Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Стандартизация комбинированных пероральных контрацептивов, содержащих в своем составе этинилэстрадиол

На правах рукописи

Денисова Татьяна Александровна

Стандартизация комбинированных пероральных контрацептивов, содержащих в своем составе этинилэстрадиол

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва-2015

005564533

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Садчикова Наталья Петровна - доктор фармацевтических наук, профессор Официальные оппоненты:

Сливкин Алексей Иванович — доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой фармацевтической химии и фармацевтической технологии ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет»

Потанина Ольга Георгиевна - доктор фармацевтических наук, директор центра научных исследований и разработок Центра коллективного пользования (Научно-образовательного центра) ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» Минобрнауки России.

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «16» декабря 2015 г. в 14— часов на заседании Диссертационного совета Д 208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНМБ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России по адресу: 119034, г. Москва, Зубовский бульвар, д.37, стр.1 и на сайте университета: www.mma.ru.

Автореферат разослан « с*^7» 15 г.

7

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 208.040.09, доктор фармацевтических наук,

профессор Дёмина Наталья Борисовна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В современных условиях проблема обеспечения качества лекарственных средств на международном, региональном и национальном уровне приобрела особое значение (1СН.2003, Федеральный закон РФ «Об обращении лекарственных средств, стратегия»). Принятый в России закон «О техническом регулировании (2003 г.) направлен на регулирование отношений, формирующихся в процессе исполнения требований к продукции, процессам производства, хранения, транспортировки и реализации. Все это в полной мере относится к области стандартизации лекарственных средств, а также - к оценке соответствия продукции.

Внимание к вопросам стандартизации и контроля качества лекарственных средств в России обусловлено рядом причин, в том числе: общим увеличением числа зарегистрированных лекарственных средств, среди которых подавляющее большинство - воспроизведенные (генерические) препараты; введением в медицинскую практику высокоактивных веществ природного и синтетического происхождения, применяемых в виде низкодозированных препаратов.

К их числу относятся гормональные контрацептивные средства, представляющие собой комбинированные препараты, содержащие эстроген и прогестаген. В качестве эстрогенного компонента используется главным образом этинилэстрадиол (ЭЭ) в дозировке от 0,020 до 0,035 мг. Прогестагенный компонент представлен производными 19-нортестостерона (левоноргестрел, гестоден), 17а-гидроксипрогестерона, реже спиронолактона с содержанием в одной таблетке 0,50-2,0 мг.

Степень разработанности темы исследования. Описанные в

литературе методы оценки качества и стандартизации комбинированных

пероральных контрацептивов (КПК) с различными гестагенами не

унифицированы, методики количественного определения действующих

веществ не позволяют с требуемой правильностью и воспроизводимостью

з

контролировать содержание действующих веществ. Присутствие на российском рынке преимущественно генерических препаратов, которые могут отличаться от оригинального составом вспомогательных веществ, технологией получения, требует обоснованного решения вопроса об их фармацевтической эквивалентности.

Цель исследования - разработка унифицированных методов контроля качества и стандартизации оригинального и генерических пероральных контрацептивов, содержащих этинилэстрадиол.

Задачи, решаемые для достижения поставленной цели

1. Провести информационно-аналитическое исследование по проблеме стандартизации лекарственных средств, содержащих ЭЭ и гестагенные компоненты.

2. Установить оптимальные условия определения ЭЭ, гестодена (Г), левоноргестрела (ЛН) и ципротерона ацетата (ЦА) методом ВЭЖХ.

3. Разработать унифицированную методику количественного определения действующих веществ в КПК с применением ВЭЖХ и провести ее валидацию.

4. Дать сравнительную оценку оригинального лекарственного средства Триквилар и воспроизведенного Три-Регол по показателю «Однородность дозирования действующих веществ».

5. По результатам испытания теста «Растворение» получить профили растворения таблеток Триквилар и Три-Регол трех типов, оценить их сопоставимость с помощью коэффициентов различия и подобия.

6. Доказать пригодность разработанной методики для контроля стабильность КПК при хранении.

Поставленные задачи решались путем критического анализа и обобщения данных литературы и результатов собственных экспериментальных исследований.

Научная новизна результатов исследования. Определены оптимальные хроматографические условия и разработана унифицированная,

4

селективная и воспроизводимая методика определения ЭЭ и гестагенных компонентов КПК с применением метода ВЭЖХ. Доказана применимость данной методики для контроля качества и стандартизации промышленных препаратов КПК.

В условиях теста «Растворение» проведено сравнительное изучение высвобождения ЭЭ и J1H из таблеток оригинального препарата Триквилар и генерического Три-Регол. На основании полученных результатов построены профили растворения. Результаты сравнительной оценки полученных профилей растворения таблеток I, И, III типов обоих препаратов позволяют считать Три-Регол фармацевтически эквивалентным препарату сравнения Триквилар.

Теоретическая значимость работы. Обоснованы условия хроматографического определения ЭЭ, JIH, Г и ЦА на основании расчета хроматографических характеристик: коэффициента емкости, числа теоретических тарелок, разрешения, фактора асимметрии пика. Рассчитаны коэффициенты подобия и различия полученных профилей растворения таблеток Триквилар и Три-Регол I, И, III типов по ЭЭ и JIH.

