Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Экспериментальная фармакокинетика и биодоступность различных фармацевтических композиций нового дипептидного анксиолитика ГБ-115

ИВАННИКОВА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА

Экспериментальная фармакокинетика и биодоступность различных фармацевтических композиций нового дипептидного анксиолитика ГБ-115

14.03.06 - Фармакология, клиническая фармакология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

18 СЕН 2Щ

Москва - 2014 005552606

005552606

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательском институте фармакологии имени В.В. Закусова» Российской академии медицинских наук (ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В.Закусова» РАМН)

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук,

профессор Жердев Владимир Павлович

Научный консультант:

кандидат биологических наук Бойко Светлана Семёновна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, член-корр. РАН, директор ФГБУ «НИИ по изысканию новых антибиотиков

им. Г.Ф. Гаузе» РАМН Фирсов Александр Алексеевич

доктор биологических наук, профессор кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней ГБОУ ВПО Первого МГМУ

им. И.М. Сеченова Минздрава России Соколов Андрей Владимирович

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И. Евдокимова» Минздрава России

Защита диссертации состоится «_» _ 2014 г. в _ч на

заседании диссертационного совета Д. 001.024.01 на базе ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ученой части ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, 8 и на сайте www.academpharm.ru

Автореферат разослан «_»_2014 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Вальдман Елена Артуровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

В связи со значительным ростом заболеваний, связанных с тревожными и депрессивными расстройствами, актуальным является разработка и внедрение новых анксиолитических средств. На сегодняшний день препараты, обладающие таким фармакологическим эффектом, представлены в основном группой соединений бензодиазепинового ряда, которые широко применяются в лечебной практике более 50 лет [Воронина Т.А., 2002; Середенин С.Б. и др., 2007; Baldwin D.S. et al., 2008]. Однако наличие у бензодиазепинов существенных побочных эффектов ограничивает их использование и стимулирует поиски новых анксиолитиков [Воронина Т.А., 2002; Baldwin et al., 2010; Griebel G., Holmes A., 2013]. Мишенями при поиске анксиолитиков нового поколения являются различные субъединицы ГАМК-бензодиазепинового комплекса, транслокаторный протеин (18 kD) [Nothdurfter С. et al., 2012; Rupprecht R. et al., 2009] и серотонинергическая система [Nothdurfter С. et al., 2012; Rupprecht R. et

В последние годы интенсивные поиски анксиолитиков проводятся среди веществ, оказывающих влияние на нейропептидную систему (кортикотропин-рилизинг фактор, холецистокинин, тахикинин и др.) [Beizung С. et al., 2006; Holmes А. et al., 2003; Griebel G., Holsboer F., 2012; Андреева Л.А. и др., 2010].

К настоящему времени установлена важная роль эндогенного нейропептида холецистокинина в патогенезе тревожных расстройств, депрессии и шизофрении [Fink Н. et al., 1998; Bourin М. et al, 1996; Bradwejn J. et al., 2001; Zwanzger P. et al., 2012; Del Boca C. et al., 2012].

Так как эндогенные нейропептиды имеют низкую энзиматическую устойчивость, подвержены гидролизу в ЖКТ, активны только после проникновения через ГЭБ, возникла необходимость поиска потенциальных анксиолитиков (антагонистов холецистокининовых рецепторов) с более компактной и защищенной структурой, эффективных при системном введении.

Исходя из гипотезы, разработанной Т.А. Гудашевой ещё в 1985 г., о возможности имитации структуры непептидного прототипа с определённой нейротропной активностью, а также активного фрагмента исходного пептида с

al., 2009].

аналогичной активностью, был синтезирован новый дипептидный анксиолитик ГБ-115 (амид Ы-фенил-Ы-гексаноил-Ь-глицил-Ь-триптофан) - ретроаналог холецистокинина-4 [Гудашева Т.А., 2011; Гудашева Т.А. и др., 2007; Гудашева Т.А. и др., 2006]. Установлена фармакологическая активность соединения: экспериментально доказано, что ГБ-115 проявляет анксиолитическое, антиалкогольное, антидепрессивное и анальгетическое действие [Колик Л.Г., 2012].

В связи с вышесказанным актуальным является изучение фармакокинетики и биодоступности субстанций и различных фармацевтических композиций нового дипептидного анксиолитика ГБ-115. При этом важным является разработка аналитических методик качественного и количественного определения ГБ-115 в биологическом материале для проведения исследования его фармакокинетики, расчёта относительной биодоступности и выбора оптимальной лекарственной формы препарата, отличающейся высокими показателями скорости и степени всасывания.

Целью настоящего исследования явилось изучение фармакокинетики и биодоступности кристаллической и микронизированной субстанций, а также четырёх фармацевтических композиций ГБ-115.

Задачи исследования

1. Разработать методики качественного и количественного определения анксиолитика ГБ-115 в биоматериале.

2. Валидировать метод количественного определения ГБ-115 с использованием ВЭЖХ с УФ-детектором.

