Автореферат и диссертация по медицине (14.01.10) на тему:Стероидрезистентная форма истинной акантолитической пузырчатки, разработка и обоснование рациональной фармакотерапии

На правах рукописи

ЛЕПЕХОВА АНФИСА АЛЕКСАНДРОВНА

СТЕРОИДРЕЗИСТЕНТНАЯ ФОРМА ИСТИННОЙ АКАНТОЛИтаЧЕСКОЙ ПУЗЫРЧАТКИ, РАЗРАБОТКА И ОБОСНОВАНИЕ РАЦИОНАЛЬНОЙ ФАРМАКОТЕРАПИИ

14.01.10 — кожные и венерические болезни 14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

3 ПАР 2015

Москва-2015

005559981

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Теплюк Наталия Павловна доктор медицинских наук, профессор Духанин Александр Сергеевич

Официальные оппоненты:

Махнева Наталия Викторовна - доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры дерматовенерологии и дерматоонкологии факультета усовершенствования врачей Государственного бюджетного учреждения здравоохранения Московской области «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимирского»

Шегай Марина Михайловна - доктор медицинских наук, начальник исследовательского отдела Центра молекулярной медицины Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования «Российский университет дружбы народов» Министерства образования и науки Российской Федерации

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится 0</'_2015 г. в «/У» часов на

заседании Диссертационного совета Д 208.040.10 при ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова по адресу: 119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49, www.mma.ru Автореферат разослан 2015 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Чебышева Светлана Николаевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В настоящее время на основании клинических, патоморфологических, иммуногистохимических данных выделяют следующие основные клинические формы истинной акантолитической пузырчатки (ИАП): вульгарная, малый вариант -вегетирующая; листовидная, малые варианты - эритематозный пемфигус и герпетиформный пемфигус, паранеопластическая [Anstey A. et al. 1992, Cotell S. et al. 2000, Jamora MJ. et al. 2003]. В отдельную группу выделены редкие и атипичные клинические варианты пузырчатки (IgA пемфигус, нейтрофильный IgA дерматоз, лекарственно-индуцированный пемфигус и др.) [Махнева Н.В., 2008, Da Silva К. et al. 2007, Eisen D. et al. 1990, Fariba G. et al. 2012, Masmoudi A. et al. 2008, Robinson N.D. et al. 1999]. Заболеваемость ИАП составляет в целом 0,5-3,2 случая на 100 000 населения [Miesfeld R.L. et al. 1996]. Мужчины и женщины болеют одинаково часто [Фицпатрик Т., 2012]. Как правило, ИАП наблюдается у лиц в возрасте 50-60 лет, у детей развивается редко [Pasticha J. et al 1995, Perretti M. et al. 2009, Yoshiike K. et al. 1990].

Этиология и патогенез ИАП связаны с аутоиммунными нарушениями. Каждая из форм ИАП имеет свои клинические черты, которые зависят от их иммунных особенностей. При всех классических формах ИАП образуются антитела или к десмоглеину 3 (ДсгЗ), или к десмоглеину 1 (Дсг1) [Amagai M. et al. 1999, Amerian M.L. et al. 1984, Hamblin T.J., 2006, Hashimoto T., 2008, Srebrnik A. et al. 2001]. Уровень акантолиза при различных формах ИАП объясняется расположением ДсгЗ и Дсг1 в эпидермисе кожи и эпителии слизистой оболочки полости рта [Amagai M et al. 1999, Chan W., 2002, Jardin F. et al. 2005].

Исход ИАП в «достероидную эру» до 50-х годов был фатальным, погибало почти 75% больных [Теплюк Н.П. и соавт., 2011]. В настоящее время при лечении ИАП не существует противопоказаний для назначения

системных глюкокортикостероидов (СГК) [Кацамбас А.Д. и соавт., 2009, Решетникова Т.Б., 2005]. Согласно данным литературы у части больных при адекватной дозе СГК не наблюдается выраженного положительного терапевтического эффекта. В научной литературе появилось понятие «стероидрезистентная пузырчатка» [Теплюк Н.П. и соавт., 2013].

Отмечается учащение случаев резистентности к терапии СГК [Asilian A. et al. 2006]. Согласно данным литературы применяют комбинации СГК с различными цитостатиками и иммуносупрессорами. Как правило, дополнительная иммуносупрессивная терапия носит курсовой характер метотрексатом, циклоспорином А, мофетил микофенолатом и ритуксимабом [Antonucci A. et al. 2007, Bewley А.Р. et al. 1996, Craythorne EE. et al. 2011, Hashimoto Т., 2003, Michailidou E.Z. et al. 2007, Misery L, 1997, Ozaki T. et al. 1982, Pujols L. et al. 2002, Siband V. et al. 2000]. Согласно Европейскому руководству по лечению дерматологических болезней, 2009 г., лечение ИАП следует начинать сразу с комбинации больших доз СГК и азатиоприна (АЗА), снижение СГК и АЗА согласно предложенной схеме проводят в течение 2-х лет. В России разработана схема снижения средних и малых доз СГК, при этом у стероидрезистентных больных также применяется АЗА, однако, клинические критерии и длительность приема определенных доз АЗА не разработаны [Решетникова Т.Б., 2005, Торсуев Н.А. и соавт., 1979].

