Автореферат и диссертация по медицине (14.00.02) на тему:Стимуляция посттравматической регенерации периферического нерва в зоне диастаза

На правах рукописи

□03466176

СЕРГЕЕВ СЕРГЕИ МИХАИЛОВИЧ

Стимуляция посттравматической регенерации периферического нерва в зоне диастаза

(экспериментально-морфологическое исследование) 14.00.02 - анатомия человека

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

0 2АПР2СС9

Саранск-2009

003466176

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Научные руководители:

- доктор медицинских наук, профессор И.И.Марков

- заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор В.М.Чучков Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В.Н.Николенко доктор медицинских наук, профессор Е.Р.Павлович Ведущая организация:

ФГУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» г. Уфа.

Зашита диссертации состоится « $ » Мйя^ 2009г. в 10 часов на заседании диссертационного Совета Д. 212.117.01 при ГОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П.Огарева» по адресу: 430000, г.Саранск, ул. Большивисткая, 68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Мордовский государственный медицинский университет» по адресу: 430000, г.Саранск, ул. Большивисткая, 68.

Ученый секретарь

диссертационного Совета

доктор биологических наук, профессор

В.П.Балашов

Общая характеристика работы Актуальность темы

Восстановление повреждённых периферических нервов является одной из сложных задач современной реконструктивной микрохирургии (Губочкин

H.Г., 2000; Щудло H.A., 2006; Голубев В.Г, 2008; Allan С.Н.,2000; Choi В.Н. et. al. 2004). Медицинское и социальное значение лечения травматических повреждений периферических нервов трудно переоценить. Они, по данным различных авторов, составляют от 1,5 до 6,0 % всех травм конечностей (Григорович К.А., 1989; Дидидзе М.Н., 2005; Noble I. et al., 1998; Bontioti E.N., 2005). Однако, несмотря на достижения микрохирургической техники (Береснев В.П., 1998; Борода Ю.И., 2000; Дудник А.П., 2004), функциональные результаты восстановление периферических нервов остаются неудовлетворительными в 35 - 50 % случаев (Мещерякова Т.И.; 199б; Миронов С.П., Крупаткин А.И., 2005; Hall S.M., 2001; Ruijs A. ef al., 2005). Альтернативным путём прогресса хирургии периферических нервов считается разработка бесшовных методов восстановления их целостности с применением проводников и различных органических клеев (Scaravell F., 1984; Archibald P., 1991; Danielsson P., 1996; Maragh H., et al. 2005). Множество различных материалов для изготовления проводников тестировалось и тестируется в настоящее время в экспериментальных условиях (Braun R.M., 1964; Chui D.T., 1982; Ohbaynshi К. et. al., 1996; Politis M.J. 2006). К сожалению, практически нет ни одного материала, который бы соответствовал критериям, предъявляемым к апло-гетерографтам (Madison R.D., 1987; Krentzberg G.N., 1996; Kumar A. et al., 2007).

Цель работы - экспериментально-морфологическое обоснование новых технологий для стимуляции посттравматической регенерации периферического нерва в зоне диастаза. Задачи работы:

I. Создать новый тип гетерографта из очина птичьего пера;

2. разработать технологию устранения значительных диастазов периферических нервов;

3. оценить влияние материала «Лит Ар» на формирование регенерата в зоне диастаза седалищного нерва экспериментальных животных;

4. изучить морфофункциональное состояние нейроцитов спинномозговых узлов экспериментальных животных в процессе восстановления непрерывности оперированного седалищного нерва.

Научная новизна работы.

1. Впервые дано морфофункциональное обоснование эффективности использования для тубулизации периферических нервов кератинового биотрансформирующего гетерографта из очина птичьего пера.

2. Впервые установлено, что наноразмерный композитный материал «Лит Ар» стимулирует регенерацию миелиновых нервных волокон в зоне диастаза, увеличивает в регенерате количество нейролеммоцитов и макрофагов.

3. Впервые показано, что в основе стимулирующего влияния материала «Лит Ар» на посттравматическую регенерацию периферического нерва в зоне диастаза лежит его способность индуцировать ангиогенез.

4. Впервые обнаружено, что одновременное использование материала «Лит Ар» и кератинового гетерографта способствует выживанию аксотомированных нейроцитов спинномозговых узлов.

Практическая значимость работы.

Применение кератинового гетерографта позволяет в эксперименте изучать процесс посттравматической регенерации в зоне диастаза поврежденных черепно-мозговых нервов. Отсутствие негативных реакций организма экспериментальных животных на имплантацию кератинового гетерографта позволяет рекомендовать его для проведения клинических испытаний. Разработанная технология тубулизации поврежденного периферического нерва с использованием материала «Лит Ар» позволяет восстанавливать в эксперименте резецированный фрагмент седалищного нерва длиной 0,5 см в течение 90-та суток. Результаты исследования внедрены в учебный процесс на кафедрах анатомии человека, гистологии и эмбриологии, общей патологии ГОУ ВПО «Самарский государственный

медицинский университет», кафедре анатомии человека ГОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская академия». Технология устранения значительных диастазов поврежденных периферических нервов у домашних животных применяется в ООО «Ветеринарная клиника «Друг» г.Самары с 2007 года.

