Автореферат и диссертация по медицине (14.00.07) на тему:Исследование реакции контактной поверхности гепатоцита при воздействии химических веществ с целью гигиенического регламентирования

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МВДИВДНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи УДК 613.632:612.354-018:612.066.3

УШАКОВ Вячеслав Федорович

ИССЛЕДОВАНИЕ РЕАКЦИИ КОНТАКТНОЙ ПОВЕРХНОСТИ ГЕПАТОЦИТА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ С ЦЕЛЫ) ГИГИЕНИЧЕСКОГО РЕГЛАМЕНТИРОВАНИЯ

14.00.07 - Гигиена 03.00.02 - Биофизика

I

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в Днепропетровском медицинском институте.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.П,11адалкин; доктор биологических наук, профессор Ю.П.Козлов; доктор медицинских наук А.И.Эйтингон.

Ведущая организация, дающая отзыв о научно-практической значимости диссертации - Санкт-Петербургский педиатрический медицинский институт.

Защита диссертации состоится * "_ 1992 г.

на заседании специализированного совета Д.084.14.05 Российского государственного медицинского университета (117513, Москва, Ул.Островитянова, д. I).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского государственного медицинского университета (117513, Москва, ул.Островитянова, д. I}.

Автореферат разослан "_"_ 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

Р.С.БОЛКОВА

ОЩАЯ ХАРАШШСША РАБОШ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБ2ЕШ. Интенсивная химизация различных областей хозяйственной деятельности, расширение ассортимента и значительное увеличение объема производства химической промышленности в последние десятилетия диктуют необходимость усиления научных и технических разработок, направленных на предотвращение неблагоприятного действия веществ, загрязняющих окружающую среду.

Трудами многих гигиенистов и токсикологов создана научно обоснованная поэтапная система предупредительных мер, призванная предотвратить неблагоприятное действие вредных веществ на организм человека. Важную роль при этом играют гигиенические нормативы (ВДК, ОБУВ и т.д.), величины которых устанавливаются на основе результатов строго регламентированных экспериментальных исследований. Однако число утвержденных в настоящее время нормативов значительно отстает от требований народного хозяйства. При потребности в комплексной токсикометрии до 1000 соединений в год, реально выполняются исследования около 100 веществ (И.В.Саноцкий, 1988). Такое отставание возможно устранить либо путем резкого увеличения объема научных исследований, проводимых с целью гигиенического регламентирования, либо путем разработки ускоренных методов нормирования. Наиболее перспективный, особенно с экономической точки зрения, является второй путь. Однако сокращение программы исследований не должно сказываться на надежное™ разработанных нормативов. Одной из рациональных возможностей повышения надежности прогнозирования гигиенических регламентов по результатам краткосрочных экспериментов является введение в схему исследований новых мето- • дических подходов, основанных на достижениях современной науки по изучению фундаментальных реакций наиболее значимых структур организма.

Актуальность исследований по указанной проблеме отражена в решениях 1-го Всесоюзного съезда токсикологов (IS86) и Всесоюзной научной конференции по ускоренным методам санитарно-гигиенического нормирования вредных веществ в воздухе рабочей зоны (1988).

Успехи последних десятилетий по изучению структуры и функций биологических мембран позволяют считать, что реакции клеток и тканей на внешние воздействия в значительной степени зависят от состояния клеточной поверхности, которая является не только важным структурным элементом, но и универсальным регулятором существенных проявлений жизнедеятельности клеток - проницаемости, межкле-

точных взаимодействий, устойчивости к повреждающим воздействиям и т.д. (К).А.Владимиров, Г.Е.Добрецов, 1980; A.A.Болдырев, 19Б5; А.Ф.Ешогар, А.Я.!.1айоре, I98G; С.В.Конев, 1987). Использование информации о состоянии клеточных мембран при изучении механизмов вредного' действия химических вещоств начато сравнительно недавно и принесло ряд важных результатов (А.А.Покровский, 1976; А.Ф.Ешо-гер, А.Я.Майоре, В.К.Залцмане, 1981; С.Н.Голиков, И.Ь.Сшюцкий, Л.А.Тиунов, 1966). Проводится поиск новых подходов для применения мембранных тестов при определении пороговых уровней воздействия 1Г.А.Красовский и др., 1989).

Важную роль в реакции эпителиальных тканей играют контактные взаимодействия эпителиоцитов, осуществляемые с помощью специализированных мембранных ультраструктур: ¡целевых, плотных и простых соединений, дэсмосом и ион слипания. Исследование структуры и функций межклеточных соединений является в настоящее время одним из наиболее успешно развиваемых разделов момбранологии в ведущих научных странах мира. Однако информацч/i о состоянии этих структур . не используется в токсикологических исследованиях и особенно при гигиеническом регламентировании содержания вродных веществ в объектах .окружающей среда.

Несоответствие уровня использования информации о состоянии контактных поверхностей клеток при гигиеническом нормировании вредных химических соединений важности контактных взаимодействий в формировании реакции ткани обусловлено, по нашему мнению, следующими причинами:

- не разработаны достаточно чувствительные количественные методы оценки состояния отдельных улътраструктур поверхностных мембран;

- не известны закономерности реагирования межклеточных соединений в зависимости от уровня и продолжительности экспозиции при воздействии вредных химических веществ на организм;

- не проведена оценка гигиенической значимости реакций ультраструктур межклеточных контактов при воздействии прамшленных веществ и возможности использования этих реакций при регламентировании.

ЦЕЛЬ К ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью работы явилось выяснение закономерностей контактных взаимодействий поверхностных мембран гопатоцитов в норме и их реакций при действии промшленнкх веществ в зависимости от уровня и продолжительности экспозиции,

выявление наиболее гигиенически значимых изменений ульграструк-тур контактных поверхностей и разработка на этой основе модели прогнозирования безопасных уровней содержания химических веществ в воздухе рабочей зоны.

Для достижения поставленной цели необходимо решить' следующие задачи: •

X. Отработать систему адекватных методических п^^одов для изучения свойств отдельных ультраструктур контактных поверхностей генатоцитов,

2. Изучить свойства ультраструктур контактных поверхностей Гепатоцитов в норме.

3. Разработать концептуальную модель контактной поверхности клетки.

4. Изучить закономерности реагирования контактных поверхностей гепатоцитов в зависимости от уровня и продолжительности экспозиции химических веществ с известным характером действия.

5. Исследовать токсичность, опасность и характер действия ряда новых промышленных веществ с учетом реакции поверхностных мембран гепатоцитов с целью гигиенического нормирования их содержания в воздухе рабочей зоны.

6. Разработать модель прогнозирования безопасных уровней содержания промышленных веществ в воздухе рабочей зоны на основе регистрации нарушений контактных взаимодействий поверхностей гепатоцитов.

НА ЗАВДТУ ВЫНОСЯТСЯ:

- концептуальная модель контактной поверхности гепатоцита-как целостной механической системы (модель основана на собственных результатах по изучению механических свойств межклеточных соединений и анализе современных сведений о структуре и функциях ультраструктур клеточной поверхности);

- доказательство существования универсальной реакции контактных поверхностей гепатоцитов при воздействии химических веществ, отличительными особенностями которой являются зависимость уровня реакции от интенсивности воздействия и различная чувствительность отдельных ультраструктур поверхности;

- научное обоснование способа ускоренного гигиенического нормирования промшленных химических веществ, основанного на оценке реакции контактных поверхностей гепатоцитов при однократном воздействии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. С помощью разработанных методов впервые изучены механические свойства ультраструктур поверхностей гепатоцитов. Анализ данных литературы и собственных исследований позволил разработать новую концептуальную модель контактной поверхности гепатоцита, по которой ультраструктуры межклеточного контакта с помощью подаембранных микрофиламент . объединены в целостную механическую систему. Точками отсчета в этой системе являются десмосомы, жестко связанные с цитоскелетом. Наиболее механически подвижными являются плазматическая мембрана в области простого соединения и щелевые соединения, наименее лабильны десмосомы. Межклеточные соединения распределены в ряд по возрастанию адгезионной прочности. Поверхность гепатоцита обладает свойствами текучести и'упругости.

Изучение влияния ряда модельных химических веществ (четырех-хлористый углерод, аллиловый спирт, трихлорэтилен, стирол, конка-навалин А, фенобарбитал и др.) на поверхность гепатоцита позволило выявить универсальную реакцию контактной поверхности гепатоцита, основными особенностями которой являются рост числа ультраструктур, вовлеченных в ответ'ткани на воздействие, с увеличением интенсивности экспозиции и различная чувствительность межклеточных соединений. Наиболее функционально лабильными являются низкоадгезивные участки простого соединения, менее чувствительны высокоадгезивные участки, недифференцированная часть простого соединения и десмосош. Наиболее устойчивы к воздействию химических веществ щелевые соединения, зоны слипания и плотные соединения. Установлен минимальный уровень ответной реакции ультраструктур поверхности клетки, позволяющей оценивать величину порога вредно-■ го действия веществ на печень. Наибольшую гигиеническую значимость имеют изменения контактных взаимодействий мембран в области простых соединений.

Получены регрессионные уравнения, связывающие величину порога острого' действия, установленного по реакции поверхности гепатоцита, со значением гигиенического норматива (1ЩК). Предложен способ прогнозирования ЦЦК в воздухе рабочей зоны для веществ, обладающих избирательным действием на печень. Способ основан не оценке реакции контактной поверхности гепатоцита при однократном ингаляционном воздействии.

