Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение влияния γ-D-глутамил-L-триптофана (Бестима) на дифференцировку и функциональную активность γ-лимфоцитов

На правах рукописи

ПЕТРОВ Александр Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ у-Б-ГЛУТАМИЛ-Ь-ТРИПТОФАНА (БЕСТИМА) НА ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ

Т-ЛИМФОЦИТОВ

14.00 36-Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

003158432

Санкт - Петербург 2007

Работа выполнена в ФГУП Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов Федерального медико-биологического агентства России

Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор

Симбирцев Андрей Семенович

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Назаров Петр Григорьевич

доктор медицинских наук, профессор Калинина Наталия Михайловна

Ведущая организация Государственный научный центр «Институт

иммунологии ФМБА России»

Защита диссертации состоится " 15 " октября 2007 года в /3 час на заседании Диссертационного совета Д 001 022 01 при Государственном Учреждении Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу 197376, Санкт-Петербург, ул академика И П Павлова, д 12

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН

Автореферат разослан " 2007 года

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор медицинских наук

Бурова Лариса Александровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В течение последних двух десятилетий, благодаря интенсивному развитию иммунологии, молекулярной биологии, биотехнологии и медицины, были достигнуты существенные успехи как в исследованиях развития иммунного ответа на различные виды антигенов, так и в изучении иммунопатогенеза заболеваний инфекционной и неинфекционной природы Это в значительной степени стимулировало интерес к иммуномодулирующим препаратам

В настоящее время значительно расширяется спектр иммунотропных лекарственных препаратов и показаний к их применению Наиболее активно развиваются в этом направлении препараты тимического происхождения Особое место среди них занимают синтетические препараты, такие как имунофан, тимоген и другие [Карсанова МИ и соавт, 1998, 2000, Лебедев В В и соавт, 1998, 1999, Нестерова И В и соавт, 2002, Старченко А А, 2002] В последние годы спектр этих препаратов пополнился новым синтетическим иммуномодулятором Бестим, который был синтезирован в ГосНИИ ОЧБ (г Санкт-Петербург) в середине 1990-х годов [Колобов А А и соавт , 1997]

Бестим (y-D-Glu-L-Trp) - дипептид, обладающий наибольшей активностью в ряду синтетических аналогов глутамил-триптофана Первый этап исследований его свойств выявил ряд перспективных преимуществ препарата При действии m vitro Бестим увеличивает продукцию ИЛ-2 лимфоцитами, усиливает их функциональную активность, активирует естественные киллеры В экспериментах на животных было показано, что дипептид также стимулирует Т-клеточное звено иммунитета, преимущественно активируя Т-хелперы 1-го типа, влияет на дифференцировку лимфоцитов, активирует макрофаги [Пигарева Н В , 2000] В то же время пути влияния Бестима на различные этапы дифференцировки Т-лимфоцитов остаются не до конца изученными

Опыт применения Бестима в клинике продемонстрировал перспективность данного препарата для лечения широкого круга заболеваний, сопровождающихся дисфункцией Т-клеточного звена иммунитета [Абрамова Н Н , 2005, Васильева Г Ю и соавт, 2002, Кукаркин НЮ, 2006, Лобзин ЮВ и соавт, 2001, Нестерова ИВ и соавт , 2002, Позняк А Л и соавт, 2000, Фаст М В , 2006]

Принимая во внимание это обстоятельство, актуальным является глубокое исследование иммуномодулирующих эффектов препарата, в частности, его влияния на дифференцировку и функциональную активность Т-лимфоцитов, в частности - на дихотомию Т-хелиеров в различных моделях иммуноопосредованной патологии

Протективная активность дипептида в модели туберкулезной инфекции была продемонстрирована ранее [Заболотных НВ , и соавт, 2001, Пигарева НВ , 2000], однако механизмы иммуномодулирующего действия, в частности, влияние на антиген-специфический иммунный ответ остаются не до конца ясными Кроме того, учитывая влияние Бестима на поляризацию Т-хелперов, представляется весьма актуальным изучение иммуномодулирующих свойств препарата в моделях аллергического иммунного ответа, в частности, при экспериментальной аллергической астме

Цель исследования. Изучение влияния Бестима на дифференцировку и функциональную активность Т-лимфоцитов Задачи исследования

1 Изучить влияние Бестима на различные этапы дифференцировки Т-лимфоцитов у мышей

2 Изучить иммуномодулирующую активность Бестима при различных путях введения у мышей

3 Исследовать иммуномодулирующее действие Бестима в модели экспериментальной туберкулезной инфекции

4 Исследовать иммуномодулирующее действие Бестима в модели аллергии

5 Исследовать влияние Бестима на количественные и функциональные показатели Т-клеток у больных хроническим вирусным гепатитом С

Научная новизна. В данной работе впервые с помощью многоцветной проточной цитофлюориметрии показано стимулирующее влияние Бестима на отдельные этапы дифференцировки Т-лимфоцитов

Впервые изучено влияние Бестима на антиген-специфический иммунный ответ в модели экспериментальной туберкулезной инфекции и выявлено его усиление с преимущественной активацией Т-хелперов 1-го типа