Духанин А.С. и соавт., 2005, выявили, что у больных ИАП со стероидной резистентостью (CP) наблюдается изменение биохимической реактивности в системе вторичных мессенджеров к специфическим

эффектам СГК как на уровне плазматической мембраны (проницаемость для

2+

ионов Са ), так и на уровне генома (регуляция образования 1Рз). Исследование этих показателей позволяет прогнозировать клиническую эффективность СГК и своевременно назначать дополнительную терапию иммуносупрессорами или цитостатиками [Теплюк Н.П. и соавт., 2013].

Таким образом, при лечении ИАП необходим поиск оптимальной схемы применения и снижения АЗА в комбинации с ранее разработанной схемой лечения СГК.

Цель исследования - разработка комплексного лечения системными глюкокортикостероидами и азатиоприном больных истинной акантолитической пузырчаткой со стероидной резистентностью на основании изучения ее молекулярных механизмов.

В соответствии с указанной целью исследования, были определены следующие задачи:

1. Провести ретроспективный анализ историй болезни больных ИАП клиники кожных и венерических болезней им. В.А. Рахманова за последние 16 лет.

2. Определить соотношение а- и (3— изоформ глюкокортикоидных рецепторов у больных резистентных к системным глюкокортикостероидам, а также количество мембранных рецепторов.

3. Исследовать влияние преднизолона на включение 3Н-уридина в мРНК лимфоцитов.

4. Определить динамику внутриклеточного содержания ядерного фактора транскрипции ОТ-кВ и провоспалителыюго цитокина ТЫР-а при проведении комплексной терапии азатиоприном и системными глюкокортикостероидами.

5. Изучить динамику клинических показателей в процессе комплексной терапии азатиоприном и системными глюкокортикостероидами при стероидрезистентной пузырчатке.

Научная новизна исследования

На основании ретроспективного анализа 123 историй болезни впервые определена частота встречаемости стероидной резистентности у больных ИАП и выделены возможные триггерные факторы, которые ее вызывают.

Впервые выявлена гетерогенность группы стероидрезистентных больных как на рецепторном, так и на пострецепторном уровне на основании исследования молекулярных механизмов резистентности к СГК: на рецепторном уровне у части больных наблюдается уменьшение экспрессии мРНК а-изоформы, у других - увеличение экспрессии мРНК (З-изоформы глюкокортикоидных рецепторов, или снижение количества мембранных, или внутриклеточных рецепторов; на пострецепторном - у части больных выявлено пониженное включение 3Н-уридина в мРНК лимфоцитов. Впервые у всех стероидрезистентных больных выявлено статистически значимое увеличение уровня экспрессии ЫН-кВ.

Впервые обоснована схема преодоления стероидной резистентности с помощью азатиоприна при исследовании экспрессии гена ОТ-кВ и ТЫР-а в динамике.

Практическая значимость

На основании проведенного ретроспективного анализа клинических данных у стероидрезистентных больных ИАП выявлены особенности течения заболевания и триггерные факторы, что оптимизирует диагностику этой формы заболевания.

Анализ клинических изменений в процессе приема азатиоприна и изучение молекулярных механизмов стероид-сберегающего эффекта препарата позволили разработать и обосновать эффективную схему рациональной фармакотерапии больных с резистентной формой ИАП.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У больных ИАП в 44% случаев наблюдается стероидная резистентность, которая проявляется обязательными обострениями в первый год от начала лечения СГК и ежегодными обострениями в последующем при отсутствии адъювантной терапии. Все больные ПНП (15%) являются стероидрезистентными (р<0,05).

2. Основные механизмы индивидуальной резистентности к СГК у больных ИАП обнаруживаются на молекулярном уровне; так, у 35%

6

стероидрезистентных больных наблюдается поражение рецепторного аппарата, а именно: снижение экспрессии а - изоформы глюкокортикоидного рецептора у 14% больных [52,85%; 55,44%] при среднем значении у стероидчувствительных больных - 69,17%, [интервал значений 65,03% -80,28%] (р<0,05), у этих же больных отмечается низкое количество внутриклеточных рецепторов (за счет а-изоформы) [0,77*103/клетку; 0,8*103/клетку] - при среднем значении 1,08±0,15х 103/клетку (р<0,05), повышение экспрессии [3 - изоформы глюкокортикоидного рецептора у 14% больных [48,36%; 49,40%] при среднем значении - 33,99% [интервал значений 15,03% - 40,25%] (р<0,05) и у 7% - снижение количества мембранных рецепторов - [6,91*103/клетку] при среднем значении -10,32±1,03><103/клетку (р<0,05); у 65% стероидрезистентных больных количество рецепторов не изменялось.

Установлено, что изменения на рецепторном уровне коррелируют с динамикой заболевания в процессе лечения.