ВНЕДРЕНИЕ В ИРАКЖКУ. I. В результате проведенных исследований обоснованы 8 ЦЦК и I ОБУВ для химических веществ в воздухе ра-

бочей зоны (3-аллия-3-этил-4~кетс-5(1 -аллилдагг.дрохян о л где н-4' '--этклпден)-4',5' -да^зш^л-лазсяияотаазолоцканинэотлсульфат (сенсибилизатор С2); -бис-Стршэтнл)-2,5-дгметул-п-ксилилендиам-моняй хлорид СИ!ДК); диаллиловый эфир изофтаяевоЗ кислоты (ДЗЙ); я,н' - метплен-бкс(з ншшюульфс«л,шропионашд) (!.13СП); 1,3-ди-метил-5(3' -иеЕ1ляирралидпнилздеп-2 '-этиляде.ч) -ижщазояздинтион--(2)-СК (4) (сенсибилизатор С1); дитозилат-3,3'[1 ",2'-бис(зтокси) эгален-бие С 1-зтил-2^летш1-5-хлорбензпмидазслля].(активатор); гяд-роксялЕМИн сернокислый, оксид кальция, цинк углекислый основной).

2. Результаты по изучению свойств ультраструктур контактной поверхности гепатсцита отражены в коллективной монография "Ст^ук-тура и функции межклеточных контактов" под общей редакцией В.К. Архипенко к Я.Г.Малвнкова (Киев, "Здороз'я", 1982).

3. Получена 2 авторских свидетельства и 2 положительных решения по заявкам на изобретения.

4. Разработанный подход к исследованию влияния химических ве-щестз на поверхностную мембрану гепатоцитов послужил основой для введения в ''Методические указания по установлению ориентировочных безопасных уровней воздействия вредных веществ в воздухе рабочей зоны" Ш., 1565) сценки состояния мембран гепатоцитов при определении ОБУЗ гепатотоксических веществ. '

5. Материалы, пасенные в работе, кепольэузтея в курсах гистологии, патологической анатомии и урологии пра обучении студентов Днепропетровского медицинского института.

ПУБПИКАЗИ. По теме диссертации опубликовано 45 работ в журналах, сборниках, монографии, а также в материалах съездов и конференций.

АПР0БЩ-1Я РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОШ. Материалы диссертации доложены и обсуздены ка: 9-м Цездународком съезде геронтологов (Киев, 1972); Ь-ел Зсссопзнси съезде АГЗ (Ташкент, 1574); 6-й Украинской Республиканской конференции АГЭ (Терлополь, 1075); 2-й Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Таллинн, 1Э7Э); Первой Всесоюзной школе по морйшатрии (Днепропетровск, 1584); 1-м и 2-м съездах АГЗ УССР (Винница, 1^50, Полтава, 1985); 10-4.1 Всесоюзно;,! съезде АГЭ (Винница, 1956); Первом Всесоюзном съезде токсикологов (Ростов-на-Дону, 1386); Всесоюзной конференции "Регуляция тканевого гомеостаза" (Тбилиси, 1387); Всесоюзное конференции "Ускорешше метода санитарно-гигиенического нормирования вредных веществ в воздухе рабочей зоны" (Ереван, 1988); заседаниях Днепропетровске»-

го областного общества токсикологов <1987-1991); на секции "Промышленная токсикология" Всесоюзной Проблемной Комиссии "Научные основы гигиены труда и профпатологии" (IS84-I99I).

Апробация диссертационной работы проведена на объединенном заседании областных обществ токсикологов, анатомов, гистологов и эмбриологов, кафедр медико-биологической физики, гистологии, анатомии человека, оперативной хирургии и топографической анатомии, биологии, общей гигиены и ЩШ Днепропетровского медицинского института 27 декабря 1991 года.

ОТЕШУРА И ОВЕЕМ. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, указателя литературы и приложений.

Диссертация изложена на 451 страницах машинописи, иллюстрирована 59 таблицами, 54 рисунками и 56 приложениями.- Указатель литературы содержит 543 источника, в том числе 237 отечественных в- 306 иностранных.

ШЕШАЛЫ, МЕТОДЫ И 0EHEU ИССЛЕДОВАНИЙ. Ддя решения поставленных задач проведены исследования ультраструктуры поверхностей гепатоцитов в норме, при воздействии 10 модельных веществ, изучены токсичность, опасность и характер вредного действия 9 внедряемых в промышленность веществ с учетом реакции контактных поверхностей гепатоцитов.

Исследования проведены на 7320 белых крысах, 850 мылах, 420 морских свинках и 35 кроликах. Животных содержали в виварии Днепропетровского медицинского института на стандартном пищевом рационе.

Изучение вредного действия веществ проводили при различных путях поступления в организм экспериментальных животных - ингаляции, введение в желудок, аппликации на кожу и слизистые оболочки глаз в соответствии с "Методическими указаниями к постановке исследований для обоснования санитарных стандартов в воздухе рабочей зоны" (* 2163-80).

Состояние животных после ингаляционного воздействия оценивали с помощью интегральных тестов и показателей, отражающих состояние важнейших органов и систем. В качестве интегральных показателей использовали: массу животных, двигательную активность в открытом поле, спонтанную и модифицированную двигательную активность в актографе, норковый рефлекс, работоспособность, скорость потребления кислорода, силу пищевого ре$иикса и суммационно-пороговый показатель.

Силу пшевого рефлекса, оцениваемую по времени побежки, реакции, открывания ДЕери и количеству сшибок, двигательную активность в актографе, скорость потребления кислорода и работоспособность определяли с помощью разработанной совместно с А.П.Королевым автоматизированной системы "Политес?". Поведенческие реакции исследовали в соответствии с "Методическими рекомендациями по использованию поведенческих реакций животных в токсикологиюских исследованиях для целей гигиенического нормирования" (№ 2166-80). Суммационно-порого-вый показатель определяли по методу И.З.Сперанского (1965).

для оценки состояния сердечно-сосудистой системы .записывали злектрокардиогра'.глы с помощью энцефалографа и определяли систолический показатель по Л.Е.Чернобай (1980), частоту сердечных сокращений и величины интервалов PQ, QS, QT, вн.

Частоту дыхания, качественный и количественный состав смывов с верхних дыхательпых путей и легких использовали для оценки состояния дыхательной системы в соответствии с "Методическими указаниями к постановке исследований по изучению раздражающих свойств и оооснованию предельно допустимых концентраций избирательно дейо-твуших раздражающих вешеств в воздухе рабочей зоны" U 2153-ЬО).

При хронических ингаляциях определяли гемоглобин, число эритроцитов к ле^жоцктов периферической крови, осмотическую резистентность эритроцитов U.A.Базарова, I3S2; Я.К.Иванов, Ф.И.Комаров,. Б.&.Коровник и др., IS75).

Функциональное состояние печени оценивали с помощью гпллуро-вой пробы, характеризующей детоксикационную функцию, и определения активности спец1*.фпческ1ц: и неспецифических ферментов в сыворотке крови: фруктозшокофосфатальдолазы (ШФА), аланик- и аспартатамь-потрансферазы (iuIT, ACT;, лактатдегидрогеназы ЦДГ) и щелочной фос;атазы Б.Г.Колб, В.С.Камьшников, 1976).

для оценки мочеаиыообразовательной функции печени и водо-, соде- и азотовыделительной функции почек определяли концентрации мочевины в крови моче, клиренс мочевины, суточный диурез, экскрецию белка и хлоридов (¿1,И.Иванов, Ф.И.Комаров, В.й.Коровккн и др., 1975; К.М.Трахтенбзрг, Л.А.Тимофиевская, И.Я.Квятковскас, 1987).

Изучение свойств ультраструктур поверхности гепатоцита проведали с помощью просвечивающей электронной микроскопии. Ткани фиксировали путем погружения кусочков печени в раствор глутарового альдегида или с помощью перфузии органа раствором фиксатора при

низком (IQ-I5 мм рт.ст.) и повышенном давлении (45-50 да рт.ст.) по разработанной нами методике (В.Ф.Ушаков, 1982). Кусочки печени постфшссировали четырехокисъю осмия, контрастировали уранилацета-том, обезвоживали в этиловом спирте и заключали в зпонаралдитную смесь. Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме JUTH-3. Срезы дополнительно контрастировали цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе 3ÎB-IQ0 АК.

При электронномикроскопическом исследовании измеряли линейные размеры ультраструктур клеточной поверхности с помощью морфо-метрической сетки, нанесенной на люминисцентный экран микроскопа. Определяли длины высокоадгезивных (В¿.У), низкоадгезивных (НАУ) участков и недифференцированной части (НПС) простого соединения, зоны слипания (ЭС), щелевого (ЩЗ) и плотного соединений (ПлС); подсчитывали количество Ш, ВАУ, НАУ, НПС и десмоссы (Д), приходящихся на 10 мкы сечения контакта, расположенного мездт синусо-идным капилляра! и желчным канальцем. Для оценки распределения межклеточных соединений на контактной поверхности гепатоцита измеряли расстояния мезду серединами ВАУ, НАУ, ШС, Д и зоной слипания. Измерения проводили на 20 сечениях контактов у каждого животного.

деформируемость клеточной поверхности определяли по разработанной нами методике (В.Ф.Ушаков, С.Д.Крамарь, Д.А.Еалпенко, Н.П. Грша, 1986) путем подсчета количества тест-точек планиметрической сетки, приходящихся на впячивания поверхности. Впячивания образуются при повышенном внутриорганнсм давлении на васкулярной и контактной частях поверхности гепатоцита. Измерения проводили на полутонких срезах, окрашенных метиленовым синим и основным фуксином, в 6 полях зрения (объектив 40, окуляр 10).

В конце хронического эксперимента и после восстановительного периода сотрудниками нашей лаборатории Л.А.Палиенко и Н.П.Гришой. выполнены гистологические исследования легких, печени, селезенки, почки и сердца в соответствии с "Методическими рекамендациямп к проведению морфологических исследований при экспериментальном обосновании гигиенических нормативов вредных веществ в воздухе рабочей зоны" (2939-83).