Положения, выносимые на защиту:

1. кератиновый гетерографт отвечает требованиям, предъявляемым к материалам, используемым для тубулизации периферических нервов и отличается гарантированной вирусной и бактериальной безопасностью и возможностью длительного хранения в обычных условиях;

2. разработанная технология устранения значительных диастазов повреждённых периферических нервов является простой, доступной и эффективной;

3. материал «Лит Ар» стимулирует регенерацию миелиновых нервных волокон, увеличивает в регенерате количество нейролеммоцитов и макрофагов, а так же индуцирует ангиогенез.

Апробация работы.

Результаты исследования доложены и обсуждены на заседаниях Самарского и Удмуртского отделений ВрНО АГЭ (Самара, 2003, 2006, 2008; Ижевск, 2007), на V Международной конференции, посвященной 450-летию г. Астрахани, 2007), на Однораловских морфологических чтениях (Воронеж, 2008).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Объём и структура диссертации.

Диссертация изложена на 129 страницах машинописи. Состоит из введения, обзора литературы, III глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Список литературы включает в себя 283 источников, из них 92 -отечественных и 181 - зарубежных.

Содержание работы Материал и методы исследования Материал исследования

Эксперименты выполнены на белых беспородных половозрелых крысах (п=37). Животные до и в период проведения экспериментов содержались в виварии Самарской ветеринарной клиники «Друг» в соответствии с правилами по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986) и соблюдением «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приказ Минвуза от 13.11.1984 г. № 724).

Операции по формированию диастаза седалищного нерва проводились на левой задней конечности животных (п=27). Правая не оперированная конечность служила контролем.

До проведения основных экспериментов по устранению диастаза нерва изучены ответные реакции крыс на имплантацию гетерографта в заднюю группу мышцы бедра (п=10).

Гистологическому и электронномикроскопическому исследованию подверглись: 1) зона диастаза оперированного седалищного нерва; 2) фрагменты интактого нерва оперированного животного; 3) спинномозговые узлы (Ь4 - Ь;) оперированной и контралатеральной сторон; 4) кожа передней брюшной стенки; 5) паховые и брыжеечные лимфатические узлы; 6) стенка тонкой кишки; 7) тимус; 8) селезенка; 9) мягкая мозговая оболочка. В качестве исходного материала для создания гетерографтов использованы очины куриных перьев диаметром от 3,0 до 5,0 мм и наноразмерный композитный материал «Лит Ар».

Технология получения кератиновых гетерографтов

Перо птиц состоит в своей проксимальной части из полого очина, который помещается в кожном влагалище. Очин продолжается в плотный ствол, по бокам которого располагается опахало. В полом очине располагаются роговые колпачки - отмершие, ороговевшие сосочки кожи. Для изготовления гетерографтов использовались полые очины, подвергнутые обработке по разработанной технологии: I) освобождение от пушкового покрова путем механической обработки; 2) уменьшение толщины стенки до 0,05 - 0,1 мм; 3) обработка в 10% растворе салициловой кислоты; 4) стерилизация; 5) соосаждение материала «Лит Ар» на внутренней поверхности очина пера. Подготовленный для проведения последней операции (соосаждения материала «Лит Ар») очин представлял собой полую мягкую эластичную трубку с высокой проницаемостью стенки для растворов.

Проницаемость стенки очина определялась с помощью следующей методики. Трубка, закрытая герметично с одного конца, заполнялась с другого конца 0,25% раствором азотнокислого серебра и закрывалась герметично. Затем она помещалась в раствор гидрохинона. Восстановление серебра из раствора происходило в течение 20-30", после чего трубка окрашивалась в коричневый цвет. Интактный же очин мало проницаем для раствора азотнокислого серебра: восстановление серебра на его наружной стенке происходит в течение 45-60 мин. Резкое увеличение проницаемости очина после его обработки, связано с изменением его гистоструктуры и значительным расширением его межклеточных промежутков.

Использованный для получения гетерографта материал «Лит Ар» представляет собой синтезированный полимер - солевой композит, полученный путем встречной диффузии ионов А13", ОН1, РО}~ в

объеме коллагена или альгината (Литвинов С.Д., 2007). При морфологическом анализе материала «Лит Ар» установлено достаточно равномерное распределение кристаллов соли вокруг коллагеновых волокон. Для идентификации однородности неорганического компонента, т.е.

отсутствие других, кроме гидроксилапатита соединений или соединений с коллагеновыми цепями, проводился РФ А, с помощью которого было показано наличие в материале «Лит Ар» именно гидроксилапатита. Одной из главных особенностей материала «Лит Ар» является его способность индуцировать ангиогенез в зоне дефекта (Марков И.И. с соавт., 2003), без которого невозможен процесс регенерации.

Методика операции

Операции проводились в условиях операционной ветеринарной клиники. Премедикация - атропин (0,05 мг/кг в/м), рометар (10 мг/кг в/м). Наркоз - диприван (2,0 мг/кг в/б) и рометар (10 мг/кг в/б). Проекционным доступом по задней конечности бедра обнажался седалищный нерв. Он пересекался с образованием диастаза 0,5 см. В качестве проводника растущих аксонов использовались гетерографты из очина перьев кур.

