. при ФГБУ «ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России по адресу: 123182, г. Москва, ул. Щукинская, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ФНЦТИО им. ак. В.И. Шумакова» Минздрава России и на сайте www.transpl.ru.

Автореферат разослан « 2015 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 208.055.01, к.в.н.

^

Волкова Елена Алексеевна

Актуальность темы исследования

Трансдермальные терапевтические системы (TTC) открывают новые возможности для целенаправленной доставки лекарственных веществ (ЛВ) пролонгированного действия. Одной из актуальных и наукоемких проблем при создании TTC остается поиск биосовместимых компонентов TTC, включая активаторы переноса ЛВ. Несмотря на сложность создания трансдермальных форм, количество лекарственных субстанций, доставляемых путем чрескожной диффузии, постепенно растет. Новым препаратом из группы местных анестетиков является замещенный амид - бромокаин (патентное название - анилокаин). Бромокаин оказывает ярко выраженную поверхностную анестезию, по активности приближающуюся к дикаину, но превосходящую ее по длительности. Поверхностно-анестезирующая активность и длительность оказываемого эффекта более выражены по сравнению с лидокаином, при этом бромокаин в 1,5 раза менее токсичен. Также стоит отметить противовоспалительное действие бромокаина, что отличает его от прочих препаратов данной группы.

Исходя из механизма действия местных анестетиков, мишенью которых являются рецепторы нервных волокон, большой интерес представляет их трансдермальная форма, которая позволит обеспечивать постоянную скорость диффузии лекарства в поверхностные слои кожи, поддерживая необходимую терапевтическую концентрацию ЛВ в месте аппликации в течение нескольких часов.

Ключевой проблемой при создании TTC местных анестетиков остается выбор биосовместимой системы доставки ЛВ, обеспечивающей его максимально возможный выход из трансдермальной формы с постоянной скоростью в течение нескольких часов при следовых концентрациях ЛВ в крови.

Степень разработанности темы исследования

Проведенные в ФНЦ трансплантологии и искусственных органов серии исследований по разработке TTC с различными лекарственными субстанциями (кофеин, инсулин, адизол) показали биологическую безопасность и функциональную эффективность микроэмульсионных систем чрескожной доставки ЛВ (Севастьянов В. И. и др., 2003, 2004, 2008; Кузнецова Е. Г. и др., 2003, 2004, 2005; Курылева О. M и др., 2004, 2008). Однако в перечисленных трансдермальных формах специфическая активность зависит от концентрации ЛВ в крови при их аппликации.

Вопрос о возможности применения микроэмульсионных систем чрескожной доставки пролонгированного действия для анестетиков - JIB поверхностного действия - до настоящего времени не решен, что и послужило основанием для выполнения настоящей работы. Выбор бромокаина в качестве поверхностного анестетика обусловлен его преимуществами перед другими лекарственными средствами той же группы.

Цель работы: разработка и экспериментальное исследование трансдермальной терапевтической системы местного анестетика бромокаина на основе биосовместимой микроэмульсионной композиции.

Задачи исследования:

1) найти оптимальный состав микроэмульсионной композиции для чрескожной доставки бромокаина;

2) разработать конструкцию TTC бромокаина;

3) оценить функциональные свойства TTC бромокаина в условиях in vitro;

4) исследовать биологическую безопасность TTC бромокаина в условиях in vivo;

5) изучить специфическую активность TTC бромокаина в условиях in vivo.

Научная новизна:

1) доказана возможность использования биосовместимой микроэмульсионной композиции для создания TTC местного анестетика;

2) разработана первая отечественная TTC местного анестетика на основе биосовместимой микроэмульсионной композиции;

3) выбран наиболее предпочтительный состав TTC бромокаина на основании исследования стабильности изделия при хранении;

4) в экспериментах на животных при трансдермальном способе введения показана специфическая активность разработанной формы;

5) показано наличие в кровотоке «следовых» количеств бромокаина при аппликации трансдермальной формы бромокаина, что подтверждает ее биологическую безопасность и соответствует механизму действия местного анестетика.

Теоретическая и практическая значимость

Результаты предварительных исследований биологической безопасности, специфической активности, функциональных свойств и стабильности при хранении TTC бромокаина in vitro и in vivo позволяют рекомендовать данное изделие для проведения расширенных доклинических исследований.

Разработаны и внедрены в практику лаборатории тканевой инженерии и систем доставки ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова» Минздрава России и испытательной лаборатории доклинических исследований AHO «Институт медико-биологических исследований и технологий» методы высокоэффективной жидкостной хроматографии для качественного и количественного определения бромокаина в водных растворах и плазме крови.

Методология и методы исследования

В ходе выполнения работы использован комплекс физико-химических и биологических методов исследования.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Возможность использования биосовместимой микроэмульсионной композиции для создания транедермальной терапевтической системы местного анестетика.