Статистическую обработку результатов измерений проводил!; по программам, составленным для микроЭШ Электроника ¡¿К—61 и tirC-54. Расчет уравнений регрессии выподне:: на зш ibiî pc/at zsitboh.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОШ

УЕЬТРАСТРУКТУРА И МЕХАНИЧЕСКАЯ МЩЕЩЬ КОНТАКТНОЙ ПОВЕРХНОСТИ

ГВПАТСВДТА

Ультшотруктура поверхностей гепатоцитов в ноше. Поверхность гепатоцита разделена на три части: базальную (ваокулярную), обращенную к санусоидному капилляру; латеральную', контактирующую с соседними гепатсцитамз, и апикальную (билиарную), образующую желчный каналец, Васкуляркая часть поверхности гепатоцита имеет большое количество микровыростов и вместе -с поверхностью эндотедиоцита образует пространство Диссе. Микровыросты часто пересекают пространство Диссе и контактируют с эндотелиоцитами' при помощи простых соединений. Этот тип межклеточных соединений обеспечивает также взаимодействие поверхности клетки Купфера с гепатоцитами, эндотелиоцитами и клетками крови. Апикальные части поверхностей соседних гепатоцитов образуют стенки желчного канальца.

Контактные поверхности гепатоцитов образуют пять видов межклеточных соединений: простое, плотное, щелевое, десмосому и зону , слипания. Наибольшую долю (86,2^) латеральной части поверхности занимает простое соединение, которое образовано двумя комплементарными мембранами, отстоящими друг от друга на расстоянии 15-25ш. Межмем бранный промежуток представляет собой слившиеся гликока-ликсы соседних клеток, под мембранами расположена сеть актиновых микрофгламент.

Щелевое соединение занимает Ъ,1% контактной поверхности гепатоцита и встречается на разных расстояниях от желчного канальца. Оно не является жесткой структурой, так как часто образует впячи-ванпя типа "замка".

Плотное соединение расположено у апикальных полюсов клеток с занимает 3,1% латеральной поверхности гепатоцита. У желчного канальца за плотным соединением расположена зона слипания, которая занимает 3,8"? контактной поверхности гепатоцита. Цитоплазмагическая сторона плазмолеммы в области зоны слипания является местом прикрепления большого числа актиновых микрофиламент, образующих алек-тронноплотныи подаэмбранный компонент.

Десмосома занимает ±,В% контактной поверхности гепатоцита и может быть расположена на любом расстоянии от плотного соединения. Мелыембранный промежуток десмосомы заполнен филаментозным содержимым. Злектронноплотная подмембранная площадка является местом при-

крепления как промежуточных тонофиламент, так и актиновых подмемб-ранных микрофиламент. Регулярные десмосош вместе с зоной слипания и плотным соединением образуют соединительный комплекс в непосредственной близости к желчному канальцу.

Механические свойства ульттастоткттр поверхности гепатопита. Для изучения подвижности клеточной поверхность и ее отдельных ульг-траструктур, сравнения по адгезионной прочности межклеточных соединений, а также для идентификации ультраструктур при количественной ыорфометрической оценке их состояния мы использовали фиксацию печени при повышенном внутриорганном давлении.

Повшение внутриорганного давления до 50 мм рт.ст. с блокированным оттокам приводит к расширению синусбидных капилляров и резкому уменьшению количества микровыростов на васкулярной части поверхности гепатоцитов. В пространстве Диссе сохраняются лишь единичные микровыросты, контактирующие с эндотелиоцитами простыми соединениями. На поверхности гепатоцитов образуются деформированные уча-стки-вшгчивания округлой формы, которые могут глубоко внедряться в клетку. Уменьшение числа микровыростов и появление впячиваний означает способность поверхности гепатоцита перетекать под действием нагрузки из одной части клетки в другую, вокруг внутриклеточного содержимого. Свойство тангенциальной подвижности .характерно для всей базолатеральной части поверхности, поскольку впячивания образуются и на контактной поверхности клетки. На билпарной поверхности впячивания не образуются.

Повдаенное давление жидкости раздвигает соседние гепатоциты со стороны синусоидного капилляра, вызывая расхождение их контактных поверхностей и испытывая.на прочность все межклеточные соединения, расположенные между синусоидным капилляром и желчным канальцем. В области простых соединений поверхности соседних гепатоцитов расходятся неравномерно, демонстрируя неоднородность адгезионных свойств латеральной части плазмолецмы. Разошедшиеся при механическом разьединении соседних клеток участки простого соединения мы назвали низкоадгезивными (НАУ). Сохранившиеся участки, ограниченные с двух сторон зонами разошедаегося контакта, названы .высокоадгезивными (ВАУ).

НАУ встречаются в различных местах сечения между пространством Диссе и плотным соединением. В среднем они находятся на расстоянии 3,14+0,13 икм от соединительного комплекса, и имзпт различные протяженности, которые в среднем составляют 0,81+0,05 ¡.дм. Ши-

рта НАУ также значительно варьирует и составляет 0,33^0,04 шм. Ка 10 икм сечения контакта приходится 5,05+0,36 НАУ. В области НАУ встречаются впячивания различной формы,■ которые отражают способ--ность клеточной поверхности к значительным локальным и генерализованные латеральным деформациям.

Высокоадгезивные участки простого соединения удерживают на расстоянии 10-20 нм мембраны соседних гепатоцитов. Зона разрушения контакта при разъединении клеток обходит эти участки. Межмембранный промежуток заполнен веществом с низкой электронной плотностью, выполняющего роль межклеточного цемента. Прочность связи на разрыв в некоторых (высокопрочных) ВАУ оказывается достаточной для отделения фрагмента одной клетки и разрыва клеточной поверхности. Длина £&У составляет 0,44+0,02 мкм, число ВАУ на 10 мкм сечения контакта 3,00+0,34, расстояние до соединительного комплекса 3,58+0,13 мкм.

Встречаются сохранишиеся участки простых соединений, до которых зона разрушения контакта дошла только с одной стороны. Поо-кольку в этих участках не выявлены Е1У в НАУ, ш назвали их недифференцированной частью простого соединения (НПС). Длина НШ составляет 1,14+0,07 мкм, число НПО, приходящееся на 10 мкм сечения контакта, равно 3,20+0,28 мкм. Расстояние до соединительного комплекса 1,73+0,15 мкм.

Под воздействием механической нагрузки контактные поверхности. расходятся в некоторых случаях до плотного соединения. При этом плотное соединение никогда не разрушается, что свидетельствует о зысокой прочности связи мембран в соединении. Длина плотного соединения равна 0,2Х±0,02 мкм. В области зоны слипания мембраны рао-ходятся без нарушения их целостности. Длина зоны слипания составляет 0,24+0,02 мил.

Структура щелевого соединения не изменяется при повышенном внутрлорганном давлении. Встречаются ограниченные мембраной фрагменты одной клетки, которые присоединены к поверхности другой клетки щелевым соединением. Это свидетельствует в пользу представления о прочной механической связи плазмолемм в соединении. Длина щелевого соединения составляет 0,78+0,03 мкм. На 10 мкм сечения контакта приходится 0,63+0,28 соединений. Среднее расстояние до соединительного комплекса равно 2,41+0,28 мкм.

Десыосомы при повышенна/ давлении встречаются по всей латеральной поверхности гепатоцита. На 10 мкм сечения контакта прихо-• дится 2,03+0,21 десмосом. Чаще всего они встречаются у желчного

- ±а -

канальца» Среднее расстояние до соединительного комплекса равно . 2,16+0,24 мкм. Под действием механической нагрузки у части десмо-сш злектронноплотные цитоплазнатические площадки вытягиваются, образуй стреловидные фигуры, и поворачиваются вокруг оси, проходящей через центр межмеибранного промежутка перпендикулярно плоскости среза. Это означает, что в области повернутых десмосом существуют сдвиговые напряжения, которым эти структуры противостоят. Хорошо выявляются пучки подповерхностных тонофиламент, которые ориентированы вдоль клеточной поверхности и соединяют отдельные десмосомальные площадки. .

Сравнение распределения щелевых соединений и десмосом на контактной поверхности при низком (10 мм рт.ст.) и повкаениом (50 ил рт.ст.) внутриорганнал давлении позволило установить, что щелевые соединения под нагрузкой не разрушаются и смещаются вдоль клеточной поверхности к келчноыу канальцу, десмосомы не смещаются, а разрушаются на месте. Это свидетельствует о невысокой прочности связи мембран в десмосоме и ее закрепленности в определенном месте клеточной поверхности.

Для оценки обратимости дефорлацш; поверхности гепатоцита мы после повыиения внутри органного давления до 50 и.; рт.ст. провели фиксацию печени при низка: давлении (10 мм рт.ст.). Оказалось, что впячивания клеточкой поверхности исчезли, восстановились микровыросты на васкулярной поверхности и исходное расстояние б простил соединении. Таким образом, базолатеральная поверхность гепатоцита при наложении и снятии нагрузки ведет себя как квазиупругое тело -ее форма полностью восстанавливается после значительных деформаций.

Ультра структура поверхности гепатотшта пта механическом разрушении ткани. Для оценки механических свойств поверхности гепатоцита мы кроме мягкого воздействия при поввпенном давлении е кровеносном русле печени разрушали кусочки печени струек изотонической жидкости. Часть клеток при эта; разрушалась, оставляя свои латеральные поверхности в контакте друг с другом. Хорошо сохранились плотные соединения, зоны слипания, десмосомы и щелевые соединения. Расстояние между мембранами простого соединения остается неизмененным на большей части латеральной поверхности. Несмотря на жесткое механическое разрушение поверхностные микрофпламенты остались прикрепленными к цитоплазматической стороне плазмолеммы. Особенно много микрофиламент остается у билиарной поверхности, плотного соединения и зоны слипания. Прочно прикреплена к плазмолемие цитоплазма-

тическая площадка дескосомы.

Полученные результаты свидетельствуют об относительной механической автономности поверхностей гепатоцитов, образующих прочно связанную систему плазмолемм клеток, межклеточного цемента и подповерхностных микрофиламентов. Внутриклеточные органеллы слабее связаны с клеточной поверхностью, чем поверхности соседних клеток друг с другом. Это послужило одной из предпосылок к построению концептуальной модели поверхности гепатоцита.