3. Изучить фармакокинетику ГБ-115 после перорального введения кристаллической и микронизированной субстанций вещества в эксперименте на крысах.

4. Изучить фармакокинетику ГБ-115 после перорального введения четырёх различных экспериментальных образцов фармацевтических композиций анксиолитика у крыс.

5. Рассчитать основные фармакокинетические параметры ГБ-115 у крыс после введения фармацевтических композиций и субстанций соединения и на основании их сравнительного анализа рекомендовать его оптимальную фармацевтическую композицию.

Научная новизна

Разработаны методики на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором для качественного определения и идентификации структуры дипептидного анксиолитка ГБ-115 и количественного определения неизмененного ГБ-115 в биологическом материале на основе ВЭЖХ с УФ-детектором.

Впервые в сравнительном аспекте проведено изучение экспериментальной фармакокинетики ГБ-115 у крыс после перорального введения кристаллической и микронизированной субстанций и 4-х новых лабораторных образцов фармацевтических композиций анксиолитика, отличающихся по технологии приготовления и составу вспомогательных веществ. Показано, что различные вспомогательные вещества (лактоза, микрокристаллическая целлюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или гипромеллоза, неусиллин, лудипресс, твёрдая дисперсная система с поливинилпирролидоном), входящие в состав фармацевтических композиций, и технология приготовления существенным образом влияют на фармакокинетику изучаемого дипептида и следствием ее оптимизации является улучшение фармакокинетических свойств разрабатываемого соединения, а именно, увеличения полноты всасывания, максимальной концентрации, скорости и степени всасывания и в конечном итоге биодоступности ГБ-115. На основе полученных экспериментальных данных показано, что определяющую роль в оптимизации фармацевтической композиции ГБ-115 играют, во-первых, использование микронизированной субстанции соединения, и, во-вторых, применение таких вспомогательных веществ, как поливинилпирролидон и

гидроксипропилметилцеллюлоза.

Научно-практическая значимость

Сравнительный анализ фармакокинетических параметров показал значительные преимущества по биодоступности двух фармацевтических композиций, что позволило рекомендовать их для дальнейшего фармакологического изучения.

Результаты фармакокинетических исследований вошли в заявку на получения патента на изобретение: «Фармацевтическая композиция амида Ы-(б-фенилгексаноил)

глицил-Ь-триптофана, выполненная в твердой лекарственной форме и способы ее получения».

Личный вклад автора

Автор принимал непосредственное участие во всех экспериментах, проводил обработку и анализ полученных результатов. Автором были подготовлены основные публикации по материалам диссертации, сформулированы положения и выводы работы.

Апробация работы

Основные результаты работы были освещены и доложены на XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2012); IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012); IV Всероссийском научно-практическом семинаре молодых учёных с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств» (Волгоград, 2012); Евразийском конгрессе с международным участием - «Медицина, фармация и общественное здоровье» (Екатеринбург, 2013); Первой Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных «Проблема разработки новых лекарственных средств» (Москва, 2013); IX международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: вопросы медицины», (Москва, 2013 г.); Международной заочной научно-практической конференции «Актуальные направления научных исследований XXI века: теория и практика», (Воронеж, 2013 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 3 статьи (в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ), 2 статьи и 5 тезисов докладов в материалах российских и международных конференций.

Объём и структура диссертации

Диссертация изложена на 109 страницах компьютерного текста. Состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения и выводов. Содержит 21 таблицу и 10 рисунков. Список литературы включает 142 источника, из них 110 зарубежных и 32 отечественных.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Методики экстракции, качественного и количественного определения ГБ-115 в биоматериале с использованием ВЭЖХ с масс-спектрометрическим и ультрафиолетовым детекторами, дающие возможность провести фармакокинетические и биофармацевтические исследования.

2. Перспективность использования микронизированной субстанции ГБ-115 в приготовлении лекарственной формы с позиций фармакокинетики.

3. Поливинилпирролидон в форме твёрдой дисперсной системы и гидроксипропилметилцеллюлоза значительно увеличивают скорость и степень всасывания ГБ-115.

4. Биофармацевтические доказательства преимущества двух оптимальных фармацевтических композиций, обладающих большей относительной биодоступностью.

Экспериментальная часть Материалы и методы исследования

В качестве стандартных веществ была использована фармацевтическая субстанция ГБ-115 (амид М-фенил-М-гексаноил-Ь-глицил-Ь-триптофан), содержание основного вещества в которой было не ниже 99%.