Практическая значимость результатов исследования. Унифицированная методика количественного определения ЭЭ, JIH, ЦА и Г в препаратах КПК с применением ВЭЖХ апробирована в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» и используется при аналитическом контроле этих лекарственных средств, а также с целью выявления фальсифицированных препаратов.

Получены профили растворения таблетированных форм, которые целесообразно использовать при выборочном контроле лекарственных средств, а также с целью подтверждения постоянства их состава и технологии производства в течение всего срока регистрации на территории Российской Федерации.

Данные о высвобождении ЭЭ и ЛН из препаратов КПК

рекомендуются для использования в исследованиях по оценке

5

эквивалентности препаратам сравнения других генерических лекарственных средств, содержащих ЭЭ и ЛН.

Методология и методы исследования. Теоретическую и методологическую основу исследований составляли современные подходы к анализу природных и полусинтетических стероидов, включая 17а-этинил-17-окси-19-норстероиды и этинилэстрадиол. В работе использованы методические рекомендации Международной конференции по гармонизации требований к регистрации лекарств (ICH) по оценке аналитических методик с помощью валидационных характеристик, а также положения фармакопейного анализа, развитые в фармакопеях ведущих стран мира.

Методология заключалась в выборе оптимальных хроматографических условий для количественного определения ЭЭ, JIH, Г и ЦА в КПК для последующего решения задач по унификации методов стандартизации, сравнительной оценки оригинального и воспроизведенного препаратов по показателям «Растворение» и «Однородность дозирования действующих веществ».

Основные положения, выносимые на защиту:

- оптимальные параметры ВЭЖХ для одновременного определения ЭЭ, ЛН, ЦА и Г;

- результаты валидации методики количественного определения ЭЭ и гестагенных компонентов в препаратах КПК;

- сравнительная оценка высвобождения ЭЭ и ЛН из оригинального препарата Триквилар и генерического Три-Регол и полученных профилей растворения таблеток I, II, III типов с помощью коэффициентов подобия и различия.

Степень достоверности результатов. Достоверность результатов обеспечена использованием современного сертифицированного оборудования, статистической обработкой результатов количественных определений, валидацией методики количественного определения ЭЭ, ЛН, Г

и ЦА в модельных смесях; апробацией предложенных методов контроля КПК на промышленных образцах препаратов.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены: на научно-практической конференции «Современные методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» (Москва, 2006 г.); на XII, XIV и XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006, 2007, 2008); на симпозиуме «Современные методы анализа лекарственных средств», являющегося частью 7-го Центрально-Европейского симпозиума по фармацевтическим технологиям и системам биодоставки (Любляна, 2008 г.); на межкафедралыюй конференции Фармацевтического факультета Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (Москва, 2014 г.).

Личный вклад автора. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки целей и задач, их экспериментальной реализации до аналитической и статистической обработки, научного обоснования, обобщения полученных результатов и рекомендаций по их внедрению. В публикациях, выполненных в соавторстве, автором лично проведено научное обоснование, анализ и обработка полученных данных.

Соответствие диссертации паспорту научной работы. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 -«фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 2 и 3 паспорта «фармацевтическая химия, фармакогнозия».

Публикации. По теме диссертации опубликованы 10 работ, из них 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках

научно-исследовательской программы ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М.

7

Сеченова «Разработка современных технологий подготовки специалистов с высшим медицинским и фармацевтическим образованием на основе достижений медико-биологических исследований» (номер государственной регистрации 01.2.006 06352). Тема работы включена в план научных исследований кафедры фармацевтической и токсикологической химии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова «Основные направления создания и оценки качества лекарственных средств».

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 120 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, включает раздел «Материалы и методы исследования», главу с результатами собственных исследований, общих выводов и списка литературы. Диссертация включает 41 таблицу и 24 рисунка. Библиографический список содержит 133 источника, из низ 82 - на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования. В работе использованы субстанции этинилэстрадиола, левоноргестрела, гестодена и ципротерона ацетата, отвечающие требованиям фармакопеи США 36, Европейской фармакопеи 2013 года и другой нормативной документации. Объектами исследования являлись: монофазные КПК: Диане-35, Микрогинон, Фемоден, производимые фирмой Шеринг ГмбХ и Ко. Продукционс КГ (Германия); трехфазные КПК, включающие три типа таблеток с различным содержанием ЭЭ и ЛН: 0,03 мг ЭЭ и 0,05 мг ЛН (I тип); 0,04 мг ЭЭ и 0,075 мг ЛН (II тип); 0,03 мг ЭЭ и 0,125 мг ЛН (III тип): Триквилар - оригинальный препарат, фирма-производитель Шеринг АГ, Германия и Три-Регол воспроизведенный препарат фирмы Гедеон Рихтер Лтд., Венгрия, а также стандартные образцы этинилэстрадиола, левоноргестрела, ципротерона ацетата квалификации Европейской фармакопеи и стандарт гестодена производства фирмы Gedeon Richter (Венгрия); плацебо, включающие

вспомогательные вещества, соответствующие составу каждого препарата.