3. В процессе исследования определены возможные причины индивидуальной резистентности к СГК у больных ИАП на пострецепторном уровне: у 28% стероидрезистентных больных при воздействии преднизолона на включение 3Н-уридина в мРНК лимфоцитов обнаружено статистически значимое пониженное включение 3Н-уридина, что выражается в увеличении синтеза тотальной мРНК в лимфоцитах [интервал значений 68,67%-78,35%] при среднем значении у стероидчувствительных пациентов 51,55% [51,55±8,1%] (р<0,05).

Установлено, что изменения на пострецепторном уровне коррелируют с динамикой заболевания в процессе лечения.

4. Для стероидной резистентности характерен высокий уровень экспрессии гена№-кВ в лимфоцитах [интервал значений 88,80%-98,61%] по сравнению со стероидчувствительными больными [интервал значений 65,39%-86,17%] (р<0,05).

5. В результате сочетанной терапии СГК и азатиоприном в группе стероидрезистеитных пациентов имеет место снижение внутриклеточного уровня экспрессии гена ЫР-кВ (р<0,01) и фактора некроза опухоли-а, что лежит в основе стероид-сберегающего действия азатиоприна, включенного в разработанную схему преодоления стероидной резистентности у этих больных.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XXXI научно-практической конференции с международным участием «Рахмановские Чтения», г. Москва, 2014 г.; Московском обществе дерматовенерологов, г. Москва, 2014 г.; Седьмом международном форуме дерматовенерологов и косметологов (П^БС 2014), г. Москва, 2014 г.; XIV Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов, г. Москва, 2014 г.; Актовом дне, посвященному 90-летнему юбилею члена-корреспондента РАН, д.м.н., профессора Н.С. Потекаева, г. Москва, 2014 г. Апробация диссертации состоялась на совместной научно-практической конференции кафедры кожных и венерических болезней имени В.А. Рахманова лечебного факультета ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России и кафедры молекулярной фармакологии и радиобиологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России 27 июня 2014 года.

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в анализе и обобщении полученных результатов. Автором составлена компьютерная база данных архивного материала, а также проведен ретроспективный анализ 123 историй болезни ИАП. Интерпретированы данные лабораторных исследований, проведены статистическая обработка и анализ полученных результатов, сформулированы выводы и даны практические рекомендации.

Внедрение результатов исследования. Результаты работы используются в научно-практической деятельности кафедры и клиники

кожных и венерических болезней им. В.А. Рахманова лечебного факультета ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Диссертация соответствует шифру научной специальности: 14.01.10 -кожные и венерические болезни; формуле специальности: кожные и венерические болезни - область медицинской науки, изучающая кожный покров и видимые слизистые оболочки в норме и патологии. Основное внимание уделяется этиологии, эпидемиологии, патогенезу, диагностике, лечению и профилактике дерматозов и инфекций, передаваемых половым путем. Также соответствует области исследований: пункты 1, 4.

Диссертация соответствует шифру научной специальности: 14.03.06 -фармакология, клиническая фармакология; формуле специальности: фармакология, клиническая фармакология - область науки, изучающая взаимодействие лекарственных средств с живыми системами посредством химических механизмов, путем связывания с регуляторными молекулами, активацией или ингибированием процессов, происходящих в организме. Основными научными задачами клинической фармакологии являются изучение эффективности и безопасности лекарственных средств у здорового и больного человека. Также соответствует области исследований: пункт 18.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы, из них 3 в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 268 страницах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического указателя, содержащего 258 источников, из них 36 отечественных и 222 зарубежных. Работа иллюстрирована 97 рисунками, 27 таблицами и 56 фотографиями.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Основой нашей работы явился анализ клинических данных 128 больных ИАП, 26 проходили обследование в клинике кожных и венерических болезней им. В.А. Рахманова ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России с 2012 по 2014 год, архивный материал включал 102 истории болезни.

Для клинической характеристики больных ИАП со стероидной резистентностью был проведен ретроспективный анализ историй болезни 123 пациентов клиники кожных и венерических болезней им. В.А. Рахманова за последние 16 лет.

При клиническом анализе историй болезни учитывали данные анамнеза жизни и заболевания, проводили оценку общего и локального статуса.

Данные анамнеза включали сведения о возрасте пациента, длительности ИАП. Особое внимание уделялось характеру течения болезни, реакции на лечение СГК, необходимости назначения адъювантной терапии, факторам, провоцирующим, как ранние обострения ИАП в первый год от начала лечения, так и поздние. При ретроспективном анализе исследовали ранние и поздние осложнения стероидной терапии, обращая внимание и на осложнения, которые вызывала сочетанная терапия СГК и цитостатиками или иммуносупрессорами.

Для определения молекулярных механизмов стероидной резистентности были обследованы и пролечены 14 стероидрезистентных (СР(+) и 10 стероидчувствительных (СР(-) больных ИАП. В качестве контроля использовали группу СР(-) больных (п=10). По возрасту и полу группы сопоставимы.