В работе использовались кристаллическая и микронизированная субстанции ГБ-115, а также 4 лабораторных образца фармацевтических композиций ГБ-115, предоставленные опытно-технологическим отделом ФГБУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова» РАМН, отличающихся по составу и технологии приготовления:

Фармацевтическая композиция №1: Субстанция ГБ-115, неусиллин, лудипресс;

Фармацевтическая композиция №2: Микронизированная субстанция ГБ-115, твёрдая дисперсная система с поливинилпирролидоном;

Фармацевтическая композиция №3: Микронизированная субстанция ГБ-115, неусиллин, лудипресс;

Фармацевтическая композиция №4: Микронизированная субстанция ГБ-115, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза. Экспериментальные животные

Фармакокинетику ГБ-115 изучали после перорального введения кристаллической и микронизированной субстанций и фармацевтических композиций в виде водной суспензии белым беспородным крысам самцам (массой 180-220 г.), полученных из питомника «Столбовая» РАМН. Животных содержали в стандартных условиях вивария при 12-ти часовом световом режиме и свободном доступе к корму и воде. Исследования проводили на здоровых, бодрствующих животных. До проведения исследования животные находились в течение 12 часов на водной диете.

Масс-спектрометрическии анализ соединения ГБ-115 в плазме крови крыс

Анализ биологических проб ГБ-115 проводили с использованием метода высокоэффективной жидкостной хромотографии с масс-спектрометрическим детектором для точной идентификации структуры пептида. Разделение проводили с помощью хроматографа Agilent 1200 Series LC-MSD TRAP (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) с автоматическим вводом проб, детектора "Agilent 6300 series ion-trap" (США) и компьютера с соответствующим пакетом для обсчёта хроматограмм. Мобильная фаза состояла из 1 л водного раствора с добавлением 50 мл 0.1 М раствора ацетата аммония и 5 мл муравьиной кислоты (А) и 100% ацетонитрила (В). ВЭЖХ анализ проводился в режиме градиентного элюирования: 0 мин - 5 % (В), 5 мин - 60% (В), 7 мин - 80% (В), 12 мин - 80% (В), 15 мин - 10% (В). Градиент был разработан экспериментальным путём. Скорость потока подвижной фазы составляла 0.25 мл/мин. Температура колонки составила 30°С. Объём вкола: 1 цЬ.

Масс-спектры были получены с использованием ионизации электрораспылением (ИЭР) и регистрацией как положительных, гак и отрицательных ионов. В результате позитивной ионизации образуется ряд положительных ионов с m/z

473, 457, 435, 418, которые предположительно соответствуют катионированным молекулярным ионам [М+К]+, [M+Na]+, [МН]+ и [MH-NH3]+ соответственно. Наличие большого количества пиков затрудняет количественное определение анализируемого вещества. Поэтому была выбрана негативная ионизация, посредством которой образуется один отрицательный ион с m/z - 434, который в дальнейшем подвергается фрагментации с образованием ионов с массовыми числами - 286 и 304, что предположительно соответствует следующим фрагментам: ацетат глицил-L-триптофана и гидроксилированный ацетат глицил-Ь-триптофана соответственно.

В качестве распыляющего газа использовали азот со скоростью - 9 л/мин. Как масс-анализатор была выбрана ионная ловушка.

Методика количественного определения соединения ГБ-115 в плазме крови крыс с применением метода высокоэффективной хроматографии с УФ-детектором.

Анализ проб плазмы крови крыс проводили с использованием метода ВЭЖХ с УФ-детектором. Разделение проводили на жидкостном хроматографе, состоящем из изократической помпы SYSTEM COLD 127 (США), ультрафиолетового детектора и компьютера с соответствующим пакетом программ для обсчёта хроматограмм "Амперсенд" (Россия).

Хроматографическое разделение проводили на аналитической колонке - Luna 5u С 18 (2) 100А, 250x4.6 мм, детектирование проводили при длине волны 282 нм, что позволило избежать влияния коэкстрактивных веществ, которые бы мешали определению ГБ-115. При использовании диапазона длин волн 200-230 нм наблюдается совпадение максимумов поглощения ГБ-115 и примесей, что и обусловило выбор максимума поглощения в УФ-свете при длине волны 282 нм.

Подвижная фаза - ацетонитрил : вода (400 : 450), трифторуксусная кислота. Скорость потока подвижной фазы - 1.0 мл/мин. pH раствора составлял 3.2.

Хроматографический анализ проводили при комнатной температуре (22-24 С). Перед хроматографированием подвижную фазу дегазировали на ультразвуковой бане, что позволило избежать дополнительных пиков во время анализа. Подвергавшуюся

анализу пробу вводили при помощи микрошприца через инжектор в петлю хроматографа объёмом 100 мкл.

Обработка биологических проб, экстракция ГБ-115 из биологических образцов

Подготовка плазмы крови крыс к хроматографическому анализу

Экстракцию ГБ-115 из биологических образцов проводили следующим способом: к 1 мл плазмы крови крыс, содержащей ГБ-115, добавляли двукратный объём ацетонитрила для осаждения белков. Водно-ацетонитрильный раствор центрифугировали при Т - 2° С со скоростью 4000 об/мин в течение 10 минут. Далее отбирали очищенную от белков плазму, добавляли 5 мл эфира, встряхивали в течение 15 минут, отделяли эфирный слой и высушивали в токе азота досуха, остаток растворяли в элюенте и вводили в систему ВЭЖХ-УФ.