Механическая модель поверхности контактирующих гепатонитов. Анализ результатов исследования свойств отдельных ультраструктур при механических нагрузках на ткань позволил построить следующую концептуальную модель поверхности гепатоцита. Поверхность гепатоцита разделена на два относительно независимых домена - базодате-ральный и апикальный. Апикальный домен более устойчив к механическим воздействиям за счет мощного слоя подповерхностных актиповых микрофиламент, прочно прикрепленных к плазмолемме. Базолатераль-ный дален более механически лабилен и неоднороден. Участки мембран базальной (васкулярной) части легко перемещаются в НАУ латеральной части при нагрузке и возвращаются после снятия нагрузки, т.е. представляют собой двумерное тело, обладающее свойствами текучести и упругости. Упругие свойства обусловлены, повидимому, прочно прикрепленными к зйазмолемме актиновыми микрофиламентамп. Текучесть зависит от состояния фосфолипидного бислоя мембраны. Латеральной подвижностью обладают и щелевые соединения.

Десмосомы представляют собой относительно неподвижные точки на контактной поверхности гепатоцита. Они объединены друг с другом я укреплены в цитоскелете с помощью промежуточных филамент диамез> ром 10 км. Тонкими филаментами диаметром 4-7 нм десмосскальные ци-топлазматические площадки присоединены к подповерхностной системе контрактильных и/или удерживающих актиновых микрофиламент. Актино-вые микрофиламенты прочно скреплены с белками плазмолеммы, участвующими в образовании отдельных ультраструктур поверхности. Это позволяет поддерживать упорядоченное распределение межклеточных соединений на клеточной поверхности.

Таким образом, десмосомам отводится особая роль опор или точек отсчета, закрепленных в цитоскелете, относительно которых ориентированы остальные соединения. Симметрия структуры десмосом позволяет согласовывать двигательную (пли удерживающую) функцию подповерхностных микрофиламент соседних клеток. Обязательное участие десмо-

Схема контактной поверхности гепатоцита. Объяснения в тех.с те.

сои в соединительных комплексах, ограничивающих полость желчных канальцев, означает крепление зон слипания и плотных соединений на контактной поверхности клеток. Еелчный каналец оказывается подвешенным на опорах - десмосомах в определенном участке поверхностей контактирующих клеток.

В соответствии с предлагаемой моделью клеточной поверхности, промежуточные тснофиламенты, подповерхностные актиновые микрофила-менты и ультраструктуры межклеточного контакта объединены с помощью десмос cu в скелет паренхимы печени, ста часть тканевого скелета участвует в распределении активных и пассивных механических нагрузок в тканиi является основой для упорядоченного расположения надмолекулярных комплексов - ультраструктур клеточной поверхности; определяет полярность и взаимное расположение клеток. Нельзя заранее' исключить важную информационную роль такой интегрирующей системы, поскольку передача дефорлационных (механических) сигналов на большие по сравнению с одной клеткой расстояния в невозбудимой ткани может оказаться гораздо экономичнее и быстрее, чем с помощью ионов или других (например, химических) сигналов.

■ Контактные поверхности .гепатоцитов гетерогенны по адгезионным свойствам. Максимальную прочность на разрыв имеет связь мембран в плотных,' щелевых соединениях и высокопрочных ВАУ. Менее прочны обычные ВАУ, десмосомы и зоны слипания. Самая слабая связь мембран в НАУ.

Различив адгезионных свойств обусловлено разнообразием в способах механического связывания и молекулярного состава мембран в отдельных соединениях. В простом соединении (ШС, ВАУ, НАУ) механическая связь осуществляется с помощью материала с низкой электронной плотностью, образованного слившимися гликокаликсаш поверхностей и обладающего свойствами межклеточного цемента. В высокопрочных ЗАУ связь усилена за счет точечных слияний мембран. В состав цемента входит молекула клеточной адгезии 105 кД и, возможно, фибронектин (W.Evans, С.Enrich, 1989). В состав мембран простого соединения входят глккопротеины 60, 180 и 200 кД (с.Enrich, e.G. Ganberg, 1985), назначение которых еще не определено. Отличие адгезионных свойств ВАУ и НАУ простого соединения-скорее всего обусловлено неоднородностью распределения вдоль латеральной поверхности молекул клеточной адгезии. С помощью ВАУ осуществляется не только взаимодействие латеральных поверхностей соседних гепатоцитов, но и фиксация эндотелиальных клеток в определенном положении относите-

льао гепатоцитов и контактирование отростков клеток Купфера с поверхностью гепатоцита.

В десмосоыах плазмолеымы соседних клеток связаны материалом, имеющим михрофаламентоэную структуру (2 ны) и включающим молекулы клеточной адгезии - десмоглеины Г2, Гд (110—139 кД, C.J.Skerrow, I«Hanter, D.Skerrow, 1987). В зоне слипания связь мембран осуществляется С помощью увоморулина. (120 кД, K.Boiler, B.V/estweber, Е. КевЬех, 1985).

В щелевом соединении клеточные поверхности связаны слитыми посередине межклеточного промежутка коннексонами. Коннексоны принадлежат разным мембранам, пронизывают их насквозь и состоят из 6 коннексйнов - белков, имеющих массу 27 кЦ (A.Wamer, 1988). Природа сил связи коннексонов неизвестна.

Прочная механическая связь в плотном соединении обеспечивается- одной или двумя слиннишся по отдельным точкам фибриллами, в состав которых входят, вероятно, белки 34, 37 и 92 кД (в.Н.Stevenson, D.A.Goodenough, 1984). В структуру плотного соединения входит так-хе белок ZO-I (225 кД, J.M. Anders од. et al., 1988).

. Молекулярные механизмы связи мембран с подповерхностными фи-ламентамя в отдельных ультраструктурах интенсивно изучаются. В области зоны слипания прикрепление актиновых микроткламентов к цито-плазматической стороне плазмолемж, вероятно, осуществляется с по-мощю винкулина (130 кД, Z.Avaur, J.V.Saall, B.Geiger, 1983). Ф-актин соединительного комплекса, повидшому,■сливается в пучки с помощью «-актинина (В.Geiger et al., 1981).

Природа механической связи всех элементов демосом (мембраны, цитоплазмагической площадки и филаиентов) находится в настоящее время в стадии исследования. Промежуточные филаменты, вероятнее всего, крепятся к цитоплазматической площадке с помощью десиопла-шшов Д| (250 кЮ и Jig (215 кД, E.Sungger-Brändle et al., 1988). Десыоглеин Tj (150 кД) - интегральный гликопротеин, имеющий фрагменты как в межклеточном промежутке, так и в цитоялазматической пяшадке (В.вoyer, J.P.Thiery, 198Э), может прикреплять площадку к мембране. Плактоглобин Д3 (83 кД) также могет участвовать в прикреплении площадки, так как он располагается блхже всех к мембране из десм'оплакинов (H.Ghlda et al., 1983).

По мере уточнения сведений о молекулярной структуре и механизмах функционирования ультраструктур клеточной поверхности предлагаемая модель естественно будет совершенствоваться. Существенным

отличием механической модели от известных является включение в нее доступных сведений (полученных нами и литературных) о механических свойствах отдельных ультраструктур поверхностей гепатоцитов, известных механизмах адгезионных свойств мембран в межклеточных соединениях и их взаимодействия с подповерхностными шшрофиламентами. Представление о поверхности контактирующих клеток как о единой механической системе, включенной с помощью дёалосом и подповерхностных микрофиламентов в тканевой скелет, полезно при изучении разнообразных морфогенетических процессов и при оценке реакции тканей на воздействия вредных химических веществ.

РЕАКЦИЯ ПОВЕРХНОСТНОЙ МЕМБРАНЫ ГЕПАТОЦИТА ШИ ВОЗДЕЙСТВИИ

МОШЫЖ ХИШЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ

Использование реакции поверхностной мембраны гепатоцита для оценки характера вредного действия и пороговых уровней воздействия новых химических веществ предполагает в первую очередь изучение влияния на клеточную поверхность веществ с известным характером действия.

Мы исследовали влияние на поверхность гепатоцитов широко используемых в науке модельных гепатотоксических веществ - четырех-хлористого углерода в аллилового спирта; известных промышленных Еещсств, действующих на печень - стирола и трихлорэтилена; промоторов опухолей печени - фенобарбитала и дихлордифекилтрихлорэтана (ДЕТ); веществ изменяющих состояние клеточной поверхности - эти-лендиаминтетраацетата (ЗДТА) и конканавалина А, а также веществ, обладающих гепатопротекторяыми свойствами - контактина и катрэк-са.

Это позволило выявить наиболее чувствительные показатели состояния поверхности гепатоцита, определить диапазон, направленность и гигиеническую значимость изменений показателей, оценить ' характер дозовой зависимости регистрируемого эффекта, выявить неспецифические рроявлекля и частные особенности в реакции мембраны на воздействие химических веществ,' уточнить механизмы действия веществ на гепатоцита.

Через 18 часов после однократного ингаляционного воздействия СС14 в концентрации 100+5,7 мг/м3 обнаружены наруления адгезионных взаимодействий и реологических свойств поверхностной мембраны в области простого соединения и перестройка кератинового цитоскелета. НАУ, ВАУ и НПС сдвинулись от желчного канальца. Параллельно наблюдали в сыворотке крови снижение содержания глюкозы, повшение ак-

тивнэсти AU il ДЦГ. При минимально действующей концентрации 40,0+ +4,5 мг/м^ изиенения ультраструктур простого соединения аналогичны, но менее выражены, возросла активность ШОк в сыворотке крови. Эта концентрация гораздо нихе установленного Ь1вао по интеграль-нш показателям (1200 мг/м3; И.П.Уланова, 1971), что свидетельствует о наличии избирательного гепатотоксического действия.