Методы исследования включали:

1) осмотр;

2) сбор анамнеза;

3) у пациентов проводился забор периферической крови из локтевой вены, из которой были выделены лимфоциты;

4) исследование молекулярных механизмов CP на рецепторном уровне включало:

• определение а- и Р-изоформ глюкокортикоидных рецепторов методом ПЦР в режиме реального времени,

• определение количества мембранных и внутриклеточных глюкокортикоидных рецепторов радиолигандным методом;

5) исследование молекулярных механизмов CP на пострецепторном

уровне включало:

• изучение экспрессии транскрипционного фактора NF-kB методом ПЦР в режиме реального времени,

• определение TNF-a с помощью твердофазного иммуноферментного анализа,

• оценку интенсивности биосинтеза мРНК в лимфоцитах с помощью радиоизотопного метода и жидкостной сцинтилляционной радиометрии.

Результаты исследования были получены на кафедре молекулярной фармакологии и радиобиологии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России.

Статистический анализ полученных результатов, полученных по двум группам больных проводили с помощью программы Excel; вычисляли средние значения по нескольким измерениям, по группе СР(-) пациентов находили медиану и интервал значений.

Для определения статистически значимых отличий между группами больных использовался интервал значений по СР(-) пациентам. Полученные результаты по группе СР(+) больных, которые не входили в интервал значений проверялись на статистическую значимость (р<0,05) различий

между группами СР(+) и СР(-) пациентов с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни для небольшой выборки.

Методы лечения

Под непосредственным наблюдением находилось 26 больных ИАП; 23 из них помимо терапии СГК, назначался АЗА.

Лечение СГК основывалось на главных принципах лечения ИАП, применяемых в России; а также на схемах лечения ИАП, разработанных на кафедре кожных и венерических болезней им. В.А. Рахманова ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздрава России [Потекаев Н.С. и соавт., 2013, Потекаев Н.С. и соавт., 2003, Решетникова Т.Б., 2005, Соколовский Е.В., 1999].

Результаты собственных исследований Общая характеристика клинических данных больных ИАП

Для клинической характеристики больных ИАП со СР был проведен ретроспективный анализ историй болезни 123 пациентов. Соотношение женщин и мужчин 1,7:1, что соответствует данным литературы. Средний возраст наших пациентов был выше (у мужчин 57,9±2,01 лет, у женщин 56,7±1,7 лет соответственно) по сравнению с литературными данными (средний возраст - 41,1+/- 13,7 лет) [Фицпатрик Т., 2012, Asilian А. et al. 2006].

У большинства больных (37% из 100 обследованных) длительность заболевания составила 1-4 года.

В процессе исследования проводился анализ триггерных факторов, способствующих дебюту заболевания. Из 100 обследованных больных 18% связывали дебют ИАП со стрессом, что соответствует данным литературы [Pfütze М. et al. 2007]. Триггерными факторами ИАП явились также аденовирусная инфекция (7%), инсоляция (6%), прием антибиотиков (4%). На связь начала ИАП с другими факторами (золотые серьги, травма, твердый антиперспирант, физическая нагрузка, генетическая предрасположенность

(ИАП у матери) и работа в холодном помещении) указывали по 1 -2 больных (17%). Не могли указать причину возникновения ИАП 48% больных.

Среди сопутствующей патологии у больных ИАП чаще всего наблюдались заболевания желудочно-кишечного тракта и сердечнососудистой системы (81% и 62% больных соответственно); заболевания дыхательной системы - у 12% больных; опорно-двигательного аппарата — у 9%; мочевыводящей системы - у 8%; эндокринной системы - у 7%; кожи - у 5%. Реже встречались патология нервной системы, органов зрения и заболевания крови.

При анализе сыпи по первичной локализации было обнаружено, что кожно-слизистый синдром и высыпания только на коже возникали у больных ИАП одинаково часто (у 46% и 44% соответственно), у 10% - только на слизистых оболочках.

Краевой феномен Никольского был положительным у 52 (52%) из 100 больных ИАП; как краевой, так и на видимо неизмененной коже - у 37 (37%) больных.

При цитологическом исследовании мазков-отпечатков со дна эрозий акантолитические клетки были обнаружены у 25% из 100 больных ИАП, у 70% исследование продемонстрировало отрицательный результат, в 5% случаев результат был сомнительный.

Наиболее частым фактором, провоцирующим обострение ИАП в первый год, являлась недостаточно максимальная доза СГК (28% больных). У 40% больных ИАП обострений в первый год не наблюдалось. Из 123 больных ИАП 80 (65%) не получали адьювантную терапию в первый год лечения.

При анализе сыпи по локализации при обострении в 1-й год от начала лечения высыпания только на коже и слизистых оболочках наблюдались одинаково часто (22% и 21% больных соответственно).

Адьювантную терапию в первый год лечения из 123 больных ИАП получали 35% пациентов. АЗА назначался 19% больным; плазмаферез получали 7%; циклоспорин А - 5%, метотрексат - 3%, тимодепрессин +

13

озонотерапия - 1%. Поздние обострения из 123 больных ИАП наблюдались у 50% пациентов.