8

Оборудование, использовавшееся в работе: весы Mettler AT 20 (Mettler Toledo Швейцария); микровесы XP2U (Mettler Toledo Швейцария); ВЭЖХ-система «Agilent 1200» с УФ-спектрофотометрическим детектором на диодной матрице (УФ-ДМ) и флуоресцентным детектором (Agilent technologies США); прибор для теста «Растворение»: Distek Evolution 6100.

Статистическая обработка результатов количественных определений проводилась с помощью пакета Microsoft Office Excel 2007. Хроматографические характеристики получены с использованием программного обеспечения ChemStation для LC 3D, версия А.10.02 [1757]. Расчет валидационных характеристик методик проводили с учетом рекомендации документа ICH «Валидация: терминология, методология» Q2(R1).

Оптимизация условий хроматографического определения этинилэстрадиола, гестодена, левоноргестрела, ципротерона ацетата

Для оптимизации условий хроматографического определения эстрогенного и прогестагенных компонентов КПК изучено их хроматографическое поведение на колонках с различными сорбентами, исследовано влияние состава подвижной фазы (ПФ) на разделение действующих веществ. На основании полученных данных установлены оптимальные условия хроматографического определения ЭЭ, Г, ЦА и J1H с целью разработки методики их определения в таблетках.

В результате информационно-аналитических исследований установлено, что для разделения изучаемых соединений, как правило, используется сорбент Cl 8 (октадецилсиликагель), подвижные фазы, включающие ацетонитрил, воду и метанол в различных соотношениях. Наряду с этим нами изучено хроматографическое поведение данных веществ на колонках Luna С8 и Luna Phenyl-Hexyl.

Выбор аналитической длины волны для детектирования основывался на УФ-спектрах поглощения ЭЭ и гестагенных компонентов КПК. В качестве аналитической была выбрана длина волны 215 нм.

В качестве подвижных фаз использовали смеси ацетонитрила и воды в соотношениях: 5:5; 4:6; 6:4, а также - ацетонитрила, метанола и воды в соотношениях: 3:2:5; 4:4:2. По результатам хроматографирования растворов стандартных образцов лекарственных веществ в различных подвижных фазах рассчитывали следующие хроматографические характеристики: коэффициенты емкости (К'), число теоретических тарелок (N), фактор асимметрии пика (Т), разрешение относительно ЭЭ (R). Данные, представленные в таблице 1, показывают, что подвижные фазы 1-4 позволяют получить сопоставимые хроматографические характеристики для колонок I и II: К' более 1,85; N - от 6405 до 12637, R между ЭЭ и Г - от 3,14 до 6,06, что доказывает их приемлемость для разделения исследуемых веществ. Для колонки III разрешение между ЭЭ и Г составляет менее 3. Для колонок IV и V фактор асимметрии пиков во всех используемых ПФ превышал значения этой характеристики, рассчитанные для других колонок.

В качестве ПФ предпочтение отдано смеси ацетонитрил-метанол-вода в соотношении 3:2:5 соответственно, в которой достигается симметричность пиков, оптимальные коэффициенты емкости и разрешение между пиками ЭЭ и Г.

Для дальнейшей работы мы использовали колонку Nova-Pak® С18, 150 х 4,6 мм, 4 мкм, на которой удалось сократить времена удерживания ЭЭ, Г, JIH и ЦА и добиться их хорошего разделения. Пики симметричны, колонка обладает достаточной эффективностью в отношении анализируемых соединений.

В качестве элюента для анализа была выбрана смесь ацетонитрила, метанола и воды (3:2:5), соответсвующая хроматограмма представлена на рис.1.

Таблица 1. Хроматографические характеристики ЭЭ и прогестагенных компонентов

Колонка Стандарт ПФ

Ацетонитрпл: вода (4:6) 1 Ацстонитрил:вода (5:5) 2 Ацетонитрил:вода (6:4) 3 Ацетонитрил:мстапол: вода (3:2:5) 4 Ацетонитрил: метанол:вода (4:4:2) 5

Nova-Pak Ь С18 150x4,6 мм, 4 мкм I ЭЭ N=10120; Т=1,05; К-9,83 N=8022; Т= 1,08; К-8,93 N=6405; Т=1,19; К-1,85 N=9903; Т=1,01; К=8,44 N=4541; Т= 1,13; К-1,12

Г N=10874; Т=1,05; R=6,06; К'= 12,74 N=9045; Т= 1,07; R=5,63; К'= 11,06 N=7345; Т=1,15; R=4,50; К'=2,35 N=9921; Т= 1,02; R=4,77; К.'= 11,04 N=5196; Т=1,20; R=l,95; К'=1,37

лн N=12637; Т= 1,06; R= 15,23; К'= 18,32 N=9936; Т=1,06; R=14,37; К'= 16,56 N=8214; Т=1,13; R=9,63; К'=3,23 N=11153; Т=1,02; R=12,69; К'= 15,14 N=5823; Т= 1,13; R=5,I2; К'=1,82

ЦА N=12098; Т=1,14; R=35,30; К-40,33 N=11039; Т= 1,06; R=31,88; К.'=33,63 N=9548; Т=1,14; R= 16,29; К-4,62 N=11667; Т=1,03; R=31,59; К-33,25 N=6511; Т=1,17; R=6,96; К'=2,09