2. Оптимальный состав и конструкция транедермальной терапевтической системы бромокаина, которая обеспечивает постоянную скорость диффузии активного вещества в кожу в течение 24 часов.

3. Биологическая безопасность и специфическая активность транедермальной терапевтической системы бромокаина.

4. Присутствие в кровотоке «следовых» количеств бромокаина при аппликации транедермальной формы бромокаина подтверждает ее биологическую безопасность и соответствует механизму действия местного анестетика.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность результатов определяется репрезентативным объемом проведенных экспериментальных исследований, использованием современных методов исследования и методов статистической обработки.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на межинститутских семинарах ФГБУ «ФНЦ трансплантологии и искусственных органов им. акад. В.И. Шумакова» Минздрава России (2013 г., 2014 г., 2015 г.), VII Всероссийском съезде трансплантологов, г. Москва, 28-30 мая 2014 г.

Публикации

Результаты проведенных исследований отражены в 4 печатных работах.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 108 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав, содержащих обзор литературы по излагаемой проблеме, описание используемых материалов и методов, результаты собственных исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, практических рекомендаций, двух приложений и списка литературы из 115 наименований, из них 63 отечественных и 52 зарубежных. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 7 таблицами, не считая приложений. Приложения включают 5 рисунков и 7 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Материалы

Для разработки трансдермальной терапевтической системы местного анестетика на основе биосовместимой микроэмульсионной композиции с содержанием JIB 5% и 10% использовали субстанцию бромокаина (ВФС 42-2946-97), синтезированную на базе ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия» совместно с Институтом технической химии УрО РАН.

В качестве депо для JIB была выбрана биосовместимая микроэмульсионная композиция, в состав которой вводился специфический активатор чрескожного переноса, биологически безопасный детергент анионной природы - докузат натриевая соль (ДНС) (C2oH37Na07S, ММ 444,56; CAS № 577-11-7, MCD Chemicals), обладающая липофильно-гидрофильными свойствами, используемая ранее для создания TTC JIB системного действия (Севастьянов В. И. и др., 2003).

Водная фаза микроэмульсионной композиции представляла собой бромокаин, растворенный в свежеприготовленном физиологическом растворе, для изготовления которого использовали воду очищенную (ФС 42-2620-97, дистиллятор ДЭ-10 и фильтр "MILLIPORE SIMPAK0R®1") и NaCl фармацевтический (ФС 42-2572-95, ЛСР-007720/09, Тюменский ХФЗ ОАО). В качестве масляной фазы эмульсии был выбран 10% масляный раствор а-токоферол ацетата (PN 001153/01, ОАО "Марбиофарм"), в который для стабилизации эмульсии дополнительно вносили липофильный эмульгатор Nikkol Decaglyn PR-20 (полиглицерил-10-полирицинолеат) (CAS № 29894-35-7, Nikko Chemicals CO., LTD).

Экспериментальные животные

Изучение функциональных свойств TTC бромокаина в условиях in vitro и in vivo выполняли на коже кроликов породы новозеландский белый обоих полов массой 2,1 -2,4 кг.

Определение концентрации бромокаина в крови и тканях экспериментальных животных, изучение специфической активности и биологической безопасности при аппликации TTC бромокаина проводили на аутбредных крысах обоих полов, весом около 200 г.

Животные получены из питомника лабораторных животных (Филиал «Андреевка» ФГБУ «НЦБМТ» РАН). Все манипуляции с животными проводили согласно правилам, принятым Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для исследований и других научных целей (European Convention for the Protection of Vertebrate Animals Used for Experimental and other Scientific Purposes (ETS 123) Strasbourg, 1986). Содержание животных осуществлялось в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 10993-2-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 2. Требования к условиям содержания животных».

Методы исследования

Для доказательства типа микроэмульсионной композиции бромокаина с различным содержанием ЛВ использовали методы разбавления и окрашивания (Шелудько А., 1984; Захарченко В. Н„ 1989; Евстратова К. И., 1990).

Коллоидную стабильность и термостабильность изучали на образцах биосовместимой микроэмульсионной композиции с содержанием бромокаина 5% и 10% согласно ГОСТу 29188.3-91 "Изделия косметические. Методы определения стабильности эмульсии».

Определение стабильности TTC бромокаина при хранении методом «ускоренного старения»

На основании известных свойств бромокаина, микроэмульсионной композиции и готовой формы, был предложен первоначальный срок годности TTC бромокаина не менее 2 лет в сухом и темном месте при t=25°C. При проведении испытаний стабильности руководствовались Временной инструкцией И-42-2-82.