При анализе факторов, провоцирующих развитие поздних обострений быстрое снижение СГК наблюдалось у 20% больных, стресс - у 9%; инсоляция у 6% больных; у 7% пациентов причина поздних обострений была не выяснена что соответствует данным литературы [Cremniter D. et al. 1998, Misery L., 1997, Srebrnik A. et al. 2001].

При поздних обострениях у 89% пациентов из 82 суточная доза СГК составляла менее 15 мг.

В качестве адьювантной терапии при поздних обострениях 29 больных получали АЗА, 14 - дипроспан, 5 - плазмаферез, трое - циклоспорин А, трое — тимодепрессин, двое - метотрексат и одному больному назначали курс озонотерапии. Некоторые пациенты получали одновременно АЗА и курс плазмафереза.

Сравнительная характеристика клинических данных СР(+) и СР(-)

больных

При проведении ретроспективного анализа 123 историй болезни было выявлено:

• количество СР(+) пациентов составляет практически половину больных ИАП (54 - 44% больных);

ПНП наблюдалась только у СР(+) больных (р<0,05); по сравнению с СР(-) больными начало заболевания в группе СР(+) больных в 5 раз чаще провоцировали стресс (р<0,001); в то время как инсоляция явилась основным триггерным фактором начала заболевания в группе СР(-) больных (р<0,01);

• при анализе локализации первичных высыпаний изолированное поражение слизистых оболочек наблюдалось в 1,9 раз чаще у СР(+) больных;

• обострения в первый год от начала лечения возникали у всех СР(+) больных, триггерными факторами которых были стресс и инсоляция

(р<0,01); недостаточно адекватная начальная максимальная доза СГК вызывала обострение как у СР(+), так и у СР(-) больных;

• поздние обострения у СР(+) больных возникали в 3 раза чаще (р<0,001);

только у СР(+) больных триггерным фактором развития поздних обострений являлось быстрое снижение СГК (р<0,0001); с инсоляцией поздние обострения в 4 раза чаще связывали СР(+) больные (р<0,05); на связь возникновения поздних обострений со стрессом в 2,5 раза чаще указывали СР(+) больные (р<0,05).

ежегодные обострения в 16 раз чаще развивались у СР(+) больных (р<0,0001).

Результаты исследования основных механизмов индивидуальной резистентности к СГК у больных ИАП на молекулярном (ре цеп тор ном)

уровне

При исследовании содержания мРНК а- и Р-изоформ глюкокортикоидных рецепторов (ГР) методом ПЦР было выявлено снижение мРНК а-изоформы ГР у 14% СР(+) больных [52,85%; 55,44%] при среднем значении контрольной группы - 69% [интервал значений 65,03% - 80,28%] (р<0,05) и повышение мРНК р-изоформы ГР у 14% СР(+) больных [48,36%; 49,40%], при среднем значении - 34% [интервал значений 15,03% - 40,25%] (р<0,05) (рисунок 1,2).

I

80% 60% 40% 20% 0%

Контрольная группа СР(+) больные

СР(-)

Рисунок 1. Сравнительная характеристика содержания мРНК а-изоформы ГР у СР(-) и СР(+) больных ИАП.

60% _

= 5? Пй%1

а ° 40% ^дяЯ

}| ». щ.

I 8 0%

о Контрольная группа СР(+) больные

Рисунок 2. Сравнительная характеристика содержания мРНК [¡-изоформы ГР у СР(+) и СР(-) больных.

При сравнительной характеристике числа участков специфического

связывания СГК на мембранах лимфоцитов радиолигандным методом было

обнаружено снижение количества мембранных рецепторов - [6,91 х

107клетку] у 7% больных в 1,5 раза по сравнению со средним значением

контрольной группы - 10,32±1,03х103/клетку (р<0,05); а также снижение

числа внутриклеточных участков (за счет а-изоформы ГР) специфического

связывания СГК у 14% пациентов - [0,77х 103/клетку; 0,8х 103/клетку] при

среднем показателе - 1,08±0,15х103/клетку (р<0,05) (рисунок 3, 4).

| 48% [ | 49%

12 10

и?

0

10.32 |

1 »Л |

■

Контрольная группа СР(-) СР(+) больные

Рисунок 3. Сравнительная характеристика числа участков специфического связывания СГК на мембранах лимфоцитов у СР(+) и СР(-) больных ИАП.

3 1.2 ^

I II

Контрольная группа СР(-) СР(+) больные

Рисунок 4. Сравнительная характеристика числа внутриклеточных участков специфического связывания СГК у СР(+) и СР(-) больных.

Проводился корреляционный анализ клинических данных больных ИАП при изменении мембранных и внутриклеточных рецепторов.

Снижение количества внутриклеточных рецепторов у СР(+) больных коррелировало со снижением экспрессии мРНК а-изоформы ГР.

