Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Тh1/Тh2-поляризация как эпигенетический механизм формирования разных вариантов иммунопатологии при реакции "трансплантат против хозяина"

Современные достижения в области биологических наук, в частности, клеточной и молекулярной биологии и молекулярной генетики, позволили понять многие процессы, лежащие в основе функционирования иммунной системы, и тонкие механизмы их регуляции. Интенсивное исследование открытых в 1986 году среди мышиных С04+Т-клеток, а затем среди Т-лимфоцитов человека двух субпопуляций Т-хелперов, которые продуцируют разные комплексы цитокинов и оказывают оппозитное влияние на основные звенья иммунного ответа [Mosmann T.R. et al., 1986; Del Prete G.F. et al., 1991], привело к формированию концепции поляризации иммунного ответа, рассматривающей баланс Thl/Th2 в качестве базисного параметра регуляции иммунных процессов. [Cher D.J., Mosmann T.R., 1987; Mosmann T.R., Sad S., 1996; Allen J.E., Maizels R.M., 1997; O'Gor D. et al., 2003]. Применение этой парадигмы при изучении регуляции иммунитета как в нормальных физиологических условиях, так и при иммунопатологических состояниях оказалось плодотворным и сегодня широко используется при изучении таких процессов, как бактериальные и вирусные инфекции, аллергические заболевания, иммунные реакции при канцерогенезе, аутоиммунные расстройства, иммунные конфликты при беременности [Fresno М. et al., 1997; Kunzendorf U.et al., 1998; Chaouat G. et al., 2003; Wilczynski J.R., 2005]. Хотя не все известные на сегодняшний день экспериментальные факты и клинические наблюдения идеально укладываются в эту концепцию, её актуальность и применимость для решения современных проблем регуляции иммунитета не вызывают сомнений.

Одним из процессов, в реализации которых ТЫ/ТЬ2-баланс играет решающую роль, является реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ) -иммунная реакция клеточного типа, развивающаяся при трансплантации зрелых Т-лимфоцитов неспособному к их отторжению хозяину в условиях тканевой несовместимости донора и реципиента [Шевелёв АС., 1976]. Описанная и изученная изначально как лабораторный феномен, в настоящее время РТПХ активно исследуется в клинике, так как представляет собой тяжёлое осложнение, которое возникает при пересадках аллогенного костного мозга, являющихся составной частью комплексной терапии при радиационных поражениях, онкологических и аутоиммунных заболеваниях [Parkman R., 1993; Murphy W.J., Blazar B.R., 1999; Ferrara J.L., 2000а]. Кроме того, в настоящее время РТПХ широко применяется для моделирования в эксперименте аутоиммунных заболеваний человека, что позволяет изучать механизмы формирования иммунопатологических процессов [Okamoto I. et al., 2000; Iwasaki Т. et al., 2000; Murphy K.M., 2000; Kolesnikova O.P. et al., 2001]. До последнего времени было принято считать, что острая РТПХ является преимущественно Thl-зависимым процессом, тогда как при хронической РТПХ происходит активация ТИ2-клеток донора [Krenger W., Ferrara J.L., 1996; Abdallah A.N. et al, 1997; Shustov A. et al., 2000]. Однако нами было обнаружено, что хроническая РТПХ может протекать в различных вариантах, клинические проявления которых предположительно связаны с разной степенью активации Т-хелперных субпопуляций [Кудаева О.Т. и др., 1992].

Основные достижения экспериментальной и клинической иммунологии последних десятилетий связаны с исследованиями генетических механизмов, лежащих в основе регуляции иммунных реакций. С помощью молекулярно-генетических и генно-инженерных методов убедительно показана генетическая детерминированность вида, направленности и интенсивности иммунных реакций, которыми организм отвечает на антигенные воздействия. В то же время само развитие этого направления в иммунологии, уделяющего основное внимание генетическим механизмам, ведёт к осознанию того факта, что хотя генотип, несомненно, является основой функционирования любых регуляторных механизмов, текущая физиологическая регуляция иммунитета не может осуществляться путём коррекции генотипа данного конкретного организма. Становится ясным, что не меньшую роль в детерминации особенностей протекания индивидуальных иммунных реакций должны играть эпигенетические механизмы, то есть долгосрочные, но обратимые изменения активности генов в процессе индивидуального развития организма, не связанные с изменением нуклеотидной последовательности ДНК, с помощью которых осуществляется целенаправленное сопряжение реакций иммунной системы с адаптационными процессами целостного организма [Fitzpatrick D.R., Wilson Ch.B., 2003; Vercelli D., 2004; Reiner S.L., 2005; Wilson C.B. et al., 2005].

