Автореферат и диссертация по медицине (14.02.02) на тему:Токсоплазмоз при ВИЧ-инфекции: эпидемиология, диагностика и профилактика.

На правах рукописи

АББАЗОВА ЕВГЕНИЯ ВИТАЛЬЕВНА

ТОКСОПЛАЗМОЗ ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ: ЭПИДЕМИОЛОГИЯ, ДИАГНОСТИКА И ПРОФИЛАКТИКА

Эпидемиология - 14.02.02.

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 - ГАЛ 2214

Москва 2014

005549159

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н. Ф. Гамалеи» Министерства Здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Гончаров Дмитрий Борисович Официальные оппоненты:

- д.м.н, проф. Лавров Вячеслав Федорович, профессор кафедры эпидемиологии ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минздрава России

- д.м,н. Ермак Татьяна Никифоровна, в.н.с. специализированного научно-исследовательского отдела эпидемиологии и профилактики СПИДа, ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора

Ведущая организация: ФБУН «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится « 20 » июня 2014 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 208.130.02 ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России и на сайте института www.gamaleya.org

Автореферат разослан « 19 » мая 2014г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор ^ \ Русакова Екатерина Владимировна

Актуальность проблемы

Токсоплазмоз - убиквитарная инвазия, широко распространенная среди населения (в мире инвазировано более 2 млрд. человек). Наиболее высокий уровень распространения токсоплазмоза регистрируется в странах Латинской Америки и тропических странах Африки, достигая 80% [Bahia-Oliveira L.M. et al., 2003; Pappas G. et al., 2009]. В России инвазировано 32-37% населения [Гончаров Д.Б. и др., 2006]. Однако показатели заболеваемости населения значительно ниже, так как у 80-90% инвазированных людей токсоплазмоз протекает латентно [Казанцев А.П., 1985].

В последние десятилетия у людей с различными формами нарушения иммунного ответа, в особенности у больных СПИДом, все чаще регистрируют тяжелые клинические формы токсоплазмоза, связанные с реактивацией латентной инвазии, нередко заканчивающиеся летальным исходом, что позволило отнести данное заболевание к числу СПИД-ассоциированных. В различных странах в настоящее время токсоплазмоз занимает 3-5 место в структуре СПИД-ассоциированных заболеваний и 1 - 2 место среди инфекционных заболеваний центральной нервной системы (ЦНС) у пациентов с ВИЧ-инфекцией [Bonnet F. et al., 2005; Fragoso Y.D. et al., 1998; Gongora-Rivera F. et al., 2000; Lanjewar D.N. et al., 1998; Mohar A. et al., 1992; Nissapa-torn V., 2008; Oliveira J.F. et al., 2006; Satishandra P. et al., 2000].

Клиническая картина токсоплазмоза, развивающаяся при ВИЧ-инфекции, в значительной степени отличается от таковой при врожденном или приобретенном токсоплазмозе у иммунокомпетентных людей. Наиболее частая форма поражения у пациентов с ВИЧ-инфекцией - церебральный токсоплазмоз, клиническая картина которого схожа со многими другими заболеваниями, развивающимися при СПИДе [Покровский В.В. и др., 2003]. Это затрудняет постановку диагноза токсоплазмоза и выводит на первый план лабораторные методы исследования. В настоящее время для дифференциальной диагностики церебрального токсоплазмоза используются иммунологические и молекулярно-биологические методы, а также методы визуализации,

например, магнитно-резонансная томография (МРТ). Несмотря на широкий спектр применяемых лабораторных исследований, единый алгоритм диагностики до сих пор не разработан, а роль иммунологических методов часто недооценивается.

В России, начиная с середины 1996 года, отмечено стремительное распространение ВИЧ-инфекции, что во многом связано с резким ростом инъекционной наркомании [Ладная H.H. и др., 2008]. В связи с этим возросло значение и СПИД-ассоциированных заболеваний, среди которых токсоплазмоз, по отдельным данным, занимает 3-5 место в структуре летальных исходов [Тишкевич O.A. и др., 2004; Цинзерлинг В.А. и др., 2010]. Данный факт не отражен в официальной статистике, поскольку регистрируют преимущественно первичные случаи инвазии, а учет хронических и латентных форм не ведется. Соответственно, истинные данные о распространении инвазии, заболеваемости и смертности от токсоплазмоза в России отсутствуют, а мероприятия по совершенствованию диагностики и профилактики токсоплазмоза при ВИЧ-инфекции не проводятся.

Цель исследования: оценить значение токсоплазмоза для больных СПИДом и усовершенствовать тактику диагностики и профилактики токсоплазмоза у пациентов с ВИЧ-инфекцией.

Задачи исследования

1. Провести оценку широты распространения токсоплазменной инвазии у пациентов с ВИЧ-инфекцией.

2. Определить диагностическую эффективность иммунологических и мо-лекулярно-биологических методов диагностики токсоплазмоза на фоне ВИЧ-инфекции.

3. Оценить заболеваемость и летальность от токсоплазмоза среди пациентов с ВИЧ-инфекцией.

4. Изучить особенности течения токсоплазменной инвазии при заражении лабораторных животных (мышей) штаммом от пациента с ВИЧ-инфекцией.

5. Разработать тактику диагностических и профилактических мероприятий в отношении токсоплазмоза как СПИД-ассоциированного заболевания.

Научная новизна работы

Впервые проведена оценка широты распространения токсоплазменной инвазии среди пациентов с ВИЧ-инфекцией в Москве. Лабораторно подтверждено, что заболевание развивается в результате реактивации латентно протекающей инвазии, определен риск реактивации с учетом современной эпидемической ситуации.