Luna С 18(2) 150 х 4,6мм, 5мкм II ЭЭ N=10162; Т=1,03; К'= 16,85 N=9434; Т=1,03; К=7,73 N=7977; Т=1,12; К'=3,94 N=8562; Т=1,03; К'=8,67 N=6518; Т=1,18; К'=1,50

г N=9962; Т=1,02; R=4,11; К'= 18,42 N=9910; Т=1,04; R=3,14; К.'=8,91 N=8824; Т=1,10; R=3,29; К'=4,71 N=9518; Т=1,04; R=3,62; К.'=10,01 N=7085; Т=1,18; R=l,69; К'=1,74

лн N=10275; Т= 1,00; R=9,52; К-25,15 N=10055; Т=1.03; R=9,38; К'= 11,76 N=9176; Т=1,1(); R=8,34; К'=6,07 N=9881; Т=1,03; R=9,38; К,-17,29 N=7541; Т=1,13; R=5,53; К.'=2,29

цл N=9391; Т=1,03; R=26,59; К-56,60 N=10271; Т=1,03; R=23,80; К-22,00 N=9955; Т=1,05; R= 17,67; К'=9,39 N=9647; Т= 1,03; R=26,74; К-24,09 N=8175; Т=1,12; R=8,73; К-2,81

Hypersil BDS-С18, 150 х 4,6мм, 5мкм III ЭЭ N=9207; Т= 1,01; К.'=8,27 N=8163; Т= 1,02; К'=3,47 N=7065; Т=1,11; К.'=2,07 N=9982; Т= 1,02; К'=7,47 N=6852; Т= 1,03; К -1,25

г N=9774; Т=0,99; R=2,31; К-9,19 N=9057; Т=1,03; R=2,68; К.-4,02 N=7808; Т=1,10; R=2,70; К'=3,12 N=11087; Т=0,98; R=2,51; К'=8,05 N=6860; Т= 1,04; R=l,49; К'=1,87

лн N=9944; Т=0,99; R=9,53; К-12,74 N=9596; Т=1,02; R=8,10; К'=5,32 N=8263; Т=1,12; R=4,81; К'=4,85 N=9896; Т=0,98; R=8,63; К'=9,84 N=7099; Т= 1,05; R=4,07; К'=5,36

ЦА N=10125; Т=1,02; R=26,04; К'=28,70 N=10206; Т= 1,01; R= 19,49; К'=9,44 N=8564; Т= 1,11; R=9,14; К'=6,07 N=10087; Т=1,03; R=20,32; К'=20,63 N=7836; Т= 1,05; R=9,22; К'=8,71

Продолжение Таблицы 1.

Ьипа С8(2) 150 х 4,6мм, 5мкм IV ЭЭ N=10772; Т=1,12; К.'=9,88 N=10205; Т=1,20; К. =3,96 N=8096:1= 1,30; К-1,98 N=10670:1=1,12; К'=8,21 N=5923:1=1,38; К'=1,22

Г N=5771:1=0,862; Я=3,82; К'=11,99 N=11003:1=1,17; 11=3,47; К-4,68 N=9302; Т=1,26; Я=3,22; К'=2,42 N=10727:1=1,08; 11=2,67; К-9,22 N=6860; Т=1,18; к=1,73; К-1,42

ЛН N=15268:1= 1,10; (<=11,65; К'=16,96 N=11201; Т=1,18; 1*=8,69; К'=5,93 N=9599:1=1,28; 1<=6,93; К'=3,01 N=11218; Т=1,09; Я=10,57; К-12,88 N=7476; Т= 1,21; ]<=4,47; К-1,76

ЦА N=13418; Т=1,08; 11=32,01; К-35,86 N=11850; Т=1,14; Я=22,50; К'= 10,72 N=10919:1=1,20; Я= 14,64; К-4,50 N=11212:1=1,11; Я=26,93; К-27,59 N=7541:1=1,24; 11=7,02; К'=2,13

Ьипа РЬепу!- Неху! 150 х 4,6 мм, 5 мкм V ЭЭ N=12476; Т= 1,12; К.-11,17 N=10522; Т=1,17; К'=4,62 N=8105; Т= 1,21; К'=2,25 N=2456; Т=1,15; К-5,36 N=5513; Т= 1,01; К'=1,48

Г N=12751; Т=1,10; 11=4,18; К'=13,13 N=11163:1=1,15; Я=4.03; К-5,63 N=9245:1=1,18; Я=3,67; К-2,80 N=10679; Т=1,09: Я= 10,67; К-10,48 N=6816; Т=1,20; Я=1,98; К'=1,96

ЛН N=12850: Т=1,11; Я=] 5,87; К-9,18 N=11556; Т=1,14; 1*=8,69; К'=5,93 N=9954:1=1,26; И=6,44; К-3,26 N=11550; Т=1,06; Я= 16,36; К'= 13,26 N=6742; Т=1,20; Б!=5,42; К'=2,29

ЦА N=58812; Т=1,12; Я=40,67; К'=47,79 N=12513:1=1,10; К=24,06; К'=13,52 N=11357:1=1,18; 11= 16,26; К'=5,37 N=11403; Т=1,09; Я=22,17; К'= 16,74 N=5985; Т=1,21; 11=11,77; К'=3,54

\ЛЛ/01 А Дп Волны '21 5 мм <ТАГМУА\015Р0001 О)

я 5

Рис. 1. Хроматограмма стандартного раствора, содержащего 0,03 мг/мл ЭЭ, 0.15 мг/мл ЛН. 0,075 мг/мл Г, 0,2 мг/мл ЦА.