Считается, что судьба развивающейся Th-клетки зависит от доминирования специфических транскрипционных факторов Thl- или Th2-дифференцировки, устанавливаемого комплексом внешних эпигенетических факторов [Glimcher L.H. et Murphy К.М., 2000; Wilson C.B., Makarb K.W., 2002; Agnello D. et al., 2003]. В связи с этим выбор направления, в котором будут развиваться конкретные Th-клетки, находится под влиянием многочисленных факторов, связывающих реакции в иммунной системе с текущим состоянием целостного организма, среди которых в первую очередь нужно указать гормональный фон, вегетативный статус, уровень активности центральной нервной системы [Козлов В.А. и др., 1982; Абрамов В.В., 1988; Rook G.A. et al., 1994; Elenkov I.J., 2004]. К числу важнейших параметров, определяющих состояние организма, относится и уровень двигательной активности, значение которой сформулировано в энергетическом правиле скелетных мышц и заключается в том, что особенности энергетики и соответственно уровень физиологических отправлений различных вегетативных систем организма в целом определяется состоянием скелетной мускулатуры [Аршавский И.А., 1982]. Несмотря на значительную вариабельность результатов, изучение влияния физических тренировок свидетельствует об их несомненном эффекте на иммунную систему [Першин Б.Б., Кузьмин С.Н., 1994; Nieman D.C., 1996; Pedersen В.К., Nieman D.C., 1998; Gleeson M., 2004].

Таким образом, соотношение активностей Thl- и ТЬ2-субпопуляций, контролирующее выбор варианта, по которому пойдет развитие иммунного процесса в каждом конкретном случае, определяется не только генотипом, но и обусловленными эпигенетическими механизмами изменениями в иммунной системе, сформировавшимися на предыдущих этапах онтогенеза. Это положение определило цель и задачи исследования. Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было исследование роли ТЫ/ТЬ2-соотношения как вероятного ключевого параметра иммунной системы, опосредующего эффект эпигенетических воздействий и определяющего направление развития иммуннопатологического процесса при хронической РТПХ у генетически однородных животных.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить состояние иммунной системы реципиентов (функциональную активность клеток иммунной системы в опытах in vitro и in vivo и способность к гуморальному и клеточному иммунному ответу in vivo) в динамике развития хронической РТПХ с момента ее индукции до формирования клинически различающихся исходов.

2. Выяснить зависимость вариантов течения хронической РТПХ от преимущественной активации Thl- или ТЬ2-субпопуляций, оцениваемой по соотношению подклассов иммуноглобулина G.

3. С помощью воздействий, стимулирующих активность Thl- или Th2-клеток, исследовать влияние ТЫ/ТЬ2-баланса в фазе индукции РТПХ на развитие разных вариантов иммунопатологического процесса.

4. Изучить влияние половых и глюкокортикоидных гормонов на развитие вариантов хронической РТПХ.

5. Охарактеризовать состояние основных функциональных параметров иммунной системы (функциональную активность лимфоцитов в опытах in vitro и in vivo и способность к гуморальному и клеточному иммунному ответу in vivo) после регулярных физических тренировок различной продолжительности.

6. Исследовать влияние регулярных физических тренировок на частоту развития клинических вариантов хронической РТПХ. Научная новизна результатов исследования.

Впервые показано, что в полуаллогенной системе DBA/2->(C57BL/6xDBA/2)Fl индукция хронической РТПХ, ранее рассматривавшейся как исключительно ТЬ2-зависимая реакция, приводит у генетически однородных реципиентов в стандартных условиях опыта к развитию двух вариантов иммунного процесса: Thl- или ТЬ2-зависимого типа.