При снижении экспрессии мРНК а-изоформы ГР у больных ИАП отмечались ограниченные высыпания, при этом назначение АЗА не всегда демонстрировало положительную динамику заболевания; при снижении количества мембранных рецепторов и повышении мРНК (3-изоформы ГР у больных ИАП отмечался генерализованный характер высыпаний во время обострений, однако длительное назначение АЗА сдерживало появление новых пузырных элементов.

Результаты исследования основных механизмов индивидуальной резистентности к СГКу больных ИАП на пострецепторном уровне При изучении молекулярных механизмов СР с помощью радиоизотопного метода и жидкостной сцинтилляционной радиометрии на пострецепторном уровне у больных ИАП было выявлено, что преднизолон (10~6М) значительно угнетал синтез мРНК в группе СР(-) больных; медиана составила 51,55%, [интервал значений - 43,12%-59,70%].

У 28% СР(+) пациентов при воздействии преднизолона на включение 3Н-уридина в мРНК лимфоцитов обнаруживалось пониженное включение 3Н-уридина, что выражалось в усиленном синтезе мРНК [интервал значений 68,67%-78,35%] при среднем значении контрольной группы - 51,55% [51,55±8,1%] (р<0,05) (рисунок 5).

Е к я

¥ е 4 40%

§ X I

о I 8 20% * т И 2 X 0%

| 52% [

2 2 Контрольная группа СР(-) СР(+) больные

больные

Рисунок 5. Сравнительная характеристика влияния преднизолона на включение 3Н-уридина в мРНК лимфоцитов у СР(+) и СР(-) больных ИАП.

17

При снижении включения 3Н-уридина (ослабленное действие гормона) у СР(+) больных ИАП наблюдалось торпидное течение кожного процесса, при обострениях сыпь носила генерализованный характер.

Разработка лечения больных ИАП азатиоприном при стероидной резистентности

В качестве адъювантной терапии СР(+) больных основной группы применяли АЗА как цитостатик, рекомендуемый к применению при ПАП Европейским руководством по лечению дерматологических болезней, 2009 г.

В первый год от начала лечения проводился анализ клинических данных 23 больных ИАП, получавших АЗА.

При СР АЗА назначался как при максимальной дозе или при обострении, так и при средних дозах СГК. Начальная доза АЗА у всех больных была 150 мг/сут. При СР АЗА назначался при максимальной дозе СГК 96,25±2,72 мг/сут в преднизолоновом эквиваленте или при обострении — при средних и малых дозах СГК (60 мг/сут или 27,5 мг/сут в преднизолоновом эквиваленте).

При анализе архивных данных 6 СР(-) больных было выявлено, что АЗА назначали при снижении СГК в целях профилактики обострений (доза СГК 70 мг/сут или 25 мг/сут в преднизолоновом эквиваленте).

От начала приема максимальной дозы СГК 96,25±2,72 мг в преднизолоновом эквиваленте АЗА в дозе 150 мг/сут назначался на 29±1,6 дней, 100 мг/сут - на 58±3,2 дней. Следует отметить, что длительность приема суточной дозы АЗА 150 мг/сут и 100 мг/сут была одинакова как в группе СР(+), так и в группе СР(-) больных. У СР(-) больных длительность приема дозы АЗА 50 мг/сут составляла от 3 до 5 месяцев при снижении средних доз СГК с его постепенной отменой; СР(+) больные получали дозу АЗА 50 мг/сут от 3 месяцев до 2,5 лет. При этом спустя полгода при отсутствии обострений АЗА назначали через день, затем два раза в неделю. Лечение АЗА проводили под контролем общего и биохимического анализа крови.

При развитии поздних обострений из 123 больных ИАП 29 (24%) пациентов получали АЗА.

По поводу позднего обострения из 69 СР(-) больных ИАП АЗА был назначен 5 СР(-) больным в дозе 150 мг/сут, остальные 6 больных ИАП продолжали получать его после назначения при раннем обострении в дозе 50 - 100 мг/сут.

Из 54 СР(+) больных АЗА получали 18 (33%) человек. Из них по поводу позднего обострения впервые АЗА назначили только одному больному, 9 СР(+) больным дозу АЗА увеличили до 150 мг/сут в связи с обострением ИАП; остальные 8 больных ИАП продолжали получать его после назначения при раннем обострении в дозе 50 - 100 мг/сут.

Доза СГК в преднизолоновом эквиваленте, при которой возникло позднее обострение, и впервые было назначено 150 мг/сут АЗА, у 4 СР(+) больных составляла 15мг/3т/сут; у 8 - 12,5мг/2,5т/сут; у 6 - 10мг/2т/сут. При этом суточная доза СГК была также увеличена до максимальной.

Доза СГК в преднизолоновом эквиваленте, при которой возникло позднее обострение, и впервые было назначено 150 мг/сут АЗА, у 2 СР(-) больных составляла 11,25мг/2,25т/сут; у 3 - 10мг/2т/сут. При этом суточная доза СГК была также увеличена до максимальной.