Впервые в России для диагностики токсоплазмоза у пациентов с ВИЧ-инфекцией использован широкий спектр иммунологических и молекулярно-биологических методов исследования: определение антител классов IgG (количественный анализ), IgM и IgA к Toxoplasma gondii в сыворотке крови и специфических IgG в образцах спинномозговой жидкости (СМЖ), а также ДНК T.gondii в том же биологическом материале. Проведена оценка диагностической эффективности каждого метода в отдельности, а также их различных комбинаций. Определен оптимальный комплекс лабораторных исследований для подтверждения факта реактивации инвазии и постановки диагноза токсоплазмоза.

На основе применения разработанного алгоритма диагностики, анализа историй болезни и данных патологоанатомических исследований определен уровень заболеваемости и летальности от токсоплазмоза среди пациентов с ВИЧ-инфекцией.

Впервые в России изучены свойства штамма T.gondii, выделенного от пациента с ВИЧ-инфекцией, при заражении им лабораторных животных.

Практическая значимость работы

На основании полученных данных разработаны мероприятия по совершенствованию тактики диагностики и профилактики токсоплазмоза у пациентов с ВИЧ-инфекцией, обоснована необходимость их внедрения в практическую медицину.

Разработанный алгоритм диагностики апробирован в ГКУЗ ИКБ №2 ДЗМ. Показано, что проведение лабораторных исследований в соответствии с разработанным алгоритмом позволило почти вдвое сократить количество летальных исходов от токсоплазмоза среди пациентов с ВИЧ-инфекцией. Внедрение в практику. Разработаны методические рекомендации «Диагностика и профилактика токсоплазмоза у пациентов с ВИЧ-инфекцией» (одобрены на «Совете по внедрению научных достижений в практику» ФГБУ «НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи» Минздрава России: протокол № 28 от 13 марта 2014г.). Полученные результаты используются в работе врачами специализированных отделений для лечения больных ВИЧ-инфекцией в ГКУЗ ИКБ №2 ДЗМ (Акт внедрения от 25.02.2014г.).

Апробация работы: Материалы работы доложены на VI Международной научно-практической конференции «Паразитарные болезни человека, животных и растений» (г. Витебск) в 2008 году, на VII Международной научно-практической конференции «Современные аспекты патогенеза, клиники, диагностики, лечения и профилактики протозоозов, гельминтозов и арахноэн-томозов человека, животных и растений» (г. Витебск) в 2010 году, IV Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (г. Москва) в 2012 году, на XIX Всероссийской конференции «Нейроиммунология. Рассеянный склероз» (г. Санкт- Петербург) в 2013 году и на VI Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (г. Москва) в 2014 году. Апробация диссертации состоялась на научной конференции отдела эпидемиологии и отдела природно-очаговых инфекций ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России 20 декабря 2013 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 9 в изданиях, рецензируемых ВАК РФ.

Структура и объем диссертации: диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы,

содержащего 210 источников, из которых 69 отечественных и 141 зарубежных. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 17 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Для оценки распространения токсоплазменной инвазии определяли 1§С и ^М к Т^опсШ в сыворотках крови от 676 пациентов с ВИЧ-инфекцией (ГКУЗ ИКБ №2 ДЗМ), от 735 человек аналогичной возрастной группы (ЗАО «Диагностический центр «ФИНИСТ»») и 351 донора (ГНЦ РАМН) в период с 2007 по 2010 год.

Диагностическую чувствительность и специфичность выявления показателей реактивации оценивали по результатам исследований образцов сывороток крови и СМЖ от пациентов с ВИЧ-инфекцией на стадии СПИД 4В с подтвержденным диагнозом «церебральный токсоплазмоз» (51 человек) и с исключенным диагнозом «церебральный токсоплазмоза», но имеющих поражения ЦНС другой этиологии и инвазированных токсоплазмами (19 человек). Наряду с определением диагностической эффективности методов лабораторной диагностики на стадии ВИЧ-инфекции СПИД 4В, показатели реактивации определяли и у пациентов с ВИЧ-инфекцией на других стадиях болезни (3, 4А, 4Б).

Определение показателей заболеваемости и летальности от токсоплазмоза проводили на основании данных историй болезней пациентов и результатах проведенных лабораторных исследований у 400 пациентов с ВИЧ-инфекцией на стадии СПИД 4В. Для анализа летальных случаев от токсоплазмоза были отобраны данные из протоколов патологоанатомического исследования - 96 случаев.

В работе использовали иммунологические и молекулярно-биологические методы исследования для определения наличия в сыворотке крови и СМЖ: и 1цМ к Т.цопсШ («ТоксоФлюоСкрин», «ТоксоплаСтрип» и «ТоксоплаСтрип М» ООО «НИАРМЕДИК ПЛЮС»); ^А к Т.§опсШ («Век-тоТоксо-1§А» ЗАО «Вектор-Бест»); индекс авидности (ИА) («ВектоТоксо-

IgG-авидность» ЗАО «Вектор-Бест»); ДНК T.gondii («АмплиСенс® Toxoplasma gondii - FL» ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора).

Для экспериментального заражения мышей штаммами T.gondii, выделенными от пациентов с ВИЧ-инфекцией, использовали 55 беспородных мышей в возрасте 1-2 месяцев. Животных заражали суспензией из фрагментов головного мозга от двух умерших больных с диагнозом: ВИЧ-инфекция, стадия СПИД 4В, токсоплазмоз головного мозга.