Гетерографт фиксировался к эпиневрию центрального и периферического концов пересеченного нерва хирургическим полимерным клеем (Сиротинкин Н.В., 2005). Гемостаз. Послойные швы на рану бедра. Сроки наблюдения - 15, 30, 45,60, 90,120 суток.

Методы исследования

Фрагменты оперированного и интактого седалищного нерва изучались на светооптическом и электронномикроскопическом уровнях.

Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм окрашивались гематоксилином и эозином, по Ван Гизон, метиленовым синим, импрегнировались по Бильшовскому - Грос.

Микрососудистое русло выявлялось интрасосудистой импрегнацией по Ранвье. Микрофотографирование препаратов проводилось через микроскоп МБИ-15 цифровой фотокамерой. Часть материала фиксировалась в 2,5% растворе глютаральдегида на 0,1 м фосфатном буфере, дофиксировалась в 1% растворе осмиевой кислоты и заключалась в эпонаралдит. Из этих блоков готовились срезы толщиной 1 мкм и ультратонкие срезы. Первые из них

окрашивались толуидиновым синим, вторые просматривались и фотографировались на электронном микроскопе Hitachi 300.

Критериями эффективности регенерации оперированного нерва служили: 1) количество миелиновых волокон и нейролеммоцитов в восстановленном фрагменте седалищного нерва; 2) состояние белоксинтезирующей системы нейролеммоцитов; 3) количество переживающих нейроцитов в спинномозговых узлах (L4 - L5); 4) структурные изменения в камбаловидных мышцах; 5) восстановление кожной болевой чувствительности (Крыжановский Н.Г. с соавт., 1991). У животных, подвергнутых операции, в различные сроки после нее проводили ламиюктомию, выделяли спинномозговые узлы (L4 - L5) с обеих сторон, фиксировали их в 10% растворе формалина, обезвоживали и заливали в парафин, готовили серийные срезы толщиной 5-7 мкм и окрашивали их гематоксилином и эозином, метиленовым синим. Подсчитывали количество нейроцитов с видимыми ядрышками и рассчитывали отношение количества перикарионов на стороне операции к количеству перикарионов на контралатеральной стороне. Часть препаратов спинномозговых узлов импрегнировали азотнокислым серебром по Бильшовскому-Грос. Одновременно с забором фрагментов седалищного нерва на обеих задних конечностях крыс выделяли камбаловидные мышцы и готовили из них парафиновые срезы, окрашенные гематоксилином и эозином и по Ван Гизон.

Морфологическому анализу были подвергнуты нейролеммоциты из зоны операции седалищного нерва. Для морфометрии выбирались только те клетки, у которых срез прошел через ядро. Для комплексной оценки их состояния вычислялся коэффициент функциональной активности белоксинтезирующей системы (КБС). В несекретирующих, долгоживущих клетках (нейроцит, глиоцит) функциональные белки образуются на свободных полисомах. Именно с ними связан синтез специфических для нейроцитов белка S-100 и нейроспецифической енолазы. Использовали формулу с изменениями внесенными в нее (Селякин С.П., 1996):

КБС = + , где

Кфр-100 10

КБС - коэффициент функциональной активности белоксинтезирующего аппарата нейролеммоцита;

БуЭ - площадь поверхности мембран шероховатой эндоплазматической сети (ЭПС);

КФР - коэффициент фрагментации цистерн ЭПС (вычисляется из соотношения количества замкнутых цистерн к площади их поверхности);

К,1'3 - степень гранулированности мембран ЭПС на 1 мкм длины мембран (среднее из 5 измерений);

Мпр - количество полирибосом на 1 мкм2 площади нейроплазмы (среднее из 5 измерений);

- количество монорибосом на 1 мкм2 площади нейроплазмы (среднее из 5 измерений);

100, 10, 1 - условные коэффициенты, учитывающие пропорциональность вклада органелл в процессы внутриклеточного синтеза белка.

У животных экспериментальной группы проводилась морфометрия микрососудистого русла оперированного седалищного нерва, а так же вычислялись показатели, демонстрирующие морфофункциональные изменения микроциркуляции: 1) изменения формы микрососудов; 2) эмиграция форменных элементов крови, образование паравазальных инфильтратов; 3) изменения реологии крови: слайд-синдром, микротромбоз.

Частоту каждого признака вычисляли в процентах, подсчитывая эти признаки в 200 полях зрения при увеличении микроскопа 400х.

Статическая обработка всех полученных морфометрических данных проводилась с определениях средних показателей (М) и средней стандартной ошибки (±ш), а так с учетом групповых различий исследуемых показателей. В качестве достоверных показателей выделялись те отличия, ошибки которых не превышало 5% (Р < 0,05).