Для подтверждения установленного нами срока хранения и выявления TTC с более стабильным составом выполняли ускоренные испытания стабильности при t=40±2°C и влажности 75±5% с использованием климатической камеры Binder KBF 115 (Германия), в которую помещали 3 серии TTC с содержанием бромокаина 5% и 10%. Контролем служили результаты, полученные при анализе образцов тех же серий на момент выпуска.

Определение скорости высвобождения JIB из TTC бромокаина осуществляли на установке Varían VK 7000/7010 (VARIAN, США), на аппарате типа «лопасть над диском» (USP, 724 "Drug Release").

Исследование диффузии бромокаина га TTC в условиях in vitro проводили в стеклянных диффузионных ячейках Франца по стандартной методике с использованием неконсервированной кожи кроликов (или синтетических мембран Strat-M®). Скорость накопления бромокаина J [мкг/(см2хч)] определяли по экспериментальным кривым динамики накопления вещества в приемной камере.

Концентрацию бромокаина в водных растворах устанавливали с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе фирмы Gilson (Франция) по специально разработанной методике. Минимальная определяемая концентрация для бромокаина составила 100 нг/мл.

Количественное определение бромокаина в плазме крови проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе Agilent 1100 (Agilent Technologies, США) с диодно-матричным детектором, автосемплером и термостатом колонок. Минимальная определяемая концентрация для бромокаина в крови составила 20 нг/мл.

Методы ВЭЖХ для определения бромокаина в водных растворах и плазме крови разработаны совместно с сотрудниками испытательной лаборатории доклинических исследований AHO «Институт медико-биологических исследований и технологий».

Количественное определение бромокаина в тканях и внутренних органах осуществляли после их предварительной гомогенизации и последующей экстракции с помощью метода ВЭЖХ.

Исследование специфической активности TTC бромокаина (совместно с ГБОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия»)

Специфическую поверхностно-анестезирующую активность изучали согласно рекомендациям, указанным в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств (ч. I, 2012 г.). Контролем послужили TTC плацебо и 5%-ный водный раствор J1B.

Оценку противовоспалительной активности выполняли с использованием модели каррагенинового отека с уменьшенной площадью активной части (20><20 мм). Контролем послужили TTC плацебо.

Субхроническую токсичность TTC бромокаина исследовали на нелинейных крысах при трансдермальном воздействии в эксперименте продолжительностью 14 суток совместно с сотрудниками испытательной лаборатории доклинических исследований AHO «Институт медико-биологических исследований и технологий». Контролем служила пластырь-основа TTC без микроэмульсионной композиции.

Токсичность препарата оценивали согласно пунктам контрольного листа наблюдения по следующим критериям: выживаемость, внешний вид (состояние шерстного покрова, глаз, ушей, конечностей, зубов), состояние и поведение животных (активность, походка, темперамент, питание), изменение массы тела, физиологические функции (дыхание, слюноотделение, мочеиспускание, экскрет), морфологический состав периферической крови, биохимические показатели крови.

После окончания эксперимента животные были подвергнуты эвтаназии с использованием гексеналового наркоза. Вскрытие производили сразу после гибели по полной патологоанатомической схеме. Проводили морфологическую оценку печени, почек, легких, сердца, селезенки, желудка, тонкого и толстого кишечника, щитовидной железы, тимуса, надпочечников, поджелудочной железы, матки, яичников, лимфатических узлов и головного мозга.

Раздражающее действие TTC бромокаина оценивали визуально и по анализу цитогистоархитектоники места аппликации в ходе субхронического эксперимента на крысах.

Методы статистического анализа полученных данных

Обработку экспериментальных данных хроматографического исследования выполняли с помощью программного обеспечения UniPointTM и Chem Station (Agilent, США).

Для построения графиков использовали найденные средние значения, стандартную ошибку, среднеквадратические отклонения. Используя t-критерий Стьюдента определяли достоверность различий (при р<0,05).

Результаты и их обсуждение

Характеристика микроэмульсионной матрицы бромокаина

Для установления и подтверждения типа разработанной микроэмульсии использовали два независимых метода. Результаты представлены на рисунках 1 и 2 (метод разбавления), и 3 (метод окрашивания).

а - в объеме; б - на предметном стекле Рисунок 1 - Разбавление эмульсии дистиллированной водой

а ............б

а - в объеме; б - на предметном стекле Рисунок 2 - Разбавление эмульсии 10% масляным раствором а-токоферол ацетата

При внесении капли эмульсии в объем дистиллированной воды и последующем встряхивании смешения не произошло - капля эмульсии распределилась по поверхности воды (рис. 1а), тогда как капля эмульсии после встряхивания в пробирке с масляным раствором (рис. 2а) равномерно диспергировалась в объеме.

При повторном испытании на предметных стеклах на каплю эмульсии наносили каплю дистиллированной воды (рис. Iff). На рисунке отчетливо видны границы несмешивающихся жидкостей. Во втором случае масляный раствор распределился в объеме эмульсии без видимых границ (рис. 26).