Фармакокинетические параметры, используемые для интерпретации экспериментальных данных

Основные фармакокинетические параметры рассчитаны модельно-независимым методом (программа "M-IND"), (Агафонов A.A., Пиотровский В.К., 1991):

AUC0_«o (нг/мл х мин) - площадь под кривой «концентрация лекарственного вещества — время», рассчитывается от момента введения до бесконечности;

AUCo—т (нг/мл х мин) - площадь под фармакокинетической кривой, рассчитывается от момента введения до момента последней регистрации концентрации исследуемого соединения;

С (нг/мл) - концентрация препарата в плазме крови после перорального введения;

Т„акс (мин) - время достижения максимальной концентрации препарата в плазме крови после перорального введения;

СМакс (нг/мл) - максимальная концентрация лекарственного вещества в плазме крови после перорального введения;

Смакс/AUC (мин"1) - параметр, характеризующий скорость всасывания препарата в системный кровоток;

MRT (мин) - среднее время пребывания лекарственного вещества в организме;

(мин"1) - константа элиминации, параметр, характеризующий скорость выведения препарата из организма;

Т|/2 (мин) - период, за который выводится половина введённой и всосавшейся дозы лекарственного вещества;

Vzpo, (л) - гипотетический объём распределения;

F (%) - относительная биодоступность (AUC0-.t(A)/ AUC0-.t(B) х 100%). Статистическая обработка полученных результатов

Полученные экспериментальные данные были математически и статистически обработаны с помощью программы «Excel v.11.0» («Statistica 6.0»). Достоверность различий для сравниваемых концентраций исследуемых соединений оценивали с помощью критерия Стьюдента [Сергиенко В.И., Бондарева И.Б., 2001].

Поскольку представленные фармакокинетические кривые были построены по усреднённым значениям 5-8 полученных данных на каждую временную точку, то при расчётах фармакокинетических параметров отсутствует статистическая обработка результатов. Расчёт фармакокинетических параметров проводился с использованием программы M-Ind (Пиотровский В.К., 1984). На всех графиках представлены средние значения Xcp±SD (SD - стандартное отклонение).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Фармакокинетика ГБ-115 у крыс после пероралыюго введения кристаллической и микронизированной субстанции в дозе 100 мг/кг

Фармакокинетические кривые ГБ-115 после перорального введения крысам микронизированной и кристаллической субстанций в дозе 100 мг/кг представлены на рисунке 1. Время регистрации соединения ГБ-115 в плазме крови крыс колеблется от 45 до 60 мин для кристаллической и микронизированной субстанций соответственно. Максимумы концентраций ГБ-115 наблюдаются через 10 мин после введения кристаллической и через 20 мин после введения микронизированной субстанций. Исходя из данных рисунка 5, можно сделать вывод, что после введения кристаллической субстанции, регистрируются более высокие концентрации ГБ-115 в течение первых 15 мин, но в последующие интервалы времени концентрации

соединения снижаются и их значения становятся ниже, чем концентрации после введения микронизированной субстанции.

Кроме того, можно отметить, что после перорального введения ГБ-115 как в виде микронизированной, так и кристаллической субстанций неизменённое соединение быстро всасывается и поступает в системный кровоток, и уже через 5 минут в плазме крови крыс регистрируются значительные концентрации анализируемого вещества.

180160 -

140- Д

120- У \

0-

I I I I I I I I I ] I ]-1

О 10 20 30 40 50 60

I, мин

Рис. 1 Фармакокинетические кривые ГБ-115 после перорального однократного введения в дозе 100 мг/кг микронизированной (1) и кристаллической (2) субстанций. По оси абсцисс — время, мин (I, мин) По оси ординат — концентрация, нг/мл (с, нг/мл)

Средние концентрации ГБ-115 в различные интервалы времени и его фармакокинетические параметры после введения кристаллической и микронизированной субстанций вещества представлены в таблицах 1 и 2 соответственно.

Таблица 1. Средние концентрации ГБ-115 после перорального введения кристаллической и микронизированной субстанций ГБ-115 крысам в дозе 100 мг/кг.

Анализ, вещ-во Показатель Концентрация, нг/мл

Микр. субст. Время 5 10 15 20 30 45 60

Хер 48.35 85.21 89.30 113.02 74.32 61.10 28.26

SD 25.163 14.336 37.126 58.039 29.036 24.892 10.600

Крист. субст. Время 5 10 15 20 30 45 60

Хер 116.93 146.16 82.36 56.60 38.64 24.84 -

SD 45.502 26.600 16.908 25.500 25.558 12.320 -

Таблица 2. Фармакокинетические параметры ГБ-115 у крыс после перорального введения кристаллической и микронизированной субстанций.

Параметры Крист. субстанция Микр. субстанция

AUCo-т. нг/мл х мин 2821.050 4019.415

AUCo—ac, нг/мл х мин 3279.311 4983.617

Тмакс, мин 10 20

Смаке, нг/мл 146.16 113,022

Смакс/AUC, мин"1 0.052 0.028

Cipo, л/мин 6.099 4.013

Кэл, мин"' 0.0471 0.0323

Т1/2, мин 14.73 21.49

MRT, мин 23.83 39.87

Vzpo, л 129.60 124.40

F, % 142.48

Как видно из приведённых выше таблиц, время достижения максимальной концентрации ГБ-115 после введения кристаллической субстанции в дозе 100 мг/кг в плазме крови крыс составило 10 мин, а её величина - 146.16 нг/мл. Максимальная же концентрация ГБ-115 после введения микронизированной субстанции в той же дозе составила 113.02 нг/мл, и достигалась через 20 мин.

Анализ параметров кинетики позволяет заключить, что ГБ-115 быстро выводится из организма после перорального введения микронизированной и в большей степени кристаллической субстанций, на что указывают значения констант скорости элиминации из плазмы крови (Ке1), которые составили 0.0323 и 0.0471 мин"' соответственно. Быстрое выведение ГБ-115 из плазмы крови животных также характеризуется такими фармакокинетическими параметрами, как среднее время удерживания препарата в организме, которое почти в 2 раза выше для ГБ-115 после введения микронизированной субстанции 39.87 мин, чем после введения кристаллической - 23.83 мин. Соответственно это нашло отражение и для периода полувыведения, значения которого ниже для кристаллической субстанции - 14.73 мин, чем для микронизированной субстанции - 21.49 мин.

Подводя итоги, следует отметить, что ГБ-115 в 1.5 раза более продолжительное время находится в организме испытуемых животных после его введения в виде микронизированной субстанции, чем при введении в той же дозе кристаллической субстанции. На это также указывают полученные значения плазменного клиренса ГБ-115 (4.013 л/мин для микронизированной и 6.099 л/мин для кристаллической субстанций).

Значения гипотетического объёма распределения ГБ-115 после введения анализируемых субстанций незначительно отличается, что указывает на схожий характер распределения активного вещества в органах и тканях.

Скорость всасывания и площадь под фармакокинетической кривой ГБ-115 существенно отличается после введения крысам двух субстанций. Так, площадь под фармакокинетической кривой ГБ-115 после введения микронизированной субстанции в 1.5 раза выше, чем после введения кристаллической, что свидетельствует о более высокой относительной биодоступности ГБ-115 после введения микронизированной субстанции. Однако, скорость всасывания ГБ-115 после введения микронизированной

субстанции, судя по времени достижения Стах, происходит медленнее, чем после введения кристаллической субстанции, что может рассматриваться как преимущество данного технологического приёма - микронизации и более продолжительно определяться в плазме крови животных после введения микронизированной субстанции. Это может сопровождаться более продолжительным фармакологическим действием вещества Надо отметить, что микронизация, которая должна способствовать увеличению скорости всасывания, не всегда увеличивает скорость растворения и абсорбцию лекарственного вещества, в частности, вследствие плохой смачиваемости труднорастворимых веществ. Важно учитывать и то, что появление на измельченном материале электростатического заряда приводит к его комкованию, потере сыпучести, плохой смачиваемости [80]. Одной из причин отсутствия желаемого эффекта (увеличение скорости растворения и абсорбции) от изучаемого технологического приёма микронизации является наличие процессов агломерации и агрегации. При микронизации происходит резкое увеличение удельной поверхности частиц и вместе с тем усиление притяжения Ван-дер-Ваальсовых сил между неполярными молекулами, что и лежит в основе процессов агломерации и агрегации.

Возможно, вследствие одной из приведённых причин, ГБ-115 более медленно всасывается в организме подопытных животных после введения микронизированной субстанции и неизменное соединение регистрируется в плазме крови животных более продолжительное время, С целью проверки фармакокинетических закономерностей ГБ-115, полученных после перорального введения крысам различных субстанций изучаемого соединения, в опытно-технологическом отделе ФГБУ «НИИ фармакологии им. В.В. Закусова» РАМН были созданы 4 лабораторных образца фармацевтических композиций ГБ-115 с использованием кристаллической и микронизированной субстанций, а также различных вспомогательных веществ.

Сравнительная фармакокинетика и биодоступность четырёх фармацевтических композиции

На рис.2 представлены фармакокинетические кривые ГБ-115 в плазме крови крыс после однократного перорального введения ГБ-115 в виде водного раствора

кристаллической и микронизированной субстанции, а также его четырёх фармацевтических композиций в дозе 100 мг/кг.

Рис.2 Фармакокинетические кривые ГБ-115 после перорального однократного введения в дозе 100 мг/кг а) фармацевтической композиции № 1 (1) и кристаллической субстанции (5) б) фармацевтической композиции №2 (2) и микронизированной субстанции (4) в) фармацевтической композиции №3 (3) и микронизированной субстанции (4) г) фармацевтической композиции №4 (4) и микронизированной субстанции (5). По оси абсцисс - время, мин (I, мин) По оси ординат — концентрация, нг/мл (с, нг/мл)

Как видно из материалов рисунка ГБ-115 быстро всасывается в ЖКТ, поступает в системный кровоток и определяется в плазме крови крыс уже через 5 мин после введения как субстанций, так и 4-х фармацевтических композиций.

Однако на стадии абсорбции препарата отмечаются значительные различия как в количественном содержании ГБ-115, так и в динамике изменения его концентраций после введения анализируемых фармацевтических композиций. Для фармацевтической композиции №1 характерно постепенное увеличение концентрации активного соединения с достижением максимальной концентрации через 20 мин после введения, которая составляет 126.25 нг/мл. Фармацевтическая композиция №2

отличается резким подъёмом концентрации фармакологически активного соединения: уже через 5 мин после введения она составляет 103.41 нг/мл и достигает максимума через 15 мин - 185.10 нг/мл. В последующие интервалы времени концентрация ГБ-Н5 постепенно снижалась на протяжении 1.5 часа и в конечный период времени составила - 35.61 нг/мл. Максимальная концентрация ГБ-115 после введения фармацевтической композиция №3 была самой низкой и составила 97.36 нг/мл через 20 мин после введения. Для данной фармацевтической композиции характерно наличие достаточно высоких концентраций в последующие интервалы времени. Концентрация ГБ-115 после введения фармацевтической композиции №4 достигает своего максимального значения через 15 мин и составляет 121.5 нг/мл.

Значительные различия в кинетике ГБ-115 наблюдались и на стадии его элиминации из плазмы крови крыс. Так, для фармацевтической композиции №1 отмечалось быстрое снижение концентрации ГБ-115 в период 20-30 мин и через 45 мин активное вещество в плазме крови крыс не обнаруживалось. Для фармацевтической композиции №2 и №4 концентрация ГБ-115 в плазме крови крыс снижалось более медленно и через 90 мин соединение регистрировалось в достаточно высоком количестве. Характер элиминации ГБ-115 после перорального введения фармацевтической композиции №3 более медленный, причём, высокая его концентрация сохранялась в течение 60 мин и составила в этот интервал времени 66.35 нг/мл.

На основании полученных экспериментальных данных рассчитаны основные фармакокинетические параметры ГБ-115 модельно-независимым методом, которые представлены в сводной таблице №3.

Таблица N»3. Фармакокинетические параметры ГБ-П5 после введения четырёх разработанных фармацевтических композиций в дозе 100 мг/кг.

Параметры ФК_1 ФК_2 ФК_3 ФК_4

АИСо_т, нг/мл х мин 2136.225 7731.801 4708.205 7664.125

АиСо^зс, нг/мл х мин 2332.120 10399.650 11962.190 12615.99

Тмакс, мин 20 15 20 15

Смаке, нг/мл 126.250 185.098 97.364 121.5

Смакс/AUC, мин-1 0.059 0.024 0.021 0.016

Cipo, мл/мин 8.576 1.923 1.672 1.585

Кэл, мин-1 0.1475 0.0155 0.0094 0.0109

Т1/2, мин 4.70 44.75 74.01 63.86

MRT, мин 18.26 68.32 113.20 95.75

Vzpo, мл 58.15 124.20 178.50 146.00

F, % 53.15% 192.36% 117.14% 190.68%

Для сравнения длительности пребывания активного вещества в неизменном виде в организме испытуемых животных после введения каждой из предложенных фармацевтических композиций необходимо сравнить следующие параметры: Кэл, Т1/2, MRT, Смакс/AUC. ГБ-115 быстрее выводится из организма после введения фармацевтической композиции №1. Для неё характерны высокое значение константы скорости элиминации - 0.1475 мин"', короткий период полувыведения - 4.7 мин и небольшое среднее время удержания лекарственного вещества в плазме крови крыс -18.26 мин. Фармацевтическая композиция №3 (Кэл - 0.0323 мин"1, Т1Д - 74.01 мин, MRT - 113.20 мин), отличается от фармацевтической композиции №1 более медленным выведением неизменённого вещества в течение 60 мин, что является хорошим показателем для фармацевтических композиций, содержащих пептидные соединения. Однако, величина См„с у неё самая низкая и к 90 мин после введения концентрация активного вещества ГБ-115 стремится к нулю. Кроме того, для фармацевтической композиции №2 в отличие от других регистрируется 2-ой максимум концентраций вещества (между 40 и 60 минутами после введения), что может быть связано с эффектом энтерогепатической рециркуляции. Отличные фармакокинетические характеристики получены для фармацевтических композиций №2 и №4: для них характерны более медленное снижение концентраций вещества в плазме крови крыс с Кш - 0.0155 мин"1 и 0.0109 мин'1, невысокие значения клиренса

Cipo 1.923 мл/мин и 1.585 мл/мин, длительные периоды полувыведения - 44.75 мин и 63.86 мин и значительные показатели среднего времени удержания ГБ-115 в плазме крови крыс - MRT - 68.32 мин и 95.75 мин соответственно.

Кроме того, для фармацевтических композиций №2 и №3, а также для фармацевтической композиции .V.4 характерны высокие значения гипотетического объёма распределения - 178.50 мл, 124.20 мл и 146.00 мл соответственно, что значительно выше объёма распределения фармацевтической композиции №1 - 58. 15 мл.

После введения животным фармацевтических композиций №2 и №4 определяются самые высокие площади под фармакокинетической кривой ГБ-115 (Табл.3) и, соответственно, самые высокие величины относительной биодоступности, составляющие 192.36% и 190.68% соответственно, что указывает на их преимущество по сравнению с другими исследуемыми фармацевтическими композициями. При анализе скорости всасывания (Смакс/AUC) существенных различий для фармацевтических композиций №2 и №4 не обнаружено.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При разработке любого оригинального лекарственного средства важным и необходимым являются фармакокинетические и биофармацевтические исследования. Они, помимо расчёта основных фармакокинетических характеристик вещества, позволяют определить перспективность того или иного пути его введения, а также выбрать оптимальную лекарственную форму изучаемого фармакологического соединения. Для соединения ГБ-115 эти исследования показали возможность использования перорального пути его выведения для дальнейшего использования и внедрения его в медицинскую практику. При этом, проанализировав различные субстанции ГБ-115, были найдены существенные отличия их фармакокинетических характеристик и получено значительное преимущество микронизированной субстанции, относительная био доступность которой превышала таковую для кристаллической субстанции в 1.5 раза. Это послужило основанием для рекомендации этой субстанции при изготовлении различных фармацевтических композиций ГБ-115 для перорального применения. Фармакокинетическое и биофармацевтическое

изучение различных фармацевтических композиций показало, что фармацевтические композиции №2 и .V»4, изготовленные с применением микронизированной субстанции ГБ-115 и вспомогательных веществ, имели преимущество перед другими представленными на анализ фармацевтическими композициями. Во-первых, они определялись более продолжительное время в плазме крови крыс, а во-вторых, была достигнута высокая относительная биодоступность, что позволило выделить эти две фармацевтические композиции и рекомендовать их для дальнейшего фармакологического изучения. Фармацевтическая композиция №2 отличалась самой высокой максимальной концентрацией. В её состав вошли следующие вспомогательные вещества: микронизированная субстанция ГБ-115, твёрдая дисперсная система с поливинилпирролидоном. Такие положительные фармакокинетические характеристики были связаны, с одной стороны, с микронизацией, с другой, с положительным влиянием матрицы поливинилпирролидона, на основе которой была создана фармацевтическая композиция №2. Многочисленными исследованиями доказано, что скорость и продолжительность действия лекарственного вещества в качестве моносоставляющего, диспергированного в матрице поливинилпирролидона, может быть повышена в 2-3 раза [Craig D.Q.M., 2002; Anupama К., Poddar М., 2011; Carina D.,2010; Tiwari R. Et al, 2009; Хабриев Р.У. и др., 2010].

Фармацевтическая композиция №4 (в её состав входят микронизированная субстанция ГБ-115, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза) характеризовалась самой высокой площадью под фармакокинетической кривой, ввиду того, что концентрации сохранялись на высоком уровне в течение всего периода наблюдения. Это можно объяснить присутствием в фармацевтической композиции №4 вспомогательного вещества гидроксипропилметилцеллюлозы - гидрофильной матрицы с контролируемой доставкой активного вещества, которая существенно повышает продолжительность высвобождения действующего вещества, что может в значительной степени пролонгировать фармакологический эффект лекарственного препарата [Li C.L. et al., 2005; Mitchell S.A., Balwinski K.M., 2008].

Поэтому эти две фармацевтические композиции рекомендованы для дальнейшего проведения фармакологических исследований. Выводы:

1. Разработаны высокочувствительные методики качественного (на основе хроматомасс-спектрометрии) и количественного (на основе ВЭЖХ) определения ГБ-115 в биоматериале.

2. Методика экстракции и количественного определения ГБ-115 в биоматериале, основанная на ВЭЖХ с УФ-детектором, обладала высокой чувствительностью и селективностью и была адаптирована для изучения фармакокинетики ГБ-115 у крыс.

3. Сравнительное изучение фармакокинетики и относительной биодоступности кристаллической и микронизированной субстанции ГБ-115 у крыс показало преимущество микронизированной субстанции и перспективность создания на её основе пероральной лекформы.

4. Показано, что из всех вспомогательных веществ, используемых при приготовления фармацевтических композиций ГБ-115, только поливинилпирролидон в форме твёрдой дисперсной системы и гидроксипропилметилцеллюлоза оказывают существенное влияние на скорость и степень всасывания изучаемого соединения у крыс.

5. Изучение фармакокинетических характеристик ГБ-115 после перорального введения крысам его четырёх разработанных фармацевтических композиций, отличающихся как по составу, так и по технологии приготовления позволили выявить две оптимальные фармацевтические композиции и рекомендовать их для дальнейшего фармакологического изучения.

Практические рекомендации.

Две фармацевтические композиции ГБ-115, имеющие наибольшую относительную биодоступность, рекомендованы для дальнейшего фармакологического изучения с целью создания лекарственной формы с оптимальными свойствами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи:

1. Иванникова Е.В. «Методика количественного определения ГБ-115 в биоматериале с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором». [Текст]/ Е.В. Пванннкова, С.С. Бойко, Д.В. Бастрыгин, В.П. Жердев, Т.А. Гудашева // Химико-фармацевтический журнал. - 2013 г. - Т. 47, № 6. - С.35-38.

2. Иванникова Е.В. «Методика количественного определения ГБ-115 в биоматериале с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии». [Текст] / Е.В. Иванникова, С.С. Бойко, В.П. Жердев, Т.А. Гудашева//Химико-фармацевтический журнал. - 2014 г. - Т. 48, №2. - С.32-34.

3. Иванникова Е.В. «Фармакокинетика трёх лекарственных форм нового дипептидного анксиолитика ГБ-115 для приёма внутрь». [Текст]/ Е.В. Иванникова, С.С. Бойко, В.П. Жердев, С.Ю. Раскин, Е.В. Блынская, К.Г. Турчинская, A.A. Илларионов // Экспериментальная и клиническая фармакология. -2014 г.-Т. 77, №7. - С.31-34.

Статьи в сборниках:

1. Бочков И.О. Создание новых лекарственных средств и оптимизация их лекарственных форм (фармакокинетические исследования). [Текст] / И.О. Бочков, Е.В. Иванникова, Р.В. Шевченко // Сб. научных трудов по материалам Евразийского Конгресса с международным участием «Медицина, фармация и общественное здоровье» 21-23 мая 2013, г. Екатеринбург. - Екатеринбург, 2013. - С.77-82.

2. Бочков И.О. Значение фармакокинетических исследований в создании новых лекарственных средств и оптимизации их лекарственных форм. [Текст]/ П.О. Бочков, Е.В. Иванникова, Р.В. Шевченко, В.П. Жердев, С.С. Бойко, A.A. Литвин // Сб. научных трудов по материалам IX международной заочной научно-практической конференции «Научная дискуссия: вопросы медицины». -С. 106-111.

Тезисы:

1. Пванникова E.B. Определение нового дипептидного анксиолитика ГБ-115 в плазме крови с использованием метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-детектированием. [Текст] / Е.В. Пванникова, Д.В. Бастрыгин, Е.А. Литвин, С.С. Бойко, В.П. Жердев // Материалы XIX Российского национального конгресса «Человек и лекарство», 23-27 апреля 2012 г., Москва. - М., 2012. - С.507-508.

2. Пванникова Е.В. Изучение биодоступности лекарственных форм нового дипептидного соединения таланакса (ГБ-115), обладающего анксиолитическими свойствами. [Текст] / Е.В. Пванникова, С.С. Бойко, В.П. Жердев, Т.А. Гудашева // Материалы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии», 18-21 сентября 2012 г., Республика Татарстан, г. Казань. - М.: изд-во Фолиум, 2012. - С.74.

3. Пванникова Е.В. Изучение фармакокинетики трёх лекарственных форм нового дипептидного анксиолитика таланакса (ГБ-115). [Текст] / Е.В. Иванникова / Материалы IV Всероссийского научно-практического семинара для молодых учёных с международным участием «Современные проблемы медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств», 29-31 октября 2012 г., Волгоград // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. - Волгоград, 2012. - Приложение. - С. 32.

4. Иванникова Е.В. Сравнительный аначиз фармакокинетики и биодоступности трёх пероральных лекарственных форм нового дипептидного анксиолитика ГБ-115. [Текст] / Е.В. Иванникова, С.С. Бойко, В.П. Жердев // Материалы Первой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы разработки новых лекарственных средств» 3-5 июня 2013, г. Москва. - М., 2013. -С. 33.

5. Бочков П.О. Фармакокинетическое исследование трёх новых оригинальных лекарственных средств и их оптимальных лекарственных форм. [Текст] / П.О. Бочков, Е.В. Пванникова, Р.В. Шевченко, В.П. Жердев, С.С. Бойко, A.A. Литвин II Материалы международной заочной научно-практической

конференции «Актуальные направления научных исследований XXI века: теория и практика», 2013 г. - Воронеж, 2012. - №2 (2).- С.36-42.

Подписано в печать: 10.07.14 Тираж: 100 экз. Заказ № 1186 Объем: 1.0 усл.п.л. Отпечатано в типографии «Реглет» г. Москва, Ленинградский проспект, д. 74 (495)790-47-77; www.reglet.ru