Результаты исследования и их обсуждение

Современные методы восстановительных операций на периферических нервах не позволяют улучшить ориентацию регенерирующих нервных волокон в зоне анатомического диастаза (Gruber H., 1993; McDevitt L. et. al., 1987; Saur К. et. al., 2004). До настоящего времени еще значительное число авторов (Береснев В.П., 1998; Миронов С.П., 2005; Ибрагимов Ш.И., 2006; Diao Е., Vannuyen Т., 2000) считают целесообразным применение микрохирургической аутонейропластики при размерах диастазах нерва от 1,0 до 7,0 см. В качестве имплантата используется фрагмент донорского нерва, отличающийся постоянным анатомическим положением, легко и быстро выделяемый и не имеющий ветвей (Галич С.П., 1987; Krentzberg G.N., 1996; Hart A.M., 2003). Чаще всего в клинических условиях аутонейропластика оказывается невыполнимой по многим условиям. Что касается аллопластики с использованием консервированных имплантатов, то еще в 1972 году специальной комиссией были высказаны серьезные сомнения относительно перспективы этого метода лечения (Kuhtendah К., 1972).

Альтернативный вариант устранения диастазов поврежденных нервов -использование проводников (трубок) из различных материалов является далеко не новым. Однако в настоящее время именно на него возлагаются большие надежды. Как на способ, позволяющий решать проблему восстановления поврежденных фрагментов периферических нервов.

Нами в качестве исходного материала для создания такого проводника были использованы очины перьев кур. Ранее птичьи перья были использованы Е.М.Дмитриевой и М.М.Душкиной (1969) для соединения артерий при формировании торацико-коронарного анастомоза в эксперименте на собаках и П.И.Поляковым (1975) для фиксации костных отломков не только в эксперименте, но и в клинике. Авторы сообщали о хороших результатах использования птичьих перьев, однако в дальнейшем сообщения о развитии этого направления как в ангиологии, так в травматологии в литературе отсутствовали. И в первой, и во-второй

публикациях приводились данные только о механической обработки перьев и их стерилизации перед введением в организм животных и людей. Поскольку перья птиц не подвергались специальной обработки, то сроки их биодеградации в тканях быличрезвычайно большими: более 16-ти месяцев в стенке артерий и 5-ть - 7-мь месяцев в .костномозговом канале. И тем не менее, в обеих публикациях сообщалось о том, что гггичьи перья, находясь много месяцев в тканях животных (собак) и постепенно биодеградируя, не вызывали реакции отторжения и не инкапсулировались как инородные тела.

В работе мы использовали очины перьев кур с внутренним диаметром от 1,0 до 5,0 мм и длиной до 50,0 мм. С наружной поверхности очина удалялись пушковые волосы и уменьшалась толщина стенки до 0,05 - 0,1 мм. Последующая химическая обработка очина изменяла гистоструктуру его стенки и делала ее высокопроницаемой для растворов, а сама трубка становилась мягкой и эластичной. Полученные в работе данные о быстрой биодеградации кератиновой трубки в задней группе мышц бедра экспериментальных животных, об отсутствии местной и общей реакции организма на ее имплантацию послужили основанием для использования кератиновых гетерографтов для устранения диастаза резецированного седалищного нерва.

Кератиновые гетерографты имеют значительные преимущества перед известными патентованными проводниками. Так, интересное техническое решение об использовании в качестве биологического футляра артерий, находящихся в зоне поврежденного нерва (Хитров Ф.М., 1977), имеют крайне ограниченное применение из-за возможных ишемических повреждений и самого нерва, и иннервируемых им мышц.

Силиконовые трубки (Lundberg G., 1982, Diaz-Flores L., 1995) требуют повторной операции для их удаления, коллагеновые трубки (Collin К., 1984; Arvidsson J.A., 1986; Archibald S.D. et al., 1989; Spektor M., 2007) требуют сложной технологии изготовления, а аутовенозные и аутоартериальные

трубки (Чумасов Е.И., 1986; Weiss P., 1944; Jde С., 1996) оказались малоэффективными в эксперименте и в клинику не были внедрены.

Твердый кератин, из которого состоят очины перья птиц, включает в себя следующие химические элементы: углерод (50%), кислород (21%), водород (7%), азот (14%), серу (3%), фосфор (0,1%), кальций (1,9%), кремний (1%), цинк (1%) и железо (7%) (Schroeder H.A., 1968).

Эти элементы, выделяющиеся при биодеградации кератина, несомненно стимулируют образование регенерата между центральным и периферическим концами резецированного седалищного нерва и способствуют формированию эпиневральной оболочки в зоне диастаза. Наши данные находят подтверждение в работе A. Kumar et. al (2007), в которой для регенерации периферических нервов был использован белок кератин. В эксперименте авторам удалось стимулировать процесс восстановление резецированного фрагмента седалищного нерва длиной - 4,0 мм у мышей через 6 недель после заполнения диастаза кератиновым гелем. Кератиновый же гель был получен путем специальной обработки человеческих волос. Авторы считают, что кератин человеческих волос стимулирует активность нейролеммоцитов, которые и запускают процесс посттравматической регенерации периферического нерва.

В качестве наполнителя проводников наиболее часто используется коллаген (I и IV типов) (Chen H.H., 1994; Chamberlain L.J., 1998; Spector M. 2007). Причем в патенте M.Spector (2007) делается акцент на очень важную деталь: материал наполнителя должен состоять из коллагеновых волокон, имеющих продольную ориентацию относительно оси трубки.