Таким образом, нами установлены оптимальные условия хроматографического разделения ЭЭ, Г, JIH и ЦА: колонка - Nova-Pak* С18, 150 х 4,6 мм, 4 мкм; подвижная фаза - ацетонитрил-метанол-вода (30:20:50); температура 21 °С; скорость потока 1,0 мл/мин; длина волны УФ-детектора 215 нм; объем вводимой пробы 20 мкл.

Пригодность системы оценивали по параметрам: эффективность колонки, фактор асимметрии пика, относительное стандартное отклонение и отношение сигнал/шум (табл. 2).

Таблица 2. Критерии пригодности хроматографической системы

Параметр Требования для данного метода

Число теоретических тарелок (N) по пику анализируемого соединения Не менее 4000 теоретических тарелок

Фактор асимметрии пика анализируемого соединения (Т) От 0,9 до 1,2

Относительное стандартное отклонение (RSD) площади пика анализируемого соединения при 6 повторных введениях Не более 1,5%

Отношение сигнал/шум (S/N) как предел количественного определения Не менее 10

Разрешение между этинилэстрадиолом и ближайшим к нему соединением Не менее 3,0

Разработка методики количественного определения компонентов комбинированных пероральных контрацептивов методом ВЭЖХ

На основании полученных результатов разработана унифицированная методика хроматографического определения ЭЭ, Г, ЦА и ЛН в составе КПК. Валидация методики проводилась по параметрам: специфичность, линейность, предел количественного определения (ПКО), прецизионность и правильность, с использованием результатов анализа модельных смесей, приготовленных согласно составу анализируемых препаратов.

Для доказательства специфичности методики ВЭЖХ определения ЭЭ и ЛН в препарате Микрогинон хроматографировали раствор модельной смеси, плацебо и стандартного раствора (рис. 1-3).

Рис. 2. Хроматограмма раствора Рис. 3. Хроматограмма раствора

плацебо таблеток Микрогинон. модельной смеси Микрогинон.

Времена удерживания пиков ЭЭ, ЛН на хроматограмме испытуемого раствора соответствуют временам удерживания аналогичных пиков на хроматограмме стандартного раствора (рис.1). На хроматограммах растворов плацебо отсутствуют пики с временами удерживания 9,5 мин, 16,8 мин, ЭЭ и ЛН, что подтверждает специфичность методики.

Линейность методики подтверждали, устанавливая зависимость площади хроматографического пика (среднее из 3 определений) каждого лекарственного вещества от концентрации в диапазоне от 80 до 120% от заявленного содержания в препарате. В результате исследования получены линейные зависимости площадей пиков ЭЭ и ЛН от концентрации добавляемых компонентов в растворе вида у = Ьх + а (для ЭЭ Ь = 59,872; а = 5,9413; для ЛН Ь = 30,503; а = 21,079), характеризующиеся высоким коэффициентом корреляции г (0,9998 для ЭЭ; 0,9997 для ЛН).

Предел количественного определения, установленный расчетным методом для ЭЭ и ЛН, составил 0,11 мкг/мл и 0,55 мкг/мл соответственно. Правильность подтверждали по результатам 10 определений на трех уровнях концентраций в диапазоне от 80% до 120% декларированного содержания лекарственного вещества в препарате.

Таблица 3. Оценка правильности методики определения ЭЭ и ЛН в модельных смесях методом ВЭЖХ (п = 3; Р = 0,95)

Модельная смесь препарата Микрогинона Содержание действующе го вещества, мкг (%) Метрологические характеристики

Хер. 8 ±ДХ е, % До, %

ЭЭ 24,0 (80) 23,80 мкг 99,17% 0,63 0,79 1,96 8,24 0,83

30,0 (100) 29,90 мкг 99,67% 0,39 0,62 1,54 5,15 0,33

36,0 (120) 35,93 мкг 99,80% 0,46 0,68 1,69 4,70 0,19

ЛН 120,0 (80) 119,77 мкг 99,80% 6,45 2,54 6,31 5,27 0,75

150,0 (100) 148,7 мкг 98,86% 6,01 2,45 6,08 6,15 0,87

180,0(120) 176,77 мкг 98,20% 7,13 2,67 6,63 3,75 1,79

Систематическая погрешность в области от 80% до 120% составляет для этинилэстрадиола от 0,19% до 0,83%; для левоноргестрела - от 0,75% до 1,79%.

Прецизионность (сходимость) результатов определения устанавливали по результатам 10 параллельных определений содержания ЭЭ, ЛН в модельных смесях. Критерием приемлемости служила величина относительного стандартного отклонения, которая не должна превышать 2,0 (табл. 4).