а 6

а - водорастворимый краситель; б - жирорастворимый краситель

Рисунок 3 - Микроскопия окрашенного образца микроэмульсионной композиции бромокаина (Olympus СХ-41 (Япония), ув. *40)

Добавление водорастворимого красителя генциан виолета (кристаллический фиолетовый, Химмед) (рис. За) привело к окрашиванию водных мицелл, которые представляют собой дисперсную фазу. Жирорастворимый краситель Oil Red О (Sigma) непрерывно распределился в дисперсной среде и привел к ее равномерному окрашиванию (рис. 36).

Полученные результаты подтверждают, что разработанная микроэмульсионная композиция бромокаина относится к обратному типу эмульсий («вода-в-масле»).

При изучении термостабильности и коллоидной стабильности микроэмульсионной матрицы с содержанием бромокаина 5% и 10% не было отмечено недопустимых расслоений образцов, на основании чего был сделан вывод о стабильности и пригодности эмульсии для дальнейшей работы.

Выбор оптимальной конструкции TTC бромокаина

Оптимальный тип конструкции определяли на основании результатов «теста высвобождения», исследуя динамику выхода бромокаина из образцов TTC матричного и резервуарного типов. Для последующих испытаний была выбрана матричная конструкция TTC бромокаина, из которой высвобождение JIB происходит со значительно большей скоростью. Из матричной TTC за 3 часа высвобождается от (73,4±8,3)% до (92,5±8,7)% содержащегося в форме JIB, из резервуарной формы - от (5,8±1,1)% до (26,7±6,3)%. Большая скорость высвобождения была показана TTC, состоящей из сорбирующей накладки ПАЛВ-01 (ООО «Группа Компаний Пальма»/ТУ 9393-005-17168608-2004) и эластичного микрогубчатого материала на основе вспененного поливинилхлорида с адгезивом ЗМ Foam tape 9773 (ЗМ, США).

Исследование диффузии бромокаина из матричной TTC через неконсервированную кожу кролика в условиях in vitro

Результаты исследования диффузии бромокаина из TTC с содержанием JIB 5% и 10% представлены на рисунках 4 и 5, соответственно.

5%TTC бездне

Д 5% TTC с ДИС

Рисунок 4 - График зависимости средней массы бромокаина, прошедшего через кожу кролика, от времени для TTC с содержанием бромокаина 5%

6000

5000 4000 3000 2000

10% TTC без ДНС

А 10% TTC с ДНС

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 Время, ч

Рисунок 5 - График зависимости средней массы бромокаина, прошедшего через кожу кролика, от времени для TTC с содержанием бромокаина 10%

После 6 или 8 часов аппликации TTC бромокаина с активатором и без активатора переноса, соответственно, зависимости средней массы бромокаина, прошедшего через кожу кролика, от времени хорошо аппроксимируются линейными функциями, что свидетельствует о постоянной скорости диффузии JIB в течение 26 часов (рис. 4 и 5).

Кроме того, отмечено, что внесение активатора переноса ДНС в TTC позволяет сократить время, необходимое для достижения постоянной скорости диффузии бромокаина с 8 часов до 6.

По результатам экспериментов in vitro была рассчитана приведенная скорость диффузионного потока бромокаина через кожу из TTC на основе микроэмульсионных композиций различного состава. Полученные данные представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Диффузия бромокаина через кожу кролика в условиях in vitro из TTC (n=6)

Состав микроэмульсионной композиции 50 мг бромокаина 50 мг бромокаина, дне 100 мг бромокаина 100 мг бромокаина, ДНС

Приведенная скорость диффузионного потока бромокаина через кожу in vitro, мкг/чхем2 ± о 23,1±3,7 120,1±21,6 31,3±8,1 332,3±70,7

Как видно из таблицы 1, в отсутствие активатора ДНС исходное содержание бромокаина в лекарственной форме (5% и 10% ЛВ) практически не влияет на скорость диффузии ЛВ через кожу (23,1±3,7 и 31,3±8,1 мкг/чхсм2, соответственно). В то же время, при добавлении ДНС в TTC с содержанием бромокаина 5% и 10% удалось достичь скорости диффузии равной 120,1±21,6 и 332,3±70,7 мкг/чхсм2, соответственно.

На основании проведенных экспериментов in vitro для TTC бромокаина в качестве системы доставки была выбрана микроэмульсионная композиция с ДНС, обеспечивающая диффузию ЛВ в месте аппликации не менее 24 ч.

Исследование диффузии бромокаина из матричной TTC через синтетическую мембрану Strat-M® в условиях in vitro

На примере TTC бромокаина с различным составом была исследована возможность замены неконсервированной кожи кролика на синтетический аналог, представленный мембранами Strat-M®, для изучения диффузии ЛВ из формы в условиях in vitro.