Нами в качестве наполнителя кератинового гетерографта применяется наноразмерный материал «Лит Ар» (Литвинов С.Д., 2007). Для его получения используется коллагеновая губка, паспортизированная, разрешенная МЗ РФ к использованию в медицинской практике, и гидроксофосфат кальция (гидроксоапатит), так же зарегистрированный МЗ РФ как фармпрепарат.

Коллагеповые волокна материала «Лит Ар», следующие параллельно оси гетерографта, служат направляющей матрицей для растущих из центрального конца нерва аксонам. Именно поэтому регенерирующие нервные волокна имеют характерный для нормы волнообразный параллельный ход, они не образуют пучков в виде «плетеной косы» (Чумасов Е.И., 1986), они не образуют спиралей Перрончито (Fride R.L., 1978; Sladky J.T. et al., 1983; Eppley J.G., 1988), a на концах растущих аксонов не формируются патологические невромы (Панченко Д.И., 1966; Борода Ю.И., 2000; Kanig Е., 1967; Thoraas Р.К., 1978). Через 15-ть суток после операции в просвете гетерографтов наблюдается фрагментарная биодеградация материала «Лит Ар» и формирование клеточного регенерата. Большая часть клеток - это малодиффенцированные структуры. Среди них наиболее четко определяются нейролеммоциты, ультраструктурная организация которых соответствует таковой нейролеммобластов. Быстрое появление в регенерате большого числа малодифференцированных нейролеммоцитов свидетельствует о том, что они выселяются из центрального конца резецированного нерва. Затем они перемещаются по ходу коллагеновых волокон и попадают в благоприятное для их дифференцировки микроокружение. Эти данные полностью соответствуют наблюдениям целого ряда авторов (Reid R.L., 1978; Lundborg G., 1981; Heldenbramol С., 1987; Breekneel J.E., 1996).

Применение в гетерографте наполнителя - материала «Лит Ар», способствует пролиферации нейролеммоцитов. Это - одно из существенных отличий разработанной нами технологии от других технических решений (Dellon A.L., 1988; Spector M., 2007; Danielson N. et al. 2007).

Это связано с тем, что нейролеммоциты, с одной стороны, служат источником растворимых факторов, стимулирующих регенерация аксонов, а с другой стороны, экспрессируют на своей поверхности факторы, способствующие адгезии конусов роста (Дойников B.C., 1955; Church R.L., 1973; Akwa Y., 1993; Kumar A. et al., 2007).

Биодеградация наполнителя, материала «Лит Ар», одновременно со стимуляцией роста аксонов и дифференцировки нейролеммоцитов индуцирует ангиогенез. Этап формирования и функционирования первичных вазоидов сменяется этапом формирования дефинитивного микрососудистого русла, без которого регенерация периферического нерва невозможна (Мельман Е.П., 1988; Геращенко С.Б., 1990; King A.L., 1983).

Дальнейшая стимуляция регенераторных процессов в зоне диастаза связана с биодеградацией кератинового гетерографта. Несомненно, что биологически активные продукты биодеградирующего кератина стимулируют процесс регенерации нервных волокон за счет повышения функциональной активности белоксинтезирующего аппарата нейролеммоцитов. Аналогичные данные приводятся и в работе К. Chung (2008).

На 60-е сутки после операции стенка гетерографта была полностью биодеградирована и лишь незначительные ее фрагменты выявлялись в окружении макрофагов и клеток инородных тел. На ее же месте сформировалась соединительнотканная оболочка, окружающая тонкой прослойкой восстановленный фрагмент седалищного нерва. Наличие в оболочке плотно упакованных коллагеновых пучков и характерного по архитектонике микрососудистого русла свидетельствует о том, что это эпиневрий.

В непосредственной близости от биодеградирующих фрагментов материала «Лит Ар» формируются первичные кровеносные микрососуды -вазоиды. Стенка их образуется из крупных плоских клеток со светлой цитоплазмой. По этим признакам они идентичны эмбриональным эндотелиоцитам. Однако, несмотря на то, что формирование стенки вазоидов не завершено - она прерывиста и лишена базапьной мембраны, в их просвете есть плазма и форменные элементы крови. Причем нельзя исключить наличие у вазоидов и эритропоэтической функции. В клеточном регенерате в зоне диастаза присутствуют так же мезенхимальные клетки и макрофаги. Эти данные не противоречат результатам, полученным ранее (Politis M.J.,

Spencer P.S., 1983). Так, после перерезки седалищного нерва, в спинном мозге крыс увеличивается число меченых Н3 - уридином или тимидином клеток красного костного мозга. Морфологически эти клетки идентичны моноцитам и макрофагам. С другой стороны, продукты биодеградации материала «Лит Ар» сами способны индуцировать ангиогенез (Марков И.И. с соавт., 2003). Основная масса клеточного регенерата - осмиофильные нейролеммоциты. Через 30-ть суток после операции они представляют собой клетки неправильной формы, основная масса цитоплазмы которых находится в отростках. Число нейролеммоцитов по сравнению с предыдущим сроком наблюдения увеличивается в 5-7 раз.

На сканирующих электронограммах через 30-ть суток после операции в зоне диастаза определяются растущие из центрального конца нерва молодые безмиелиновые волокна. Они следуют или изолированно, или в цитоплазме дифференцирующихся нейролеммоцитов. При этом растущие аксоны сближаются с отростками и перинуклеарным пространством нейролеммоцитов и образуют аксон - нейролеммапьные комплексы. Их образование играет решающее значение для роста аксонов, для определения их правильного направления к мишени и для их миелинизации.

При резекции нервного ствола периневральный эпителий, по данным литературы (Behrman J.E., 1981), не заполняет дефект между центральным и периферическим концами нерва. Считается, что причина этого заключается в нарушении непрерывности коллагеновых волокон. Восстановление же непрерывности коллагеновых связей с помощью материала «Лит Ар» способствует и полной регенерации периневральной оболочки. Через 45-ть суток после операции на всем протяжении регенерирующего фрагмента седалищного нерва располагаются многочисленные пучки нервных волокон. Диаметр большей части из них составлял от 1,0 до 2,0 мкм. Известно, что именно при таком диаметре регенерирующих нервных волокон вокруг них формируются миелиновая оболочка (Сотников О.С., 1986). Аксоны несут действующий на нейролеммоциты фактор, индуцирующий миелиногенез.

Причем степень развития миелиновой оболочки так же контролируется аксоном. Это проявляется в поддержании постоянного соотношения между диаметром аксона и толщиной оболочки на всем протяжении нервного волокна (Smith Q.V., Stevenson J.A., 1987). И, тем не менее, сформированная миелиновая оболочка не является метаболической стабильной структурой. Ее поддерживает, прежде всего, синтетическая активность нейролеммоцитов (Varon S., Williams L.R., 1985). Нами так же было отмечено увеличение функциональная активность белоксинтезирующая аппарата нейролеммоцитов в эксперименте уже через 30-ть суток после операции. После резкого (~ в 3 раза) ее падения в первые 15-ть суток послеоперационного периода.

О повышении синтетической активности нейролеммоцитов свидетельствует появление в их отростках крупных митохондрий, а в осевых цилиндрах - микровезикул, нейрофиламентов и микротрубочек. Эта стадия регенерации миелинового волокна - стадия рыхлого миелина, во время которой вновь образованные нервные волокна окружаются отростками молодых активных нейролеммоцитов.

Применение в эксперименте кератинового гетерографта и материала «Лит Ар» позволяет выполнить все те условия, которые необходимы для миелинизации регенерирующих аксонов. Это и наличие наполнителя, в котором распределены коллагеновые волокна, и полупроницаемая стенка гетерографта, позволяющая диффундировать в его просвет интерстициальной жидкости, это и мезенхимапьные клетки регенерата, из которых уже в раннем послеоперационном периоде дифференцируются фибробласты.

Регенерация аксонов и миграция нейролеммоцитов приводит к их сближению и налаживанию взаимного влияния. В этих условиях нейролеммоциты начинают проявлять свои цитолеммогепные свойства и симбиотические отношения с аксоном (Сотников О.С., 1986; Taniu Chi M. et al., 1986).

Через 60-ят суток после операции происходит увеличение протяженности и толщины миелиновых волокон. Диаметр основной массы миелиновых волокон достигает 4,0 мкм, а дифференцировка нейролеммоцитов в восстановленном фрагменте нерва завершается. По данным литературы (Питере А., 1972), миелинизация аксонов «выгодна» дифференцирующимся нейролеммоцитам, так как она связана с образованием межмембранных контактов, а следовательно, с увеличением механической устойчивости и надежности сложной системы спиралевидной намотки. Таким образом, в процессе регенерации нервных волокон аксон-нейролеммальные комплексы являются той обязательной промежуточной структурой, которая в ходе дельнейшего развития событий перестраивается в миелиновые или безмиелиновые волокна. В эти сроки наблюдения на поперечных и продольных срезах миелиновых волокон среднего и большого диаметра выявляются насечки Шмидта-Лантермана. У них ещё узкая щель, за счёт несовершенного миелина. Определяются так же и перехваты Ранвье. В нейролеммоцитах уменьшается количество отростков, поэтому и площадь цитоплазмы их так же незначительно уменьшается. Снижается электронная плотность митохондрий, появляются рибосомы, полисомы и эндоплазматическая сеть. Это свидетельствует о том, что аксон-нейроломмальные комплексы трансформируются в аксон-нейролеммальные единицы с образованием миелиновых проводников.

В восстановленном фрагменте нерва число безмиелиновых волокон достигает =71 %, а миелиновых волокон - = 68 % от числа этих волокон в интактом седалищном нерве белой крысы. На поперечных срезах миелиновые волокна определяются в виде колец или овалов, слоистость миелина в них чётко выражена. Толщина миелина у волокон большого диаметра составляет 1,05 ± 0,1 мкм, среднего диаметра - 0,8 ± 0,07 мкм, малого диаметра — 0,5 ± 0,01. Чётко выявляются полностью сформированные насечки Шмидта-Лантермана, перехваты Ранвье и осевые цилиндры круглой или овальной формы.