Хроническая РТПХ Thl-зависимого типа характеризуется спленомегалией и гипергаммаглобулинемией при отсутствии атрофических изменений тимуса, резким подавлением IgM- и IgG-антителообразования в сочетании с нормальным клеточным ответом на Т-зависимый антиген, а также преимущественной продукцией IgG2a по сравнению с IgGl.

Хроническая РТПХ ТЬ2-зависимого типа характеризуется более значительными по сравнению с Thl-вариантом спленомегалией и гипергаммаглобулинемией при отсутствии атрофических изменений тимуса, супрессией как гуморального, так и клеточного ответа на Т-зависимый антиген, преимущественной продукцией IgGl по сравнению с IgG2a, а также формированием аутоиммунной патологии - люпус-подобного иммунокомплексного гломерулонефрита.

Получены новые данные о возможных механизмах развития у реципиентов Thl- или ТЬ2-вариантов иммунопатологических состояний. Развитие Thl- варианта сопровождается значительным повышением спонтанной и LPS-стимулированной продукции IL-1 перитонеальными макрофагами реципиентов в начальные сроки после индукции хРТПХ, тогда как при ТЬ2-варианте не происходит подъёма продукции этого цитокина. Выявлена разная динамика образования антител к ДНК при Thl- и Th2зависимых вариантах хРТПХ с пиком в более ранние сроки при Инварианте. Показано, что формирование аутоиммунного гломерулонефрита в данной модели не зависит от Lyl+B клеток. Установлено, что развитие хронической РТПХ у lupus-реципиентов сопряжено с поддержанием повышенного уровня кортикостерона и более выраженным преобладанием продукции женских половых гормонов над мужскими по сравнению с nonlupus-мышами. Показано, что поражение почек при ТЬ2-варианте имеет обратимый характер и корригируется летальным облучением с последующим восстановлением клетками сингенного костного мозга. Развивающийся иммунодефицит (супрессия иммунного ответа на Т-зависимый антиген) при обоих вариантах имеет стойкий характер и не нормализуется летальным облучением с последующим восстановлением клетками сингенного костного мозга.

Установлена возможность модуляции течения хронической РТПХ агентами, изменяющими соотношение Thl/Th2 в индуктивную фазу реакции (первые 2 недели): введение веществ, активирующих Thl -клетки, снижает частоту развития аутоиммунного гломерулонефрита; введение веществ, стимулирующих ТЬ2-клетки, увеличивает частоту этого клинического варианта в экспериментальных группах. Показано, что подавление пролиферации гемопоэтических клеток-предшественников при хронической РТПХ снижает, а ее стимуляция увеличивает частоту формирования аутоиммунного гломерулонефрита.

Показано, что регулярные физические тренировки умеренной интенсивности не вызывают значительных сдвигов в иммунной системе грызунов. Наблюдается достоверное, но не резкое снижение выраженности иммунных реакций. В то же время эффекты физических упражнений закономерно усиливаются при увеличении длительности тренировок, приводя к значительному подавлению функциональной активности лимфоцитов. Получены данные, свидетельствующие о поликлональной активации В-клеток на фоне регулярных физических упражнений различной длительности. Физические тренировки снижают частоту развития иммунокомплексного гломерулонефрита при индукции хронической РТПХ в полуаллогенной системе DBA/2->(C57BL/6xDBA/2)Fl.

Обнаружено, что реакция иммунной системы организма на физические тренировки зависит от пола экспериментальных животных, тогда как изменения процессов кроветворения характеризуются однонаправленными эффектами.

Научная и практическая значимость работы.

На модели хронической РТПХ показано, что иммунопатологический процесс у генетически идентичных экспериментальных животных, находящихся в стандартных условиях, развивается по двум существенно различающимся клиническим вариантам, формирование которых связано с исходной фенотипической разнородностью опытной группы, возникающей в результате эпигенетических воздействий таких факторов, как эндокринный статус и двигательная активность, на соотношение Thl/Th2 - ключевой внутрисистемный параметр, определяющий развитие хронической РТПХ по тому или иному варианту. Показано, что при определённых условиях активация Thl-клеток у мышей может приводить не к острой форме РТПХ, а к ранее не известному варианту хронической РТПХ, что расширяет представления о механизмах иммунопатологических процессов.