В первом эксперименте были изучены особенности течения инвазии при различных вариантах заражения мышей цистами T.gondii из патологоанато-мического материала: доза (от 1><104цист/мышь до Зх104цист/мышь), способ введения (внутрибрюшинно (в/б) или подкожно (п/к)), исходное состояние иммунитета (иммунокомпетентные мыши и мыши с предварительным в/б введением циклофосфамида (ЦФ) в дозах от 150 до 400 мг/кг массы тела). Также было прослежено нахождение токсоплазм в различных органах. Во втором эксперименте изучена динамика гуморального ответа.

Для подтверждения инвазии готовили мазки из различных органов мышей (мозг, печень, селезенка и др.). Мазки окрашивали по Романовскому-Гимзе и просматривали при увеличении хЮОО на микроскопе Olympus (Япония).

Определение IgG, IgGl, IgG2a и IgA к T.gondii у мышей проводили в тест-системе «ТоксоплаСтрип». В качестве конъюгата использовали суммарные антитела к IgG мыши («Медгамал») и моноклональные антитела («Caltag»).

ДНК T.gondii в материале от мышей определяли с помощью комплекта реагентов для выделения ДНК «ДНК-ЭКСПРЕСС» (ООО НПФ «Литех») и комплекта реагентов для ПЦР-амплификации ДНК для последующей детекции методом гель-электрофореза (формат «Форез») (ООО «НПО ДНК-Технология»).

Статистическую обработку полученных данных осуществляли на персональном компьютере IBM PC с помощью текстового редактора Microsoft Of-

fice Word и табличного редактора Microsoft Office Excel для Windows XP Professional, версия 2007 года. Использовали статистические показатели инвази-рованности и заболеваемости. Достоверность показателей и их различий оценивали с помощью ошибки репрезентативности m и доверительного коэффициента (критерий «?»).

Результаты исследования и их обсуждение Оценка распространения токсоплазмоза среди пациентов с ВИЧ-инфекцией Оценка уровня распространения токсоплазменной инвазии проводилась на основании определения IgG к T.gondii в сыворотке крови. Инвазирован-ность населения Москвы и Московской области (МО) и пациентов с ВИЧ-инфекцией показана в таб. 1. Средние показатели инвазированности пациентов с ВИЧ-инфекцией во всех возрастных группах, кроме 50 лет и старше были достоверно выше, чем населения Москвы и МО. Достоверно выше и средний показатель инвазированности пациентов с ВИЧ-инфекцией, проживающих в Москве и МО, - 48,82±1,92%. Отсутствие достоверных различий в инвазированности лиц старше 50 лет может объясняться недостаточностью выборки в данной группе (является отражением современной эпидемической ситуации в отношении распространения ВИЧ-инфекции в России).

Таблица 1. Сравнение показателей инвазированности Т^опсШ населения Москвы и МО и пациентов с ВИЧ-инфекцией.

№ Группы Число лиц с IgG к Число лиц с IgG к Критерий до-

(по возрасту): T.gondii среди населе- T.gondii среди пациен- стоверности t

ния Москвы и МО, % тов с ВИЧ-инфекцией,

%

1 20-29 лет 28,32±2,70 47,5±3,5 4,34

2 30-39 лет 28,36±2,72 48,75±2,64 5,38

3 40-49 лег 35,96±5,09 51,43±5,97 1,97

4 50 лет и старше 42,39±5,15 51,16±7,62 0,95

5 Всего: 31,02±1,71 48,82±1,92 6,92

Результаты исследования показывают, что пациенты с ВИЧ-инфекцией являются группой риска в отношении заражения Т^опсШ. Вероятно, это связано с их большей восприимчивостью к паразиту на фоне снижения иммунитета или более низким санитарно-гигиеническим уровнем жизни.

Оценка распространения активных форм токсоплазмоза в обеих группах (населения Москвы и МО и пациентов с ВИЧ-инфекцией) проводилась на основании определения уровня к Т^опсШ и наличия специфических ^М.

Возможность использовать выявление различных уровней к Т^опсШ для разграничения острой инвазии и латентной была проанализирована в группе доноров - условно здоровом населении. Специфические ^О были выявлены в сыворотке крови у 37,9±2,6% доноров. При этом уровень ^О к Т^опсШ, соответствующий титру 1:64 в РНИФ и 1:6400 в ИФА был отмечен менее чем у 1% серопозитивных доноров, в то время, как уровень к Т^ошШ, соответствующий титру 1:32 и выше в РНИФ и 1:3200 и выше в ИФА, наблюдался у 6,8% серопозитивных доноров. Таким образом, за диагностический уровень к Т.допсШ, который с большой долей вероятности может свидетельствовать об активности инвазионного процесса, был принят уровень, соответствующий титру 1:64 и выше в РНИФ и 1:6400 и выше в ИФА, который не наблюдался у здоровых людей.

На основе принятого критерия разделения на диагностические и недиагностические уровни к Т^опс1н были проанализированы обе исследуемые группы - жители Москвы и МО и пациенты с ВИЧ-инфекцией. В группе пациентов с ВИЧ-инфекцией достоверно чаще выявляются высокие уровни к Т^опсШ: в 32,12±2,57% случаев против 5,7±1,54% случаев среди населения Москвы и МО (Таб. 2). Следовательно, в группе пациентов с ВИЧ-инфекцией достоверно чаще регистрируются случаи активно протекающего инвазионного процесса.

Таблица 2. Сравнение выявления высоких уровней ^О к Т^опсШ среди населения Москвы и МО и пациентов с ВИЧ-инфекцией.