Для оценки избирательности эффекта промышленных ядов И.В.Са-ноцким, Н.Г.Ивановым и Г.Г.Максшовыы предложено использовать "зону острого специфического действия" (zac ер ), величина которой равна отношению порога острого действия по интегральным показателям к порогу острого специфического действия. При z >1 ве-

ас sp

щество обладает выраженным специфическим действием, если z -

зс sp

= I, то вещество умеренно влияет на выбранный орган или систему, при zac Sp < I вещество не оказывает избирательного действия. Б соответствии с этой классификацией СС14 обладает выраженным ге-патотоксическиы эффектом.

При внутрижелудочном введении CCI^ (60 в 600 мг/кг) выявлено увеличение деформируемости клеточной поверхности, что подтверждает результаты, полученные при ингаляциях, и данные других авторов (В.АЛ1курупий, 1975; J.îi.Jaaes et al., 1985).

После воздействия аллилового спирта в концентрации 133+3,5 мг/м3 изменения ВАУ и НАУ имеют тот *е характер, что и при ингаляциях СС14: перестраивается кератиновый цитоскелет, ультраструктуры контактной поверхности сдвинулись от желчного канальца, увеличилась деформируемость плазмолешш, изменился показатель пробы на синтез гилпуровой кислоты, активность щелочной фосфатазы и содержание глюкозы в крови. После воздействия вещества в концентрации 78±7 мг/м3 обнаружен сдвиг НАУ, ВАУ и десмосом относительно желчного канальца, повышение активности ЛДГ и содержания холестерина в крови.

Полученные результаты позволяют считать концентрацию 78 мг/м3 близкой к sp, установленного по изменению показателей сос-

тояния печени. bimac по изменениям функций печени, нервной и дыхательной систем составляет 140 мг/м (Ы.В.Бидевкина, 1986). Таким образом, аллиловыЯ спирт относится к веществам с выраженным избирательным действием на печень ( zac sp > I ).

Изменения контактных взаимодействий гепатоцитов в области простых соединений после воздействия трихлорэтклэка в концентрации 2575 мг/м3 аналогичны изменениям после ингаляции аллилового

спирта в концентрации 133 иг/у?. Концентрация трихлорэтилена 1227 мг/м^ близка к пороговой. При воздействии в этой концентрации увеличилась длина-НАУ и уменьшилось количество ШС.

Стирол не обладает избирательным действием на печень при однократном воздействии. Ытас стирола установлен на уровне 250 мг/м3 по поведенческим реакциям (М.В.Бздевкина, 1986). Изменения состояния поверхностной мембраны в области простого соединения и десмосом обнаружены только после ингаляций в концентрации 1200 мг/м3.

Снижение концентрации двухвалентных катионов в околоклеточ-' ной среде с помощью ЗДТА привело к нарушению адгезионного взаимодействия мембран в области простого соединения и уменьшена» их де-фор.шруемости.

Конканавалин укрупняет размеры ВАУ, повидан ому, за счет связывания «-Д-маннозккх остатков, принадлежащих гликокаликсам соседних клеток, и изменяют текучесть ллазиолеммы.

Промоторы опухолей печени фенобарбитал и ДЕТ в концентрациях, ускоряющих рост опухолей, существенно нарушают адгезионные взаимодействия и дефордкруемосгь поверхностной мембраны в области проо-того соединения, что свидетельствует о необходимости включения показателей состояния мембран в области простого соединения в минимальный достаточный набор краткосрочных тестов на проыоторную активность веществ.

Экстракты из тканей животных - адгезин, катрэкс и ранее изученный контактин вызывают стабилизацию мембран простых соединений.

Проведенный сопоставительный анализ степени участия отдельных улътраструктур в реакции поверхности гепатоцита на воздействие исследованных химических веществ позволяет утверждать, что наиболее . чувствительным элементом контакта гепатоцитов к воздействию является НАУ. Длина, ширина, количество и расстояние до желчного канальца этой ультраструктуры изменяется при минимальных уровнях воздействия чаще, чем другие показатели состояния контактной поверхности. Особенно чувствительной является дАина НАУ. Обнаружены изменения длины НАУ во всех 16 экспериментах с достоверно отличающимися показателями подопытных и контрольных животных. Изменение количества НАУ и его расстояния до желчного канальца характеризуют степень упоря-. доченности адгезионных свойств мембран простого соединения и встречаются раже (9 случаев из 16). Вторым по чувствительности соединением является ВАУ (10 случаев из 16), укорочение которого при дей-

ствил гепатотоксинов свидетельствует о нарушении адгезионных взаимодействий гепатоцитов. Менее чувствительными являются НПС и дес-мссома, которые включаются в ответ ткани при больших уровнях воздействия. В наших экспериментах показатели состояния щелевого соединения оказались малочувствительными (2 случая) и совсем не реагировали на воздействия плотные соединения и зоны слипания.

Таким образом, все межклеточные соединения кожнс расположить по уменьшению чувствительности к воздействию химических веществ в следующий ряд: НАУ, ВАУ, НПО, десмосома, щелевое соединение, зона слипания и плотное соединение. Этот ряд напоминает порядок расположения соединений в зависимости от прочности адгезионной связи мембран. Наиболее чувствительным к воздействию оказалось соединение с наименьшей адгезионной связью, наиболее устойчива к химическим веществам ультраструктура с большей адгезионной прочностью.

Различие чувствательностей межклеточных соединений обуславливает, повидцмому, характер дозовой зависимости реакции поверхности гепатоцита на внешнее воздействгхе. При повылении уровня воздействия увеличивается количество показателей состояния, вовлекаэ-мых в реакцию клеточной поверхности (табл. I) - растет степень дезорганизации, вызванной действием вещества.

Воздействия веществ в используемых нами миткальных концентрациях или вообще не вызывали изменений состояния комбран, или вызывали отклонение только самых чувствительных показателей: размеров НАУ и ВАУ, количества НПС и расстояний до зоны слипания. Доля изменившихся параметров при этом не превышала 22,от общего количества измеряемых показателей (табл. I). Параллельно проведенные оценки активности маркерных ферментов и печеночных проб свидетельствуют-о том, что концентрации веществ, вызывающие минимальные изменения ультраструктурных показателей близки к пороговым значениям, определяемым по функциональны:.! показателям состояния печени. Поэтому нам кажется возможным ввести представление о минимальной реакции поверхности гепатоцита, при которой изменяются не более 25& измеряемых 18 морфшетричвеких показателей и которой, невидимому, соответствует пороговая концентрация при однократном воздействии веществ. Среди измеряемых параметров должны обязательно присутствовать размеры НАУ, как самые чувствительные показатели состояния поверхности.

Исследование влияние на поверхность гепатоцитов веществ, обладающих повреждающим или стабилизирующим действием на печень по-

Таблица X

Выраженность реакции поверхности гепатоцита в зависимости от уровня воздействия (концентрации)

Вещество

Концентрация

¡Количество показателей, отличающихся достоверно у подопыт-!ных и контрольных !групп животных

¡Размеры и ¡Расстоя-!количества!ния до зо-!соединений!ны слипания

Количество измеряемых показателей .

Доля изменившихся показателей (%)

Четыреххло- ристый углерод 20 мг/м"* 40 мг/м3 100 мг/м3 0 2 4 0 I 4 17 17 17 0 17,6 47,1

Аллиловый спирт 78 мг/м^ 133 мг/М3 0 6 3 4 17 17 17,6 58,8

Трихлор- ' этилен 1227 мг/мй 2575 мг/м3 2 7 II II 18,1 63,6

Стирол 460 мг/ма 1200 мг/м3 0 . 5 12 12 0 41,6

Фенобарбитал 0,004? 0,022 0,1* 3 5 8 1 Г 2 18 18 18 22,2 33,3 55,6

зволяет ввести своеобразный критерий вредности воздействия на печень, оцениваемый по характеру реакции контактной поверхности гэ-патоцитов. Вещества, повреждающие печень (СС14, аллиловый спирт, трихлорэтилен, фенобарбитал, ДДТ, ЗДТА) вызывают удлинение НАУ и укорочение ВАУ, что соответствует ослаблению силы адгезионного взаимодействия и увеличению текучести мембран простого соединения. Гепатопротекторы уменьшают длину НАУ и не изменяют длину ВАУ, что соответствует стабилизации контактных поверхностей клеток. Разобщающий эффект может быть усилен укенылением длины НЕС или ослаблен увеличением ее. Нагл кажется полезным ввести следующую гипотезу . о критерии вредности - считать вредным разобщающий эффект (уменьшение длин ВАУ и увеличение длины и ширины НАУ). К стабилизирующему эффекту отнесем обратные изменения - увеличение длины ВАУ и уменьшение длины и ширины НАУ. Наибольшую гигиеническую значимость,

по нашему мнению, имеет изменение размеров ВАУ, как самого чувствительного элемента латеральных поверхностей гепатоцитов.

Введений критерий вредности с ¿ответствует большому количеству результатов исследований при экспериментальных воздействиях и патологических состояниях тканей. Нарушение контактных взаимодействий эпителиоцитов и миодктов при выраженных повреждениях тканей-. носит характер разобщения: снижается сцепленность клеток, расходятся мембраны простых соединений, ухудаается ионная и метаболическая кооперация клеток (А.Г.Маленков, Г.А.Чуич, 1979; В.И.Архи-певхо и др., 1982; А.Г.Меликянц, 1985).