В совокупности, полученные в работе результаты представляют собой новое научное достижение, существенно меняя взгляд на развитие хронической РТПХ и теоретически обосновывая роль в этом процессе эпигенетических факторов, влияние которых опосредуется Thl Дисбалансом в целостном организме.

Изученная в работе индукция хронической РТПХ в полуаллогенной системе DBA/2-> (C57BL/6xDBA/2)Fl является адекватной лабораторной моделью для изучения механизмов формирования ТЫ/ТЬ2-зависимых иммунопатологических состояний и тестирования препаратов, влияющих на соотношение Thl/Th2 в условиях in vivo.

Разработанный микрометод определения концентрации иммуноглобулина класса G в цельной крови позволяет измерять его уровень в микрообъёмах периферической крови (1-5 мкл), что очень важно при работе с мелкими экспериментальными животными, а также может быть использовано в клинике.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Хроническая РТПХ в полуаллогенной системе DBA/2-> (C57BL/6x DBA/2)F1 протекает либо по Thl-, либо по Т112-зависимому сценарию, приводя к разным клиническим исходам.

2. Развитие разных вариантов хронической РТПХ определяется Thl/Th2-соотношением донора в начальной фазе реакции.

3. Регулярные физические тренировки являются значимым фактором, участвующим в регуляции функциональной активности клеток иммунной системы у мышей; эффекты тренировок зависят от величины нагрузки и пола животных.

4. Исходная фенотипическая разнородность экспериментальных групп животных, возникающая в результате эпигенетических воздействий таких факторов, как эндокринный статус и двигательная активность, приводит к формированию у генетически идентичных реципиентов разных вариантов хронической РТПХ.

Работа выполнена в лаборатории регуляции иммунопоэза (руководитель лаборатории д.м.н. В.А.Козлов, академик РАМН, профессор) и лаборатории экспериментальной иммунотерапии (руководитель лаборатории д.м.н. О.П.Колесникова) ГУ НИ Института клинической иммунологии СО РАМН.

Иммуногистохимическое исследование почек и морфологический анализ органов проводили совместно с к.м.н. В.А. Логиновым и к.м.н. JI.A. Обуховой (Институт клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН). Уровень гормонов определяли совместно с к.б.н. И.Н.Оськиной (Институт цитологии и генетики СО РАН) и к.б.н. И.А.Колосовой (Институт систематики и экологии животных СО РАН).

выводы.

1. Реакция «трансплантат против хозяина», индуцированная в полуаллогенной системе DBA/2->(C57BL/6xDBA/2)Fl и обладающая характерными для хронической формы РТПХ признаками (спленомегалия, отсутствие атрофии тимуса, поликлональная активация В-лимфоцитов), приводит к формированию двух клинических исходов, определяемых преимущественной активацией Thl- либо ТЬ2-клеток, что говорит о существовании двух вариантов хронической РТПХ: Thl- или Th2-зависимого типа.

2. Развивающийся у части животных один из вариантов хронической РТПХ характеризуется гипергаммаглобулинемией с преимущественным синтезом IgG2a по сравнению с IgGl, резким подавлением продукции IgM- и IgG-антител в сочетании с нормальным клеточным ответом на Т-зависимый антиген, что свидетельствует о доминирующей роли Thl-клеток в формировании иммунных реакций при данном течении РТПХ.

3. Другой вариант хронической РТПХ, сопровождающийся развитием гипергаммаглобулинемии с. преимущественным синтезом IgGl по сравнению с IgG2a, снижением функциональной активности Т клеток и подавлением как клеточного, так и гуморального ответа на Т- зависимый антиген, связан с преобладанием влияния ТЬ2-клеток и приводит к формированию аутоиммунной патологии - люпус-подобного иммунокомплексного гломерулонефрита.

4. Введение агентов, специфически активирующих Thl- или Th2-клетки, направляет развитие хронической РТПХ по одному из возможных вариантов, соответственно снижая или увеличивая вероятность развития гломерулонефрита, что подтверждает ключевую роль ТЫ/ТЬ2-соотношения в определении пути развития хронической РТПХ.