Впервые показана иммуномодулирующая активность Бестима в модели аллергической бронхиальной астмы и показано подавляющее действие препарата на системные и местные проявления патологического процесса

Впервые изучено иммуномодулирующее действие Бестима в комплексной терапии больных хроническим гепатитом С и установлено, что препарат стимулирует функциональную активность Т-лимфоцитов, преимущественно активируя Т-хелперы 1 типа

Практическая значимость. Продемонстрирована активность Бестима для стимуляции Т-хелперов первого типа, как в эксперименте, так и в клинике Показано, что при пероральном введении препарат сохраняет иммуномодулирующую активность, что существенно расширяет возможности его применения в амбулаторных условиях Выявлено достоверное противоаллергическое действие препарата Бестим, наряду с лечением иммунодефицитных состояний и некоторых инфекционных заболеваний, может быть применен для лечения аллергической патологии, в частности - бронхиальной астмы

Результаты диссертационной работы используются в работе НИИ фтизиопульмонологии при разработке схем комплексной терапии туберкулеза, а также в ГосНИИ ОЧБ для разработки новых схем лечения инфекционных и аллергических заболеваний

Основные положения, выносимые на защиту:

1 На основании проведенных исследований установлено, что Бестим ускоряет дифференцировку ранних предшественников Т-лимфоцитов в костном мозге, а также дифференцировку Т-клеток в тимусе

2 При пероральном введении Бестим в полном объеме проявляет иммуномодулирующую активность

3 Механизм протективного действия Бестима при экспериментальном туберкулезном процессе связан с активацией антиген-специфического иммунного ответа и поляризацией Т-хелперов в направлении Тх1

4 В модели аллергической бронхиальной астмы Бестим подавляет местные и системные проявления аллергического иммунного ответа

5 Иммуномодулирующее действие Бестима при хроническом гепатите С проявляется в поляризации иммунного ответа в направлении Т-хелперов 1-го типа

Личный вклад автора в проведение исследования Экспериментальные исследования, включающие приготовление необходимых препаратов, разработку схем их введения, работу с лабораторными животными, а также статистическая обработка и интерпретация полученных результатов выполнялись лично автором Роль остальных соавторов состояла в предоставлении ряда необходимых реактивов и препаратов, консультативной помощи при постановке иммунологических тестов, финансовой поддержке Моделирование экспериментальной туберкулезной инфекции и морфологический анализ проводились совместно с сотрудниками ФГУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» Клиническое исследование эффективности и безопасности совместного применения Бестима и Пегинтрона® у больных хроническим гепатитом С проводилось на базе кафедры инфекционных болезней Российской военно-медицинской академии им С М Кирова Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на VIII и X Всероссийском научном Форуме с международным участием имени акад В И Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (2004, 2006), Международном конгрессе «Иммунитет и болезни от теории к терапии» (Москва, 2005), 6th FOCIS Annual Meeting (San Francisco, 2006), 29th European Peptide Symposium (Gdansk, 2006), Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора Н Н Кеворкова «Иммунитет и аллергия от эксперимента к клинике» (Пермь, 2006)

Диссертационная работа апробирована на научной конференции отдела иммунологии ГУ НИИЭМ РАМН 14 мая 2007 г

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 1 статья, 1 глава в монографии и 6 тезисов

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы Диссертация изложена на 152 страницах текста, включающего 40 таблиц и 6 рисунков Список цитируемой

литературы содержит 205 источников, в том числе 44 отечественных и 161 иностранных

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальные животные и введение препарата. В работе использовались мыши линий C57BL/6 и FI (CBAxC57BL/6) (Питомник лабораторных животных «Рапполово»), а также беспатогенные мыши линии BALB/c и аутбредные мыши Swiss Webster (Питомник лабораторных животных «Пущино») Ампулированный препарат Бестим (ООО «НПФ Верта», любезно предоставлен к х н Колобовым А А ) разводили в стерильном физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно (в/б) в различных дозах в объеме 200 мкл Для перорального (п/о) введения препарата разводили в дистиллированной воде и вводили через пищеводный зонд в объеме 200 мкл Введения проводили ежедневно в течение 3 дней

Анализ иммунологических показателей. Через 24 или 72 часа после последнего введения клетки красного костного мозга, тимуса и селезенки выделяли асептически Экспрессию маркеров CD90 1 (Thyl) и CD117 (c-kit) на клетках костного мозга, CD4 и CD8 на тимоцитах и CD3, CD4 и CD8 на клетках селезенки анализировали с использованием соответствующих фшооресцеин- или фикоэритрин-меченых моноклональных антител (Caltag) помощью проточной цитофлюориметрии на цитофлюориметре EPICS XL (Beckman Coulter) Конканавалин А (КонА)-индуцированную пролиферацию спленоцитов и тимоцитов определяли про включению 3Н-меченого тимидина и выражали в импульсах в минуту (имп/мин) Также определяли КонА-индуцированную продукцию цитокинов, для чего тимоциты или спленоциты стимулировали различными дозами КонА и через 24 часа собирали супернатанты Активность Интерлейкина (ИЛ)-2 в супернатантах определяли с помощью ИЛ-2-зависимой линии CTLL-2 Концентрации ИЛ-2, ИЛ-4 и интерферона (ИФН)-у измеряли с помощью соответствующих иммуноферментных тест-систем (Pharmmgen) Автор выражает искреннюю благодарность кмн Пигаревой H В и к б н Котову А Ю за помощь в постановке иммунологических реакций