Изменение состояния поверхностной мембраны метет существенно модифицировать уровень функционирования клетки. Например, в работе групп японских исследователей (ТЗакгашга еъ а1., 1983) показано, что при низкой плотности гепатоцитов в культуре интенсифицируются функции, зависимые от роста (синтез ДНК, клеточных белков и т.д.), при высокой плотности стимулируются специфические функции гепатоцита (синтез триглицеридов, индуцируется тирозишпшотранс-фераза и т.п.). Аналогичное переключение функций можно вызвать в культуре низкой плотности при контактироёании поверхности клеток с изолированными плазматическими мембранами, выделенными из печени взрослых крыс. Следовательно, для существенного изменения функционирования клетки достаточен только контакт поверхностей, а не клетки с другой клеткой. Это подтверждает правильность выдвинутого нами представления о контактирующих клеточных поверхностях как системы с высокой степенью автономности, что послужило одной из предпосылок построения модели контактирующих поверхностей. Результаты экспериментов по изучению влияния модельных веществ на контактную поверхность гепатоцитов свидетельствуют о ток, что основные компоненты поверхности - гликокаликс, фосфолипиднкй бислой плазмолем-аш и подмембранные микрофиламенты связаны сильно не только механически, но и функционально - они реагируют на воздействие химических веществ совместно. Как правило, изменяется адгезионное взаимодействие йембран, текучесть плазмолеммы и расположение соединений или состояние кератинового цитоскелета.

Совместное участие элементов модели в реакции контактирующих поверхностей согласуется с представлениями С.В.Ковева с соавторами о генерализованных структурных перестройках мембран, в соответствии с котораш изменение состояния некоторого участка мембраны передается латерально на всю мембрану (С.В.Конев, 1987). Мы счита-

ем, что кроме того согласованная реакция соседних клеток в ткани на воздействие химических веществ осуществляется за сче.т совместного участия основных элементов контактирующих мембран - межклеточного цемента, фосфолипмдного бислоя с встроенными белками в под-мембранных микрофиламент.

В исследуемой нами реакции контактных поверхностей гепатоцитов можно выделить следующие общие, неспецифкческие признаки:

1. Особый характер зависимости от уровня воздействия - с ростом уровня увеличиваются не абсолютные значения отдельных показателей, а их количество, что соответствует усилению дезорганизации поверхности клетки.

2. Наиболее чувствительными ультраструктурами к воздействию являются НАУ и ВАУ. Изменение их размеров и количества соответствует изменениям адгезионных взаимодействий и реологических свойств мембран.

3. При увеличении дозы вслед за изменением НАУ и ВАУ включая ется перестройка кератинового цитоскелета (десмосом).

4. Наиболее устойчивы к воздействиям зона слипания, щелевые и плотные соединения.

о. Направленность изменений размеров НАУ и ВАУ соответствует характеру действия вещества. При повреждающем воздействии химических веществ размеры ВАУ уменьшаются, НАУ - увеличиваются. При стабилизирующем действии изменения размеров НАУ образны, ВАУ не изменяются.

6. В реакции принимают совместное участие три основных элемента контактных поверхностей - межклеточный цемент (гликокаликс), плазмолемма (фосфолипидный бислой) и подповерхностные микрофила-менты.

Перечисленные особенности имеют место при воздействии всех исследованных вещестЕ, поэтому может быть сформулировано представление об универсальной" реакции контактных поверхностей гепатоцитов, очерченной выие перечисленными свойствами.

ХАРАКТЕР ВРЕДНОГО ДЕЙСТШЯ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ ПШ ОДНОКРАТНОЙ

И ХРОНИЧЕСКОЙ ИНГАЛЯЦИЯХ И РЕАКЦИЯ КОНТАКТНЫХ ПОВЕРХНОСТЕЙ

ГЕПАТОЦИТОВ

Обнаруженная при воздействии модельных химических веществ универсальная реакция была использована нами при изучении характере вредного действия 9 веществ, внедряемых в промышленность. С целью оценки возможности использования реакции контактной поверхности ге-

патоцита для прогнозирования ШИК веществ, обладающих избирательный действием на печень, определены Ь1шас в Ы»сЬ по специфический (поверхность гепатоцита, функции печена) в интегральный показателям.

Для оценки Ипас Д31ф были испытаны концентрации 37,3+3,3; 26,0+8,5 е 12,5+0,6 мг/ы3. После однократной ингаляции в концент-. рации 37,3 иг/ьг выявлены существенные нарушения контактных взаимодействий гепатоцитов (увеличена длина НАУ, уменьшились количества ВАУ, НАУ и Д), повысился синтез гшшуровой кислоты, снизились двигательная активность и количество выглядываний из темной камеры.

Ингаляция Д5ИФ в концентрации 26 мг/м3 вызывает увеличение синтеза гшшуровой кислоты, уменьшение длины контакта и числа дес-мосси, снижение двигательной активности и эглоциспальной реактивности. После воздействия в концентрации 12,5 цг/м3 отличий в состоянии животных подопытных и контрольных групп не обнаружено.

Полученные результаты позволяют считать концентрацию 26 мг/м3 близкой к Ииас Д3№ по показателям состояния контактной поверхности гепатоцитов, функции печени и нервной системы, что свидетельствует об умеренном действии на печень (гас Ер = I).

При определении Ь1тоЬ были испытаны концентрации 2,4+0,9 мг/м3 и 14,1+1,3 мг/м3. Воздействие Д3№ в концентрации 14,1 ыг/м3 ухе через 1 месяц вызывает выраженные нарушения контактных взаимодействий гепатоцитов: увеличились длины НАУ и НПО, уменьшились количества ВАУ, НАУ и ЩС, что свидетельствует об изменении адгезионных и реологических свойств плазмолеммы и возможном нарушении межклеточного обмена ионами и молекулами. Через 2,5 месяца ингаляций нарушены адгезионные взаимодействия плазмолемм в простом соединении и состояние кератинового цмтоскелета, через 4 месяца адгезионные взаимодействия и состояние ДС. Увеличение синтеза гиппуро-вой кислоты и выведения бромсульфалеина, свидетельствующее о стимуляции обезвреживающей и поглотительно-выделительной функции печени, обнаружено только после 2-х месяцев воздействия Дй15>. Через 4 месяца снижен синтез гшшуровой кислоты. Изменения интегральных показателей носили менее выраженный и нерегулярный характер по сравнению с нарушениями контактных взаимодействий гепатоцитов.

ДЗИФв концентрации 2,4 мг/м3 вызывал незначительные изменения интегральных показателей, активности ДДГ и пировиноградной кислоты в гомагенате печени. Нарушение контактных взаимодействий ге-

патоцятов обнаружены во все исследуемые сроки и затрагивают свойства простых, щелевых и плотных соединений. Li»ch установлен на уровне 2,4 мг/м3.'Реакция контактной поверхности гепатоцита лучше других эффектов соответствует обнаруженному в остром эксперименте умеренному действию ДЭИФ на печень.

После однократной ингаляции МЭСП в концентрации 90,0+10,5 • мг/м3 существенно изменились показатели состояния печени (повысилась активность АЛТ и ACT, снизилась активность ШФА я экскреция гкшуровой кислоты) и интегральные показатели (частота дыха-' ния, сила пищевого рефлекса, потребление кислорода, работоспособность). Воздействие в концентрации 34,2+14,3 мг/м3 изменило активность ЛДГ и S.ÎÎA, силу пищевого рефлекса, потребление кислорода и двигательную активность. Исследование улътраструятуры поверхности гепатоцитов позволило обнаружить увеличение длины НАУ, уменьшение количества Д и'ИЗ. После ингаляции МВСП в концентрации 9,4+1,2 мг/м3 показатели состояния животных подопытных и контрольных групп не отличались.

Концентрация 34 мг/м3 близка к Licac по состоянию контактных поверхностей гепатоцитов, функциям печени и интегральным показателям' состояния животных, МВСП умеренно действует на печень.

На протяжении всего хронического ингаляционного воздействия МВСП на уровне bimoh (10 мг/м3) наблюдали изменения синтеза runny ровой кислоты и активностей AIT, ACT, ДЦГ и 1ДФ в сыворотке крови, что свидетельствует о нарупении "функций печени. Кроме того в разные сроки обнаружены изменения концентраций белка, мочевины и хлоридов в моче, изменения интеграл*пых показателей (СПП, норковый рефлекс, пищевой рефлекс). Таим образом, результаты хронического эксперимента подтверждают выявленное при однократной ингаляции умеренное действие МКШ на печень. Ведущим токсикодинамиче-ским признаке«,I при хроническом воздействии является нарушение функций печени, которое сопровождается изменением интегральных показателей и состояния почек.

Linac сенсибилизатора CI установлен на уровне 30 мг/м3 по изменению интегральных показателей (снизилась двигательная активность, увеличилась частота сердечных сокращений) и нарушению кое-тактных взаимодействий гепатоцитов (увеличились длина и ширина НАУ, укоротились НПС), что свидетельствует об умеренном действии сенсибилизатора на печень.

Хроническое ингаляционное воздействие сенсибилизатора в кон-

центреции 3,86 ыг/ifi, принятой в качестве , приводит к уме-

ренной интоксикации, характеризующейся прежде всего нарушениями в функционировании печени и почек (изменение активности АЛТ,Щ>, SKA, обмена мочевины, экскреции бедка и хлоридов), которые сопровождаются изменениями некоторых интегральных показателей: массы тела, частоты дыхания, норкового рефлекса. Указанные изменения согласуются с выявленным при однократном воздействии умеренным действием сенсибилизатора CI на печень.

•При определении Ь1аас сенсибилизатора С2 испытаны концентрации ПО,3+19,3; 45,0+9,5 и 16,1+4,2 кг/м3. После ингаляции в концентрации 110,3 мг/нг повысились уровни SiiA к AIT в сыворотке крови, что обусловлено,'.невидимому, нарушением проницаемости поверхностных мембран гепатоцитов; снизилась двигательная активность, сила пищевого рефлекса и работоспособность. При концентрации 45 мг/м3 увеличилась активность ШЭД, снизилась двигательная активность и сила пищевого рефлекса, существенно нарушились контактные взаимодействия гепатоцитов: уменьшились длина ЕАУ и количество HUC, увеличились длина НАУ, ЩС и ЭС. Ингаляция в концентрации 16,1 мг/м не привела к изменению измеряемых показателей.

iimac sp по показателям состояния печени (в основном, поверхности гепатоцитов) равен ii»ttC по интегральным подателям. Сенсибилизатор С2 обладает умеренным действием на печень.

biaac ТМДК установлен на уровне 95 иг/м3 по частоте дыхания и двигательной активности. После воздействия вещества в концентрации 190 мг/м3 изменения интегральных показателей более выра-кены, нарушены контактные взаимодействия гепатоцитов (удлинились НАУ и укоротились НПС). Поскольку Ыоас ср по состояния печени вше I«imac , то ШДК де обладает избирательны!.! действием на печень.