№ Группы Число лиц с высоким Число лиц с высоким Критерий до-

(по возрасту): титром IgG к Т. gondii титром IgG к T.gondii стоверности t

среди населения среди пациентов с

Москвы и МО ВИЧ-инфекцией

(%) (%)

1 20 - 29 лет 6,3±2,73 47,42±5,07 7,14

2 30-39 лет 2,56±1,79 27,43±3,37 6,52

3 40 - 49 лет 15,6±6,41 16,67±6,21 0,12

4 50 лет и старше 2,56±2,53 27,27±9,49 2,52

5 Всего: 5,7±1,54 32,12±2,57 8,82

^М к T.gondii были выявлены у пациентов с ВИЧ-инфекцией в 4,59±0,8% в отличие от населения Москвы и МО, где ^М к Т^опсШ не выявлялись у лиц старше 20 лет. При этом ^М к Т^огкШ определяются как у пациентов без ^О к T.gondii, свидетельствуя о свежем инфицировании, так и у пациентов со специфическими Однако чаще ^М к Т^опсШ выявляли у лиц с высоким уровнем к T.gondii.

Для определения причин активности инвазионного процесса у пациентов с ВИЧ-инфекцией был определен ИА ^О к T.gondii. У всех обследованных пациентов, кроме одного, были выявлены высокоавидные к T.gondii, что подтверждает - развитие токсоплазмоза у пациентов с ВИЧ-инфекцией преимущественно связано с реактивацией латентной инвазией на фоне выраженного снижения иммунитета.

Определение эффективности иммунологических и молекулярно-биологических методов лабораторной диагностики токсоплазмоза при

ВИЧ-инфекции

У 50 из 51 пациента с диагнозом «церебральный токсоплазмоз» выявлены к Т^откШ в сыворотке крови. У 26 из них выявлен высокий (диагностический) уровень специфических у 24 - низкий. ^М к Т^огкШ выявлены у 1 пациента, ^А к Т^огкШ - у 35. Специфические в СМЖ выявлены у 19 человек. ДНК возбудителя выделен у 28 пациентов в сыворотке кро-

ви и у 31 в СМЖ. Результаты по определению диагностической чувствительности отдельных методов исследования представлены на рис. 1: ни один из них не обладает достаточной чувствительностью для подтверждения реактивации инвазии.

100%

60%

я £ 80%

■■L н

" О

г я

= л

¡- q

g £ 40%

u 3

S l- 20%

et a

51% 2% < ¡8,6? > : 7,3? 1 > ■4,9°/ 1 ¡0,8? >

I

и L

высокий IgM в ígA в IgG в СМЖ ДНК Т.нопсШ ДНК Т.уопс|11

уровень IgG сыворотке сыворотке в сыворотке в СМЖ

в сыворотке

Рисунок 1. Диагностическая чувствительность выявления показателей реактивации церебрального токсоплазмоза при ВИЧ-инфекции.

Комплексная оценка результатов исследований с выявлением всех показателей реактивации показала, что у пациентов с высоким (диагностическим) уровнем IgG к Т.gondii в сыворотке крови показатели реактивации выявляются чаще, чем у пациентов с низким (недиагностическим) уровнем IgG к Т.gondii (Таб. 3). Только выявление ДНК Т.gondii в СМЖ является стабильно информативным диагностическим показателем у пациентов, как с высоким, так и с низким уровнем IgG в сыворотке крови. У пациентов с высоким уровнем IgG к Т.gondii диагноз церебрального токсоплазмоза подтвержден обнаружением минимум одного показателя реактивации, а у большинства - двумя и более. Несмотря на невысокую диагностическую чувствительность лабораторных методов у пациентов с низким уровнем IgG к Т.gondii в сыворотке крови, диагноз церебрального токсоплазмоза получил лабораторное подтверждение у 22 человек из 24 данной группы.

Таблица 3. Выявление показателей реактивации у больных церебральным токсоплазмозом с низким и высоким

уровнем специфических IgG в сыворотке крови.

Пациенты с низким уровнем IgG к T.gondii (титр не выше 1:32 в РНИФ и не выше 1:3200 в ИФА) Пациенты с высоким уровнем IgG к T.gondii (титр 1:64 и выше в РНИФ и 1:6400 и выше в ИФА)

Кол-во чел. IgA в сыв. ДНК T.gondii в сыв. IgG вСМЖ ДНК T.gondii вСМЖ Кол-во чел. IgA в сыв. ДНК T.gondii в сыв. IgG в СМЖ ДНК T.gondii в СМЖ

2 - - - - 3 + - - -

2 + - - _ 1 - + -

2 - + - 2 + - + -

1 - - + - 2 + + - -

4 - - - + 4 + + - +

2 + + - - 3 + - + +

3 + - - + 2 - + + +

1 + - + - 2 + + + -

3 - + - + 7 + + + +

3 + + - +

1 + - + +

Кол-во положительных результатов, абс. (%):

24 12 (50) 10 (41,7) 3 (12,5) 14 (58,3) 26 23 (88,5) 18 (69,2) 16 (61,5) 16 (61,5)

В таблице представлены результаты по 50 пациентам с ^С к Т^опйи в сыворотке крови. Обозначения: «-» - не выявлен; «+» - выявлен.

Таким образом, комплексный подход к лабораторному обследованию больного церебральным токсоплазмозом, включающий выявление различных показателей реактивации, повышает достоверность окончательного диагноза, особенно у пациентов, имеющих низкий уровень IgG к Т.gondii в сыворотке крови. Диагностическая чувствительность различных комбинаций иммунологических и молекулярно-биологических методов представлена на рис. 2.