Экспериментальный туберкулез вызывали в/в инокуляцией культуры M tuberculosis Erdman (1х107 микробных тел/мышь) Начиная с седьмого дня после

s

заражения, каждые два дня проводились пробные вскрытия мышей с визуальной оценкой легких с целью выявления фокусов специфического воспаления Лечение было начинали при регистрации в легких множественных субмилиарных (<0,1 мм) очагов Мышей лечили противотуберкулезными препаратами (изониазид 10 мг/кг + рифампицин 10 мг/кг), и дополнительно Бестимом в течение 5 дней Бестим вводили в/б (0,1 или 1,0 мкг/кг) или п/о (0 1, 1 или 10 мкг/кг) Результа1ы регистрировали на 5, 12, 19 и 33 день от начала лечения Сравнение проводили с зараженными нелеченными животными (контроль заражения) и с группой контроля лечения, не получавшей Бестим Клинический эффект препарата оценивали по показателям тяжести течения экспериментального туберкулезного процесса коэффициентам массы легких и селезенки, индексу поражения легких, гистологической оценке легких и высеваемости МВТ из легких Также оценивали иммунологические показатели субпопуляционный состав тимуса и селезенки, КонА-индуцированную пролиферацию и продукцию цитокинов спленоцитами, а также, используя в качестве стимулятора вакцинный штамм М bovis BCG (BCG), антиген-специфическую пролиферацию и продукцию цитокинов Помимо ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФН-у также измеряли ИЛ-10 и ИЛ-12 с помощью коммерческих тест-систем (Pharmingen)

Экспериментальную аллергическую астму моделировали по Kato Y et al, 1999, с небольшими изменениями Беспатогенных мышей линии BALB/c иммунизировали овальбумином (OvA) (8 мкг/мышь) дважды с интервалом в 5 дней Бестим вводили в/б в дозе 0, 0 1 или 1 0 мкг/кг с 6 по 11 дни после первой иммунизации Далее, на 12, 16 и 20 дни после первой иммунизации проводили аэрозольное бустирование овальбумином и через 24 часа после последней аэрозольной экспозиции оценивали тяжесть течения экспериментальной аллер! ической астмы Исследовали клеточность и цитологический состав бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), титры анти-OvA IgE в сыворотке и БАЛ, выполняли гистологическое исследование ткани легких с окраской гематоксилин-эозином и Шифф-йодной кислотой с морфометрией Автор выражает искреннюю признательность Иольевой М Е за помощь при проведении морфологических исследований

Анализ влияния Бестима на показатели Т-клеточного иммунного ответа у больных хроническим гепатитом С (ХГС) проводился на клиническом материале

от больных, участвовавших в пилотном исследовании эффективности и безопасности совместного применения Бестима и Пегинтрона у больных ХГС 35 больных, инфицированных вирусом гепатита С 1-го генотипа в течение 48 недель получали терапию, состоявшую из пегилированного итерферона-а (Пегинтрон) и Бестима Периферическая кровь анализировалась до начала терапии и через 2, 12, 24 и 48 недель Цитофлюориметрически оценивали экспрессию маркеров CD3, CD4, CD8, CD25 на мононуклеарах периферической крови, а также изучали фитогемагглютинин (ФГА)-индуцированную продукцию ИЛ-2, ИЛ-4 и ИФН-у и липополисахарид (ЛПС)-индуцированную продукцию ИЛ-10 в цельной крови с помощью иммуноферментного анализа (тест-системы производства ООО «Цитокин», г Санкт-Петербург)

Статистическая обработка результатов выполнялась стандартными методами с помощью t критерия Стьюдента, критериев Вилкоксона и Манна-Уитни, критерия %2, точного критерия Фишера, показателя корреляции г Обработка данных проводилась в программах «Microsoft Excel» и SPSS v 13 0

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние Бестима на дифференцировку Т-лимфоцитов у интактных мышей

Ранее с помощью лимфоцитотоксического теста было показано увеличение процента клеток, экспрессирующих Т-клеточный маркер Thyl, в красном костном мозге мышей после введения Бестима [Пигарева H В , 2000] В настоящей работе эти эксперименты были воспроизведены, но экспрессия маркеров оценивалась с помощью проточной цитофлюориметрии, которая является более современным и достоверным методом Результаты подтвердили сделанные ранее наблюдения (рис 1, В)