В раннем послеоперационном периоде у животных наблюдается значительное ухудшение чувствительности частично денервированной конечности. При механическом давлении отмечается достоверное снижение порогов болевой чувствительности на стопе оперированной конечности. В то же время пороги болевой реакции по тесту горячей пластины не давали достоверных отличий по сравнению с контролем. Эти данные полностью согласуются с результатами работ Н.Г. Крыжановского с соавт. (1991) и А.В.Новикова (1999). В последующие сроки наблюдения возникла и постепенно нарастала в течение 15-ти суток после операции глубокая гипостезия по типу «чулок», появились и признаки периферического пареза. Передвижения животные осуществляли за счёт ослабленных движений в тазобедренных суставах с ходулеобразным использованием задних конечностей. Активные движения в [соленном суставе и в суставах стопы оперированной конечности отсутствовали. Тем не менее, патологические изменения в ней к 60-м суткам эксперимента регрессировали и передвижения животных стали носить адаптивных характер. Пороги болевой чувствительности при механическом раздражении к этому времени постепенно возвращались к контрольным показателям. Можно полагать, что этому способствовало быстрое восстановление резецированного фрагмента седалищного нерва, прорастание регенерирующих аксонов в его периферический конец, отсутствие в регенерате невром и спиралей Перончитто. При этом восстановление чувствительности происходило медленнее, чем восстановление двигательной активности оперированной конечности. Это, по всей вероятности, общая закономерность, наблюдаемая при посттравматической регенерации периферических нервов (Мещерякова Т.Н., 1996; Борода Ю.И., 2000; 1с1е С., 1996). Стойкие трофические расстройства могут быть связаны с частичной десимпатизацией оперированной конечности (Селякин С.П., 1996).

Успех регенерации поврежденного периферического нерва зависит от многих факторов, и в первую очередь, от способности аксотомированных

нейроцитов выжить после травмы (Дойников Б.С., 1955; Жаботинский Ю.М., 1965; Cajal S.R., 1959). В целом ряде работ (Рагинов И.С. с соавт. 2000; 2002; Челышев Ю.А. с соавт. 2000) показано положительное влияние лекарственного препарата ксимедона на аксотомированные нейроциты спинномозговых узлов и нейролеммоциты поврежденного периферического нерва.

Наши данные свидетельствуют о том, что в раннем послеоперационном периоде (15-е сутки) значительная часть нейроцитов спинномозговых узлов (L4 - L5) на оперированной стороне подвергается морфофункционапьным изменениям. По состоянию хроматофильного вещества эти изменения характеризовались или тотальным, или частичным хроматолизом. В последующие сроки наблюдения (30-е сутки) уже определялись нейроциты первой группы, вступившие апоптоз. На светооптическом уровне основанием для такого заключения был тотальный хроматолиз нейроцита, сформированные выступы на его поверхности и начинающаяся его фрагментация. Вторая группа нейроцитов, имеющая смещенное к периферии набухшее ядро, стертую границу между ним и перикарионом,' гипертрофированное ядрышко, представляла собой группу выживающих нейроцитов.

К этому сроку наблюдения в спинномозговых узлах (L4 - L5) на оперированной стороне погибло 29,8% нейроцитов, а на контралатеральной стороне - 20,0%. И совершенно неожиданно в спинномозговых узлах (L4 - L5) на оперированной стороне на 60-е сутки эксперимента среди нейроцитов И-ой группы были обнаружены практически неизмененные нейроциты. В связи с этим общее число нейроцитов в спинномозговых узлах достоверно увеличилась (~ на 10,0%). В конечном итоге в послеоперационном периоде в спинномозговых узлах (L4 - Ь5) на оперированной стороне погибло 21,7% нейроцитов, на контралатеральной стороне - 13,4%. Характерной чертой выживших нейроцитов была выраженная перинейрональная глиальная реакция. При этом отмечалось увеличение числа клеток-сателлитов, как

образующих капсулу нейроцита, так и формирующих локальные очаги. Одновременно наблюдалось и увеличение числа нейролеммоцитов.

В капсуле выживших нейроцитов число клеток-сателлитов превышает этот показатель у интактных животных в среднем на 7,7 ± 0,8 клетки. Выраженная пролиферация клеток - сателлитов и нейролеммоцитов способствует выживанию аксотомированных нейроцитов за счёт адаптивного снижения их функциональной активности. Значительная часть выживших нейроцитов (до 10 %) состояла из клеток с нормальной субмикроскопической структурой. Это свидетельствует о том, что они не подвергались реактивным ретроградным изменениям. По всей вероятности, эти зрелые нейроциты — завершающий этап дифференцировки нейральных клеток-предшественников. В спинномозговых узлах (Ь4 - Ь5) на контралатеральной стороне наблюдались те же достоверные морфологические изменения, что и в узлах (Ь4 - Ь5) на оперированной стороне. Разница лишь в масштабах этих изменений: меньшее число погибших нейроцитов (13,4%), менее выраженные реактивные изменения выживших нейроцитов, но и меньшее число интактных нейроцитов. По данным литературы (Боровский М.Л., 1962), это связано с рефлекторно возникающей импульсацией, идущей от центрального конца травмированного нерва в спинномозговые узлы, а затем и в центральную нервную систему. Возникшие в одном полушарии большого мозга импульсы передаются в симметричный пункт противоположного полушария, а затем в спинномозговые узлы контралатеральной стороны.