1 2 3 4 5 6

Рисунок 2. Диагностическая чувствительность различных комбинаций иммунологических и молекулярно-биологических методов исследования для подтверждения церебрального токсоплазмоза у пациентов с ВИЧ-инфекцией.

/ - определение высокого уровня специфических IgG и IgA в сыворотке крови и IgG в СМЖ; 2 - определение ДНК T.gondii в сыворотке крови и СМЖ; 3 - определение в сыворотке крови высокого уровня специфических IgG и ДНК T.gondii в сыворотке и СМЖ; 4 -определение высокого уровня специфических IgG в сыворотке крови, а также IgG и ДНК T.gondii в СМЖ; 5 - определение высокого уровня специфических IgG, IgA и ДНК T.gondii в сыворотке крови; 6 - определение в сыворотке крови специфических антител IgG (высокий уровень) и IgA, IgG в СМЖ, а также ДНК T.gondii в сыворотке и СМЖ.

У 19 пациентов с ВИЧ-инфекцией без диагноза «церебральный ток-соплазмоз» во всех случаях был выявлен низкий уровень IgG к T.gondii в сыворотке крови, a IgM к T.gondii не определялись. IgA к T.gondii в сыворотке крови определяли у 9 пациентов, а ДНК возбудителя - у двух. Специфические IgG и ДНК T.gondii в СМЖ были выявлены у одного пациента. Полученные данные свидетельствуют о высокой диагностической специфичности

определения высокого уровня IgG и IgM к T.gondii в сыворотке крови (100%) и показателей реактивации в СМЖ (94,7%). Более низкой диагностической специфичностью обладают определение ДНК возбудителя (89,5%) и IgA T.gondii (52,6%) в сыворотке крови.

Интересным представляются и результаты по определению показателей реактивации токсоплазменной инвазии у пациентов с ВИЧ-инфекцией на более ранних стадиях болезни (3, 4А, 4Б) без клинических признаков ток-соплазмоза. При исследовании сывороток крови инвазированных T.gondii пациентов у 25,4% выявлен высокий уровень специфических IgG, у 12,7% -IgM к T.gondii, у 69,8% - IgA к T.gondii. ДНК T.gondii была выявлена у 11,1% пациентов. При этом во всех случаях IgG к T.gondii были высокой авидности, что исключает наличие острой инвазии. Выявление маркёров реактивации у пациентов без клинических проявлений токсоплазмоза на различных стадиях ВИЧ-инфекции, вероятно, является ранним признаком начала реактивации и может служить для прогнозирования развития заболевания [Калитин А.В., 2007; Mechain В. et al., 2000].

Значение токсоплазмоза в структуре инфекционной натологии у пациентов с ВИЧ-инфекцией

Среди пациентов с ВИЧ-инфекцией на стадии СПИД 4В инвазировано токсоплазмами 55,5±2,5% пациентов. У 59,9±3,3% из них наблюдалась реактивация токсоплазменной инвазии с развитием токсоплазмоза. Вопреки устоявшемуся мнению, что реактивация токсоплазмоза наблюдается при уровне СВ4-лимфоцитов менее 100 кл/мл, у 30,7% пациентов с ВИЧ-инфекцией уровень СБ4-лимфоцитов на момент развития заболевания был выше. У одного пациента был диагностирован острый приобретенный токсоплазмоз (ИА<30%).

На основании данных патологоанатомических исследований (2 случая) и эффективности этиотропной терапии с формированием кальцификата на месте очага поражения в головном мозге (1 случай) диагноз токсоплазмоза был поставлен трем пациентам с ВИЧ-инфекцией без IgG к T.gondii.

Таким образом, в проведенном исследовании токсоплазмоз был диагностирован у 137 (34,25±2,4%) пациентов с ВИЧ-инфекцией. Высокий уровень заболеваемости среди пациентов с ВИЧ-инфекцией в Москве и МО во многом объясняется недостатками работы МГЦ СПИД: 59,9% пациентов с ток-соплазмозом состояли на учете, однако на момент госпитализации их серопо-зитивность к Т^опсШ была неизвестна и профилактика церебрального ток-соплазмоза не проводилась.

Анализ клинических форм токсоплазмоза выявил, что у 99,3±0,7% пациентов наблюдался церебральный токсоплазмоз. В 1,5% случаев поражение ЦНС сочеталось с поражением глаз (ретинит, хориоретинит), а в 2,2% случаев - с поражением легких. В 0,7±0,7% случаев был диагностирован токсоплазмоз лимфатических узлов без поражения ЦНС.

У 21,2% пациентов, несмотря на проводимую этиотропную терапию, церебральный токсоплазмоз закончился летальным исходом. Для 13,1% пациентов исход остался неизвестным: часть из них были переведена по показаниям в туберкулезные больницы, а часть отказалась от лечения. У 9,5% пациентов наблюдалась стойкая утрата трудоспособности. Значительное улучшение состояния наблюдалось только у 56,2% человек.

Анализ данных патологоанатомического отделения выявил большее число локализаций токсоплазменных поражений у пациентов с ВИЧ-инфекцией, чем было выявлено при клиническом анализе, а также другие причины высокой летальности от токсоплазмоза. У 93,75% пациентов с ВИЧ-инфекцией при патологоанатомическом исследовании диагностировано поражение ЦНС токсоплазменной этиологии. В 75% случаев церебральный токсоплазмоз протекал без поражения висцеральных органов, а в остальных случаях возбудитель Т^опсШ был обнаружен в сердце, печени, легких, селезенке и др. (Рис. 3). Наблюдались поражения как отдельных висцеральных органов, так и сочетанные. В 6,25% случаев диагностирован экстрацеребральный токсоплазмоз: ни в одном из этих случаев диагноз не был поставлен при жизни и этиотропной терапии не проводилось.

□ цнс

ШЩНС+сердце ВЦНС+легкие

□ ЦНС+сердце+легкие

□ ЦНС+сердце+печень

@ ЦНС+сердце+печень+селезенка+ почки+надпочечники

О ЦНС+сердце+легкие+надпочечни ки

Ж ЦНС+сердце+легкие+гипофиз В Печень В Сердце ВЛегкие

■ Сердце и легкие

Рисунок 3. Локализация поражений токсоплазменной этиологии у больных СПИДом (даны абсолютные значения).

Высокая летальность от токсоплазмоза среди пациентов с ВИЧ-инфекцией связана как с тяжестью течения самого заболевания, так и с недостаточным выявлением пациентов с ВИЧ-инфекций в городе Москве, неправильным направлением этих больных в медицинские учреждения, отсутствием настороженности в отношении СПИД-ассоциированных заболеваний у врачей неспециализированных отделений, в том числе и врачей туберкулезных больниц.

Изучение особенностей течения токсоплазменной инвазии на модели in vivo

В первом эксперименте наблюдали за особенностями течения токсоплазменной инвазии у мышей при различных схемах их заражения выде-

ленным от пациента с ВИЧ-инфекцией штаммом Т.gondii и определяли его вирулентность.

В первые два месяца после заражения гибели мышей не было. Наличие инвазии устанавливали по обнаружению IgG к Т.gondii. Было показано, что заражение мышей штаммом T.gondii происходило при большей иммуносу-прессии на момент заражения (ЦФ в дозе 300 и 400 мг/кг) или при большей дозе заражения (Зх 104цист/мышь). Также имел значение и способ заражения: при в/б заражении инвазия развивалась у большего числа животных, чем при п/к введении. Таким образом, интенсивность размножения возбудителя в макроорганизме (в том числе и человеческом) зависит не только от вирулентности конкретного штамма, но и чувствительности самого организма.

Обсемененность органов была настолько мала, что выявить цисты возбудителя микроскопически удалось только спустя 2,5 месяца после заражения, плотность их была чрезвычайно низкой (Рис. 4). Основным методом выявления токсоплазм в органах был метод ПЦР. Длительно (пожизненно) ток-соплазм обнаруживали в мозге мышей, в то время как внутренние органы (почки, печень, селезенка) в течение месяца освобождались от паразитов. Возможно, штаммы T.gondii, выделенные от пациента с ВИЧ-инфекцией, имеет наибольший тропизм именно к ЦНС.

Рисунок 4. Циста T.gondii в мозге мыши (увеличение *1000, окраска по Романовскому-Гимзе).

Полученные результаты показывают, что при низкой вирулентности штаммов токсоплазм эффективность паразитологических исследований крайне мала. В тоже время, использование иммунологических и молекуляр-но-биологических методов исследования позволяет более четко следить за течением инвазии в организме хозяина.

В ходе второго эксперимента была изучена динамика гуморального ответа у мышей при заражении штаммом Т.gondii (Рис. 5). Острый период инвазии в течение трех месяцев после заражения сопровождался высокими уровнями IgG и изотипов IgGl и IgG2a, а также высоким уровнем IgA. В этот же период наблюдалась гибель части мышей. Переход инвазии в латентную стадию сопровождался снижением уровней IgG и IgG2a и исчезновением IgGl и IgA.

ср. 2-2,5 3 нед. 1 мес. 3 мес. 3,5 4,5 отр. нед. мес. мес.

контр.

Время исследования, нед./мес.

Рисунок 5. Динамика выработки анттипел различных изотипов после заражения мышей низковирулентным штаммом Т.^опйИ.

Таким образом, динамика выработки антител достаточно четко маркирует стадии развития инвазии: начало инвазии, пик ее развития и переход в латентную фазу. Полученные данные подтверждают важность определения показателей гуморального ответа для диагностики и прогнозирования реактивации у пациентов с ВИЧ-инфекций.

Предложения по совершенствованию тактики диагностики и профилактики токсоплазмоза у пациентов с ВИЧ-инфекцией

В проведенном исследовании выявлен высокий уровень заболеваемости церебральным токсоплазмозом среди пациентов с ВИЧ-инфекцией. В связи с отсутствием патогномоничных симптомов заболевания, важная роль в диагностике должна отводится специфическим лабораторным методам. С учетом данных о диагностической чувствительности и специфичности выявления различных показателей реактивации, алгоритм диагностики должен выглядеть следующим образом (Рис. 6).

Высокий уровень заболеваемости и летальности от токсоплазмоза среди пациентов с ВИЧ-инфекцией обусловлен широким распространением у них токсоплазменной инвазии и высоким риском реактивации токсоплазмоза на поздних стадиях болезни. В связи с этим необходимо уделять больше внимания профилактике токсоплазмоза у пациентов с ВИЧ-инфекцией.

При постановке на учет в центр по профилактике и борьбе со СПИДом по месту жительства необходимо проводить исследование по определению 1ёС к Т^опсШ в сыворотке крови с последующим разделением всех пациентов на две группы: серонегативные и серопозитивные, тактика ведения которых должна различаться.

В отношении серопозитивных к Т^опс1п пациентов с ВИЧ-инфекцией необходимо проведение вторичной профилактики, направленной на предотвращение реактивации латентной токсоплазменной инвазии. Тактика должна быть основана на проведении скрининговых исследований с определением специфических ^О и ^А к Т^опсШ в сыворотке крови. Спектр скрининговых исследований также может быть расширен определением ДНК Т^опсШ в сыворотке крови. Выявление у пациентов хотя бы одного из показателей реактивации - высокого уровня специфических ^А к Т^опсШ или ДНК Т^опсШ - требует проведения курса этиотропной терапии (бисептол или фансидар) в профилактических дозах и повторного скринингового исследования для контроля эффективности этиотропной терапии.

Рисунок 6. Алгоритм диагностики церебрального токсоппазмоза у пациентов с ВИЧ-инфекцией.

Проведение скрининговых исследований совместно с плановым определением показателей иммунного статуса, регламентированного методическими указаниями по организации лечебно-диагностической помощи и диспансерного наблюдения за больными ВИЧ-инфекцией и СПИДом, позволит увеличивать частоту их проведения по мере снижения показателей иммунитета (Таб. 4).

Таблица 4. Сроки повторного планового обследования пациентов с ВИЧ-инфекцией в соответствии с методическими указаниями по организации лечебно-диагностической помощи и диспансерного наблюдения за больными ВИЧ-инфекцией и СПИДом.

№ Стадия Уровень С04-лимфоцитов, , Интервалы обследования,

ВИЧ-инфекции кл/мкл в неделях

>500 24

1 ЗБ,ЗВ <500 12

неизвестно 24

>500 24

2 4А, 4Б, 4В <500 12

неизвестно 12

3 Терминальная В зависимости от клинической картины

В отношении серонегативных на токсоплазмоз пациентов с ВИЧ-инфекцией необходимо проведение первичной профилактики, направленной на предотвращение заражения. Пациентов необходимо информировать о возможных путях заражения и мерах предосторожности.

В качестве мер специфической профилактики на всем протяжении наблюдения за пациентом необходимо проведение регулярных скрининговых обследований с определением и 1§М к Т.цопсШ для раннего выявления инвазии по факту сероконверсии. Учитывая более высокий риск заражения для пациентов с ВИЧ-инфекцией, чем для здоровой популяции, скрининго-вые исследования следует проводить не реже 1 раза в год.

ВЫВОДЫ

1. Выявлено широкое распространение токсоплазменной инвазии в Москве и Московской области среди пациентов с ВИЧ-инфекцией -48,82±1,92%, что в 1,6 раза выше фоновой инвазированности условно здорового населения.

2. Использование комплекса иммунологических и молекулярно-биологических методов исследования (определение в сыворотке крови к Т^опсШ в высоких титрах и ^А, ^ в СМЖ и ДНК Т.§опсШ в сыворотке и СМЖ) позволяет верифицировать диагноз в 96,1% случаев, в то время как использование только одного из них уменьшает показатель до 37,3-68,6%.

3. У 34,25±2,4% пациентов с ВИЧ-инфекцией на стадии СПИД 4В выявляются случаи токсоплазмоза, которые развиваются преимущественно в результате реактивации латентной инвазии. Среди них в 99,3% случаев диагностируется церебральный токсоплазмоз.

4. Определен высокий показатель летальности от токсоплазмоза для пациентов с ВИЧ-инфекцией даже при своевременной диагностике и лечении -21,2%. Показано, что в 9,5% заболевание приводит к стойкой утрате трудоспособности.

5. У пациентов с ВИЧ-инфекцией поражение ЦНС при патологоанатоми-ческом анализе выявляется в 93,75% случаев, а в 6,25% случаев диагностируются экстрацеребральные формы токсоплазмоза.

6. Течение токсоплазменной инвазии у мышей при заражении штаммом Т^опсШ от пациентов с ВИЧ-инфекцией сопровождалось незначительным числом случаев гибели животных в отдаленные сроки (2-3 мес.) и преимущественным поражением ЦНС.

7. Определена динамика гуморального ответа при заражении мышей штаммом Т^опсШ от пациентов с ВИЧ-инфекцией, которая четко маркирует стадию развития инвазонного процесса.

8. Разработан и внедрен в практику алгоритм диагностики церебрального токсоплазмоза у пациентов с ВИЧ-инфекцией, и сформулирована тактика

профилактических мероприятий для предотвращения заражения и реактивации латентной инвазии.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Гончаров, Д. Б. Церебральный токсоплазмоз при ВИЧ-инфекции / Д. Б. Гончаров, А. Б. Перегудова, Е. В. Губарева, С. А. Прыгина // Нейроим-мунология. - 2007. - Том 5, №2. - С.25.

2. Гончаров, Д. Б. Изучение персистенции низковирулентного 'штамма Toxoplasma gondii на модели in vivo / Д. Б. Гончаров, Е, В. Губарева, И. М. Тишкевич, Н. В. Кобец, Ю. Г. Пархоменко, Т. Г. Боровая, Б. И. Мараку-ша, Н. В. Шевлягина, А. Б. Перегудова // Журнал микробиол. - 2009. -№4. - С.107-111.

3. Губарева, Е. В. Особенности эпидемиологии и диагностики токсоплазмо-за при ВИЧ-инфекции / Е. В. Губарева, Д. Б. Гончаров, А. Б. Перегудова, Ю. Г. Пархоменко, И. М. Тишкевич, О. А. Тишкевич, Н. В. Кобец // Журнал микробиол. - 2010. - №2. - С.28-32.

4. Губарева, Е. В. Разработка подходов к созданию системы диагностики и профилактики токсоплазмоза при ВИЧ-инфекции / Е. В. Губарева, Д. Б. Гончаров, Н. В. Кобец, Т. И. Долгих, Н. А. Магда, А. Б. Перегудова, Ю. Г. Пархоменко, О. А. Тишкевич // Эпидемиология и Вакцинопрофилак-тика, - 2010. - Т. 53, №4. - С.60-65.

5. Гончаров, Д. Б. Токсоплазмоз при ВИЧ-инфекции: критерии реактивации инвазии / Д. Б. Гончаров, Е. В. Губарева, Н. В. Кобец, Э. А. Домонова, Е. С. Иевлева // Журнал микробиол. - 2012. - №.4. - С.88-92.

6. Губарева, Е. В. Использование иммунологических и молекулярно-биологических методов для диагностики церебрального токсоплазмоза при ВИЧ-инфекции / Е. В. Губарева, Д. Б. Гончаров, Э. А. Домонова, О. Ю. Сильвейстрова, А. Б. Перегудова, О. А. Тишкевич, Е. С. Иевлева, Н. В. Кобец, О. Ю. Шипулина// Мед. паразитол. - 2013. -№1. - С.7-12.

7. Губарева, Е. В. Выявление показателей реактивации токсоплазмоза у пациентов на разных стадиях ВИЧ-инфекции / Е. В. Губарева, Д. Б. Гонча-

ров, Э. А. Домонова, О. Ю. Сильвейстрова, Е. С. Иевлева, А. Б. Перегудо-ва// Инфекционные болезни. - 2013. - Т. 11, Приложение №1. - С.112-113.

8. Губарева, Е. В., Токсоплазмоз у больных СПИДом: результаты патолого-анатомических исследований / Е. В. Губарева, Д. Б. Гончаров, О. А. Тишкевич, Ю. Г. Пархоменко // Инфекционные болезни. - 2013. - Т. 11, Приложение № 1. - С. 113.

9. Губарева, Е. В. Проблемы мониторинга церебрального токсоплазмоза у пациентов с ВИЧ-инфекцией / Е. В. Губарева, Д. Б. Гончаров, Е. С. Иевлева, Э. А. Домонова, А. Б. Перегудова, О. А. Тишкевич // Нейроим-мунология. - 2013. - Т. XI, №1-2. - С.39-40.

Ю.Гончаров, Д. Б. Эпидемиология токсоплазмоза в России / Д. Б. Гончаров, Е. В. Губарева, Н. В. Кобец // Актуальные вопросы зоонозных инфекций «Эрдэм шинжилгээний бутээл»: матер, к Междунар. науч.-практ. конф. / Улаанбаатар, Монголия, 2008. - С.30-41.

П.Губарева, Е.В. Особенности и перспективы развития диагностики токсоплазмоза у ВИЧ-инфицированных / Е. В. Губарева, Д. Б. Гончаров, Н. В. Кобец, А. Б. Перегудова, И. В. Лукаш // Паразитарные болезни человека, животных и растений: труды VI Междунар. науч.-практ. конф., Витебск, Белоруссия, 25 - 26 сент. 2008. - С.32-35.

12.Губарева, Е. В. Актуальные вопросы эпидемиологии и профилактики токсоплазмоза / Е. В. Губарева, Д. Б. Гончаров, Н. В. Кобец, И. В. Лукаш / Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней: сборник науч. трудов (выпуск 9) / Москва, 2009. - С.457-462.

13.Губарева, Е. В. ВИЧ-инфекция и токсоплазмоз: персистенция возбудителя и иммунный ответ/ Е. В. Губарева, Д. Б. Гончаров, Б. И. Маракуша, Н. В. Шевлягина, Н. В. Кобец, О. А. Тишкевич, А. Б. Перегудова, Т. И. Долгих // Современные аспекты патогенеза, клиники, диагностики, лечения и профилактики протозоозов, гельминтозов и арахноэнтомозов человека, животных и растений: труды VII Междунар. науч.-практ. конф., Витебск, Белоруссия, 23 - 24 сент. 2010. - С.35-38.

14.Губарева, Е. В. Эпидемиология и диагностика токсоплазмоза у ВИЧ-инфицированных/ Е. В. Губарева, Д. Б. Гончаров, А. Б. Перегудова // Паразиты голарктики: сборник науч. статей Междунар. симпоз., Петрозаводск, Россия, 2010.-Т. 1. - С.79-81. °

Благодарности:

Выражаю свою глубокую признательность и благодарность моему научному руководителю кандидату биологических наук Гончарову Дмитрию Борисовичу за всестороннюю помощь в проведении исследования, ценные рекомендации, поддержку и понимание.

Выражаю благодарность главному врачу ГКУЗ ИКБ №2 ДЗМ В.А.Мясникову за возможность проведения исследования совместно с сотрудниками лечебного учреждения. Особую признательность выражаю А.Б. Перегудовой и O.A. Тишкевичу.

За помощь в выполнении исследования благодарю сотрудников лаборатории протозойных инфекций ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, а также Б.И. Маракушу и Н.В. Шевлягину. За помощь в проведении молекулярно-биологических исследований выражаю благодарность сотрудникам ФБУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора и особенно Э.А. Домоновой.

Считаю своим приятным долгом выразить глубокую благодарность ученому секретарю диссертационного совета доктору медицинских наук, профессору Е.В. Русаковой за помощь и участие при подготовке материалов диссертации к защите.

Выражаю свою признательность ученому секретарю ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России к.б.н. Л.К. Кожевниковой.

Благодарю своих рецензентов к.м.н. Г.А. Данилину и к.м.н. А.П. Самсонову за поддержку и помощь в рецензировании работы.

Подписано в печать: 18.04.2014 Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 950 Отпечатано в типографии «Реглет» 101000, г. Москва, Пл. Мясницкие Ворота д. 1, стр.3 (495) 971-22-77 www.reglet.ru