5. Вероятность возникновения определённого варианта хронической РТПХ зависит от индивидуального гормонального статуса реципиента: повышенный уровень кортикостерона и женских половых гормонов предрасполагают к развитию ТЬ2-зависимого варианта реакции, в то время как тестостерон и дегидроэпиандростерон увеличивают частоту развития Thl-зависимого варианта.

6. Поликлональная активация В-клеток костного мозга и селезёнки мышей, возникающая при регулярных физических тренировках умеренной интенсивности, сохраняется при истощающем режиме тренировок, который приводит к глубокому подавлению других функциональных реакций клеток иммунной системы.

7. Индукция хронической РТПХ в полуаллогенной системе DBA/2->(C57BL/6xDBA/2)Fl на фоне регулярных физических тренировок реципиентов сопровождается снижением частоты развития иммунокомплексного гломерулонефрита, свидетельствуя об изменении условий ТЬ1/ТЬ2-поляризации под влиянием физических нагрузок.

8. Развитие хронической реакции «трансплантат против хозяина» в полуаллогенной системе DBA/2-> (C57BL/6x DBA/2)F1 находится под регулирующим действием эпигенетических факторов, эффект которых опосредуется изменением соотношения Thl/Th2 клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Подводя итоги данного исследования, можно сказать, что полученные в работе результаты убедительно доказывают предположение об определяющей роли ТЫ/ТЬ2-соотношения в развитии хронической РТПХ, индуцируемой в стандартной полуаллогенной системе DBA/2->(C57Bl/6xDBA/2)Fl. Показано, что вероятность развития одного из оппозитных вариантов течения хронической РТПХ, обозначенных как nonlupus- и /и£Ш$-варианты, тесно связана с соотношением Thl- и Th2-субпопуляций и может быть закономерным образом увеличена или уменьшена при воздействии агентов с заранее известным влиянием на ТЬ1/ТЬ2-баланс.

Чувствительность использованной системы к внешним воздействиям, а также возможность оценивать реакцию на уровне целостного организма позволяет рекомендовать исследованный тип хронической РТПХ в качестве адекватной лабораторной модели для тестирования фармакологических препаратов и других агентов, потенциально способных направленно влиять на процессы ТЫ/ТЬ2-поляризации.

Наиболее интересным и перспективным результатом проведенных исследований оказывается выявление и научная оценка того факта, что даже в группах генетически идентичных животных, содержащихся в стандартных условиях и не подвергавшихся никаким предварительным экспериментальным воздействиям, индукция хронической РТПХ приводит к формированию различных иммунопатологических состояний у индивидуальных животных. Таким образом, генотип животного и параметры непосредственного антигенного воздействия на его организм не полностью предопределяют характер развивающихся иммунных реакций и их конечный итог. В значительной степени характеристики процесса и его исход зависят от того «иммунобиологического статуса», в котором находится данное животное в момент индукции и который сложился в течение его предшествующей жизни. Поэтому анализируя разнообразие индивидуальных иммунных реакций, следует учитывать не только генотипические особенности особи, но и присущую каждому индивиду «эпигенетическую составляющую», то есть ту констелляцию иммунорегуляторных факторов, которая, в конечном итоге, определяет характер и выраженность индивидуальных реакций на специфические антигенные воздействия и вероятность развития иммунопатологических состояний.

В качестве примеров таких факторов развития, которые обусловлены особенностями индивидуального жизненного цикла и в то же время обладают иммунорегуляторными эффектами, можно привести гормональный статус и двигательную активность животных, значимое влияние которых на выбор варианта развития хронической РТПХ показано в данной работе.

Таким образом, условия индивидуальной жизни особи формируют текущее стабильное состояние иммунных параметров, внося коррективы в определяемые генотипом интегральные характеристики иммунной системы индивида, и тем самым определяя направленность и выраженность его будущих реакций на антигенные воздействия и вероятность возникновения иммунных конфликтов в организме. Наряду с генетической гетерогенностью естественных популяций эта основанная на эпигенетических механизмах изменчивость иммунной системы служит основанием для видимого разнообразия индивидуальных реакций на антигенные стимулы, создавая определенную восприимчивость к инфекционным агентам и предрасположенность к развитию различных заболеваний, в патогенезе которых значимую роль играет функциональная активность клеток иммунной системы.