Таким образом, в спинномозговых узлах (Ь4 - Ь5) на оперированной и на контралатеральной сторонах выявляются три группы нейроцитов; 1) вступающих апоптоз; 2) выживших и 3) интактных. Посттравматическому выживанию нейроцитов и появлению интактных нейроцитов способствует увеличенное число нейролеммоцитов с высокой активностью белок-синтезирующего аппарата.

Выводы

1. Кератиновые гетерографты из очина птичьего пера и соосажденного на их внутреннюю поверхность наполнителя-наноразмерного материала «Лит Ар» - обладают значительными преимуществами перед известными патентованными проводниками. Они нетоксичны, не антигенны, биосовместимы и полностью биодеградируют в течение 60-ти суток.

2. Кератиновые гетерографты, имплантированные в заднюю группы мышц бедра белых крыс, не вызывают местной воспалительной реакции. Общая кратковременная иммунная реакция тимуса и периферических органов иммунной системы является ответом на введение анестетиков и оперативное вмешательство.

3. Восстановление резецированного фрагмента седалищного нерва белых крыс осуществляется на основе биодеградации стенки кератинового гетерографта и материала «Лит Ар». В результате в просвете гетерографта формируется регенерат, состоящий из синусоидных микрососудов, малодифференцированных клеток, макрофагов и нейролеммоцитов.

4. Регенерирующие аксоны распространяются в регенерате по ходу коллагеновых волокон материала «Лит Ар». Они имеют волнообразный ход и параллельное направление, характерные для интакных нервных волокон. Это позволяет растущим аксонам преодолеть расстояние между местом пересечения седалищного нерва и его терминальными структурами в течение 60-ти суток.

5. В регенерате, сформированном в просвете гетерографтов, зафиксировано увеличение числа нейролеммоцитов с высоким коэффициентом их белоксинтезирующего аппарата (60 - 72 УЁ). Они образуют с растущими аксонами аксон-нейролеммальные комплексы, на основе которых формируются миелиновые и безмиелиновые волокна. В восстановленном фрагменте нерва число миелиновых

волокон по сравнению с интактным нервом составляет - 68%, а число безмиелиновых волокон - ~ 71%.

Устранение диастаза седалищного нерва кератиновым гетерографтом уменьшает число нейроцитов, вступающих в апоптоз и стимулирует выживание сохранившихся нейроцитов в спинномозговых узлах Ь4 - Ь5 белых крыс на оперированной (до 78,3%) и контралатеральной (до 86,6%) сторонах.

Восстановление чувствительной и двигательной функций оперированной конечности белых крыс к 60-м суткам после тубулизации поврежденного седалищного нерва является достоверным подтверждением нормализации морфологического и физиологического статуса его нервных волокон.

Практические рекомендации

Рекомендуется использовать кератиновые гетерографты в эксперименте для изучения посттравматической регенерации черепно-мозговых нервов.

Рекомендуется использовать кератиновые гетерографты для изучения влияния различных наполнителей на двухсторонние взаимоотношения между регенерирующими аксонами и нейролеммоцитами, а так же на важнейшейся фактор реституции поврежденного нерва - ориентацию нервных волокон в зоне диастаза.

Рекомендуется проведение клинических испытаний кератиновых гетерографтов, их сертификация как «медицинского прибора для восстановления целостности периферических нервов» и его серийное производство.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сергеев С.М. Устранение диастаза седалищного нерва с помощью аутовенозного имплантата и стимуляции аксоногенеза / С.М.Сергеев, И.И.Марков // Морфология, 2006, №5, с. 80.

2. Сергеев С.М. Стимуляция постгравматической регенерации периферического нерва в зоне диастаза / С.М.Сергеев, В.М.Чучков, И.И.Марков // Морф, ведомости, 2008, № 1-2, с. 93 - 95.

3. Sergeev S. Total replacement in the treabment of discogenic pain associated With degeneration disc disease: study on 78 patients / S.Sergeev // Luberec., 2008, p. 79-83.

4. Сергеев С.М. Посттравматическая регенерация периферического нерва в зоне диастаза / С.М.Сергеев, И.И.Марков, В.М.Чучков // Сб. науч. тр. «Однораповские чтения», Воронеж, 2008, с. 77 - 78.

5. Сергеев С.М. Реакция миокарда на имплантацию материала «Лит Ар» / С.М.Сергеев, И.И.Марков // Сб. научн. тр. «Однораповские чтения», Воронеж, 2008, с. 99 - 100.

6. Сергеев С.М. Устранение диастазов периферических нервов с помощью аллографтов и материала «Лит Ар» / С.М.Сергеев, И.И.Марков // Сб. научн. тр. «Вопросы морфологии XXI века», СПб, 2008, Вып. 1, с. 187- 188.

7. Сергеев С.М. Гистоструктура спинномозговых узлов (L4 - L5) после устранения диастаза седалищного нерва / С.М.Сергеев, И.И.Марков, В.А.Ваньков // Морф, ведомости, 2008, № 3 - 4, с. 76 - 77.

Подписано в печать: 26.02.2009 г. Формат: 60x80 1/16 Бумага офсетная. Печать оперативная. Тираж: 120 экз. Объем: 1,5 усл.п.л. Заказ № 138

Отпечатано в типографии ООО «Издательство СНЦ» 443001, г. Самара, Студенческий пер., За