Таким образом, на основании клинического наблюдения была разработана схема преодоления CP с помощью АЗА у больных ИАП.

При выявлении CP и возникновении обострения проводилась замена одного СГК на другой в эквивалентной дозе, отсутствие стабилизации процесса в течение 4-6 дней требовало назначение дипроспана 2,0 мл в/м. Прогрессирование заболевания в последующие 7 дней, т.е. отсутствие положительного эффекта от применения дипроспана, приводило к назначению максимальной дозы СГК на 2-3 недели и 150 мг АЗА в течение 1,5 месяцев (накопление препарата). Затем при достижении положительного эффекта на 80-90% (возможно сохранение единичных эрозий на слизистых оболочках в стадии эпителизации и 1 -2 корочек на волосистой части головы)

19

доза АЗА снижалась до 100 мг в сутки. После снижения дозы СГК до 20 мг в сутки, дозу АЗА снижали до 50 мг сутки. Через 2-3 месяца на фоне снижения СГК по схеме медленного снижения малых доз у некоторых больных суточную дозу АЗА начинали назначать через день, затем и 2 раза в неделю. В летнее время сохранялся ежедневный прием АЗА в дозе не менее 50 мг в сутки.

Наиболее торпидными к проводимой терапии являлись высыпания, локализующиеся на коже волосистой части головы и лица, как у СР(+), так и у СР(-) больных.

У всех больных ИАП наблюдался синдром Иценко-Кушинга; у 17 СР(+) больных другими наиболее частыми осложнениями со стороны кожных покровов являлись пиодермии, микотические поражения, из общих осложнений - различные изменения со стороны сердечно-сосудистой системы.

Изучение экспрессии гена №-кВ у СР(+) и СР(-) больных ИАП в динамике на фоне терапии азатиоприном

Для обоснования действия АЗА как адьювантного препарата при лечении ИАП проводилось изучение экспрессии гена ОТ-кВ у СР(+) и СР(-) больных ИАП на фоне терапии СГК и АЗА.

Было выявлено, что группа СР(-) пациентов характеризовалась по относительному количеству кДНК гена ОТ-кВ медианой 74,36% и интервалом значений [65,39%-86,17%]; группа СР(+) - медианой 95,44% и интервалом значений [88,80%-98,61%].

При изучении экспрессии гена ОТ-кВ у СР(+) больных ИАП в процессе лечения АЗА в качестве адъювантной терапии было продемонстрировано, что уровень показателя снижался, достигая такового у СР(-) больных (рисунок 6).

50 м г АЗА

Порядковый номер больных ИАП

*- статистически значимые результаты

Рисунок 6. Динамика экспрессии кДНК NF-kB у СР(+) больных до и на фоне приема азатиоприна.

Проводился анализ клинических данных больных ИАП при изменении

экспрессии кДНК гена NF-kB у СР(+) больных ИАП на фоне терапии АЗА.

При сравнительном анализе экспрессии транскрипционного фактора

NF-kB до и в процессе терапии АЗА найдено статистически значимое

снижение экспрессии (р<0,01) у 8 (57%) СР(+) больных ИАП из 14.

При назначении АЗА пять больных из 8 демонстрировали

положительный клинический ответ в виде регресса высыпаний на 80% с

длительной полной ремиссией. У одной больной отмечалась

непереносимость АЗА, в связи с чем препарат был отменен. У других трех

больных наблюдалось торпидное течение кожного процесса: полной

ремиссии при назначении АЗА не наблюдалось, продолжали появляться

единичные элементы сыпи на лице, верхней части туловища. В динамике

уровень экспрессии гена NF-kB замедленно снижался у одного больного, у

которого длительно существовал очаг на коже волосистой части головы.

У двух больных с повышенной экспрессией мРНК ß-изоформы ГР и

двух пациентов со сниженной экспрессией мРНК а-изоформы начальный

уровень экспрессии гена NF-kB был высоким, отмечалось замедленное

снижение показателя по сравнению с другими пациентами что, вероятно,

способствует рецидивам ИАП на малых дозах АЗА и СГК.

Таким образом, на основании вышеизложенного можно предполагать,

что экспрессия гена NF-kB у всех больных ИАП повышена; вместе с тем,

21

скорость снижения уровня экспрессии гена ЫЯ-кВ в процессе терапии АЗА индивидуальна и не всегда отражает клиническую динамику заболевания.

При определении ТЫЯ-а у СР(+) и СР(-) больных ИАП статистически значимого влияния терапии СГК и АЗА на внутриклеточный уровень ЮТ-а у пациентов со СР(+) формой ПАП не наблюдалось.

ВЫВОДЫ

1. При ретроспективном анализе историй болезни у 44% больных ИАП из 123 наблюдается стероидная резистентность, которая проявляется обязательными обострениями уже в первый год от начала лечения СГК и ежегодными обострениями в последующем при отсутствии адъювантной терапии. Все больные ПНП (15%) являются стероидрезистентными (р<0,05).