Учитывая полученные данные об увеличении процента клеток, экспрессирующих Thyl, в костном мозге, что свидетельствует о стимуляции созревания предшественников Т-лимфоцитов, была также изучена экспрессия маркера стволовых гемопоэтических и плюрипотентных клеток c-kit (CD117) В экспериментах на SPF животных было выявлено небольшое, но статистически достоверное увеличение количества клеток, экспрессирующих этот маркер на клетках костного мозга через 24 часа после однократного и трехкратного введения Бестима

s

5 4

3 2 1

J-

■

¡Ж*

Контроль

Бестим 0,1 м кг) кг

Бестим 1,0 мкг>кг

-

—

, -

! ' 1 4'vLV

Контроль

Бестим 0,1

MVT^VLT

бестим 1,0 mvltFHÏ

i'nc 1. Экспрессия маркеров CD117 и Thyl на клетках костного мезга мышеи после введения Бестима (беспатогенные мыши Swiss Webster). Л. Процент клеток костного mo'î га, же премирующих CD117; 24 часы после трехкратного введения Бестим a. В. I Iponein клеток костного мозг% экспрессирующих Thy 1 ; 72 часа после трехкратного введения Бестима! ** различия с контролем достоверны, р<0.01.

в дозе 1 мкг/к1. что свидетельствует о том, что препарат способен стимулировать самые ранние этапы костномозгового лимфопоэза.

Далее нами было подробно изучено влияние введения Бестима на созревание Т-лимфощпов в тимусе. Было выявлено, что после введения Бестима тимоциты мышей более интенсивно пролифериругот в ответ на КонА, а также продуцируют больше ИЛ-2 при стимуляций митогеном (рие. 2 Л и ¡5). Данное наблюдение было очень хорошо воспроизводимым на мышах различных линий. В то же время достоверные воспроизводимые изменения субпопуля ционного состава тимоцитов были получены только при использовании бесматогенмых мышей. Было выявлено снижение процента «двойных позитивных» (С04+СР8+) клеток на 10-25% и увеличение на 5-10% двойных негативных и Си4(.'1)Х- тимоцитов и на 10-15% &Ь4+СЭ8- тимоцитов (рис. 2 С),

Мри этом интенсивность пролиферативного отвега на КонА положительно коррелировала с процентом зрелых форм тимоцитов (С1 )4+С1Ж, г "0.764. р"~0.0002) и отрицательно — с процентом «двойных положительных» клеток (г — -0.759, р=0.0003). Таким образом, полученные данные указывают на то, что повышение функциональной активности тимоцитов после введения Бестима связано с изменением их субпопуля! [ионного состава. Поскольку описанные изменения не сопровождались достоверным снижением общей клеточное™ тимуса, мы полагаем, что введение Бестима приводит, во-первых, к увеличению притока ранних

предшественников тимоцитов из костного мозга и тимус (увеличение популяций CD4-CD8- клеток) и во-вторых - к ускорению созревания промежуточных форм (CD4+CD8+) в зрелые CD4+ и CD8+ лимфоциты.

Не смо гря [¡и многочисленные попытки, пыявйть воспроизводимые изменения количества или процента CD3+CD4+ или CD3+CD8+ лимфоцитов н селезенке или периферической крови у интактных мышей после введения БесТима нам ис удалось, что свидетельствует о том, что введение препарата не Приводит к выраженным количественный изменениям субпопуляций периферических Т-клеток п отсутствие патологический изменений в организме.

70000 еоаоо

500СП I 40000

5

I зоооо 20000 юооо о

О Кон А 0.5 миг/мл

IKohA 1 икс/МП

4

3,5 3

ц

"I 2,5

lïr 2

сч

ri 1,5

s

1

0,5 0

Контроль Бестим 1 нкг/мл

Контроль Бестим 1 мкгУкг

С Контроль

Ьссти.м, 1 mkt/ki

Рис, 2. Изменен и н функциональной активности и субпопулнцяонного состава гимоцнтов iioc.it введения Бестима. I¿еепатогенные мыши BALB/c, 72 часа поел« трехкратного введения препарата.

А- КонА-ннлуцнрованиая пролиферация тимоцитов. В. КонА-иядуиированная продукция И JI -2 тимоцитами (Кон Л 1 мкг/мл),

С. Цитофл кюри метрический анализ экспрессии CD4 и СОЯ на гим оцтах (среднее±стандартное отклонение процента клеток, экспресеируюншх соответствующие маркеры), * различия с контролем достоверны, р<0,05.

2.0*0.7 81.2±З.Я

2Jiil.6 14-.5+2.Я

5,6*2,2 v О ■ ■

4,fcfcJ3-

CD4

Иммуномодулирующая активность Бестима при пероральном введении

Синтетические иммуномодуляторы на основе коротких пептидов в настоящее время используются практически только в формах для парентерального введения, поскольку быстро разрушаются в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) Поскольку в составе Бестима аминокислоты соединены атипичной у-связью, а также поскольку одна из этих аминокислот является левовращающей, мы предположили, что данный препарат будет существенно более устойчивым в ЖКТ и, возможно, будет проявлять свою иммуномодулирующую активность при введении per os Для проверки этого была проведена серия экспериментов, в которых Бестим вводили мышам в различных дозах п/о или в/б и сравнивали наблюдавшиеся эффекты Было обнаружено, что после перорального введения Бестима, также как и после внутрибрюшинного, у мышей наблюдается увеличение процента Thyl+ клеток в костном мозге, снижается процент CD4+CD8+ клеток и увеличивается доля CD4+CD8- клеток в тимусе, повышается КонА-индуцированная пролиферация и продукция ИЛ-2 тимоцитами Кроме того, наблюдаются описанные ранее для в/б введения изменения продукции цитокинов в культурах спленоцитов при стимуляции КонА, а именно - увеличение продукции ИЛ-2 и ИФН-у при неизменной или сниженной продукции ИЛ-4 Максимальный эффект наблюдался при п/о введении Бестима в дозах 0,1-1,0 мкг/кг и в/б введении в тех же дозах (табл 1)

Таблица 1

Изменения иммунологических показателей при внутрибрюшинном и пероральном введении Бестима в дозе 0,1 мкг/кг.