Полученные значения параметров диффузии в экспериментах in vitro с использованием синтетических мембран Strat-M® не зависят от исходного количества бромокаина в TTC и наличия активатора переноса: приведенная скорость диффузионного потока бромокаина через кожу из 5% и 10% TTC бромокаина, содержащих ДНС, составила 4,1±2,3 и 4,4±1,1 мкг/чхсм2, соответственно, что несопоставимо с данными, полученными при использовании кожи (таблица 1).

Таким образом, применение синтетических мембран Strat-M® возможно лишь для обоснования принципиальной возможности прохождения ЛВ через кожу.

Исследование стабильности разработанных TTC с различным содержанием бромокаина при хранении

Для подтверждения первоначально установленного срока хранения и выявления наиболее приемлемого с точки зрения хранения состава TTC использовали методику «ускоренного старения». Стабильность устанавливали на основании исследования внешнего вида ЛФ, содержания бромокаина в TTC и его высвобождения из TTC на разных этапах хранения (в конце 1-го, 2-го, 3-го и 6-го месяцев хранения) в сравнении с теми же показателями на момент выпуска. При оценке каждого исследуемого параметра на всех этапах исследования было отобрано минимум 6 форм каждой серии обеих

дозировок.

При оценке внешнего вида различия между испытуемыми и контрольными образцами были выявлены только на последнем этапе исследования (в конце 6-го месяца) для TTC с содержанием бромокаина 10%: установлено отлипание нетканой накладки от подложки и наличие масляных пятен на адгезиве.

При анализе содержания бромокаина в испытуемых образцах допускалось отклонение содержания JIB в процессе хранения не более ±10%. При хранении в условиях «ускоренного старения» в исследуемых ЛФ не произошло снижения содержания активного вещества как в TTC с содержанием бромокаина 5%, так и в TTC с 10% бромокаина.

При исследовании профиля высвобождения бромокаина из контрольных образцов были установлены нормы по количеству анестетика, которое должно перейти в среду высвобождения за определенный промежуток времени. Так, для первого отбора пробы на 30 минуте исследования в среду должно перейти от 75% до 85% бромокаина, от 80% до 95% - для второго отбора, проводимого на 60 минуте теста высвобождения, и для третьего (180 мин) - более 95% от исходного количества в трансдермальной форме.

Образцы TTC с 5% бромокаина на протяжении всего эксперимента имели профиль высвобождения, который укладывается в установленные нормы. При анализе TTC бромокаина с содержанием ЛВ 10% с 3-го месяца эксперимента отмечены отклонения от профиля высвобождения.

На основании испытания «ускоренное старение» можно утверждать, что TTC, содержащая 5% бромокаина сохраняет свои функциональные и физико-химические свойства при хранении в течение 2 лет при t=25°C. Образцы TTC с содержанием бромокаина 10% были признаны нестабильными при длительном хранении.

Изучение спеиифической поверхностно-анестезирующей активности

Показатели, характеризующие глубину и продолжительность анестезирующего эффекта, вызванного нанесением на поверхность кожи животных исследуемой TTC и препаратов сравнения, приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Результаты исследования активности при поверхностной анестезии микроэмульсионной TTC бромокаина в опытах на крысах (п=10)

Экспериментальная группа Глубина анестезии, % Время достижения максимальной глубины, мин Продолжительность анестезии, мин

TTC плацебо 0 0 0

5% водный раствор бромокаина, трансдермальное введение 0 0 0

5% TTC бромокаина 25,6±5,2 47±6 1283±60

Водный раствор бромокаина -инфильтрационная анестезия 85,0±9,6 6±1 88±11

Основным показателем, по которому проводилась оценка местноанестезирующего эффекта, служило изменение порога электрического раздражения кожи крыс. Установлено, что нанесение на поверхность кожи крыс TTC плацебо не вызывает изменения порога раздражения ткани. Нанесение на поверхность кожи 5% водного раствора бромокаина также не позволяет добиться анестезирующего действия. В группе животных, на кожу которых апплицировали 5% TTC бромокаина, наблюдался местноанестезирующий эффект небольшой глубины, но достаточно большой по продолжительности (1283±60 мин). Также установлено, что глубина анестезии при использовании 5% TTC уступает глубине эффекта при инфильтрационной анестезии (таблица 2). Максимальная глубина достигается медленнее, чем при внутрикожном введении - в течение 41-53 минут. При этом продолжительность анестезирующего действия лекарственной формы - в 14,8 раз превышает таковую при введении водного раствора.

Таким образом, доказана возможность поверхностно-анестезирующей активности 5% TTC бромокаина, которая по длительности превосходит инфильтрационную анестезию.