2. При исследовании а- и Р-изоформ глюкокортикоидных, мембранных и внутриклеточных рецепторов у стероидрезистентных больных выявляется гетерогенность: у 14% больных наблюдается снижение экспрессии а-изоформы глюкокортикоидного рецептора - [52,85%; 55,44%] при среднем значении у стероидчувствительных больных - 69,17%, [интервал значений 65,03% - 80,28%] (р<0,05), у этих же больных отмечается низкое количество внутриклеточных рецепторов (за счет а-изоформы) - [0,77х103/клетку; 0,8><103/клетку] - при среднем значении - 1,08±0,15><103/клетку (р<0,05), у 14% пациентов - повышение экспрессии Р-изоформы глюкокортикоидного рецептора - [48,36%; 49,40%] при среднем значении - 33,99%, [интервал значений 15,03% - 40,25%] (р<0,05); у 7% - снижение количества мембранных рецепторов - [6,91 х 103/клегку] при среднем значении -10,32±1,03х103/клетку (р<0,05).

Все выявленные изменения на рецепторном уровне лежат в основе механизмов формирования стероидной резистентности и коррелируют с динамикой заболевания в процессе лечения.

3. На пострецепторном уровне гетерогенность у стероидрезистентных

больных сохраняется: у 28% пациентов при воздействии преднизолона на

включение 3Н-уридина в мРНК лимфоцитов обнаруживается пониженное

22

включение 3Н-уридина, что выражается в увеличении синтеза тотальной мРНК в лимфоцитах - [интервал значений 68,67%-78,35%] при среднем значении у стероидчувствительных пациентов - 51,55% [51,55±8,1%] (р<0,05), и также относится к механизмам развития резистентности.

4. У всех стероидрезистентных пациентов выявляется увеличение уровня экспрессии гена №-кВ в лимфоцитах [интервал значений 88,80%-98,61%] по сравнению со стероидчувствительными больными [интервал значений 65,39%-86,17%] (р<0,05), что позволяет трактовать стероидную резистентность как фенотипическое явление.

5. В результате сочетанной терапии СГК и азатиоприном у стероидрезистентных больных установлено снижение внутриклеточного уровня экспрессии гена ОТ-кВ (р<0,01) и "ПЧР-а, что лежит в основе стероид-сберегающего действия азатиоприна, включенного в разработанную схему преодоления стероидной резистентности у этих больных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Все больные ПНП (15%) являются стероидрезистентными, поэтому у больных ИАП необходимо проводить онкопоиск раз в год;

2. При развитии стероидной резистентности азатиоприн рекомендуется назначать на основании разработанного поэтапного алгоритма: максимальную дозу СГК на 2-3 недели и 150 мг азатиоприна в течение 1,5 месяцев. Затем при достижении положительного эффекта на 80-90% (возможно сохранение единичных эрозий на слизистых оболочках в стадии эпителизации и 1-2 корочек на волосистой части головы) дозу азатиоприна рекомендуется снижать до 100 мг в сутки и до 50 мг в сутки после снижения СГК до 20 мг в сутки. Через 2-3 месяца на фоне снижения СГК по схеме медленного снижения малых доз суточную дозу азатиоприна назначать через день, затем и 2 раза в неделю. В летнее время применять азатиоприн ежедневно в дозе не менее 50 мг в сутки;

3. Больным с пониженной экспрессией мРНК а-изоформы ГР, у которых обострения протекали без генерализации высыпаний, а отмечались лишь

23

единичные пузыри и эрозии азатиоприн рекомендуется назначать курсами; пациентам с повышенной экспрессией мРНК ß-изоформы ГР и сниженным количеством мембранных рецепторов, у которых наблюдается упорное течение кожного процесса с генерализацией высыпаний при обострениях, терапию поддерживающей дозой азатиоприна (50 мг/сут) следует проводить длительно.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Теплюк Н.П., Духанин A.A., Потекаев Н.С., Кочергин Н.Г., Лепехова A.A., Куприянова А. Возможные причины стероидной резистентности при истинной акантолитической пузырчатке и пути ее преодоления // Врач - 2013. - № 2. - С. 68-74.

2. Теплюк Н.П., Лепехова A.A. Клинические аспекты стероидной резистентности при аутоиммунной пузырчатке // Российский журнал кожных и венерических болезней - 2014. - № 2. - С. 13-16.

3. Духанин A.C., Теплюк Н.П., Лепехова A.A., Земскова О.В. Биохимические аспекты стероидной резистентности при аутоиммунной пузырчатке // Российский журнал кожных и венерических болезней - 2014. -№3. С. 25-31.

4. Алтаева A.A. Теплюк Н.П., Лепехова A.A. Триггерные факторы обострения пузырчатки в первый год от начала лечения и стероидная резистентность // Тезисы к Рахмановской конференции, Москва, 24 января 2014 г; http://www.dermatology.ru/abst:racts/31184/31255.

Подписано в печать 16.01.2015 г. Формат А5 Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 100 Экз. Заказ №309-1-15 Типография ООО "Ай-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39