Показатель Группа животных

Контроль Бестим 0,1 мкг/кг в/б Бестим 0,1 мкг/кг п/о

Пролиферация тимоцитов, КонА 1 мкг/мл (имп/мин, ср зн ±ст откл ) 6314±432 14261±1400* 9754±1633 *

Продукция ИЛ-2 тимоцитами, КонА 1 мкг/мл (Ед/мл, ср зн ±ст откл) 0 1,40±0,38* 1,00±0,13*

Продукция ИЛ-2 спленоцитами, КонА 5 мкг/мл (Ед/мл, ср зн ±ст откл ) 50,2±0,1 93,4±18,3* 85,8±6,б*

Продукция ИФН-g спленоцитами, КонА 1 мкг/мл (нг/мл, ср зн ±ст откл ) 6 3±2,9 13,1±3,0 * 15,7±2,7 *

Продукция ИЛ-4 спленоцитами, КонА 5 мкг/мл (пг/мл, ср зн +ст откл ) 312±22 153±26* 230±19 *

* различия с контролем достоверны, р<0,05

Полученные результаты, а именно совпадение оптимальных действующих доз при в/б и п/о введении препарата, являются необычными, поскольку, как правило, биодоступность подобных препаратов при пероральном введении уступает таковой при парентеральном Для прояснения вопроса был проведен анализ фармакокинетических параметров Бестима при различных путях введения, который подгвердил, что биодоступность препарата при пероральном и внутрибрюшинном введениях практически одинакова и составляет у мышей около 50-60% В целом приведенные данные доказывают, что Бестим после введения per os поступает в системный кровоток и сохраняет свою иммуномодулирующую активность, что создает перспективы для разработки таблетированной формы препарата

Изучение механизмов протективного действия Бестима в модели экспериментальной туберкулезной инфекции.

Протективная активность Бестима при экспериментальном туберкулезе была показана ранее и объяснялась поляризацией иммунного ответа в направлении Т-хелперов 1-го типа, что проявлялось увеличением КонА-индуцированной продукции ИЛ-2 спленоцитами, а также разнонаправленными изменениями уровней ИФН-у и ИЛ-4 в сыворотке больных животных [Пигарева Н В , 2000] Мы предположили, что эффект Бестима в данной модели может также быть связан с активацией антиген-специфического Т-клеточного ответа Для изучения этого вопроса была воспроизведена модель генерализованного туберкулеза у мышей Бсстим в данном эксперименте вводился в/б или перорально

Результаты эксперимента подтвердили протективную активность Бестима как при внутрибрюшинном, так и при пероральном введении Наибольший эффект наблюдался в группах, получавших препарат в дозе 1,0 мкг/кг в/б или п/о В этих группах было зафиксировано достоверное снижение количества возбудителей в легочной ткани (рис 3 А), уменьшение индекса поражения легких, гистологический анализ продемонстрировал достоверное преобладание лимфоидных гранулем (в контрольной группе преобладали эпителиоидные (рис ЗВ и ЗС)) при минимальной выраженности альтеративного компонента воспаления и более часто, по сравнению с контролем, встречающихся лимфогистиоцитарных перибронхиальных инфильтратах

--г----1---—г ■■ ■ -

Контроль &ЁС1ЧМ

терапии 1 mm.pi 1 мкг7кглК>

Рис. 3, Протек! напое Н1К и;и I Нссшма к 1 и эксперименталь-

ной туберкулез вой инфекции.

Л, Количество М, шЬсгсЫок^ в ткани легких мышей, 33 день после начала терапии В. Эпителиондно-клеточная гранулема в ткани легкого, группа контроля герыпии. С, Лимфоидная гранулема в ткани легкого, группа, получавшая Бестим 1 мет/мкг/кг п/о, (В и С - 33-й день от начала терапии, "200, гематоксилин-эозин), * различия с контролем достоверны,

Изучение иммунологических параметров животных в течение эксперимента выявило на ранних сроках после курса Бестима стимуляцию функциональной активности тимоцитов и изменения субпопуляциоиного состава, схожие с наблюдавшиеся у интакгаых животных (рис, 4Л),

11а более поздних сроках в группам получавших Бестим в дозе 1 мкг/кг п/о или в/б. н селезенке было обнаружено достоверное увеличение процента клеток, экспрессирующнх маркеры активации С069 и С025 (рис. 4В). При том. чго интенсивность антиген-индуцированной пролиферации клеток селезенки оставалась на достаточна низком уровне (индекс стим\:1йвди не более 6,0) в« всех группах животных на 12 и 19 сутки от начала терапии, на 33-е сутки было отмечено резкое повышение этого показателя в группах, получавших Бестим (рие, 4 С). 1! то же время нам ве удалось выявить существенного увеличения ВСб-инду цирован ной продукции ИЛ-2 или ИЛ-4, что могло бы объяснить интенсивный пр олифе рати в ныЙ ответ

(данные не представлены). Продукция ИФ11-у культурами Йпленоцитов от отмеченных групп животных имела даже тенденцию к снижению по сравнению с группой кон I роля терапии, однако помимо этого было выявлено достоверное снижение ВСО-индуцированной продукции ИЛ-10 при умеренном повышении продукции ИЛ-12 (Рис. 41)). Известно, что ИЛ-12 один т важнейших цп го кип он. обеспечивающих поляризацию Т-хелперов в направлении Тх-1. 15 то же время. ИЛ-] О цитокип. обладающий мощными противовоспалительными свойствами, продуцируемый у мышей Т-хелперами 2-го типа, регул я горными ® клетками п макрофагами. Активация макрофагов после видения Бесгима была продем о н сгрирована ранее [Заболотных М.В. и соавт,, 2003] и также наблюдалась

А

35000 ЗЙ100

гьооа ¡15000

и Спонтанная ■ кона 0,5 мкг/мл

1 Мсг.'кг, н.'ь 1 М,-,Г п/о

Бестии

а 'в

IIя и !|| 10 !5| в

х а м

55Ё

С] С069 Я С0?5

т.

а

ИнпктиысКонтропь Веским Ввстим 14Р1ИИИ ' ММГ/КГ 1 МКëà и/6 п/о

30

Э1 I

е 20 £ ? 1®

Интактныемыши

- Контроль терапии Вес тин 1,0 мкг/кг в®

- Бестим 1,0 мкг.'кг лЮ

О ИЛ-10 Ш ИЛ-12

12 сут. 19суг. ЗЗсут.

Срок после начала терапии

Интактныв140"1 воль тернпии

Бостим Еестим 1 мкг/кг 1 мкг!кг

Ы П.Л

!'нс. 4. Влияние Бестищв па иммунологические параметры в модели генерализованной туберкулезной ннфекпин. А. Спонтанная и КопА-индуцированная пролиферация тимоцвтов (ими/мин), 5 день от начала терапии Бсстимом. В. Экспрессия марке рои активации ГП69 и С025 па спленшштах мышей (%), 12 сутки после начала терапии. С. Динамика ВСО-индуцированной пролиферации спленоцитов, индексы стимуляции. О. Продукция ИЛ-10 и ИЛ-12 культурами спленоцитов при стимуляции ВСО, иг/мл. * различия с группой контроля терапии достоверны, р<0.05.

нами в данном эксперименте Не исключено, что описанные выше изменения продукции цитокинов могут быть следствием действия Бестима на дендритные клетки и макрофаги, что косвенно также способствует поляризации Т-хелперного ответа в направлении Т-хелперов первого типа

Изучение эффектов Бестима в модели экспериментальной аллергической астмы

Поскольку Бестим воспроизводимо демонстрирует иммуномодулирующую активность, проявляющуюся в поляризации Т-клеточного ответа в направлении Тх-1, было важно исследовать действие препарата в модели Тх-2-опосредованной патологии, в качестве которой была выбрана модель аллергической астмы В этих экспериментах Бестим вводили коротким курсом после парентеральной сенсибилизации мышей, но до аэрозольной экспозиции, что моделировало использование препарата для профилактики обострения аллергического процесса Было выполнено 2 серии опытов с использованием животных в возрасте 6-8 и 18-20 недель в начале эксперимента, соответственно Результаты, полученные на животных разных возрастов, были не совсем идентичны, что, вероятнее всего, отражает значительно более высокую вариабельность тяжести протекания аллергических процессов у более старых мышей В опытах на молодых животных в группах, получавших 0,1 и 1,0 мкг/кг Бестима, было выявлено уменьшение общей клеточности БАЛ за счет всех популяций лейкоцитов, в том числе, эозинофилов (рис 5А), а также снижение титров антиген-специфических ^Е в сыворотке крови и БАЛ (рис 5В) Гистологическое исследование ткани легких выявило интенсивную перибронхиальную и периваскулярную лейкоцитарную инфильтрацию, а также выраженное увеличение процента слизеобразующих бокаловидных клеток в эпителии крупных и средних бронхов у животных, не получавших терапии Морфометрический анализ показал достоверное снижение процента бокаловидных клеток в группах, получавших 0,1 мкг/кг Бестима (медиана - 15,2%) по сравнению с контрольной группой (медиана - 39,3%), а также достоверное уменьшение инфильтрации вокруг бронхов и тенденцию к уменьшению периваскулярной инфильтрации в обеих группах, получавших Бестим, по сравнению с контролем

2.5

« о 2 С5 С

¡1.5

с;" 3 1

1 :

а> 0,5 £

0

□ Общая клеточность П Моноциты/макрофаги ■ Лимфоциты Я Эозинофипы

г

Бестим Бестим

0,1 мкг/кг 1 м кг/к г

Я Сыворотка □ БАЛ

Рис. 5. Влияние терапии Бестимом на клеточность п цитологический состав бронхоальвсолярного лаважа (БАЛ) (А) и на уровни анти-ОвА IцК в сыворотке н БАЛ (В). * различия по сравнению с контрольной группой достоверны, р<0.05.

Контропь

Бестим, Бестим, 0,1 мкг/кг 1 мкг/кг

Таким образом, использование Бестима в модели экспериментальной аллер] и ческой аст мы привело как к снижению интенсивности аллергического иммунного ответа на системном уровне (снижение титров ^Е в сыворотке), так и к подавлению его местных проявлений (уменьшение количества клеток в БАЛ. в особенности, эозинофнлов, снижение воспаления и проницаемости бронхов, уменьшен!«! количества слизеобразующих клеток). Поскольку в основе патогенеза всех этих процессов лежит активность Т-хелпсров 2-го типа и производимых ими цитокниов (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-13). то, учитывая полученные рапсе результаты об эффектах Бестима у здоровых мышей, следует предполагать, что механизм действия препарата при экспериментальной астме связан с подавленней поляризации Г-к.теток н направлении Тх-2.

Влияние Бестима на количественные и функциональные показатели Т-лимфоцитову больных хроническим гепатитом С (ХГС).

Поляризация Т-клеточного иммунного ответа наблюдалась при введении Бестима интактным животным, ее признаки выявлялись в инфекционной модели туберкулезной инфекции, характеризующейся снижением Тх-1 ответа, а также в модели аллергической патологии, в основе которой лежит избыточная поляризация Т-лимфоцитов в направлении Тх-2 В то же время возможность поляризации иммунного ответа с помощью данного препарата в клинике не исследовалась достаточно широко В связи с этим был проведен анализ динамики абсолютного и относительного количества CD3+, CD4+, CD8+ и CD25+ лимфоцитов, а также продукции цитокинов после стимуляции культур цельной крови митогенами у больных ХГС, получавших Бестим в сочетании с пегилированным интерфероном-а (Пегинтрон®) в течение 48 недель (табл 2)

Как видно из таблицы у больных наблюдались незначительные изменения относительного содержания CD3+, CD4+ и CD8+ клеток Повышение экспрессии CD25+ отмечалось ранее как эффект Бестима при действии на мононуклеары человека in vitro [Пигарева Н В, 2000] и также наблюдалось у обследованных больных ХГС Анализ продукции цитокинов выявил явную тенденцию к повышению продукции ИЛ-2 и ИФН-у при незначительном увеличении продукции ИЛ-4, при этом условное соотношение ИФН-у/ИЛ-4 также имело тенденцию к повышению Продукция ИЛ-10 незначительно снижалась на ранних сроках и была достоверно ниже исходного уровня в конце терапии Следует отметить, что анализ современной литературы, описывающей изменения продукции цитокинов у больных ХГС на фоне интерферонотерапии, не позволяет связать наблюдавшуюся в данном исследовании их динамику с терапией пегилированным интерфероном [Bergammi et al, 2001, Furusyo et al, 2005, Mammaev S N, 2002, Neau-Cransac et al, 2005, Panasiuk et al, 2004, Par et al, 2002] Клинический эффект от проведенной терапии в данном исследовании был незначительным хотя доля больных с неопределяемым уровнем РНК вируса в крови по окончании терапии (58,8%) была достоверно выше, чем при монотерапии Пегинтроном® (39%, р=0 03), однако через полгода после окончания терапии (20%) не отличалась от таковой у пациентов, получавших только Пегинтрон® (14%, р=0 316) [Lindsay et al, 2001]

Таблица 2

Показатели Т-клеточного иммунного ответа у больных ХГС на фоне терапии Вестимом и Пегинтроиом®

Показатель Неделя терапии

0 2 12 24 48

CD3+ лимфоциты, % (ср знач ±ст откл ) 64,8±13,4 68,5±9,0 * 66,5±11,1 66,4±9,4 63,3±11,9

CD4+ лимфоциты, % (ср знач±стоткл) 36,4±9,7 37,9±8,0 36,3±10,2 37,1±9,9 34,3±9,8

CD8+ лимфоциты, % (ср знач±стоткл) 27,6±7,3 29,7±7,4 28,5±7,4 29,3±7,5 30,3±7,5

CD25+ лимфоциты, % (ср знач±стоткл) 2,9±1,4 3,9±1,7 ** 2,7±1,4 2,7±1,8 4,0±2,0 А

ФГА-индуцированная продукция ИЛ-2, пг/мл (ср знач ±ст откл) 28,6±20,6 40Д±28,7 * 38,1±27,1 43,0±30,3 38,8±21,7 *

ФГА-индуцированная продукция ИФН-у, пг/мл, медиана (диапазон) 351 (96-2222) 477** (113-2548) 395 (17-1347) 566* (137-1559) 435 (83-2369)

ФГА-индуцированная продукция ИЛ-4, пг/мл (ср знач ±ст откл) 89,6±52,3 101,1±60,5 110,5±69,6 ** 101,3±62,7 96,8±50,0

LPS- индуцированная продукция ИЛ-10, пг/мл, медиана (диапазон) 145 (34-479) 132 (0-615) 102 (0-430) 150 (0-501) 73* (0-464)

Соотношение ИФН-у/ИЛ-4,уел ед,медиана (диапазон) 3,11 (0,9-185,4) 3,63 (0,86133,51) 3,12 (0,13151,92) 5,29 (1,19-84,04) 4,86 (0,66-48,28)

* различия по сравнению со уровнем до терапии достоверны, р<0,05 и ** р<0,01

Тем не менее, анализ иммунологических параметров пациентов позволил продемонстрировать, что при использовании Бестима в клинической ситуации его иммуномодулирующая активность также проявляется в реципрокных изменениях уровней митоген-индуцированной продукции Тх-1 и Тх-2 цитокинов Таким образом, становится обоснованным и целесообразным исследование клинической эффективности Бестима при заболеваниях, в основе которых лежит дисбаланс Т-хелперных клонов с недостаточной активностью Т-хелперов первого гипа и/или избыточной активацией Т-хелперов второго типа

ВЫВОДЫ

1 Бестим увеличивает долю ранних (c-kit+) предшественников гемопоэза в костном мозге экспериментальных животных, ускоряет дифференцировку Т-клеток в тимусе от «двойных негативных» незрелых форм к CD4+ и CD8+ зрелым Т-лимфоцитам, вызывает поляризацию зрелых форм в направлении Тх1

2 При пероральном введении мышам Бестим в полном объеме обладает иммуномодулирующей активностью, проявляющейся в ускорении созревания и в усилении функциональной активности Т-лимфоцитов

3 Механизм протективного действия Бестима при экспериментальном туберкулезном процессе у мышей связан с активацией Т-клеточного антиген-специфического иммунного ответа с подавлением BCG-индуцированной продукции ИЛ-10 и увеличением продукции ИЛ-12

4 В модели аллергической бронхиальной астмы у мышей Бестим снижает эозинофилию бронхоальвеолярного лаважа, титры антиген-специфических IgE и долю бокаловидных слизеобразующих клеток в эпителии бронхов

5. Иммуномодулирующее действие Бестима при хроническом вирусном гепатите С у людей проявляется в поляризации иммунного ответа в направлении Txl, что выражается в увеличении продукции ИЛ-2 и ИНФ-у и снижении продукции ИЛ-4 и ИЛ-10 клетками периферической крови in vitro

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Петров А.В , Пигарева H В , Котов А Ю , Колобов А А, Симбирцев А С Изучение влияния Бестима на дифференцировку Т-лимфоцитов у мышей // Цитокины и Воспаление -2007 -Т 6 -№3 -С 25-29

2 Бестим в комплексной терапии туберкулеза легких / H В Заболотных, Т И Виноградова, ЛА Скворцова, А А Колобов, A.B. Петров, H В Пигарева, И Я Сахарова, Г Ю Васильева, под ред Ю H Левашева и А С Симбирцева - СПб «Борей-Арт», 2007 - 68 с

Тезисы докладов:

1 Петров А.В, Пигарева H В , Симбирцев А С Изучение действия иммуномодулятора Бестим при пероральном введении на антиген-специфический иммунный ответ // Журнал АДАИР -2005 -Т6 (Прил 1) - С 251

2 Петров А.В , Пигарева H В , Котов А Ю , Виноградова В И , Заболотных H В , Витовская M Л , Колобов А А, Симбирцев А С Биологические свойства нового иммуномодулятора «Бестим»//Медицинская иммунология -2006 -Т8 -№2-3 -С 455

3 Петров AB., Пигарева H В , Котов А Ю , Колобов А А, Симбирцев А С Влияние «Бестима» на поляризацию Т-хелперных лимфоцитов у мышей // Медицинская иммунология - 2004 - Т 6 - №3-5 - С 244-245

4 Петров A.B., Пигарева H В , Котов А Ю , Колобов А А , Симбирцев А С Влияние иммуномодулятора Бестим на лимфопоэз и поляризацию иммунного ответа // Вестник Уральской медицинской академической науки -2006 -№3-1(14) - С 189-191

5 Kolobov А , Petrov A., Trofîmov А, Trefflov V , Tuthill С Pharmacokinetic Study of Gamma-D-Glutamyl-L-Tryptophan // Journal of Peptide Science -2006 -V 12 - S 1 -P 578

6 Pctrov A., Pigareva N , Kotov A, Vinogradova T, Zabolotnyh N, Tuthill С , Kolobov A, Simbirtsev A SCV-07 Peroral Formulation Protects Mice Against Expenmental // Proceedings of FOCIS 6th Annual Meeting (June 1-5,2006, San Francisco) Su 51

Подписано в печать 06 09 07 Формат 60*84 1/16 Бумага офсетная Печать офсетная Печ л 1,0 Тираж 100 экз Заказ 80

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства СПбГЭТУ "ЛЭТИ"

Издательство СПбГЭТУ "ЛЭТИ" 197376, С -Петербург, ул Проф Попова, 5