Изучение противовоспалительной активности TTC бромокаина Данные, полученные в экспериментах на крысах, представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Результаты исследования противовоспалительной активности 5% TTC бромокаина в опытах на крысах (п=10)

Исследуемый образец

TTC плацебо TTC 5%

Исходный объем стопы, мл 0,86±0,04 1,08±0,06

Объем стопы через 1 ч после инъекции флогогена мл 1,13±0,06 1,14±0,09

% 30,6±3,1 6,1±2,8*

Торможение отека, % 80,1

Объем стопы через 3 ч после инъекции флогогена мл 1,24±0,08 1,18±0,11

% 44,0±5,4 11,9±5,0*

Торможение отека, % 72,9

Объем стопы через 4 ч после инъекции флогогена мл 1,09±0,06 1,18±0,10

% 27,2±5,6 11,5±6,2*

Торможение отека, % 57,7

Объем стопы через 5 ч после инъекции флогогена мл 1,19±0,07 1,18±0,10

% 37,0±5,5 12,2±5,0*

Торможение отека, % 67,0

* - различие достоверно по сравнению с контролем при р < 0,05

Установлено, что исследуемая лекарственная форма оказывает выраженную противовоспалительную активность, что проявляется в достоверном уменьшении прироста объема конечности по сравнению с контролем - TTC плацебо и выражается высоким показателем торможения отека, составившим 69,4%±9,5% (таблица 3).

Исследование субхронической токсичности TTC бромокаина

Результаты проведенных исследований субхронической токсичности 5% TTC бромокаина в виде аппликаций готовой лекарственной формы на сутки в течение 14 суток, показали:

1. Выживаемость: на протяжении эксперимента все животные оставались живы.

2. Поведение и внешний вид: каких-либо отклонений в поведении (повышенной или пониженной активности) и состоянии крыс по сравнению с контрольной группой не

отмечено. Животные активно поедали корм, реагировали на внешние раздражители, проявляли интерес к людям. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью. Крысы были средней упитанности, истощением не страдали. Шерстный покров ровный и блестящий; выпадения или ломкости шерсти не обнаружено. Помутнения роговицы, слезотечения или каких-либо патологических признаков со стороны глаз не отмечено. Ушные раковины розового цвета без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета, поломок не наблюдалось.

3. Функции: дыхание у подопытных крыс, получающих препараты, как и у контрольных, было обычного ритма, незатрудненное; слюноотделение без патологии; частота, количество и цвет мочи, консистенция фекальных масс в пределах физиологической нормы.

4. Динамика массы тела: масса тела крыс на протяжении исследования значимо не отличалась между группами. Половых различий по этому параметру при этом не наблюдалось.

5. Клинические исследования крови: аппликации 5% TTC бромокаина не повлияли на состав форменных элементов крови: уровень гемоглобина, число эритроцитов, тромбоцитов, лейкоцитов и субпопуляционный состав лейкоцитов не отличается между группами.

6. Биохимические исследования крови: для выявления возможного воздействия TTC бромокаина на печень, сердечную мышцу и костную ткань в сыворотке крови животных определяли активность аспартат- и аланинаминотрансфераз, лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы - никаких отклонений в активности изучаемых ферментов не выявлено. Уровень общего белка, альбумина, мочевины и креатинина сыворотки крови практически не изменялся в группах на протяжении эксперимента.

Аппликация TTC бромокаина не оказала влияния на белок-образующую функцию печени и деятельность почек, не нарушило углеводный и липидный обмен в организме крыс. Гомеостаз электролитов в крови на протяжении исследования поддерживался в пределах физиологической нормы.

Были проведены морфологические исследования внутренних органов. По результатам макроскопического исследования изучаемых органов различий между группами не установлено. Достоверных отличий как абсолютной, так и относительной

массы внутренних органов крыс опытной группы от контрольной группы не выявлено. Во время микроскопического исследования при просмотре гистологических препаратов изучаемых органов контрольных и опытных животных различий между группами не обнаружено.

Таким образом, испытания TTC бромокаина не показали изменений внутренних органов, токсического действия на систему крови животных, токсического влияния на структуру внутренних органов.

Исследование раздражающего действия TTC бромокаина на кожу крыс

Выполняли подробный осмотр животного в клетке содержания и в руках. Исследовали на наличие и выраженность отёка, эритемы и образование струпа.

Оценка кожной реакции: на протяжении всего времени аппликации разработанной формы на кожу и последующего наблюдения за животными визуально не отмечали каких-либо признаков раздражения кожи (гиперемии, отека, инфильтрации, шелушения и т.п.). Сами участки кожи с пластырем животных не беспокоили, пальпация их была безболезненной. Температура поверхности кожи у подопытных животных практически не изменялась. Измерение толщины кожной складки в местах аппликации заявляемого средства показало, что она ни в одном случае достоверно не изменялась по сравнению с исходными показателями. Результаты эксперимента объективно подтверждают отсутствие отека кожи, даже после многократных аппликаций.