" При длительной экспозиции "ВДК на уровне Ы» h (43,5 мг/м3) внявлены изменения в структуре и функциях почек, пече:-:и, селезенки, легких, сердечно-сосудистой системы и всего организма в целил. После месячной ингаляции вещества снижены двигательная активность, частота пульса, работоспособность и сила пищевого рефлекса, содержание мочевины в моче, количество лейкоцитов, увеличена активность АДТ и Щй, нарушены контактные взаимодействия гепатоцитов: .увеличены длины НПС и контакта, уменьшились количества ВАУ, НАУ и Д. Изменения состояния подопытных животных после 2, 3 и 4 месяцев возде- , йствия также свидетельствуют об интоксикации без выраженной специфики. Характер изменений поверхности гепатоцита свидетельствует о

преобладании компенсаторных процессов. После 4 месяцев ингаляционного воздействия .укоротились НАУ и увеличилось количество НПС, что соответствует стабилизации контактных взаимодействий. Таким образом, И»1ДК при хронической ингаляции не оказывает преимущественного вредного действия на печень и поверхность гепатоцита.

Аналогичный еывод был получен и при исследовании характера действия цинка углекислого основного. Ь5лас установлен на уровне 102 мг/м3 по изменению параметров электрокардиограммы и активности После ингаляции в концентрации 205 мг/м3 кроме изменения ЗКГ увеличен синтез гиотуровой кислоты, активность АЛТ и концентрация мочевины-в сыворотке крови, нарушены контактные взаимодействия гепатоцитов: уменьшились длина ЕАУ, количество НПС, ЩЗ и Д.

Поскольку Иа.„ __ по состоянию печени выше Ыт „ , то цинк угас ьр ас

леклслый основной не обладает избирательным действием на печень прл однократной ингаляции. При хроническом воздействии на уровне Ь1ае11 обнаружено преимущественное влияние вещества на сердечнососудистую систему.

К веществам не оказывающим избирательного действия на печень отнесены нами также активатоо и оксид кальция. Ыт„„ __ активато-

о * Э.С вр

ра равен 100 мг/м по изменению состояния контактной поверхности гепатоцитоЕ и активности маркерных фергентов. Ывас по снижению двигательной активности составляет 43 мг/м3.

Оксид кальция обладает избирательным раздражающим эффектом. Его Ь1ш&0 по изменению морфологического состава^клеток смыва из легких и верхних дыхательных путей равен 60 мг/м^. Минимально эффективной концентрацией оксида кальция по изменению контактных взаимодействий гепатоцитов является 662 мг/м3.

Проведенное исследование позволило установить соответствие реакции поверхности гепатоцита характеру вредного действия вещества. При воздействии веществ, обладающих выраженным избирательные или умеренным действием на печень, Ышас , определенный по показателям контактных взаимодействий гепатоцитов, оказывался ниже или на уровне порога, установленного по показателям функционального состояния печени и общетоксическому эффекту. В случае иной избирательности порог по контактным взаимодействиям был выше порога, определенного по другим показателям.

При хронической ингаляции веществ, га0 вр которых > I, наиболее выражены изменения состояния печени. При гас ер < I такой эффект не наблюдается. Изменение контактных взаимодействий гепа-

тоцитав при хронической воздействии соответствует характеру вред-наго действия вещества, выявленного при однократной ингаляции. Указанное позволяет сделать вывод о той, что сопоставление реакции контактной поверхности гепатоцита с другими функциональными показателями позволяет установить степень избирательности действия вещества на печень в условиях краткосрочного воздействия.

Дрогнозиррвачяе ПЕК веществ, обладающих избирательна« действием на печень', по реакции контактных поверхностен гепатозитов. Анализ научной литератур! по проблеме ускорения гигиенического регламентирования позволил установить, что одним из наиболее перспективных направлений является прогнозирование регламентов на основе математических зависимостей между параметрами токсикометрии при учете избирательности действия веществ на организм.

Исследованные нами вещества могут быть разделены по степени избирательности действия на печень на три группы: с выраженным избирательным эффектом (четыреххлористый углерод, аллиловый спирт, трихлорэтилен), умеренным действием СДл1'1, сенсибилизаторы С1 и С2, МВСП), отсутствием избирательного действия на печень (стирол, ВДК, активатор, гидрокейяамин сернокислый, оксид кальция, цинк углекислый основной).

Избирательность действия веществ на печень проявляется наиболее четко при однократном воздействии. Изменение состояние печени при хроническом воздействии соответствует степени избирательности, выявленной в краткосрочном эксперименте, и наблюдается как при ингаляции гепатотоксических веществ 1ДЗЛ0, МВСП, сенсибилизатор С1), так и при ингаляциях веществ не обладающих избирательным действием на печень в остром эксперименте СЕДК, гидроксилаиин сернокислый, цинк углекислый основной). Эти результаты согласуются с современным представлением о тш, что первичная реакция на воздействие обусловлена в основном специйическк.: действием на конкретную функциональную систему, вторичные эМюкты вшиваются вовлечением в процесс других функциональных систем организма к носят более интегральный характер (Е.А.Лужников, 1282; С.Н.Голиков, К.Б. Саноцкий, Л.А.Тиунов, 1986).

Если считать, что ПДК в значительной степени зависит от характера' действия веществ, то связь между параметра:,® токсикометрии в краткосрочном эксперименте и ШШ следует искать отдельно для веществ, обладающих различны?,к избирательными эффектами. Мы получили регрессионные уравнения, связывающие 1ЩК с величиной порюга

острого действия, установленного по реакции контактной поверхности гепатоцита:

1в\ ПДК = 0,75 1в Ь±та0 - 1,4

(г = 0,81; р < 0,01; Б^ = 0,332)

и

1б ПДК = 0,637 1б Ь1па(Г 1,087

(г = 0,955; р< 0,031; 6 =0,179)

(1)

(2)

В таблице 2 представлены величины ЦДК-, установленные в соответствии с существующими методическими указаниями, и ПИК^^, рас-читанные по уравнениям (I) и (2).

Таблица 2

Соотношение расчетных и установленных в законодательном порядке гигиенических норлативов веществ, - обладающих различно!: степенью избирательности действия на печень

Вещество

1 ПДК ! ! (ОБУВ) Г

-, I ! 2 ! (игЛг )!уравнение!уравнение.!

! 2 ас зр

! Различие

! I ! а

,у>авн.!уравк.

спирт 2 1,04 1,32 > I 1,9 1,5

2. Трахлорэтилен 10 ь,з 7,6 > I 1,2 1,3

3. Четыреххлорис-тый углерод 20 С,6 0,86 > I 33,3 23,2

4. Д31Ф . 0,5 0,46 0,65 = I 1,09 1,3

5.' Сенсибилизатор л т их 0,5 0,51 0,72 = 1 1,02 1,4

6. Сенсибилизатор С2 (1,0) 0,69 0,93 = I 1,4 +»1

г» 1 • МВСП 1,0 0,56 0,75 1,6 1,3

8. Гидроксиламин сернокислый 0,4 1,97' 2,3 < I 4,9 5,8

9. Цинк углекислый основной 0,4 2,16 2,4 < I 5,4 6,0

Ю. Оксид кальция 1.0 4,84 5,1 < I 4,8 5,1

II. Активатор 2,0 1,26 1,5 < I 1,6 1,3

12. так 5,0 2,03 2,3 < I 2,5 2,2

13. Стирол 5,0 8,1 7,5 < I 1,6 1,5

В двух последних столбцах таблицы проставлены числа, показывающие во сколько раз отличаются друг от друга ЦДК и ЦДК^^. Для 6 веществ из 7, обладающих выраженным или умеренным избирательным

действием на печень С 2ас 8р ^ I), отличие ПДК от ПДК^^ не пре-вииает 2 до первому уравнении в 1,5 по второму уравнению. Очень большое отличие ь случае повидимсму, означает зазызенность

утве раде иного регламента, что подтверждают и другие авторы Ш.В. Бидевкина, 1986; Н.Г.Иваков, 1966). У веществ,.не обладающих избирательным действием на печень ( гас зр < I), соотношение ПДК и ЦДК^Р^ хуже. Только у двух веществ из 6 соотношение меньше 2 по первому уравнению и не превышает 1,5 ло второму уравнению, сто, аовидшоиу, обусловлено тем, что математические зависимости, связывающие параметры токсикометрии для веществ с различной спецификой» имеют неодинаковый вид.

Таким образом, полученные уравнения дают удовлетворительное соответствие ДДК, обоснованных в установленном порядке, и ЕДК^^ и могут быть рекомендованы для прогнозирования ПДК веществ, обладающих избирательным действием на печень.

ВЫВОДЫ

1. Разработана система морфометряческих нрктерг.ев состояния контактной поверхности гепатоцита, позволяющая оцеыаать реакцию отдельных ультраструктур поверхности клетки при воздействии химических веществ. Предложенные показатели дают возможность судить об изменениях адгезионного взаимодействия латеральных поверхностей гепатоцитов, подвижности отдельных ультраструптур, их взаимном расположении, перестройках кератинового цитоскелета и дефоршз-руемости клеточной поверхности. Система показателей апробирована при изучении влияния 10 модельных и 9 внедряем: в промышленность химических веществ. Чувствительность показателей достаточна для оценки пороговых концентраций вредных химических веществ.