Таблица 4. Оценка сходимости результатов определения ЭЭ и ЛН в

модельной смеси (п = 10; Р = 0,95)

№ Аналитический сигнал, мВхс Содержание, мкг Метрологические характеристики

Этинилэстрадиол

1 376,821 30,64 Хер. 8 ±дх

2 364,032 30,18 30,39 0,60 0,43 1,41

3 356,737 29,67

4 372,569 30,28

5 384,921 31,14

6 379,905 30,05

7 350,364 29,41

8 378,967 30,47

9 380,873 30,78

10 387,442 31,26

Левоноргестрел

1 927,812 150,03 8 ±АХ 8,%

2 934,737 151,64 149,60 1,28 0,92 0,61

3 919,905 148,67

4 930,227 150,71

5 922,046 149,33

6 917,653 148,28

7 925,771 149,72

8 932,014 151,08

9 920,976 148,84

10 914,720 147,67

Полученные результаты свидетельствуют об удовлетворительной

воспроизводимости результатов эксперимента; относительная ошибка определения ЭЭ и ЛН с 95%-ной доверительной вероятностью составляет 1,41% и 0,61% соответственно.

Оценка качества промышленных образцов КПК по содержанию этинилэстрадиола и левоноргестрела Установленные нами условия хроматографического определения действующих веществ были использованы при разработке методики их определения в препаратах Микрогинон, Фемоден, Три-Регол, Триквилар, Диане-35.

Методика количественного определения ЭЭ и ЛН в препарате Микрогинон:

Приготовление раствора испытуемого образца

10 драже (точная навеска) помещали в колбу вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл подвижной фазы. Мерную колбу закрывали пробкой и обрабатывали ультразвуком в течение 30 мин. Полученную дисперсию тщательно взбалтывали, после термостатирования при комнатной температуре переносили в центрифужную пробирку и центрифугировали в течение 10 мин при 5000 об/мин. Прозрачный надосадочный раствор использовали для определения (концентрация этинилэстрадиола около 6 мкг/мл; левоноргестрела - около 30 мкг/мл).

Приготовление стандартного раствора

Около 3,0 мг стандартного образца этинилэстрадиола (точная навеска) и 15,0 мг стандартного образца левоноргестрела (точная навеска) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли в подвижной фазе, доводили объем раствора до метки тем же растворителем и перемешивали. 1 мл полученного раствора переносили в мерную колбу вместимостью 5 мл, доводили объем раствора до метки тем же растворителем и перемешивали (концентрация этинилэстрадиола 6 мкг/мл; левоноргестрела 30 мкг/мл).

Последовательно хроматографировали по 20 мкл испытуемого раствора и раствора стандартного образца.

Содержание ЭЭ и ЛН (Х,%) в драже рассчитывали по формуле:

Аш п х С . х р — -,

х сиа,

где Аисп - площадь пика ЭЭ или ЛН на хроматограмме испытуемого

раствора;

Аст - площадь пика ЭЭ или ЛН на хроматограмме стандартного

раствора;

Сет - концентрация ЭЭ или ЛН в стандартном растворе, мг/мл;

Снсп - концентрация ЭЭ или ЛН в испытуемом растворе, мг/мл;

Р - чистота стандартного образца ЭЭ (ЛН), %. Таблица 5. Результаты количественного определения ЭЭ и ЛН в

промышленных образцах препарата Микрогинон (п = 3; Р = 0,95)

Заявленное Полученные Среднее S.D. RSD, Еср.%

Серия количество, мкг результаты, мкг значение, мкг %

ЭЭ 29,5

24133В 30,0 29,2 29,5 0,3 1,02 2,51

29,8

ЛН 149,2

150,0 146,1 147,9 1,61 1,09 4,00

148,4

ЭЭ 30,8

30,0 31,0 30,9 0,12 0,39 0,96

24138В 30,8

ЛН 149,3

150,0 151,0 150,7 1,28 0,85 2,10

151,8

ЭЭ 29,3

30,0 29,5 29,4 0,10 0,34 0,84

24140В 29,4

ЛН 146,6

150,0 148,2 147,2 0,85 0,58 1,43

146,9

Данные табл. 5 свидетельствуют о соответствии содержания действующих веществ нормам, регламентированным фармакопеей США 36 для таблеток аналогичного состава.

Унифицированная методика количественного определения ЭЭ, ЛН, ЦА и Г в препаратах КПК с применением ВЭЖХ апробирована в ФГБУ «Научный Центр экспертизы средств медицинского применения».

Изучение стабильности КПК при хранении Стабильность анализируемых препаратов оценивали по количественному содержанию лекарственных веществ в таблетках в течение зарегистрированного срока годности (5 лет). Согласно нормативным требованиям содержание действующих веществ в препаратах должно находиться в пределах от 95,0% до 105,0% от заявленного. Определение содержания ЭЭ, ЛН, ЦА и Г в препаратах в течение срока годности

устанавливали с помощью разработанной методики. В табл. 6 приведены результаты контроля стабильности препарата Микрогинон.

Таблица 6. Результаты количественного определения ЭЭ и ЛН в препарате Микрогинон в течение срока годности

Микрогинон

№№ партии 24133В Дата начала испытаний 11.2003

Дата наработки 11.2003 Дата окончаний испытаний 11.2008

Упаковка Блистер из поливинилхлоридной пленки и фольги алюминиевой

Условия хранения 25°С±2°С/ Отн. вл. 60%±5%

Результаты анализа

Колич. содерж. % Срок хранения

0 мес 6 мес 12 мес 1 г 6 мес 2 г 2 г 6 мес Зг 3 г 6 мес 4 г 4 г 6 мес 5 лет

ЭЭ 99,1 98,9 99,2 99,4 98,8 98,6 98,4 98,7 98,3 97,9 97,4

ЛН 100,1 99,8 99,4 99,6 99,1 98,3 99,0 98,6 98,4 98,5 98,0

Как следует из результатов табл. 6, содержание ЭЭ и ЛН в таблетках

постепенно снижается от 99,1% и 100,1% соответственно на момент выпуска до 97,4% и 98,0% к истечению срока годности, оставаясь при этом в пределах регламентируемых норм.

Нами выявлено уменьшение содержания ЭЭ в Фемодене и Диане-35 от 99,8% для обоих препаратов на момент выпуска до 97,3% и 97,4% соответственно - по истечению срока годности, а также снижение содержания гестодена с 99,7% - на момент выпуска до 98,1% - по истечению срока годности, ципротерона ацетата - от 100,9% на момент выпуска до 98,3% - по истечению срока годности. При этом среднее значение каждого действующего вещества укладывалось в регламентируемые нормы.

Сравнительная оценка препаратов Триквилар и Три-Регол по показателям «Растворение» и «Однородность дозирования» Для сравнительной оценки оригинального КПК Триквилар и воспроизведенного препарата Три-Регол изучали высвобождение ЭЭ и ЛН

из таблеток трех типов с различными дозировками действующих веществ.

19

Исследование проводилось в соответствии с ОФС 42-003-04 «Растворение» и Фармакопеей США 36 на аппарате Distek Evolution 6100 (фирма «Distek») в следующих условиях: вращающийся элемент - лопастная мешалка; скорость вращения - 50 об/мин; среда растворения - 0,1 M хлористоводородная кислота; объем среды растворения — 500 мл; температура -37 ± 0,5°С; время отбора проб - 5, 10, 15, 20, 30, 40 мин.

Количественное определение ЭЭ и JIH проводили с помощью ВЭЖХ с флюоресцентным детектором (этинилэстрадиол) при возбуждении 280 нм и эмиссии 310 нм, а также УФ-детектора в области максимального поглощения 245 нм (левоноргестрел).

В качестве стандартов использовали растворы этинилэстрадиола и левоноргестрела в среде растворения с концентрацией 0,06 и 0,1 мкг/мл соответственно.

Рассчитывали среднее количество ЭЭ и ЛИ из 6 определений, высвободившееся из таблеток I, II, III типов за каждый промежуток времени. На основании полученных данных строили графики зависимости высвобождения этинилэстрадиола и левоноргестрела от времени (рис. 4-9).

из таблеток I типа. таблеток I типа.

Сопоставимость полученных кривых высвобождения оценивалась с помощью коэффициентов различия и подобия, которые целесообразно

учитывать при решении вопроса о фармацевтической эквивалентности оригинального и воспроизведенных препаратов. Для препарата Три-регол таблеток 1 типа коэффициенты различия (/}) профилей растворения составили по ЭЭ 4,19, по ЛН 4,89, коэффициенты подобия (/>) - по ЭЭ 73,08, по ЛН 70,10.

Три-Регол •Триквилар

"ри-Регол •Триквилар

Рис. 6. Кривая высвобождения ЭЭ из таблеток II типа.

Рис. 7. Кривая высвобождения ЛН из таблеток II типа.

Для таблеток 11 типа коэффициенты различия (/}) профилей растворения составили по ЭЭ 6,30, по ЛН 7,77, коэффициенты подобия (J\) - по ЭЭ 70,17, по ЛН 63,43.

л пп

Три-Регол Триквилар

Рис. 8. Кривая высвобождения ЭЭ Рис. 9. Кривая высвобождения ЛН из из таблеток III типа. таблеток III типа.

Для таблеток III типа коэффициенты различия (/)) профилей растворения составили по ЭЭ 3,81, по ЛН 4,37, коэффициенты подобия (/i) - по ЭЭ 76,45, по ЛН 72,65.

Полученные результаты подтверждают необходимость оценки качества низкодозированных таблетированных форм не только по показателю «Растворение», но и по профилю высвобождения.

Для оценки равномерности распределения действующих веществ в препаратах Триквилар и Три-Регол по отдельно взятым единицам дозированной лекарственной формы устанавливали количественное содержание ЛН и ЭЭ в каждой из 10 таблеток трех типов в соответствии с общими фармакопейными требованиями, используя разработанную нами методику. Критериями приемлемости служил норматив 85%-115% от заявленного количества действующего вещества в таблетке.

Таблица 7. Результаты определения однородности дозирования ЭЭ и ЛН в таблетках Триквилар и Три-Регол

Таблетки I типа (0,03 мг ЭЭ и 0,05 мг ЛН)

Триквилар Три-Регол Триквилар Три-Регол

Содержание этинилэстрадиола (% от заявленного) Содержание левоноргестрела (% от заявленного)

Х,рсд. 98,2 92,3 98,9 93,9

RSD,% 1,72 3,43 1,41 4,09

Таблетки II типа (0,04 мг ЭЭ и 0,075 мг ЛН)

Хсрсд. 99,1 92,8 98,9 94,9

RSD,% 1,30 3,18 1,59 3,52

Таблетки III типа (0,03 мг ЭЭ и 0,125 мг ЛН)

Хсрсд. 98,3 95,1 99,0 96,2

RSD,% 1,26 3,02 1,42 3,34

Как следует из представленных результатов, оба препарата соответствуют нормативным требованиям по показателю «Однородность дозирования», однако для таблеток Три-Регол всех типов отмечена большая по сравнению с препаратом Триквилар вариабилыюстъ содержания ЭЭ и ЛН в каждой таблетке. Причиной этого могут быть различия как в способах введения

лекарственных веществ в таблеточную массу, так и в составе вспомогательных веществ и их технологических характеристиках.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. На основании информационно-аналитических и экспериментальных исследований установлены оптимальные хроматографические условия определения ЭЭ, Г, JIH и ЦА методом ВЭЖХ: колонка Nova-Pak С18, 150 х 4,6 мм, 4 мкм; подвижная фаза - ацетонитрил-метанол-вода в соотношении (30:20:50); температура колонки 21°С; скорость потока 1,0 мл/мин; УФ-детектирование при 215 нм. Сформулированы критерии пригодности системы.

2. Разработана унифицированная методика количественного определения ЭЭ и гестагенных компонентов: Г, JIH и ЦА - в препаратах Диана-35, Микрогинон, Фемоден, Триквилар и Три-Регол с применением ВЭЖХ.

3. Установлены валидационные характеристики методики определения ЭЭ, ЛН, Г и ЦА в модельных смесях КПК. Охарактеризована специфичность, линейность в аналитической области 80% - 120% от декларированного содержания действующих веществ, сходимость и правильность.

4. Проведена количественная оценка равномерности распределения ЭЭ и ЛН в таблетках Триквилар и Три-Регол на основании результатов контроля по показателю «Однородность дозирования». Выявлено, что при соответствии нормам по показателю «Однородность дозирования» распределение ЭЭ и ЛН по отдельным таблеткам Три-Регола в отличие от Триквилара неравномерно, что может быть связано с различиями в способах ведения действующих веществ в таблеточную массу.

5. В результате изучения высвобождения ЭЭ и ЛН из таблеток трех типов

препаратов Три-Регол и Триквилар получены профили растворения,

рассчитаны коэффициенты подобия [( I тип - 73,08% - для ЭЭ, 70,10% - для

ЛН; II тип 70,17% - по ЭЭ, 63,43% - по ЛН; III тип: 76,45% - для ЭЭ, 72,65%

- для ЛН)] и различия [(I тип: 4,19% - для ЭЭ, 4,89% - для ЛН; II тип: 6,30%

23

- для ЭЭ, 7,77% - для ЛН; III тип: 3,81% - по ЭЭ, 4,37% - по ЛН)], что дает основание считать эти КПК фармацевтически эквивалентными. 6. Доказана пригодность разработанной методики для контроля стабильности промышленных образцов КПК при хранении (25°С±2°С/ Отн. вл. 60%±5%). Показано, что в течение заявленного срока годности количественное содержание действующих веществ остается в пределах регламентируемых норм: от 95,0% до 105,0% от заявленного.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Использование теста «Растворение» в оценки качества оральных контрацептивов Триквилар и Три-Регол / Денисова Т.А., Нечаева Е.Б., Садчикова Н.П. // Всероссийская научно-методическая конференция «Фармобразование - 2005». Пути и формы совершенствования фармацевтического образования»: сб. материалов конф. - Воронеж. - 2005 г. -С. 330-331.

2. Сравнительная оценка качества оральных контрацептивов Триквилар (Schering, Германия) и Три-Регол (Gedeon Richter, Венгрия) / Багирова В.Л., Денисова Т.А., Садчикова Н.П., Нечаева Е.Б. // XIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: сб. материалов конф. -Москва, 3-7 апреля 2006. - С.743.

3. Разработка метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для количественного определения комбинированных оральных контрацептивов, содержащих в своем составе эстроген и прогестаген / Денисова Т.А., Багирова В.Л., Садчикова Н.П., Нечаева Е.Б. // XIV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: сб. материалов конф. - Москва, 16-20 апреля 2007. - С.817.

4. Использование метода высокоэффективной жидкостной

хроматографии для определения показателя «Растворение» таблетированных

форм оральных контрацептивов, содержащих этинилэстрадиол и гестоден /

Денисова Т.А., Садчикова Н.П., Нечаева Е.Б. // XV Российский

24

национальный конгресс «Человек и лекарство»: сб. материалов конф. -Москва,14-18 апреля 2008. -С.536.

5. Сравнительная оценка высвобождения этинилэстрадиола и левоноргестрела из таблетированных форм / Денисова Т.А., Садчикова Н.П., Нечаева Е.Б. // Вестник Воронежского государственного университета. Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2008. - N1. - С.131 -135.

6. Количественное определение компонентов комбинированных гормональных контрацептивных средств методом ВЭЖХ / Денисова Т. А., Чистяков В. В., Садчикова Н. П. // