Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Структурно-функциональная организация, механизм действия и иммунобиологические свойства [Г]-D-глутамил-L-триптофана (Бестима)

На правах рукописи

□□3447395

КОЛОБОВ Александр Александрович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ, МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА у-О-глутамил-Ь-триптофана (Бестима)

14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

0 2 ОПТ 2008

Санкт-Петербург 2008

003447395

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте особо чистых биопрепаратов Федерального медико-биологического агентства России.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Симбирцев Андрей Семенович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Полевщиков Александр Витальевич доктор биологических наук, профессор Самойлова Кира Александровна доктор биологических наук Самойлович Марина Платоновна

Ведущая организация:

Государственный научный центр Российской Федерации Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России

Диссертационного со ,, , и ГУ Научно-исследовательский

институт экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., д. 69/71.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

Автореферат разослан « г.

Защита состоится

в 13 часов на заседании

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования:

В настоящее время гуморальные регуляторные факторы иммунной системы, действующие как местно, так и на системном уровне, находятся в центре внимания клинических иммунологов как потенциальные лекарственные препараты. Они используются для модуляции активности иммунной системы с целью лечения целого ряда патологических состояний и заболеваний (Кетлинский и др., 1992; Кетлинский, Калинина, 1998; Новиков, 1999; Jeffery, 2004). Особое место среди биорегуляторов иммунной системы занимают низкомолекулярные медиаторы полипептидной природы. Их особая роль заключается в тесной функциональной взаимосвязи с другими гормонами, особенно с гормонами гипоталамуса, гипофиза, надпочечников и половых желез, обеспечивающей один из механизмов реализации нейроиммуноэндокринных взаимодействий (Blalock, 1989; Jiang et al., 1998; Dantzer, 2004).

Действие низкомолекулярных пептидных биорегуляторов селективно и высокоспецифично, их эффективные концентрации лежат в зоне микро-наномолярных значений. Как правило, они нетоксичны и неиммуногенны, время их действия ограничено, они быстро разлагаются до аминокислот под действием протеолитических ферментов. Совокупность уникальных биологических свойств и возможности промышленного получения низкомолекулярных пептидов с помощью методов химического синтеза делают этот класс соединений одним из наиболее перспективных кандидатов для разработки новых лекарственных препаратов (Шабанов, 2006).

Одной из задач современной иммунофармакологии является изучение структурно-функциональной организации биорегуляторов, т.е. зависимости проявления биологической активности от структуры молекул, которое помогает установить механизмы их действия на молекулярном и клеточном уровнях. Знание структурно-функциональной организации позволяет целенаправленно подходить к конструированию новых аналогов, обладающих селективной

активностью и уникальными фармакологическими свойствами, стимулирует разработку лекарственных препаратов на их основе. В тоже время понимание механизмов функционирования лекарственных препаратов позволяют более обоснованно и эффективно применять их в тшунокорригирующей терапии (Козлов и др., 2001; Нестерова и др., 2002). В связи с этим, разработка новых синтетических иммуномодуляторов пептидной природы и изучение механизмов их действия является актуальной теоретической и практической задачей.

Настоящее исследование посвящено изучению иммунотропной активности нового семейства иммуномодулирующих препаратов - у-глутамил содержащих дипептидов, исследованию их структурно-функциональной организации, установлению механизма действия и клинико-иммунологической характеристике наиболее активного по совокупности использованных тестов соединения у-О-глутамил-Ь-триптофана.

Результаты проведенных исследований положены в основу включения лекарственного препарата Бестим, в котором у-О-глутамил-Ь-триптофан используется в качестве фармакологически активной субстанции, в терапию заболеваний, сопровождающихся дисбалансом Тх-1/Тх-2 звеньев иммунитета и снижением функциональной активности макрофагов. Цели исследования:

Изучение закономерностей структурно-функциональной организации у-глутамил содержащих дипептидов, исследование спектра иммуномодулирующей активности и механизма действия у-О-глутамил-Ь-триптофана, разработка нового иммунотропного препарата пептидной природы на его основе.

Основные задачи исследования:

1. исследовать взаимосвязь структура-активность в ряду у-глутамил содержащих дипептидов и осуществить дизайн структуры с наиболее высокой иммуномодулирующей активностью;

2. изучить влияние у-Э-глутамил-Ь-триптофана (Бестима) на дифференцировку, пролиферативную и функциональную активность иммунокомпетентных клеток;

3. провести исследование взаимодействие Бестима с клеточными рецепторами;

4. исследовать фармакокинетические свойства Бестима при различных путях введения препарата;

5. изучить иммуномодулирующее действие Бестима в экспериментальных моделях с преимущественной активацией иммунного ответа по Тх-1 или Тх-2 типу при различных путях введения препарата,

6. провести клинико-иммунологическую характеристику лекарственного препарата Бестим в ходе клинических испытаний.

Научная новизна:

Впервые показано, что дипептиды, содержащие глутаминовую кислоту, соединенную у-связью со следующим аминокислотным остатком, а также их аналоги с р-связью по аспарагиновой кислоте обладают выраженным иммуномодулирующим действием. Проведенные исследования выявили такие структурные особенности нового семейства имму но модуляторов как предпочтительность глутаминовой кислоты по отношению к аспарагиновой в первом положении, наличие триптофана с немодифицированным индольным кольцом и глутаминовой кислоты в О-конфигурации, отсутствие модификаций на К- и С-концах молекулы. Доказано, что наибольшей иммуностимулирующей активностью обладает активностью у-О-глутамил-Ь-триптофан (Бестим, от ВЕ(пеЯс1а1) 8Т(1ти1а1ог) оГ 1М(типку)).

Установлено, что [3Н]Бестим с высоким сродством связывается с перитонеальными макрофагами и тимоцитами мыши, а также плазматическими мембранами, выделенным из этих клеток. В концентрациях 10"10~1(Г6М Бестим снижает аденилатциклазную активность мембран макрофагов и тимоцитов мыши.

Фармакологическое действие препарата определяется усилением дифференцировки и пролиферации предшественников Т-лимфоцитов. При действии in vitro Бестим усиливает продукцию ИЛ-2 и экспрессию его рецептора лимфоцитами, усиливает их пролиферативную активность. В модельных системах in vivo Бестим стимулирует Т-клеточное звено иммунитета, активирует макрофаги и естественные киллерные клетки. Установлено, что иммуномодулирующее действие Бестима идентично как при парентеральном, так и пероральном применении.

В модели экспериментального генерализованного туберкулеза у мышей Бестим обладает противоинфекционным и иммуномодулирующим действием, усиливая антиген-специфический иммунный ответ с преимущественной активацией Т-хелперов 1 типа. В .модели аллергической бронхнальной астмы показано ингибирующее действие препарата на местные и системные проявления патологического процесса.

Иммуномодулирующее действие Бестима изучено при его применении в комплексной терапии пациентов с гнойно-септическими процессами, больных распространенными и локализованными формами мочеполового хламидиоза и инфильтративным туберкулезом легких. Динамика клинико-иммунологических показателей после курса препарата свидетельствует о стимуляции антиген-специфического иммунного ответа, функциональной активности Т-клеток, преимущественной активации Т-хелперов 1 типа. Основные положения, выносимые на защиту:

1. у-О-глутамил-Ь-триптофан (Бестим) обладает дозозависимым, невидоспецифичным иммуномодулирующим действием и наиболее активен среди у-глутамил содержащих пептидов.

2. Биологическая активность Бестима обусловлена высокоаффинным селективным взаимодействием со специфическими сайтами на мембранах макрофагов и тимоцитов.

3. Биодоступность препарата при внутрибрюшинном и пероральном путях введения одинакова и составляет 55-60%.

4. Механизм иммуностимулирующего действия Бестима связан с увеличением дифференцировки и преимущественным усилением функциональной активности Т-хелперов 1 типа.

5. Введение Бестима приводит к усилению антиген-специфического иммунного ответа.

6. Бестим обладает противоинфекционным и иммуномодулирующим действием в модели экспериментального генерализованного туберкулеза

7. В модели экспериментальной аллергической бронхиальной астмы Бестим снижает титры аллерген-специфических ^Е и тканевые проявления аллергического иммунного ответа.

8. Бестим эффективен при комбинированном лечении больных со вторичными иммунодефицитами различной этиологии, причем положительная клиническая динамика сопровождается иммуномодулирующим действием препарата.

Практическая значимость:

Практическая ценность работы заключается в установлении закономерностей структурно-функциональной организации нового семейства иммуномодулирующих соединений - у-глутамил содержащих пептидов; дизайне структуры нового иммуномодулирующего соединения и создании на ее основе нового отечественного лекарственного препарата Бестим; демонстрации иммуномодулирующего эффекта Бестима, связанного с преимущественной активацией Т-хелперов первого типа и нормализацией баланса между Тх-1 и Тх-2, при парентеральном и пероральном применении; установлении механизмов его действия; определении оптимальных схем использования препарата; изучении эффективности включения иммуномодулирующей терапии с помощью препарата Бестим в стандартные схемы лечения инфекционных заболеваний.

Результаты, полученные в ходе выполнения исследования, использованы для регистрации и получения разрешения на выпуск в обращение препарата «Бестим, 100 мкг, лиофилизат для приготовления раствора для

внутримышечного введения» (рег.уд. PN03335/03 от 29.12.2006). В настоящее время препарат выпускается ФГУП Гос.НИИ ОЧБ ФМБА России. Личный вклад автора в проведенные исследования:

Работа выполнена лично автором на базе ГосНИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА России. Вклад автора состоит в организации и проведении экспериментальных исследований, теоретическом обобщении и интерпретации полученных результатов. Ряд исследований выполнен совместно с сотрудниками ГосНИИ ОЧБ к.х.н. Смирновой М.П., к.х.н. Колодкиным Н.И., Шпенем В.М., к.х.н. Прусаковым А.Н., Афониной И.В., Трофимовым A.B., Родиным С.В , к.м.н. Пигаревой Н.В., к.м.н. Петровым A.B., Демьяновым A.B., Боковановым В.Е. и другими. Работы по радиорецепторному анализу Бестима проводились на базе Филиала института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова (Пущино) под руководством д.б.н. Наволоцкой Е.В. Работы по изучению влияния Бестима в модели экспериментального генерализованного туберкулезного процесса проводились на базе Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи под руководством д.м.н. Виноградовой Т.И. Обработка результатов фармакокинетических исследований проведена совместно с сотрудником Института токсикологии ФМБА России (Санкт-Петербург) Трефиловым В.В. Клинические испытания Бестима в терапии хламидиоза проведены на базе клиники кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской Академии им. С.М.Кирова МО России (Санкт-Петербург) под руководством д.м н. Позняка A.JL, в терапии туберкулеза легких - на базе клиники Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии под руководством д.м.н. Скворцовой J1.A., в терапии гнойно-воспалительных хирургических заболеваний - на базе клинической больницы №83 ФУ МБ и ЭП при МЗ РФ (Москва) под руководством к.м.н. Захарченкова В.А. По всем полученным совместно результатам имеются совместные публикации. Соискатель приносит своим соавторам искреннюю благодарность.

Апробация работы:

Основные результаты исследований и положения диссертационной работы были представлены и доложены на: 25 Европейском пептидном симпозиуме (Будапешт, Венгрия, 1998), 16 Американском пептидном симпозиуме (Миннеаполис, США, 1999), 17 Международном конгрессе по аллергологии и клинической иммунологии (Сидней, Австралия, 2ООО), 26 Европейском пептидном симпозиуме (Монпелье, Франция, 2000), 42 Междисциплинарной конференции по антимикробным агентам и химиотерапии (Сан-Диего, США, 2002), 27 Европейском пептидном симпозиуме (Сорренто, Италия, 2002), Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003), 12 Международном иммунологическом конгрессе (Монреаль, Канада, 2004), VIII и X Всероссийском научном форуме им. акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004, 2006), XIII Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Ялта, 2005), 29 Европейском пептидном симпозиуме (Гданьск, Польша, 2006), 6-ой ежегодной Конференции Американского Общества Клинических Иммунологов (Сан Франциско, 2006), 13 Международном иммунологическом конгрессе (Рио де Жанейро, Бразилия, 2007). Публикации:

По теме диссертации опубликовано 44 научные работы, в их числе 13 российских и международных патентов и 10 работ, изданных в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК Минобрнауки России. Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 278 страницах машинописного текста, включая 83 таблицы и 21 рисунок, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 9 глав собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Список литературы содержит 392 работы (60 отечественных и 332 зарубежных).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Химический синтез пептидов, у-глутамил содержащие дипептиды и их аналоги с аспарагиновой кислотой синтезированы методами классического пептидного синтеза в растворе или твердофазным способом. Все полученные соединения были индивидуальны по данными тонкослойной хроматографии, их чистота по данным ОФ ВЭЖХ была не менее 95%, аминокислотный состав соответствовал теоретическому (±10%), расчетные молекулярные массы совпали с экспериментально определенными (±0.5%).

Экспериментальные животные и введение препаратов. В работе были использованы лабораторные мыши линий СВА, Balb/c, C57BI/6 и Fl (СВАхС57В1/6) весом 18-20 г и белые беспородные крысы весом 160-180 г (питомник лабораторных животных Рапполово). Кроме того, использовались также SPF мыши линии Balb/c и аутбредные SPF мыши Swiss Webster (питомник лабораторных животных Пущино). Изучаемые соединения разводили в стерильном физиологическом растворе (ФР) и вводили внутрибрюшинно (в/б) в различных дозах в объеме 200 мкл. Для перорального (п/о) введения препараты разводили в дистиллированной воде и вводили с помощью желудочного зонда в объеме 200 мкл. Контрольным животным вводили ФР в/б или дистиллированную воду п/о в тех же объемах.

Методы оценки иммуномодулирующей активности препаратов. Уровень экспрессии маркеров дифференцировки на клетках костного мозга (CD90.1, CD117), тимуса (CD4, CD8) и селезенки (CD3, CD4, CD8) мышей и лимфоцитах периферической крови человека (CD 16, CD25) определяли с помощью комплемент-зависимого лимфоцитотоксического теста с соответствующими моноклональными антителами (Terasaki et.al., 1972) или с помощью проточной цитофлюориметрии с флюоресцеин- или фикоэритрин-меченными МАТ на цитофлюориметре EPICS XL (Beckman Coulter). Пролиферативную активность тимоцитов и спленоцитов оценивали по включению [3Н]-тимидина в реакции

и

бласттрансформации лимфоцитов после стимуляции митогенами или специфическими антигенами. Спонтанную или митоген-(антиген)стимулированную продукцию цитокинов в супернатантах культур клеток или цельной крови оценивали с помощью соответствующих ИФА тест-систем. Активность интерлейкина-2 (ИЛ-2) определяли с помощью ИЛ-2 зависимой линии CTLL-2. Функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов определяли в тесте люминолзависимой хемолюминисценции. Для изучения хемотактической активности использовали метод миграции лейкоцитов под агарозой (Nelson et al., 1975). Фагоцитарную активность лейкоцитов оценивали по отношению к предварительно опсонизированным пекарским дрожжам. В качестве мишеней для естественных киллеров использовали клетки мышиной В-клеточной линии Yac-1 (банк клеточных культур Института цитологии РАН), меченные [3Н]-уридином. В качестве моделей иммунного ответа in vivo использовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа, иммунизацию растворимым (овальбумином) и корпускулярным (эритроциты барана) антигенами.

Фармакокинетическце исследования. Содержание Бестима в системном кровотоке мышей после внутривенного, внутрибрюшинного или перорального введения определяли в динамике, используя разработанный нами набор «ИФА-Бестим» на основе твердофазного конкурентного иммуно-ферментного анализа. В наборе использованы моноспецифические поликлональные антитела кролика к Бестиму, конъюгаты Бестим-биотин и авидин-пероксидаза. Связывание [*Н]Бестима с першпонеалышми макрофагами и пшмоцитами мыши. Взаимодействие Бестима с макрофагами и тимоцитами мыши, а также с плазматическими мембранами этих клеток исследовали с помощью радиорецепторного анализа, используя [3Н]-Бестим, полученный методом твердофазного радноизотопного обмена, в качестве лиганда. Активность аденилатциклазы определяли с помощью а[32Р]АТФ по методу (Saltarelli et al., 1985).

Модель экспериментального туберкулезного процесса. Экспериментальный генерализованный туберкулез (ТБ) вызывали инокуляцией в хвостовую латеральную вену второй генерации 3-х недельной культуры М. bovis штамм 8 (ОД мг влажной культуры на мышь) или М tuberculosis Erdman (lxlO7 микробных тел на мышь). Начиная с седьмого дня после инокуляции инфекта, каждые два дня проводились пробные вскрытия мышей из группы контроля заражения с визуальной оценкой легких с целью выявления фокусов специфического воспаления. Лечение начинали при появлении в легких множественных субмилиарных или единичных милиарных очагов. Мышей всех опытных групп лечили противотуберкулезными препаратами в средних терапевтических дозах, животных, получавших иммунотерапию, -дополнительно Бестимом в течение 5 или 10 дней, начиная с первого дня лечения противотуберкулезными препаратами. Бестим вводили как в/б, так и п/о. Результаты лечения регистрировали на 5, 12, 19 и 33 дни от начала лечения. Сравнение проводили с зараженными нелечеными животными (контроль заражения) и с группой контроля лечения, получавшей только противотуберкулезные препараты (контроль лечения). Тяжесть течения ТБ процесса оценивали по макроскопическому исследованию легких и селезенки, рассчитывая индекс поражения (ИП) легких и коэффициенты массы (КМ) селезенки и легких, по высеваемости микобактерий из селезенки и легких, выражая в колониеобразующих единицах (КОЕ), по гистологическому изучению легких. Параллельно оценивали субпопуляционный состав тимуса и селезенки, митоген- и антиген-специфическую пролиферацию спленоцитов и продукцию цитокинов, уровень цитокинов в сыворотке крови.

Модель иммунного ответа аллергического типа. Использовали модель, описанную в (Kato et al., 1999). В качестве аллергена для двукратной иммунизации и трехкратного аэрозольного бустирования использовали овальбумин (OVA). Бестим вводили после повторной иммунизации перед первой экспозицией аэрозолю в течение 5 дней в дозе 0,1 и 1 мкг/кг. При

оценке тяжести экспериментальной аллергической астмы исследовали клеточность и цитологический состав бронхо-апьвеолярного лаважа (БАЛ), титры анти-ОУА ^Е в БАЛ и сыворотке и проводили гистологическмй анализ тканей легких

Клииико-иммуиологическая характеристика Бестима. Исследование проводилось на клиническом материале, полученном от больных, которые участвовали в клинических исследованиях эффективности и безопасности применения Бестима в сочетанной терапии гнойно-воспалительных хирургических заболеваний, хламидиоза и инфильтративного диссиминированного туберкулеза легких в рамках 2 фазы клинических испытаний Бестим применяли в виде курса из 5 или 10 ежедневных, или проводимых через один день инъекций по 100 мкг. Во всех случаях иммунотерапия Бестимом проводилась на фоне стандартной этиотропной терапии соответствующих заболеваний. При хламидиозе и туберкулезе химиотерапия назначалась с учетом устойчивости возбудителя бактериостатическим препаратам. Периферическую кровь анализировали до начала терапии, по ее окончании и через 3 месяца после окончания курсов этиотропной терапии. Оценивали общее количество лимфоцитов, процентное и абсолютное число зрелых СБЗ1 Т-лимфоцитов, С044 и СБ8+ клеток, В-лимфоцитов, ответ Т-лимфоцитов на ФГА или специфический антиген в РБТЛ, экспрессию «активационных маркеров» на Т-лимфоцитах, уровни спонтанной и индуцированной продукции цитокинов, уровни неспецифических иммуноглобулинов, циркулирующих в крови иммунных комплексов, бактерицидную и фагоцитарную активность нейтрофилов.

Статистическая обработка результатов. Выполнялась стандартными методами с помощью I критерия Стьюдента, критериев Вилкоксона и Манна-Уитни, критерия уД точного критерия Фишера. Различия между группами считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ у-ГЛУТАМНЛ СОДЕРЖАЩИХ ДИПЕПТНДОВ

у-глутамил содержащие дипептиды и их аналоги получены методами химического синтеза. Все соединения были гомогенны по данным аналитической ОФ ВЭЖХ, имели аминокислотный состав и молекулярную массу, соответствовавшие теоретическим. Биологическую активность аналогов оценивали в тестах т vitro изменению экспрессии Thy-1 (CD90.1) антигена на пре-Т-клетках костного мозга мыши, пролиферации клеток тимуса мыши, стимулированных субоптимальной дозой лектинов, и продукции ИЛ-2 митоген-стимулированными спленоцитами мыши.

Сравнительное изучение биологической активности а-; р- и у-пептидов показало, что замена а- пептидной связи на у-связь приводит к значительному усилению иммуностимулирующей активности соединений. Так, y-L-Glu-L-Trp стимулировал экспрессию Thy-1 антигена в более широком диапазоне концентраций (0,01 -100 мкг/мл), и его активность была более выражена, чем у соответствующего а-соединения. Принимая во внимание, что у-пептид был значительно более активным, в качестве соединения-лидера был выбран y-L-Glu-L-Trp, и во всех последующих полученных аналогах мы сохранили этот тип соединения двух аминокислотных остатков. Исследование структурно-функциональной организации у-дипептидов проведено методом заместительной модификации. Список синтезированных и исследованных аналогов приведен в таблице 1.

Таблица 1

Структура синтезированных и исследованных соединений

Химическое название Химическая структура Химическое название Химическая структура

a-L-глутамил-L-триптофан у-Ь-глутамил-L-тирозин -чЛХ „

у-Ь-глутамия-L-триптофак у-Ь-глутамил-L-фешшаланин

P-L-аспартил-L-триптофан VtP у-Ь-глутампл-L-гистидин

а-Ь-а^лартнл-Ь-тригпофан у-1_-глутамнл-Ь-лепцин •"ч-'кА,, « Г юх/ ™ Ч-'Ч^.-С". 11» ™

¡З-Б-аспар гнл-Ь-трипгофан у-Ь-глутамил-Ь-пролпн "Х-кЛ/" Г П»

а-О-аспарит-Ь-трнптофш! у-Ь-глутамил-Ыщ-формил-Ь-триптофан „ л "" "

у-Ь-глутампл-Ь-гриптофан М-ыетнл-у-Б- глутамил-Ь-трпптофан " Утр

у-О-глутампл-Ь-гриптофаи М-ацетнл-у-Б- глутамил-{^-триптофан

у-Ь-глута\шл-О-триптофан у-И-глу тамил-Ь-тршпампц

у-О-глутамил-Б-триптофан у-Б-глутамил-Ь-триптофил-амид

Суммировав результаты проведенных исследований, мы сделали следующее заключение о структурно-функциональной организации нового семейства иммуномодулирующпх соединений' аминокислоты должны быть соединены у-или р-амидной связью; в первом положении глутаминовая кислота предпочтительна по сравнению с аспарагиновой кислотой; аминокислота в первом положении должна быть в В-конфнгуращш; во втором положении должен находиться остаток триптофана с немодифицированным индольным кольцом; И- и С-концы молекулы должны быть немодифицированными,

Структуру нового семейства иммуномодуляторов можно описать общей формулой:

Я-МН-СН-(СН2)„-С-Х, где п=1,2;

I II

соон о

И: Н, низший ацил или низший алкил;

Х- ароматическая или гетероароматическая аминокислота или ее производное.