После эвтаназии у животных изымали фрагменты кожи, на которые наносили TTC. На гистологических препаратах признаков уплотнения ткани, слущивания кератиноцитов и других дегенеративных процессов не обнаружено.

Определение содержания бромокаина в крови при аппликаиии TTC бромокаина

Для определения содержания ЛВ в плазме крови отбор крови проводили через 1, 2, 4, 6, 8, 16 и 24 после аппликации TTC, после чего проводили эвтаназию крыс гексеналовым наркозом. Контролем служила группа с TTC плацебо, общее число животных составило 96 особей.

Через 1 час после аппликации TTC бромокаина в крови экспериментальных животных ЛВ определялось в концентрации 0,21±0,09 мкг/мл. Максимальная концентрация бромокаина в плазме крови была достигнута через 4 часа от момента

начала аппликации и составила 0,40±0,14 мкг/мл. В дальнейшем концентрация бромокаина сохранялась на стационарном уровне в течение последующих 12 часов и составила в среднем 0,39±0,13 мкг/мл, после чего отмечается незначительное снижение концентрации бромокаина (рис. 6). Следует отметить достаточно высокую погрешность, которая обусловлена тем, что обнаруженные в крови концентрации бромокаина находятся на границе предела обнаружения метода.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что бромокаин из микроэмульсионной TTC поступает в системный кровоток в незначительных количествах. Обнаруженные в крови количества бромокаина можно считать безопасными, поскольку в пересчете на килограмм массы экспериментальных животных эти показатели составляют от 0,022 до 0,045 мг/кг, в то время как LD50 бромокаина при внутривенном введении находится в пределах от 53,3 до 61,0 мг/кг. Таким образом, максимальная концентрация, регистрируемая в кровотоке крыс, почти в 1,5 тысячи раз ниже токсической.

При определении содержания бромокаина, оставшегося в TTC после 24-часовой аппликации на кожу крыс in vivo, было обнаружено, что из формы вышло 35,52±1,35 мг вещества, что составляет 71,1±2,7% от содержания ЛВ в TTC. В крови при этом всего обнаружено 0,143±0,028 мг бромокаина, что составило лишь 0,4% от количества бромокаина, вышедшего из формы.

Время, ч

Рисунок 6 - Усредненная динамика концентрации бромокаина в плазме крови экспериментальных животных при аппликации TTC с содержанием бромокаина 5% (п=6)

Определение содержания бромокаина в тканях и внутренних органах после аппликации 5% TTC бромокаина проводилось совместно с Пермской государственной фармацевтической академией. Полученные при анализе внутренних органов данные показали, что при 24-часовой аппликации микроэмульсионных TTC, содержащих 5% JIB, в печени и почках бромокаин не обнаруживается на протяжении всего периода нанесения.

После 24-часовой аппликации TTC с содержанием бромокаина 5% определяли количество бромокаина, оставшееся в коже экспериментальных животных в зоне аппликации (10 см2), которое составило 0,584±0,009 мг, что ~ в 4 раз больше, чем в крови. Таким образом, данные, полученные в этой серии экспериментов, свидетельствуют о том, что бромокаин, который высвобождается из лекарственной формы, поступает в кожу и создает предпосылки для получения пролонгированного эффекта.

Чрезвычайно малая концентрация ЛВ в крови крыс (стах=0,40±0,14 мкг/мл) при аппликации TTC бромокаина свидетельствует об отсутствии системного воздействия препарата на организм. Полученные результаты соответствуют механизму действия местного анестетика и подтверждают биологическую безопасность разработанной трансдермальной формы.

Заключение

В результате выполнения данной работы создана трансдермальная система доставки бромокаина, представляющая собой первое отечественное местноанестезирующее аппликационное средство для снятия болевых синдромов, сопровождающих постгерпетическую невралгию, межреберную невралгию, артрозы, миозит и вертеброгенные поражения.

В ходе экспериментальных исследований подобран и оптимизирован состав матрицы для трансдермальной доставки местного анестетика бромокаина. Выбраны методы для характеристики разработанной матрицы. На основании изучения скорости высвобождения бромокаина в условиях in vitro выбрана матричная конструкция TTC.

При изучении функциональных свойств форм при хранении выбран наиболее стабильный во времени состав.

В условиях in vitro доказано, что при использовании TTC бромокаина можно осуществлять доставку активного вещества с постоянной скоростью на протяжении не менее 24 часов, показана принципиальная необходимость введения специфического переносчика для увеличения скорости диффузии активного вещества.

В ходе проведенных исследований TTC бромокаина в условиях in vivo обнаружено наличие только «следовых» количеств бромокаина в крови экспериментальных животных (стах=0,40±0,14 мкг/мл), что свидетельствует об отсутствии системного воздействия на организм.

Биологическая безопасность TTC бромокаина подтверждена отсутствием раздражающего действия на кожу, токсического действия на систему крови и структуру внутренних органов экспериментальных животных.

Исследование специфической активности разработанной TTC бромокаина в условиях in vivo выявило наличие поверхностно-анестезирующей (продолжительность оказываемого эффекта 1283±60 мин; глубина анестезии 25,6%±5,2%) и противовоспалительной эффективности формы (показатель торможения отека 69,4%±9,5%).

Выводы

1. Разработана матричная трансдермальная терапевтическая система местного анестетика бромокаина на основе биосовместимой микроэмульсионной матрицы «вода-в-масле».

2. В условиях in vitro исследовано влияние наличия специфического переносчика -докузат натриевой соли - на скорость диффузии бромокаина через кожу. Установлено, что присутствие 0,6% докузат натриевой соли в TTC с содержанием бромокаина 5% и 10% приводит к увеличению скорости диффузии лекарственного вещества из соответствующих форм в ~5 и ~11 раз, соответственно.

3. Показано, что TTC с содержанием бромокаина 5% при хранении на протяжении 2 лет в сухом и темном месте при t=25°C остается стабильной, сохраняя свои физико-химические функциональные свойства.

4. В экспериментах in vivo, проведенных в соответствии с Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств (ч. I, 2012 г.), доказана биологическая безопасность разработанной TTC бромокаина.

5. Методом ВЭЖХ с УФ-детектированием показано, что при аппликации TTC бромокаина на кожу лабораторных животных в плазме крови обнаруживаются только «следовые» количества анестетика, которые в -1500 раз ниже LDj0, что является дополнительным показателем безопасности разработанной формы и соответствует механизму действия местных анестетиков.

6. Показано наличие специфической поверхностно-анестезирующей и противовоспалительной активности разработанной 5% TTC бромокаина: глубина анестезии при продолжительности оказываемого эффекта в течение 1283±60 мин составила 25,6%±5,2%; показатель торможения отека в опытах на экспериментальных животных 69,4%±9,5%.

Практические рекомендации

При выборе оптимального типа конструкции TTC рекомендуется руководствоваться результатами «теста высвобождения» (USP, 724 "Drug Release").

Для качественного и количественного определения бромокаина в водных растворах и в плазме крови следует использовать разработанные методы высокоэффективной жидкостной хроматографии с нижним пределом обнаружения 100 нг/мл и 25 нг/мл, соответственно.

При разработке трансдермальных терапевтических систем для обоснования принципиальной возможности прохождения J1B через кожу могут быть использованы синтетические мембраны Strat-M®.

Подход, использованный при разработке TTC бромокаина, может быть рекомендован для создания аппликационных форм других лекарственных веществ, не требующих системного воздействия.

Перспективы дальнейшей разработки темы На основании совокупности полученных результатов исследования неинвазивной формы анестетика TTC с 5% бромокаина можно рекомендовать к проведению расширенных доклинических исследований. При условии подтверждения терапевтической эффективности в клинических испытаниях разработанная форма займет свою нишу в неврологической практике.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Рыжикова В. А.. Тихобаева А. А., Саломатина JI. А., Курсаков С. В., Кузнецова Е. Г., Курылева О. М., Севастьянов В. И. Влияние активатора переноса на функциональные свойства матричных трансдермальных терапевтических систем бромокаина // Перспективные материалы. - 2014. - №2. - С. 26-32.

2. Rvzhikova У. A.. Tikhobayeva A. A., Salomatina L. A., Kursakov S. V., Kuznetsova Е. G., Kuryleva О. М., Sevastianov V. I. Effect or the transfer activator on functional properties of the bromocain matrix transdermal therapeutic systems // Inorganic materials: applied research. - 2014. - Vol. 5. -№5. - P. 498-503. DOI: 10.1134/S207511314050177.

3. Рыжикова В. А.. Саломатина JI. А., Тихобаева А. А., Кузнецова E. Г., Севастьянов В. И. Влияние активатора переноса на диффузию бромокаина из матричных трансдермальных терапевтических систем // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - Т. XVI, приложение. С. 280. Материалы VII всероссийского съезда трансплантологов, г. Москва, 28-30 мая 2014 г.

4. Рыжикова В. А.. Кузнецова Е. Г., Белов В. Ю., Саломатина JI. А., Севастьянов В. И. Определение стабильности трансдермальной терапевтической системы местного анестетика бромокаина // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2014. -№4.-С. 85-97. DOI: http://dx.doi.org/10.15825/1995-l 191-2014-4.

Подписано в печать: 18.05.2015 Тираж: 100 экз. Заказ № 1348 Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект, д. 74 (495)790-47-77; www.reglet.ru