2. Изучены подвижность и адгезионная прочность ультраструктур клеточной поверхности гепатоцита. Показано, что поверхность гепатоцита обладает свойствами текучести и упругости. Наиболее механически яаоильна часть поверхности в нпзкоадгезквных участках простого соединения. Она перетекает в базальную часть клетки и обратно. Подвижны и щелевые соединения. Относительно неподвижными точками на клеточной поверхности являются десмссомы, которые препятствуют сдвигу соседних поверхностей относительно друг друга. Злеиенты контактной поверхности (глпкокаликс, фосфолиглдкьи; бислок с встроенными в него белками, и яодиэмбранные мзкропаламенты) связаны друг с другом прочнее, чем с внутриклеточными органоидами и включениями*

3. Построена 'концептуальная механическая модель контактной поверхности гепатоцита. Модель основана на результатах собственных исследований по- изучению механических' свойств межклеточных соединений и современных представлениях о структуре и свойствах клеточной поверхности. По модели поверхность гепатоцита состоит из двух, отличающихся по механическим свойствам, доменов - базо-латерального и апикального. Баз олатеральный домен представляет собой единое трехмерное тело, обладающее свойствами текучести и упругости. Латеральная часть поверхности образована различными по механическим свойствам ультраструктурами - ВАУ, НАУ, .десмосо-мами, зоной слипания, щелевыми и плотными соединениями. Десмосо-мы являются координирующими структурами на клеточной поверхности, остальные структуры ориентированы относительно десмосом с помощью подповерхностных микрофиламент, прикрепленных к цитоплазмати-ческим площадкам' десмосом. Ультраструктуры контактной поверхности расположены в ряд по возрастанию адгезионной прочности НАУ; ЕАУ, десмосомы и зоны слипания; высокопрочные ВАУ, щелевые и плотные соединения.. Природа адгезионной связи в соединениях различна. В простых соединениях, десмоссмах и зонах слипания это специфические адгезионные молекулы, в щелевых и плотных соединениях - это связь интегральных белков мембран. Совокупность межклеточного цемента, фосфолипэднобелковой мембраны и подповерхностных шкрофи-ламентов образуют прочно' связанную и упорядоченную механическую систему. Эта система с помощью десмосом совместно с кератиновыми промежуточными филаментами образуют скелет паренхимы печени.

4. Установлены следующие закономерности в реакции контактной поверхности при воздействии химических веществ:

- при воздействии химических веществ, изменяющих состояние печени, контактные взаимодействия поверхностей гепатоцитов изменяются;

- при повреждающем воздействии нарушается адгезионные взаимодействия мембран в области простого соединения (увеличиваются размеры НА7, уменьшаются размеры ВАУ), изменяется количество десмосом и увеличивается деформируемость мембран. При действии протекторов обнаружены изменения обратной направленности в области НАУ;

- ультраструктуры контактной поверхности располагаются в следующий ряд по снижению чувствительности к воздействию химических

веществ: НАУ, 2АУ, НПС, десмосоиа, щелевое соединение, зона слипания и плотное соединение. Наиболее чувствительно к воздействию наименее адгезионно прочное соединение, наиболее устойчивы к химическому воздействию механически прочные структуры.

5. Обнаружена универсальная реакция контактной поверхности гепатоцита при воздействии химических веществ, отличителъяыхл особенностями которой являются:

- характер зависимости выраженности реакции от уровня воздействия - при повьшении концентрации вещества растет количество показателей, вовлеченных в ответ ткани на воздействие, что соответствует большей дезорганизации поверхности клетки;

- пороговым уровням воздействия соответствует нарушение взаимодействий мембран в области простых соединений, при увеличении концентрата: вещества включается перестройка кератинсвого цитоске-лета;

- в реакции принимают участие три основных элемента контактных поверхностей - межклеточный цемент, фосфолипидный бислой с встроенными в него белкам:: и подмембраяные микрофиламенты.

6. Реакция контактной поверхности гепатоцита соответствует характеру действия изученных химических вешеств при однократной и хронической ингаляциях. Для ззществ, обладающих избирательные: действием на печень, порог острого действия, определяемый по реакции поверхности гепатоцита, ниже или равен порогу по другим показателям состояния печени или общетоксическому эффекту. Зто позволяет оценить степень избирательности действия веществ на печень путем сопоставления минимально эффективных концентраций, установленных по реакции поверхности гепатоцита и других функциональных структур организма в условиях краткосрочного воздействия.

7. Исследованы токсичность, опасность и характер вредного действия 9 веществ, внедряемых в промышленность, с использованием реакции контактной поверхности гепатоцита. Обоснованы ПИК этих веществ в воздухе рабочей зоны.

.8, Получены регрессионные уравнения для прогнозирования ПЖ веществ в воздухе рабочей зоны но величине порога острого действия, определенного по показателям контактных взаимодействий гапа-тоцитов. Уравнения дают хорошее соответствие (отличие нз более 1,5 и 2-х раз) расчетных ПДК и полученных в результате традиционных исследований для веществ, обладающих избирательным действием на печень, что позволяет рекомоцдовать использование реакция контактно":

поверхности гепатоцита для прогнозирования ЦДК гепатотоксических

веществ по результатам краткосрочного эксперимента.

Приношу глубокую благодарность доктору медицинских наук

Николаю Георгиевичу Иванову за консультативную помощь при выполнении настоящей работы.

ПО МАРШАЛАМ Д1ССЕРТАЩИ ШУБШКОВАНЫ СЛВДУНЩЕ ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ:

1. Адгезионная прочность ультраструктурных элементов контактов гепатоцитов //Биофизика.-1978.-Т.23, Л 3.- С.558-659 (в соавторстве ).

2. Метод исследования механических свойств ультраструктурных элементов контактов гепатоцитов //XI Всесоюзная конференция по электронной микроскопии. Тез.докл. - М.: Наука, 1979. - С.113.

3. Влияние адгезионного фактора печени --контактина на механические свойства ультраструктурных элементов контактов гепатоцитов //Биофизика.- 1979. - Т.24, Я 6.- С.1054-1057 (в соавторстве).

4. Влияние дефицита ионов кальция на механические свойства ультраструктурных элементов контактов гепатоцитов //I Украинский съезд АГЭ. Тез.докл. - Винница, 1980,- С.211-212 (в соавторстве).

5. Механическая модель контактов гепатоцитов //Биофизика,- 1980. - Т.25, И 3.- С.491-498.

6. Механические свойства контактов гепатоцитов у мышей инбредных линий и предрасположенность к спонтанным гепатомам //Болл.эксп.

" биол. - 1980. - Т.89, № 4.- С.459-462 (в соавторстве).

7. Сравнение подвижности щелевых соединений и десмосом //Цитология. - 1281. - Т.23, Ц 4. - С.454-457 (в соавторстве).

8. Модификация конканавалином А механических свойств контактов-гепатоцитов //Биофизика. - 1981. - Т.26, й 4. - С.727-728 (в соавторстве).

9. Механические свойства межклеточных контактов //Структура и функции межклеточных контактов /Под ред. В.И.Архипенко, А.Г.Маленкова. - Киев: Здоров'я, 1982. - С.33-53.

10. Способ воздействия на контакты гепатоиитов. Авт.свидетельство № 1010559, 1982.

11. Влияние гепатотоксических промышленных веществ на контактные взаимодействия гепатоцитов крыс //Гигиена труда и профзаболевания. - 1984. - № 5. - С.20-22 (в соавторстве).

12. Динамика изменений ультраструктуры контактов гепатоцитов крыс при действии гепатотоксических веществ //Актуальные вопросы

морфологии: Тез.докл. II съезда АГЭ УССР. - Полтава, 1985. -С.21Б (в соавторстве).

13. Контактные взаимодействия эндотелиоцитов и гепатоцитов при .повшенном давлении в кровеносном русле //Тез.областной научно-практической конференции морфологов. - Днепропетровск,1986..

- С.44-45.

• 14. Актограф из стандартных блоков для оценки двигательной актив. ности мелких лабораторных животных //Гигиена труда и профзаболевания. - 1986. - В 3. - С.59-60 (в соавторстве).

15. Реакция контактов гепатоцитов при действии гепатотокспческих промышленных веществ //I Всесоюзный съезд токсикологов. Тез. докл. - Ростов-на-Дону, 1986. - С.362-363.

16. Ультраструктура контактов гепатоцитов при действии гепатотроп-ных веществ /ДО Всесоюзный съезд АГЭ. Тез .докл. - Винница,

' • 1966. - С.356-357.

17. Die Veränderung interzellulärer Xonta>te als Parameter der Hepatotoxizität industrieller Substanzen //Z.gesamte Hyg. -1986— Bd.32, к 11.- s, 675-677 (в соавторстве).

18. .Регуляция контактных взаимодействий гепатоцитов с помощью экстрактов из тканей животных //Сб. Регуляция тканевого гомеоста-за. Нетоксическая профилактика и терапия хронических патологий.

- Тбилиси, 1987. - С.170-176.

19. Актограф. для сценки двигательной активности лабораторных животных. Авт.свидетельство № I33I490 4 А 61 В, 1987 (в соавторстве).

20. Experimentelle Untersuchungen zur Wirkung von Trichlorethy-. len auf die Eattenlebar //Z.gesane Hyg.- 1988.- Bd.34, Ks

ß.262—263 ' (в соавторстве).

21. Автоматизация процесса измерений интегральных показателей состояния организма животных как средство оптимизации экспериментов. по санитарно-гигиеническому нормированию вредных веществ //Ускоренные методы санитарно-гигиенического нормиро-.вания вредных веществ в воздухе рабочей зоны: Тез.докл. Всесоюзной конференции. - Ереван, 1988. - C.I92-I93 (в соавторстве).

.22, Исследование контактных взаимодействий гепатоцитов с целью ускоренной оценки гепатотоксичности промышленных веществ //Там же. - С.108-109.

23. Токсичность и характер действия н,н'-бис-(триметил)-2,5 даме-