Для дальнейшего расширенного изучения был выбран у-О-глутамил-Ь-триптофан, как наиболее активный из исследованных представителей семейства у-глутамил содержащих дипептидов (рис.1). Две структурные особенности этого дипептида - гамма связь между аминокислотными остатками и стереоконфигурация аминокислоты в первом положении - обуславливают его устойчивость к действию протеолитических ферментов, а также предопределяют возможность перорального применения.

Рис.1. Структурная формула у-О-глутамил-Ь-триптофана.

Бестим - это натриевая соль у-О-глутамил-Ь-триптофана. или согласно международной номенклатуре ШРАС натриевая соль 2-амино-4-[[1-кабокси-2-(1Н-индол-3-ил)этил]карбомоил] бутановой кислоты. Брутто формула этого соединения С^Н^зС^а, молекулярная масса - 355,3. С органолептической точки зрения это бесцветный аморфный порошок без запаха. Разработан метод крупномасштабного классического синтеза Бестима и аналитические методики, совокупность которых позволяет подтвердить структуру полученного соединения и оценить степень его чистоты. На основе этих данных, а также изучения стабильности препарата при хранении, была разработана и утверждена Фармакопейная статья ФСП-42-0303140301 на субстанцию препарата Бестим. Оценка качества препарата производится по следующим показателям: растворимость образцов; прозрачность, цветность, рН, удельное вращение и удельное поглощение их растворов; содержание воды, наличие

посторонних примесей и остаточных органических растворителей; микробиологическая чистота и пирогенность.

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕС КОЙ АКТИВНОСТИ БЕСТИМА Активность Бестима в модельных системах in vitro. При исследовании структурно-функциональной организации у-глутамил дипептидов было показано, что краткосрочная (2-24 часа) инкубация с Бестимом стимулирует экспрессию Thy-1 антигена пре-Т-кдетками костного мозга и продукцию ИЛ-2 спленоцитами мыши (рис.1, А). Усиление КонА-индуцированной пролиферации тимоцитов крысы сопровождалось активацией лектин-стимулированной продукции ИЛ-2 клетками селезенки (рис.1, Б).

Рис.1. Влияние Бестима на экспрессию ТЬу-1 антигена на клетках костного мозга и продукцию ИЛ-2 спленоцитами мыши (А), пролиферацию тимоцитов и продукцию ИЛ-2 спленоцитами крысы (Б). * - различия с контролем достоверны, р<0,05.

Влияние Бестима на экспрессию клеточных маркеров и функциональную активность зрелых лимфоидных клеток, циркулирующих в периферической крови, было исследовано по изменению экспрессии СО 16 и С025 антигенов на мононуклеарах периферической крови (МПК) человека и продукции цитокинов этими клетками при 24-х часовой инкубации с препаратом. Оказалось, что

Бестим усиливал экспрессию СЭ16 и С025 только в присутствии ФГА, причем индукция СБ 16 антигена происходила лишь под влиянием узкого диапазона высоких концентраций препарата (0,1-1 мкг/мл, рис.2А). Усиление экспрессии СЭ25 антигена происходило в том же диапазоне концентраций, как и активация ФГА-индуцированной продукции ИЛ-2 (0,01-10 мкг/кг). В то же время Бестим в концентрациях 0,1-10 мкг/мл усиливал спонтанную продукцию ИЛ-ф и ФНОа (рис.2Б).

Контроль 0,001 0,01 0,1

БЕСТИМ, М к ПН II

Рис,2. Влияние Бестима на экспрессию CD16, CD25 антигенов на поверхности МПК человека и продукцию цитокинов этими клетками. А.

Процент клеток, экслрессирующих CD 16 и CD25 антигены, и ФГА-стимулированная продукция ИЛ-2. Б. Спонтанная продукция ИЛ-ip и ФНОа. * - различия с контролем достоверны, р<0,05.

Таким образом, иммуностимулирующее действие Бестима в модельных системах in vitro было воспроизводимым, невидоспецифичным и дозозависимым. Характер кривой «доза-эффект» был типичен для полипептидных лигандов, с максимальным эффектом в средних дозах и снижением, вплоть до исчезновения, активности в самых низких и высоких концентрациях.

Изучение фармакокинетики Бестима. Фармакокинетическое исследование проведено при внутривенном, внутрибрюшинном и пероральном введении Бестима мышам СВА. Количественное определение препарата в сыворотке

мышей выполнялось с помощью разработанного нами набора «ИФА-Бестам», в котором реализован один из вариантов твердофазного иммуноферментного конкурентного анализа. На рнс.З представлены сравнительные графики трёх фармакокинетических кривых препарата в одном масштабе.

Значения параметров модельных кривых, полученных при использовании трех относительно независимых способов оценки фармакокинетических показателей (модельно-независимая (прямая) оценка; компартментные модели и метод профиля поступления), практически совпадали и лежали в пределах точности оценки.

Рнс.З. Графики экспериментальных фармакокинетических кривых Бестнма при внутривенном, внутрпбрюшннном и пероральном введении в дозе 2500 мят/кг.

Расчет фармакокинетических показателей Бестима при различных путях введения показал, что распределение препарата в организме, по всей видимости, ограничено внеклеточной водной фазой: начальный объем распределения составляет 100-130 мл/кг, кажущийся объем стационарного

распределения характеризуется умеренной величиной - 250-350 мл/кг. Препарат быстро выводится из системного кровотока - среднее время его циркуляции составляет 10-11 минут; скорость элиминации характеризуется высоким клиренсом - 25-30 мл/кг/мин. При в/б и п/о путях введения фармакокинетические кривые имеют типичный вид с затянутым нарастанием в начале. Скорость конечного снижения концентрации достоверно отличается от аналогичного показателя для в/в введения, что связано, по-видимому, с постепенным поступлением препарата в кровоток из места введения. Полное время присутствия препарата в организме при в/б и п/о путях введения составляет, соответственно, 20 и 50 минут, а среднее время поступления лежит в пределах 9-10 и 30-35 минут, соответственно. Биодоступность при в/б и п/о введении Бестима практически одинакова и составляет 55-60%.

Связывание /3Н}-Бестима с перитонеальиыми макрофагами и тимоцитами

мыши. [3Н]Бестим с высоким сродством связывается с обоими типами клеток и их плазматическими мембранами. Зависимость общего, неспецифического и специфического связывания [3Н]Бестима при 4°С от времени приведена на рис. 4. Анализ специфического связывания Бестима с макрофагами (рис.5А) и тимоцитами (рис.5Б) показал, что на поверхности этих клеток имеется один класс участков связывания (рецепторов). Величины Кс1 равные 2,1±0,1 нМ и 3,1+0,2 нМ для макрофагов и тимоцитов, соответственно, свидетельствуют о высокой аффинности связывания. Количество участков специфического связывания в расчете на 1 клетку составляет 43660+3050 (макрофаги) и 39130±2860 (тимоциты).

Показано, что обработка макрофагов трипсином приводит к потере ими способности специфически связывать [3Н]Бестим. Это является свидетельством белковой природы рецептора или, по-крайней мере, той его части, которая участвует в связывании с лигандом.

20 40 60 60 100 120

Время, мин

Время,

Рис. 4. Зависимость общего (1), специфического (2) и неспецифического (3) связывания |3Н]Бестима с перптонеальнымн макрофагами (А) и тимоцитами (Б) мыши от времени инкубации. Величину специфического связывания меченого пептида определяли как разность между его общим и неспецифическим связыванием.

А Б

Рис.20. Анализ в координатах Скэтчарда специфического связывания [3Н]Бестима с пернтонеальными макрофагами (1) и тимоцитами (2) мыши (А) и плазматическими мембранами, выделенным» из перитонеальных макрофагов (1) и тпмоцитов (2) мыши (Б). В и Б - молярные концентрации связанного и свободного меченого пептида, соответственно.

Для характеристики специфичности связывания в качестве потенциальных конкурентов [Н]Бестима были протестированы глутаминовая кислота, триптофан, a-Glu-Trp, АКТГ (1-24), p-эндорфин, люлиберин, пептид 5-сна, нейротензин, вещество Р, кассинин, меллитин, соматостатин, вазопрессин, энкефалины. Оказалось, что только a-Glu-Trp ингибировал специфическое связывание [3Н]Бестима с макрофагами и тимоцитами (K¡ 0.9±0.1 нМ и 1,1±0,1нМ, соответственно). В концентрациях 10 - 1000 нМ Бестим снижал активность аденилатциклазы плазматических мембран перитонеальных макрофагов и тимоцитов мыши на 30-35%.

Активность Бестима в модельных системах ex vivo. Оценка экспрессии маркеров дифференцировки клетками костного мозга SPF мышей Swiss Webster была проведена с помощью проточной цитофлюориметрии. Исследование показало, что однократное или курсовое введение препарата, как при внутрибрюшинное (в/б), так и пероральное (п/о), приводит к статистически достоверному увеличению количества клеток, несущих Thy-1 (CD90.1) и c-kit (CDU 7) антигены (рис. 3). CD117 является маркером стволовых гемопоэтических и плюрипотентных клеток, усиление его экспрессии свидетельствует о стимулирующем влиянии Бестима на ранние этапы костномозгового лимфопоэза.

5 14

Контроль 1 В/Б

1П/0 10 П/О БЕСТИМ, МКГ/кг

бестим, МКПКГ

Рис.3. Влияние Бестима на экспрессию Thy-1 (CD90.1) и c-kit (CD117) антигенов на клетках костного мозга мышей. А. Процент Thy-1 позитивных клеток через 72 часа после трехкратного введения препарата. Б. Процент CD117 позитивных клеток через 24 часа после однократного в/б введения препарата. * - различия с контролем достоверны, р<0,05.

При исследовании влияния Бестима на субпопуляционный состав тимоцитов БРР мышей Ва1Ь/с было обнаружено снижение процента СЭ4+С08+ клеток (на 10-25%), сопровождающееся увеличением относительного содержания С04-С08- тимоцитов (на 5-10%) и зрелых. С04+СЭ8- (на 10-15%) и С04-Сй8+ клеток (на 5-10%. рис. 4). Поскольку данные изменения не сопровождались изменениями клеточности тимуса, то введение Бестима, по-видимому, приводит к увеличению притока ранних предшественников тимоцитов из костного мозга в тимус и ускорению созревания промежуточных форм в зрелые СР4+ и С08+ лимфоциты.

Контроль

Бестим. 1 мкг/кг

ос О

У

2^=08% 82,6±4,0% ' Ш 4-- тш

2,4±<)Л% '■'■■: ; ■■■ 14,8±2,5%

5,4ь2,<1%* 62,9±9,6%*

4,Ш,6% 26,2Й$,3%*

СБ4

Рис. 4. Изменение субпопуляционного состава клеток тимуса после курсового в/б введения Бестима (средние значения и стандартные отклонения процентов клеток, экспрессирующмх соответствующие маркеры; * - различия с контролем достоверны, р<0,05).

Воспроизводимые изменения субпопуляционного состава тимоцитов получены только при использовании животных без специфических патогенов. В то же время стимулирующее действие Бестима на пролиферацию тимоцитов и продукцию ИЛ-2 в ответ на КонА отмечалось у животных различных линий (рис.5). Препарат не влиял на нестимулированные клетки, но усиливал функциональную активность клеток тимуса при стимуляции суб- и

оптимальной дозами КонА как при в/б, так и при п/о применении в дозах 0.1 - 1 мкг/кг.

* 25000 £ С

| 20000 к"

515000

о.

©

^ юооо

О с

м 5000

Контр. 0,01 0,1 1 0,01 0И 1 внутрибрюшиннс перорально

бестим. тгтг

Рис.5. Влияние Бестима на функциональную активность тимоцитов мыши при виутрибрюшиниом и пероральном введении. А. КонА-индуцированная пролиферация тимоцитов (0,5 и I мкг/мл КонА). Б. КонА-индуцированная продукция ИЛ-2 (I мкг/мл КонА). * - различия с контролем достоверны, р<0,05.

Достоверных изменений спонтанной и КонА-индуцированной пролиферации спленоцитов выявлено не было. Наблюдалась тенденция к увеличению процента СШ+ лимфоцитов и небольшой сдвиг пропорции С04+/СБ8+ в сторону Т-хелперов. Бестим не влиял на спонтанную продукцию ИЛ-2 и ИФН-у, но значительно (в 2-3,5 раза) активировал КонА-стимулированную продукцию этих цитокинов (рис.бА). Как спонтанная, так и митоген-индуцированная продукция ИЛ-4 были снижены в группах животных, получавших препарат в дозах 0,1 и I мкг/кг. причем эффект не зависел от способа введения препарата (рис.бБ). Наблюдаемые реципрокные изменения в продукции Тх-1 и Тх-2 зависимых цитокинов свидетельствуют, по-видимому, о преимущественной активации Т-хелперов 1 типа под влиянием Бестима.

Исследование периферической крови не выявило значимых изменений количества лейкоцитов, лейкоцитарной формулы или субпопуляций Т-клеток после введения Бестима. Уровни циркулирующих в крови мышей Т-клеточных цитокинов были ниже чувствительности использованных ИФА тест-систем.

гаил-2 ЯИФНд

ВНУТРИБРЮШИННО ПЕРОРАЛЬНО

БЕСТИМ, МКПКГ

ВНУТРИБРЮШИННО ПЕРОРАЛЬНО БЕСТИМ, МКГЖГ

Рис.6. Влияние Бестима на продукцию цитокинов спленоцитами мыши при внутрибрюшинном и пероральном введении. А. КонА индуцированная продукции ИЛ-2 и ИФН-у (1 мкг/мл КонА). Б. Спонтанная и КонА-индунированная (1 мкг/мл КонА) продукция ИЛ-4. * - различия с контролем достоверны, р<0.05.

Для изучения влияния Бестима на активность естественных киллерных (ЕК) клеток препарат вводили мышам СВА трехкратно, в/б и через 72 часа после последнего введения исследовали продукцию ИЛ-2 спленоцитами и цитотоксическую активность ЕК клеток по отношению к клеткам лимфомы мыши Уас-1. Оказалось, что усиление цитотоксической активности, наблюдаемое в диапазоне доз 0,01 - 10 мкг/'кг, сопровождается повышением КонА-индуцированной продукции ИЛ-2 клетками селезенки (рис.7А).

А Б

Ж.

Ш

Контроль 0,001

0,01 0.1 БЕСТИМ. МКПКГ

Рис.7. Влияние Бестима на цитотоксическую активность естественных киллерных клеток и продукцию ИЛ-2 спленоцитами (А) и количество антителообразуюших клеток и титры гемагглютинирующих антител при иммунизации эритроцитами барана. * - различия с контролем достоверны, р<0.05.

аСПОНТАННАЯ В КомА-ИНДУЦИР О ВАННАЯ

Иммуностимулирующее действие Бестима оценено в модели иммунизации эритроцитами барана. Показано, что трехкратное введение препарата перед иммунизацией приводит на 5 день по завершении курса к достоверному увеличению количества антителообразующих клеток, которое сопровождается увеличением титров геммаглютинирующих антител (диапазон доз 0,01-10 мкг/кг, рис.7Б). Кроме того, трехкратное введение Бестима в дозах 0,1-10 мкг/кг непосредственно перед введением разрешающей дозы эритроцитов барана приводит к достоверному увеличению индекса реакции ГЗТ.

При изучении влияния Бестима на иммунный ответ животных, иммунизированных растворимым антигеном, в качестве которого был использован овальбумин (OVA), основное внимание было уделено развитию антиген-специфического ответа. Иммунизацию OVA проводили в неполном адъюванте Фрейнда в 1 и 15 дни эксперимента, а курсы Бестима - в 1-3 и 15-17 дни. Пролиферацию клеток селезенки, стимулированных OVA, оценивали на 15 и 29 дни.

Рис.8. Влияние Бестима на иммунный ответ при иммунизации овальбумином. А. Антиген-специфические пролиферация спленоцитов и продукция ШТ-2 этими клетками на 29 день. Б. Антиген-специфическая продукция ИФН-у и ИЛ-4 спленоцитами на 29 день. * - различия с контролем достоверны, р<0.05.

Оказалось, что Бестим не вызывал усиления специфического ответа на антиген после первичной иммунизации, но значительно усиливал антиген-

специфическую пролиферацию клеток селезенки на 29 день эксперимента. Достоверное усиление антиген-стимулированной продукции ИЛ-2 отмечено только в дозе ОД мкг/кг, однако именно в этой дозе наблюдалась и максимальная активация анген-специфической пролиферации спленоцитов (рис 8А). Усиление OVA-стимулированной продукции ИФН-у наблюдалось в широком диапазоне доз 0,001 - 1 мкг/кг, при этом снижение антиген-специфической продукции ИЛ-4 отмечено в дозе 0,1 мкг/кг (рис.8Б).

Таким образом, данные, полученные при исследовании активности Бестима на моделях стимуляции иммунного ответа, свидетельствуют о том, что препарат обладает выраженной иммуностимулирующей активностью, усиливает антиген-специфический иммунный ответ, действуя на Т-клеточное звено иммунитета и стимулируя, преимущественно, созревание и функциональную активность Т-хелперов 1 типа.

Активность Бестима в модели экспериментального туберкулезного процесса. В патогенезе туберкулезной инфекции важное значение имеет дисбаланс между Т-хелперами 1 и 2 типа, приводящий к снижению антиген-специфической пролиферации, угнетению продукции Тх-1 зависимых цитокинов, повышению уровня ИЛ-4. Восстановление Тх1/Тх2 баланса и сдвиг его в сторону Тх1 типа необходимы для благоприятного исхода заболевания. Поскольку результаты предшествующих исследований показали, что механизм действия Бестима может быть связан с преимущественной активацией Т-хелперов 1 типа, мы выбрали модель экспериментального генерализованного туберкулеза для оценки возможности терапевтического применения Бестима и подтверждения ранее сделанных выводов.

Бестим назначался на фоне противотуберкулезных препаратов в дозах 0,01; 0,1; 1 и 10 мкг/кг в/б, ежедневно, по 5, 10 или 15 инъекций. В моделях классического, вялотекущего и остро прогрессирующего экспериментального ТБ у мышей, вызванного М bovis, продемонстрирован выраженный лечебный

эффект препарата в дозах 0,1 и 1 мкг/кг при его назначении на фоне сниженной продукции ИЛ-2 спленоцитами.

Максимальный терапевтический эффект выявлен при использовании Бестима при остро прогрессирующем экспериментальном ТБ, где под его влиянием к 30 дню от начала курса отмечалась положительная динамика массы тела, существенное снижение летальности (на 15-25%), уменьшение индекса поражения легких и высеваемости микобактерий из селезенки (рис.ОА). При гистологическом исследовании тканей легких наиболее выраженные различия между опытными и контрольными группами также обнаружены при остро прогрессирующей инфекции. У мышей, получавших Бестим, параплельно достоверному снижению распространенности специфического воспаления в легочной ткани, сохранению многорядности бронхиального эпителия и стимуляции признаков напряженности местных иммунных реакций в легочной ткани отмечено отчетливое уменьшение альтеративного компонента воспаления (встречаемости скоплений ядерного детрита и нейтрофильных гранулоцитов).

КОНТРОЛЬ ТЕРАПИИ

S ИНДЕКС ПОРАЖЕНИЯ ЛЕГКИХ S КОЭФ. МАССЫ СЕЛЕЗЕНКИ ÖKOEX10-2

БЕСТИМ 0.1 МКГ/КГ

асол Qcoe

ИНТАКТНЫЕ ЖИВОТНЫЕ

КОНТРОЛЬ ТЕРАПИИ

БЕСТИМ 0,1 мкпкг

Рис. 9. Влияние Бестима на показатели тяжести течения ТБ инфекции (А) и экспрессию маркеров клетками тимуса (Б) у мышей с остро прогрессирующим ТБ, вызванным инокуляцией М.bovis, на 30 день от начала курса иммунотерапии. * - различия с интактной группой достоверны, **- различия с контролем терапии достоверны, р<0.05.

Использование Бестнма привело к значительному усилению экспрессии Thy-1, CD4 и CD8 антигенов на тимоцитах к 30 дню от начала курса иммунотерапии (рис. 9Б) Достоверное повышение экспрессии CD4 антигена и восстановление числа клеток с маркером Thy-1 в селезенке мышей, получавших Бестим, до показателей интактных мышей наблюдалось уже к 8 дню от начала курса препарата.

Под влиянием Бестима отмечено повышение пролиферативной активности клеток тимуса и селезенки мышей как в нестимулированных культурах, так и при индукции пролиферации КонА и ЛПС. При остро прогрессирующем ТБ КонА-индуцированный ответ тимоцитов к 30 дню от начала использования Бестима повысился до 72% от уровня интактной группы при 36% у мышей, леченных только изониазидом (р<0,05), а спленоцитов - до 69% при 35% в контроле лечения (р<0,01).

Стимулирующий эффект Бестима на продукцию ИЛ-2 спленоцитами, проявлявшийся независимо от уровня ингибиции продукции цитокина. отмечен при всех вариантах течения инфекции. При остро прогрессирующем ТБ Бестим на 9 день от начала его курса стимулировал выработку цитокина до 73% от уровня интактных мышей против 22% в группе контроля лечения, на 15 - до 49% против 24%.

Действие Бестима на продукцию ИФН-у и ИЛ-4 спленоцитами, а также на их содержание в сыворотке крови оценивалось только при вялотекущем варианте течения инфекции. При этом в КонА-стимулированных культурах клеток у мышей, леченных 0,1 и 1 мкг/кг Бестима, обнаружены разнонаправленные изменения цитокинов: повышение продукции ИФН-у и снижение секреции ИЛ-4 (рисЛОА). Такие изменения зафиксированы практически на всех сроках обследования при использовании Бестима в разных режимах. Содержание ИФН-у и ИЛ-4 в сыворотке крови животных под влиянием Бестима менялось в тех же направлениях: уровень ИФН-у повышался, а содержание ИЛ-4 - снижалось (рис.1 ОБ).

ЕЗЭИФНд

•■»-ИЛ-4 ^^ X \ г- 4 I "

ИНТАКТНЫЕ ЖИВОТНЫЕ

КОНТРОЛЬ ТЕРАПИИ

БЕСТИМ

0,1 МКГ/КГ

140СС1 130С0 12000 11000

ЕЙИФНд ИЛ - 4

X А / I

\ п

/ \

1 N

[у..

ИНТАКТНЫЕ КОНТРОЛЬ БЕСТИМ

ЖИВОТНЫЕ ТЕРАПИИ 0.1 МКГ/КГ

Рис.!0. Влияние Бестима на продукцию ИФН-у и ИЛ-4 спленоцитами (А) и уровень этих цитокинов в сыворотке крови у мышей с вялотекущим ТБ, вызванным инокуляцией М.Ьоггх, на 22 день от начала иммунотерапии. * -

различия с интактной группой достоверны, **- различия с контролем терапии достоверны, р<0,05.

Стимулирующий эффект Бестима на Мф отмечен по снижению уровня внеклеточной 5-нуклеотидазы, стимуляции адгезивной способности Мф, нормализации продукции супероксидных радикалов Мф. Наблюдался восстанавливающий эффект Бестима на активность фагоцитоза Мф при ее ингибиции в ходе развития инфекции и под влиянием длительной (более месяца) терапии туберкулостатиками.

При терапии классического генерализованного ТБ процесса, вызванного МЛиЬегсгйоьш, также обнаружено отчетливое позитивное влияние Бестима на течение заболевания. Отмечено снижение индекса поражения легких и коэффициента массы селезенки, снижение высеваемости микобактернй из легких животных, прошедших курс иммунотерапии (рис.11А). Гистологическое исследование срезов легких у инфицированных мышей подтвердило высокую терапевтическую эффективность Бестима как при парентеральном, так и пероральном введении в дозе 1 мкг/кг.

й ИНДЕКС ПОРАЖЕНИЯ ЛЕГКИХ 5ЯКОЭФ. МАССЫ СЕЛЕЗЕНКИ □ КОЕхЮ-4

й КонА-ИНДПРОЛИФЕРАЦИЯ а ВСС-ИНД.ПРОЛИФЕРАЦИЯ

КОНТРОЛЬ ТЕРАПИИ

БЕСТИМ В/Б

1 мкг/кг

БЕСТИМ П/0 1 МКГ/КГ

БЕСТИМ 1 МКГ/КГ П/О

Рис.10. Влияние Бестима на показатели тяжести течения инфекции (А) и митоген- и антиген-индуцированную пролиферацию спленоцитов (Б) на 33 день после начала иммунотерапии у мышей с классическим ТБ,

вызванным инокуляцией М,йлЬегси1о5Я5.

достоверны. р<0,05.

- различия с контролем терапии

Лечебный эффект Бестима сопровождался стойким имму но модулирующим действием препарата, наиболее выраженным в дозе 1 мкг/мг в/б или п/о. Интенсивность антиген-специфической пролиферации спленоцитов значимо увеличилась к 33 дню наблюдения (рисЛ1А), уровень митоген-индуцированной пролиферации практически не менялся на всех сроках наблюдения.

5С025 ЙС069

КОНТРОЛЬ ТЕРАПИИ

БЕСТИМ 1 МКГ/КГ В/Б

БЕСТИМ 1 МКГ/КГ П/О

1600 1400 1200 1000

КОНТРОЛЬ ТЕРАПИИ

ЕИЛ-Ю В ИЛИ2

БЕСТИМ 6ЕСТИМ

1 МКПКГ В/б 1 МКГ/КГ П/О

Рис.11. Влияние Бестима на экспрессию клеточных маркеров спленоцитами (А) и продукцию ИЛ-10 и ИЛ-12 ВСС-стимулированными культурами спленоцитов (Б) на 12 день от начала иммунотерапии у мышей с классическим ТБ, вызванным инокуляцией МЛиЬегсиЬэг'э. * -

различия с контролем терапии достоверны, р<0,05.

На ранних сроках после иммунотерапии отмечены стимуляция спонтанной и КонА-индуцированной пролиферации тимоцитов и изменение субпопуляционного состава тимуса, наблюдавшиеся ранее у интактных животных. На 12 день наблюдалось достоверное увеличение количества клеток, экспрессирующих CD25 и CD69 антигены (рис.1 ОБ). Существенного усиления ИЛ-2 или ИЛ-4 продукции в ответ на BCG обнаружено не было. Продукция ИФН-у спленоцитами имела даже тенденцию к снижению по сравнению с контролем терапии, однако было выявлено статистически достоверное снижение BCG-стимулированной продукции ИЛ-10 на фоне некоторого повышения продукции ИЛ-12 (рис.11Б).

Таким образом, в данной модели лечебный эффект Бестима сопровождался стойким иммуномодулирующим действием препарата. При классическом течении инфекции Бестим способствовал увеличению содержания зрелых Т-клеток в селезенке и экспрессии на спленоцитах маркеров активации, при остро прогрессирующем ТБ - усилению созревания Т-клеток в тимусе и их поляризации в сторону Тх-1. Использование Бестима привело также к повышению функциональной активности Тх-1 клеток (усиление пролиферативной активности клеток тимуса и селезенки, продукции спленоцитами ИЛ-2, антиген-специфической продукции ИЛ-12, нормализации спонтанной и КонА-индуцированной продукции ИФН-у). Под влиянием Бестима отмечалась нормализация уровня продукции спленоцитами Тх-2 зависимых цитокинов - ИЛ-4 и ИЛ-10. При этом наиболее значимые изменения активации спленоцитов и продукции ими цитокинов, указывающие на интенсивное развитие антиген-специфического ответа под действием Бестима, наблюдались через 14-21 день от начала его курса, а нормализация уровня большинства цитокинов - через месяц после назначения. Активность Бестима в модели экспериментальной аллергической астмы. В качестве модели патологического состояния, ведущую роль в патогенезе которого играют Т-хелперы 2-го типа, была выбрана модель аллергической астмы, вызванной ингаляционным введением OVA.

70

й? 60-

с"

<

Ш 50

ю

<с

и 40-.

О

0

'5 зо

X

1 г°)

§ 10

Рис. 12. Влияние Бестима на клеточный состав бронхо-альвеолярного лаважа (А) и уровни анти-ОУА ^Е в сыворотке и БАЛ (Б). * - различия с контролем достоверны. р<0,05.

В экспериментах на животных в возрасте 6-8 недель было показано, что общая клеточность бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) под влиянием Бестима не изменяется (2,00±0,34 млн. клеток в контрольной группе; 1,96±0,99 млн. в группе, получавшей 0,1 мкг/кг препарата; и 2,21±1,16 млн. в группе, получавшей 1 мкг/кг). Однако при сравнении относительных долей отдельных популяций лейкоцитов в БАЛ отмечено достоверное снижение содержания эозинофилов и увеличение содержания макрофагов в группе, получавшей 1 мкг/кг Бестима (рис.12А). При анализе уровня антиген-специфических 1§Е в БАЛ выявлено достоверное дозозависимое снижение этих показателей в группах, получавших Бестим, по сравнению с контрольной группой. Уровни анти-ОУА ^Е в сыворотках животных были достоверно ниже, чем в контроле, только в группе, получавшей 1 мкг/кг препарата (рис.12Б).

Морфометрический анализ препаратов от животных, получавших Бестим в дозе 0.1 ,мкг/кг. показал более чем двукратное снижение относительного содержания бокаловидных клеток в эпителии бронхов по сравнению с контрольной группой (р<0,05). Также отмечено достоверное уменьшение инфильтрации вокруг бронхов и отчетливая тенденция к снижению интенсивности периваскулярной инфильтрации в обеих опытных группах, получавших Бестим.

Таким образом, в данной модели использование Бестима приводит к снижению интенсивности аллергического иммунного ответа как на местном, так и системном уровне. Поскольку в основе патогенеза аллергических процессов лежит активность Тх-2 клеток и секретируемых ими цитокинов, то можно предположить, что механизм действия Бестима при экспериментальной астме связан с подавлением поляризации Т-клеток в направлении Тх-2.

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ БЕСТИМА НА КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ II ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ИММУНИТЕТА У БОЛЬНЫХ С ГНОЙНО-СЕПТИЧЕСКИМИ II ИНФЕКЦИОННЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

Основанием для проведения исследования клинической эффективности применения Бестима послужило разрешение №118 Департамента государственного контроля лекарственных средств и медицинской техники МЗ РФ от 04.07.02. Клиническими базами были утверждены клиника Санкт-Петербургского НИИ фтизиопульмонологии (инфильтративный туберкулез легких, руководитель д.м.н. Скворцова Л.А.), клиническая больница №83 ФУ МБ и ЭП при МЗ и СР РФ, Москва (гнойно-воспалительные заболевания в хирургии, руководитель к.м.н. Захарченков В.А.), клиника кафедры инфекционных болезней Военно-Медицинской Академии. Санкт-Петербург (урогенитальный и генерализованный хламидиоз, руководитель д.м.н. Позняк А.Л.). Во всех случаях иммунотерапия Бестимом проводилась на фоне стандартной этиотропной терапии соответствующих заболеваний.

55 больных инфильтративным туберкулезом легких получали инъекции препарата Бестим в дозе 100 мкг (5 ежедневных в/м инъекций) на фоне подобранной противотуберкулезной этиотропной терапии. Оказалось, что иммунотерапия с помощью препарата Бестима значительно снижает бактериовыделение: через 1 месяц после иммунотерапии прекращение бактериовыделения отмечено у 57% пациентов в опытной группе и лишь у 19% в контрольной группе; через 3 месяца тот же параметр составил 80% и 37%, соответственно. Отмечено положительное влияние препарата на закрытие

полостей распада в легких, исчезновение симптомов туберкулезной интоксикации и улучшение субъективного состояния пациентов. Положительная клиническая динамика сопровождалась достоверным повышением относительного содержания CD3+ лимфоцитов в периферической крови сразу после окончания лечения и через 3 месяца после иммунотерапии и явной тенденцией к увеличению количества CD3+CD4+ клеток. Кроме того, у больных, получавших Бестим, наблюдалось достоверное снижение лектин-стимулированной РБТЛ и, одновременно, повышение РБТЛ, стимулированной PPD.

Использование Бестима (100 мкг в/м, 1 раз в день, 5 дней) в комплексной терапии у больных с генерализованными формами хирургической инфекции (генерализованный сепсис, перитонит, панкреонекроз, пневмония, абсцессы и инфильтраты брюшной полости, гнойно-воспалительные процессы в малом тазу и др.) и больных с гнойно-септической пульмонологической патологией, развившейся вне связи с оперативным вмешательством (пневмония, обострение бронхоэктатической болезни) позволяет добиться устойчивой положительной динамики в состоянии пациентов Бестим позитивно влиял на биохимические и гематологические показатели, на восстановление параметров иммунного статуса и, прежде всего, повышение процентного содержания в периферической крови CD3+ лимфоцитов, активированных Т-лнмфоцитов CD3+HLA-DR+, CD3+CD4+ клеток, повышение иммунорегуляторного н снижение лейкоцитарно-Т-лимфощггарного индексов, повышение уровней лштоген-индуцированной пролифератавной активности Т-лимфоцитов от vitro.

В ходе клинических испытаний Бестима у 79 испытуемых, страдавших распространенными и локализованными формами мочеполового хламидиоза, выявлено положительное влияние препарата на процесс клинического выздоровления и бактериологической санации пораженных органов. Бестим (100 мкг в/м, 1 раз в день, 10 дней) использовался в качестве дополнения к традиционной антибактериальной терапии. При использовании Бестима в терапии локализованных форм мочеполового хламидиоза как клиническая

(КЭ), так и бактериоцидная эффективность (БЭ) после окончания лечения (КЭэ 81%, БЭэ 75%) были достоверно выше, чем в контрольной группе (КЭк 50%, БЭК 56%). Через 3 месяца после окончания лечения достоверность различия в исследованных параметрах сохранялись, причем, у испытуемых, леченных Бестимом, не произошло снижения показателей эффективности терапии вследствие рецидивов (КЭэ 81%, БЭэ 80%), как это наблюдалось в контрольной группе (КЭк 40%, БЭГ 35%). Обращает на себя внимание возрастание содержания лимфоцитов, СЭЗ+, СОЗ+СБ4+ и С03^С08+ клеток в процессе лечения у испытуемых, получавших Бестим Наряду с этим происходило снижение уровня СБ20+ и СО 16+ клеток. Кроме того, наблюдалось снижение спонтанной продукции ИЛ-1, ФНО, ИЛ-6, ИЛ-8 и концентрации С5а компонента комплемента, что связано, вероятно, с уменьшением интенсивности воспаления в пораженных органах. Возросли спонтанная продукция ИЛ-2 и нестимулированная пролиферация лимфоцитов. Усиливалась ИЛ-8- и ФМЛП-индуцированная миграция нейтрофилов, их спонтанная адгезия и фагоцитарная активность мононуклеарных клеток.

Таким образом, применение инъекционной формы иммуномодулирующего препарата Бестима в качестве средства патогенетической терапии у больных инфекционными заболеваниями с преимущественно внутриклеточной локализацией возбудителя было патогенетически оправданным, способствовало санации организма от патогена и ликвидации иных патологических признаков заболеваний. Положительная клиническая динамика наблюдалась на фоне выраженной динамики клинико-иммунологических показателей в сторону усиления антиген-специфического иммунного ответа и направлении Т хелперов 1 типа.

Полное отсутствие побочных реакций при применении, комплексное иммуномодулирующее действие препарата, быстрое наступление клинического и иммунотропного эффектов, позволяют рассматривать Бестим как один из песпективных препаратов для иммунокорригирующей терапии в клинике хирургических и инфекционных болезней.

37

ВЫВОДЫ

1. Установлены закономерности структурно-функциональной организации у-глутамил содержащих дипептидов и показано, что наиболее активным аналогом с иммуномодулирующим действием является у-Б-глутамил-Ь-триптофан (Бестим).

2. Биологическая активность Бестима обусловлена высокоаффинным связыванием со специфическими сайтами на мембранах макрофагов и тимоцитов.

3. Исследование фармакокинетики Бестима при различных путях введения показало высокую биодоступность препарата как при парентеральном, так и при пероральном путях введения.

4. Механизм иммуностимулирующего действия Бестима связан с увеличением дифференцировки и преимущественным усилением функциональной активности Т-лимфоцитов хелперов 1 типа. Как при парентеральном, так и пероральном введении Бестим ускоряет дифференцировку ранних предшественников Т-лимфоцитов в костном мозге, созревание Т-клеток в тимусе, увеличивает ИЛ-2-зависимую пролиферацию лимфоцитов, экспрессию а субъединицы рецептора ИЛ-2, продукцию ИЛ-2 и ИФН-у на фоне параллельного снижения продукции ИЛ-4. Бестим усиливает развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа, стимулирует дифференцировку и цитотоксическую активность естественных киллеров, увеличивает фагоцитоз и переваривающую активность макрофагов.

5. При развитии иммунного ответа Бестим усиливает антиген-специфическую пролиферацию лимфоцитов и антиген-специфическую продукцию лимфоцитами ИЛ-2 и ИФН-у, стимулирует продукцию антител и появление антител ообразующих В-клеток.

6. Бестим усиливает противоинфекционный иммунитет. Механизм протективного действия Бестима в модели экспериментального туберкулеза связан с усилением фагоцитоза, активацией антиген-специфического

иммунного ответа и поляризацией Т-хелперов в направлении Т-хелперов 1 типа.

7. Бестим обладает иммуномодулирующим действием, изменяя направление преимущественного развития иммунного ответа. В модели экспериментальной аллергической бронхиальной астмы Бестим снижает титры аллерген-специфических и тканевых проявлений аллергического иммунного ответа.

8. Бестим эффективен при комбинированном лечении больных гнойно-воспалительными хирургическими заболеваниями, хламидиозом, туберкулезом легких. Положительная клиническая динамика сопровождается иммуномодулирующим действием, проявляющемся в поляризации иммунного ответа в направлении Т-хелперов первого типа и в усилении антиген-специфического иммунного ответа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Пигарева Н В., Симбнрцев А.С., Колобов А.А., Калинина Н.М., Кауров О.А., Кетлинский С.А. Изучение иммуномодулирующей активности нового пептидного соединения бестима П Иммунология. - 2000. - №1. - С.33-35.

2 Simbirtsev А., Zabolotnych N„ Kolobov A., Pigareva N., Kotov A., Minaeva E., Vinogradova T. Synthetic peptide gamma-D-glutamvnyl-L-tryptophan has antituberculosis activity m murine model // Eur.Resp.J. - 2001. - V.18. -N.3. - P.340-344.

3. Наволоцкая E В., Колобов A.A., Кампе-Немм E.A , Заргарова T.A., Малкова Н.В., Краснова С.В., Ковалицкая Ю.А., Завьялов В.П., Липкин В.М. Синтетический пептид VKGFY и его циклический аналог стимулируют бактерицидную активность макрофагов через неопиоидные рецепторы р-эндорфина // Биохимия. -2003. - Т.68. - №1. - С.42-51

4 Navolotskaya E.V., Kovalitskaya Y.A., Zolotarev Y A., Kudryashova N.Y., Goncliarenko E.N., Kolobov A.A., Kampe-Nemm E.A., Malkova N.V., Yurovsky V.V., Lipkin V.M. Beta-endorphin-like peptide reduces the production of 11-oxycorticosteroids by rat adrenal cortex through non-opioid beta-endorphin receptors // Peptides - 2003. - V.24. -N.12. - P. 1941-1946.

5. Navolotskaya E.V., Vanina V.I., Zolotarev Y.A., Kudryashova N.Y., Goncliarenko E.N., Kolobov A.A., Kampe-Nemm E.A., Yurovsky V.V., Lipkin V.M. Synthetic peptide immunocortin stimulates the production of 11-oxycorticosteroides by rat adrenal cortex through ACTH receptors // Regul. Pept. - 2004. - V.119. - N.l-2. -P.99-104.

6 Наволоцкая E.B., Ковалицкая Ю.А., Золотарев Ю. А , Колобов А.А., Кампе-Немм Е.А., Малкова Н.В., Юровский В.В., Липкин В М. Характеристика неопиоидного рецептора (З-эндорфина // Биохимия. - 2004. - Т.69. - №.4 - С.394-400.

7 Алексеева Т.М., Шабашова Н.В., Фролова Е.В., Колобов А.А., Симбирцев А.С. Влияние иммуномодулятора Бестим на клиническое состояние и иммунную реактивность больных идиопатическими воспалительными миопатиями II Цитокины и воспаление. -2007. -Т 6. -№1. - С.36-39.

8 Петров А В., Пигарева Н.В., Котов А.Ю, Колобов А.А, Симбирцев А.С. Изучение влияния Бестима (SCV-07) на дифференцировку Т-лимфоцитов у мышей // Цитокины и воспаление. - 2007. - Т.6. - №3. - С.27-31.

9 Ковалитская Ю.А., Садовников В.Б., Колобов А.А., Золотарев Ю.А., Юровский В.В., Липкин В.М., Наволоцкая Е.В. Связывание (З-эндорфина и его

фрагментов с неопиоидным рецептором перитонеальных макрофагов мыши // Биоорг. Хим. -2008. -Т.34. - №1. - С.36-42.

10 А. А. Колобов, Н. И. Колодкин, Ю. А. Золотарев, С. Тафил, Е. В. Наволоцкая. Взаимодействие синтетического иммуномодулирующего дипептида бестима с макрофагами и тимоцитами мыши // Биоорг. Хим. - 2008. - Т.34. - №1. - С.43-49.

11 Alexander Kolobov, Andrey Simbirtsev, Nickolay Kolodkin, Natalia Pigareva, Alfred Rudolph, Cynthia Tuthill. Immunomodulatory properties of gamma-glutamyl and beta-aspartyl containing peptides // Peptides 1998. - Budapest, 1998. - P.526-527.

12. Alexander Kolobov, Andrey Simbirtsev, Natalia Pigareva, Nickolay Kolodkin, Alfred Rudolph, Cynthia Tuthill. Further investigation of immunomodulatory properties of gamma-glutamyl containing peptides // Peptides 2000. - Paris, 2001. -P.877-888.

13. Alexander A. Kolobov, Andrey S. Simbirtsev, Natalia V. Pigareva, Natalia V. Zabolotnych, Tat'yana I. Vinogradova, Alexander Y. Kotov, Cynthia W. Tuthill, and Alfred R. Rudolph. Biological activity of the immunomodulatory peptide SCV-07 against murine tuberculosis // Peptides 2002. - Napoli, 2002. - P.536-537.

14 Симбирцев А., Колобов А., Заболотных H., Пигарева H., Конусова В , Котов А., Варюшина E., Бокованов В., Виноградова Т., Васильева С., Туфил С. Изучение биологической активности пептида SCV-07 на модели экспериментального туберкулеза у мышей // Russian Journal of Immunology. -2003.-V.8-№1.-C.l 1-22.

15 Kolobov A.A., Simbirtsev A.S. Bestim is an unique regulator of immunity // New Information technologies in medicine, pharmacology and biology. - Gurzuf, 2005. -P.81-84.

16. Заболотных H.B., Виноградова Т.И., Скворцова JI.A., Колобов А.А., Петров А.В., Пигарева Н.В., Сахарова И.Я.. Васильева Г.Ю. Бестим в комплексной терапии туберкулеза легких. Под ред. Ю.Н.Левашева и А.С.Симбирцева // -СПб.: «Борей-Арт», 2007. -68 С.

СПИСОК ПАТЕНТОВ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Колобов А.А., Симбирцев А.С., Куликов С.В., Прусаков А.Н., Калинина Н.М., Пигарева Н.В., Котов А.Ю., Шпень В.М. Пептид, обладающий иммуномодулирующей активностью // Патент РФ №2091389 (95120266) от 27.09.97.

2. Kolobov А.А., Simbirtsev A.S., Kulikov S.V , Prusakov A.N., Kalinina N.M., Pigareva N.V., Kotov A.U., Shpen V.M., Kaurov O.A., Ketlinsky S.A.. Gamma-glutamyl containing immunomodulator compounds and methods therewith // PCT W09719691, May 06, 1997.

3. Кауров O.A., Кетлинский С.А., Колобов A.A., Симбирцев А.С. Иммуностимулятор и препарат на его основе // Патент РФ №212098 (95119704) от 28.10.1998.

4. Колобов А А., Симбирцев А.С. Пептид, обладающий иммуностимуляторной активностью, и препарат на его основе // Патент РФ №2142958 от 20.10.1999.

5. Kolobov А.А., Simbirtsev A.S., Kulikov S.V., Prusakov A.N , Kalinina N.M., Pigareva N.V., Kotov A.U., Shpen V.M., Kaurov O.A., Ketlinsky S.A.. Gamma-glutamyl containing immunomodulator compounds and methods therewith // US patent 5,744,452. April 28, 1998.

6. A.A. Kolobov, A.S. Simbirtsev. Gamma-glutamyl and beta-aspartyl containing immunomodulator compounds and methods therewith // US patent 5,916,878, June 29, 1999.

7. E.T. Wei, A A. Kolobov, A.S. Simbirtsev. Gamma-glutamyl and beta-aspartyl containing immunomodulator compounds and methods therewith // PCT W099/33799, July 08, 1999.

8. Н.В.Заболотных, Л.А.Иванова, Т.И.Виноградова, М.В.Павлова, С.Н.Васильева, А.С.Симбирцев, А А.Колобов. Способ лечения туберкулеза легких // Патент РФ №2229892 от 06.10.2004.

9. A A.Kolobov, A S Simbirtsev, T.l.Vinogradova, N.V.Zabolotnyh. Treatment of tuberculosis using immunomodulator compounds // PCT W003013572, February 20, 2003.

10.Tuthill Cynthia W., Rudolph Alfred R„ Kolobov Alexandr A., Simbirtsev Andrey S., Petrov Alexandr V. Treatment or prevention of respiratory viral infections with immunomodulator compounds//PCT W02005112639, December, 01, 2005.

11. A.A.Kolobov, A.S.Simbirtsev, T.I.Vinogradova, N.V.Zabolotnyh. Treatment of tuberculosis using immunomodulator compounds // US patent 7.173.013, February 06, 2007.

12.Thutill C., Rudolph A., Kolobov A., Simbirtsev A., Petrov A. Treatment or prevention of respiratory viral infections with immunomodulator compounds // W02005/112639 A3, December 01,2005.

13.Симбирцев А.С., Колобов А.А., Петров А.В., Пигарева H.A., Оганезов B.K., Сизякина Л.П., Чирютина Э.В. Способ лечения аллергических заболеваний // Заявка на патент РФ 2007118237 от 17.05.2007.

Подписано в печать 18 08.08. Формат А5 Бумага офсетная. Печать методом ризографии. Тираж ЮОэкз. Заказ № 475

Отпечатано с готового оригинал - макета в типографии рекламного агентства ООО «Аднс»

Рекламное агентство ООО «Адис» 197110, С - Петербург, Левашовекий пр., 12

Актуальность исследования:

В настоящее время гуморальные регуляторпые факторы иммунной системы, действующие как местно, так и па системном уровне, находятся в центре внимаиия клинических иммунологов как потенциальные лекарственные препараты. Они используются для модуляции активности иммунной системы с целыо лечения целого ряда патологических состояний и заболеваний (Кетлинский и др., 1992; Кетлинский, Калинина, 1998; Jeffery, 2004; Новиков, 2005). Особое место среди биорегуляторов иммунной системы занимают пизкомолекулярные медиаторы полипептидпой природы. Их особая роль заключается в тесной функциональной взаимосвязи с другими гормонами, особенно с гормонами гипоталамуса, гипофиза, надпочечников и половых желез, обеспечивающей один из механизмов реализации пейроиммуноэндокриииых взаимодействий (Blalock, 1989, Jiang el al., 1998, Dantzer, 2004).

Действие пизкомолекулярных пептидных биорегуляторов селективно и высокоспецифично, их эффективные концентрации лежат в зоне микро-наиомолярных значений. Как правило, они нетоксичны и пеиммуиогеппы, время их действия ограничено, они быстро разлагаются до аминокислот под действием протеолитических ферментов. Совокупность уникальных биологических свойств и возможности промышленного получения пизкомолекулярных пептидов с помощью методов химического синтеза делают этот класс соединений одним из наиболее перспективных кандидатов для разработки новых лекарственных препаратов (Шабанов, 2006).

Одной из задач современной иммупофармакологии является изучение структурно-функциональной организации биорегуляторов, т.е. зависимости проявления биологической активности от структуры молекул, которое помогает установить механизмы их действия па молекулярном и клеточном уровнях. Знание структурно-функциональной организации позволяет целенаправленно подходить к конструированию новых аналогов, обладающих селективной активностью и уникальными фармакологическими свойствами, стимулирует разработку лекарственных препаратов на их основе. В тоже время понимание механизмов функционирования лекарственных препаратов позволяют более обоснованно и эффективно применять их в иммунокорригирующей терапии (Козлов и др., 2001; Нестерова и др., 2002). В связи с этим, разработка новых синтетических иммуномодуляторов пептидной природы и изучение механизмов их действия является актуальной теоретической и практической задачей.

Настоящее исследование посвящено изучению иммунотропной активности нового семейства иммуномодулирующих препаратов - у-глутамил содержащих дипептидов, исследованию их структурно-функциональной организации, установлению механизма действия и клипико-иммунологической характеристике наиболее активного по совокупности использованных тестов соединения у-Э-глутамил-Ь-триптофана.

Результаты проведенных исследований положены в основу включения лекарственного препарата Бестим, в котором у-О-глутамил-Ь-триптофап используется в качестве фармакологически активной субстанции, в терапию заболеваний, сопровождающихся дисбалансом Тх-1/Тх-2 звеньев иммунитета и снижением функциональной активности макрофагов.

Цели исследования:

Изучение закономерностей структурпо-фупкциопальной организации у-глутамил , содержащих дипептидов, исследование спектра иммуномодулирующей активности и механизма действия у-О-глутамил-Ь-триптофана, разработка нового иммунотропного препарата пептидной природы на его основе.

Основные задачи исследования:

1. исследовать взаимосвязь структура-активность в ряду у-глутамил содержащих дипептидов и осуществить дизайн структуры с наиболее высокой иммуномодулирующей активностью;

2. изучить влияние у-О-глутамил-Ь-триптофана (Бестима) па дифференцировку, пролиферативную и функциональную активность иммупокомпетен гных клеток;

3. провести исследование взаимодействие Бестима с клеточными рецепторами;

4. исследовать фармакокинетические свойства Бестима при различных путях введения препарата;

5. изучить иммупомодулирующее действие Бестима в экспериментальных моделях с преимущественной активацией иммунного ответа по Тх-1 или Тх-2 типу при различных путях введения препарата;

6. провести клипико-иммупологическую характеристику лекарственного препарата Бестим в ходе клинических испытаний.

Работа выполнена в Государственном научно-исследовательском институте йсобо чистых биопрепаратов Федерального Медико-биологического Агентства России в рамках соискательства. I

Научная новизна:

Впервые показано, что дипептиды, содержащие глутаминовую кислоту, соединенную у-связыо со следующим аминокислотным остатком, а также их аналоги с (3-связью по аспарагиновой кислоте обладают выраженным иммуномодулирующим действием. Проведенные исследования выявили такие структурные особенности нового семейства иммупомодуляторов как предпочтительность глутамиповой кислоты по отношению к аспарагиновой в первом положении, наличие триптофана с пемодифицированпым ипдольпым кольцом и "глутамиповой кислоты в D-конфигурации, отсутствие модификаций, на N- и С-копцах молекулы. Доказано, что наибольшей иммуностимулирующей активностью обладает активностью у-О-глутамил-Ь-триптофап (Бестим, от BE(neficial) ST(imulator) oflM(munity)).

Установлено, что [ Н]Бестим с высоким сродством связывается с перитопеальными макрофагами и тимоцитами мыши, а также плазматическими мембранами, выделенным из этих клеток. В концентрациях 10"10— 10~6М Бестим снижает аденилатциклазпую активность мембран макрофагов и тимоцитов мыши.

Фармакологическое действие препарата определяется усилением дифферепцировки и пролиферации предшественников Т-лимфоцитов. При действии in vitro Бестим усиливает продукцию ИЛ-2 и экспрессию его рецептора лимфоцитами, усиливает их пролиферативпую активность. В модельных системах in vivo Бестим стимулирует Т-клеточпое звено иммунитета, активирует макрофаги и естественные киллерные клетки. Установлено, 'что иммупомодулирующее действие Бестима идентично как при парентеральном, так и пероральпом применении.

В модели экспериментального генерализованного туберкулеза у мышей Бестим обладает противоинфекционпым и иммупомодулирующим действием, усиливая аптиген-специфический иммунный ответ с преимущественной активацией Т-хелперов 1 типа. В модели аллергической бронхиальной-' астмы показано ипгибирующее действие препарата па местные и системные проявления патологического процесса.

Иммупомодулирующее действие Бестима изучено при его применении в комплексной терапии пациентов с гнойно-септическими процессами, больных распространенными и локализованными формами мочеполового хламидиоза и ипфильтративпым туберкулезом легких. Динамика клинико-иммунологических показателей после курса препарата свидетельствует о стимуляции антиген-специфического иммунного ответа, функциональной активности Т-'клеток, преимущественной активации Т-хелперов 1 типа. 11 Практическая значимость:

Практическая ценность работы заключается в установлении закономерностей структурно-функциональной организации нового семейства иммуномодулирующих соединений - у-глутамил содержащих пептидов; дизайне структуры нового иммупомодулирующего соединения и создании на ее основе нового отечественного лекарственного препарата Бестим; демонстрации иммупомодулирующего эффекта Бестима, связанного с преимущественной активацией Т-хелнеров первого типа и нормализацией баланса между Тх-1 и Тх-2, при парентеральном и пероральном применении; установлении' механизмов его действия; определении оптимальных схем использования препарата; изучении эффективности включения иммуномодулирующей терапии с помощью препарата Бестим в стандартные схемы лечения инфекционных заболеваний.

Результаты, полученные в ходе выполнения исследования, использованы' для регистрации и получения разрешения па выпуск в обращение препарата «Бестим, 100 мкг, лиофилизат для приготовления раствора для внутримышечного введения» (рег.уд. Р№)3335/03 от 29.12.2006). В'настоящее время препарат выпускается ФГУП Гос.НИИ ОЧБ ФМБА России.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. у-О-глута'мил-Ь-триптофан (Бестим) обладает дозозависимым, невидоспсцифичным иммупомодулирующим действием и наиболее активен среди у-глутамил содержащих пептидов.

2. Биологическая активность Бестима обусловлена высокоаффинпым селективным взаимодействием со специфическими сайтами на мембранах макрофагов и тимоцитов.

3. Биодоступность препарата при внутрибрюшиппом и пероральном путях введения одинакова и составляет 55-60%.

4. Механизм иммуностимулирующего действия Бестима связан с увеличением дифференцировки и преимущественным усилением функциональной активности Т-хелперов 1 типа.

5. Введение Бестима приводит к усилению антиген-специфического иммунного ответа.

6. Бестим обладает противоипфекциопным и иммуномодулирующим действием в модели экспериментального генерализованного туберкулеза.

7. В модели экспериментальной аллергической бронхиальной астмы Бестим снижает титры аллерген-специфических IgE и тканевые проявления аллергического иммунного ответа.

8. Бестим эффективен при комбинированном лечении больных с вторичными иммунодефицитами различной этиологии, причем положительная клиническая динамика сопровождается иммуномодулирующим действием препарата.

Апробация работы:

Основпь1е результаты исследований и положения диссертационной работы были представлены и доложены на: 25 Европейском пептидном симпозиуме (Будапешт, Венгрия, 1998), 16 Американском пептидном симпозиуме (Миннеаполис, США, 1999), 17 Международном конгрессе по аллергологии и клинической иммунологии (Сидней, Австралия, 2000), 26 Европейском ' пептидном симпозиуме (Монпелье, Франция, 2000), 42 Междисциплйнарпой конференции по антимикробным агентам и химиотерапии (Сап-Диего, США, 2002), 27 Европейском пептидном симпозиуме (Сорренто, Италия, 2002), Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов (Москва, 2003), 12 Международном иммунологическом конгрессе (Монреаль, Канада, 2004), VIII и X Всероссийском научном форуме им. акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004, 2006), XIII Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Ялта, 2005), 29 Европейском пептидном симпозиуме (Гданьск, Польша, 2006), 6-ой ежегодной Конференции Американского Общества Клинических Иммунологов (Сан Франциско, 2006), 13 Международном иммунологическом конгрессе (Рио де Жанейро, Бразилия, 2007).

Диссертационная работа прошла апробацию па научной конференции отдела иммунологии ГУ НИИЭМ РАМН.

Публикации:

По теме диссертации опубликовано 44 научные работы, в их числе 13 российских и' международных патентов и 10 работ, изданных в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Объем и структура диссертации:

Диссертация изложена на 280 страницах машинописного текста, включая 83 таблиц и 22 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 9 глав собственных исследований, обсуждения результатов и выводов. Список литературы содержит 392 работ (60 отечественных и 332 зарубежных).

ВЫВОДЫ

1. Установлены закономерности структурно-функциональной организации у-глутамил содержащих дипептидов и показано, что наиболее активным аналогом с иммупомодулирующим действием является у-О-гутамил-Ь-триптофан (Бестим).

2. Биологическая активность Бестима обусловлена высокоаффинным связыванием со специфическими сайтами на мембранах макрофагов и тимоцитов.

3. Исследование фармакокинетики Бестима при различных путях введения показало высокую биодоступность препарата как при парентеральном, так и при пероральпом путях введения.

4. Механизм иммуностимулирующего действия Бестима связан с увеличением дифференцировки и преимущественным усилением функциональной активности Т-лимфоцитов хелперов 1 типа. Как при парентеральном, так и пероральном введении Бестим ускоряет дифференцировку ранних предшественников Т-лимфоцитов в костном мозге, созревание Т-клеток в тимусе, увеличивает ИЛ-2-зависимую пролиферацию лимфоцитов, экспрессию а субъединицы рецептора ИЛ-2, продукцию ИЛ-2 и ИФНу на фоне параллельного снижения продукции ИЛ-4. Бестим усиливает развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа, стимулирует дифференцировку и цитотоксическую активность естественных киллеров, увеличивает фагоцитоз и переваривающую активность макрофагов.

5. При развитии иммунного ответа Бестим усиливает антиген-специфическую пролиферацию лимфоцитов и антиген-специфическую продукцию лимфоцитами ИЛ-2 и ИФН-у, стимулирует продукцию антител и появление антителообразующих В-клеток.

6. Бестим усиливает противоинфекциониый иммунитет. Механизм протективного действия Бестима в модели экспериментального туберкулеза связан с усилением фагоцитоза, активацией антиген-специфического иммунного ответа и поляризацией Т-хелперов в направлении Т-хелперов 1 типа.

7. Бестим обладает иммуномодулирующим действием, изменяя направление преимущественного развития иммунного ответа. В модели экспериментальной аллергической бронхиальной астмы Бестим снижает титры аллерген-специфических ^Е и тканевых проявлений аллергического иммунного ответа.

8. Бестим эффективен при комбинированном лечении больных гнойно-воспалительными хирургическими заболеваниями, хламидиозом, туберкулезом легких. Положительная клиническая динамика сопровождается иммуномодулирующим действием, проявляющемся в поляризации иммунного ответа в направлении Т-хелперов первого типа и в усилении антиген-специфического иммунного ответа.

242

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обзор литературы показывает, что существует большой пул низкомолекулярных полипептидных биорегуляторов иммунитета. Многие из них продуцируются клетками первичных органов иммунной системы или являются гормонами, синтезируемыми в ЦНС, другие возникают в результате ограниченного протеолиза биологически активных белков-предшественников. В настоящее время уже не вызывает сомнений, что такие пептиды образуются в организме и играют роль сигнальных молекул. Однако, как правило, биологическая активность таких биорегуляторов плейотропна, помимо влияния па иммупокомпетентные клетки они обладают способностью модулировать функциональную активность других клеток и тканей. у-глутамил содержащие пептиды представляют особую группу биорегуляторов с уникальными физико-химическими свойствами, которые определяются их первичной структурой. Это, прежде всего, высокая энзиматическая устойчивость, высокая удельная активность, возможность перорального применения. Однако действие у-глутамил содержащих пептидов на клетки иммунной системы на настоящий момент не изучено.

В обзоре приведены примеры успешного применения препаратов па основе низкомолекулярных пептидов в медицинской практике. Следует подчеркнуть ценность таких качеств пептидных препаратов, как высокая активность, практически полное отсутствие токсичности и иммуногенности. В то же время, клиническое применение эндогенных пептидов лимитируется их полифункционалыюстыо и низкой биодоступностыо, особенно при пероральном применении. Поэтому основной задачей исследователей является получение селективных аналогов с узким спектром действия. Не менее важными требованиями являются высокая активность и пролонгированность действия препаратов. Использование современных методов химического синтеза пептидов позволяет получать аналоги пептидных биорегуляторов, содержащие пеприродные аминокислоты или связи между ними, что позволяет успешно решать вышеозначенные задачи.

ЧАСТЬ 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ЖИВОТНЫЕ И ВВЕДЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ В работе были использованы лабораторные мыши линий СВА, Balb/c, С57В1/6 и F1 (СВАхС57В1/6) весом 18-20 г и белые беспородные крысы весом 160-180 г (питомник лабораторных животных Рапполово). Кроме того, использовались также SPF мыши линии Balb/c и аутбредные SPF мыши Swiss Webster (питомник лабораторных животных Пугципо). Животные содержались в условиях постоянно контролируемой температуры и влажности при 12-часовом цикле день/почь. Все животные получали стандартную диету и воду ad libitum.

Синтез у-глутамил содержащих пептидов и их аналогов осуществляли методами классического и твердофазного синтезов. Изучаемые соединения разводили в' стерильном физиологическом растворе (ФР) и вводили внутрибрюшинно (в/б) в различных дозах в объеме 200 мкл. Для пероралыюго (п/о) введения препараты разводили в дистиллированной воде и вводили с помощью желудочного зонда в объеме 200 мкл. Контрольным животным вводили 200 мкл ФР в/б или 200 мкл дистиллированной воды п/о. Анализ гематологических и иммунологических параметров проводили после одно-; трех- или пятикратного введения с 24 часовым интервалом.

1.2. ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ у-ГЛУТАМИЛ СОДЕРЖАЩИХ ДИПЕПТИДОВ

И ИХ АНАЛОГОВ Все полученные соединения (см. Глава 2, таблица 2) охарактеризованы данными тонкослойной хроматографии (ТСХ), аналитической ВЭЖХ, аминокислотного анализа и масс-спектрометрии. Чистота всех полученных пептидов по данным обращепо-фазовой ВЭЖХ была не менее 95%, аминокислотный состав соответствовал теоретическому (±10%), расчетные молекулярные массы совпали с экспериментально определенными (±0.5%).

Ниже приведены типичные методики классического синтеза в растворе и твердофазного синтеза дипептидов.

1.2.1.Синтез у-Э-глутамил-Ь-триптофана методом смешанных ангидридов

0.74 г (0.002 М) а-бепзилового эфира ТчГ-беизилоксикарбонил-Вглутаминовой кислоты растворяют в 12 мл сухого тетрагидрофурана, прибавляют 0.22 мл (0.002 М) Ы-метилморфолина и охлаждают до -15°С. После добавления 0.28мл (0.002 М) изобутилхлорформиата реакционную смесь перемешивают в течение 3 мин. при -10°С и добавляют охлажденный раствор

0.93 г (0.002 М) пара-толуолсульфопата бепзилового эфира Ь-триптофапа и 0.22 \ мл (0.002 М) М-метилморфолина в 15 мл тетрагидрофурана. Полученный раствор перемешивают в течение 12 час. при 4°С, фильтруют, промывают 20 мл тетрагидрофурана и упаривают. Остаток растворяют в 50 мл этилацетата, промывают равными объемами воды, 2Ы серной кислоты, водой, 5% раствором бикарбоната натрия и вновь водой. Раствор высушивают над безводным сульфатом натрия и растворитель удаляют в вакууме до объема 10 мл. Дибензиловый эфир Ы-бензилоксикарбопил у-В-глутамил-Ь-триптофапа выпадает при добавлении 50 мл гексана.

Выход: 820 мг, (62%), (А, хлороформ : метанол : уксусная кислота= 90:8:2) -0.75.

Раствор 0.6 г (0.0009 М) дибепзилового эфира "М-бепзилоксикарбопил у-Э-глутамил-Ь-триптофана в 30 мл метанола гидрируют водородом над палладисвым катализатором (10%, 200 мг) в течение 5 час. Катализатор I удаляют фильтрованием и фильтрат упаривают досуха. Полученное масло растворяют в 0.1% трифторуксуспой кислоте и очищают ОФ ВЭЖХ на колонке иИгаргер С18 в градиенте 10-30% ацетонитрила в 0.1% трифторуксусной кислоте и лйофилизируют. Содержание основного вещества в целевом продукте по данным оптической плотности не менее 97%.

Выход: 190 мг, ЯГ (В, 2-пропапол : 25%№14ОН : вода = 50:5:15) - 0,5; ЯГ (С, бутанол : уксусная кислота : вода = 3:1:1)- 0.45.

1.2.2. Синтез у-Ь-глутамил-Э-триптофапа методом активированных эфиров

0.99 г (0.0026 М) а-бепзилового эфира 1Ч-бензилоксикарбопил-Ь-глутамиповой кислоты растворяют в 96 мл диметилфорамида, прибавляют 0.3 г (0.0026 М) N-оксисукципимида, охлаждают до минус 5°С и при сильном перемешивании приливают к реакционной смеси раствор 0.56 г (0.0027 М) N,N-дициклогексилкарбодиимида в 3 мл диметилформамида. Смесь перемешивают при 0°С 1 час и ос1авляют на 12 час. при комнатной температуре. Отфильтровывают дициклогексилмочевипу, прибавляют к фильтрату 0.64 г (0.0031 М) D-триптофана и 0.46 мл (0.0033 М) триэтиламипа и перемешивают реакционную смесь 16 час. при комнатной температуре. Раствор фильтруют, разбавляют 50 мл воды и экстрагируют три раза 20 мл этилацетата. Объединенные органические экстракты промывают последовательно 20 мл воды, два раза по 20 мл 2N серной кислоты, два раза по 20 мл насыщенного раствора хлористого натрия и сушат безводным сернокислым натрием. Растворитель ' удаляют в вакууме до объема 10 мл. Бепзиловый эфир N-бепзилоксикарбонил у-Ь-глутамил-Э-триптофапа выпадает при добавлении 50 мл гексапа.

Выход: 1,2 г, (81%), Rf (А) - 0.7.

Раствор 0.6 г (0.0009 М) бензинового эфира N-бензилоксикарбонил y-L-глутамил-О-триптофапа в 30 мл метанола гидрируют водородом над палладиевым катализатором (10%, 200 мг) в течение 5 час. Катализатор удаляют фильтрованием и фильтрат упаривают досуха.

Полученное масло растворяют в 0.1% трифторуксусиой кислоте и очищают ОФ ВЭЖХ па колонке Ultraprep С18 в градиенте 10-30% ацетопитрила в 0.1% трифторуксусиой кислоте и лиофилизируют. Содержание основного вещества в целевом продукте по данным оптической плотности пе менее 97%.

Выход: 180 мг, Rf(B) - 0,5; Rf(C) - 0.45.

1.2.3. Синтез Р-О-аспартил-Ь-триптофана твердофазным методом Для синтеза пептида Р-О-аспартил-Ь-триптофана в реакционный сосуд загружают 0.1 г трет-бутилоксикарбонил->1т-формил-Ь-триптофил-полимсра. Содержание триптофана 0.7 мМ/г полимера. Пептидную цепь далее наращивают по следующей программе (см. таблицу 1).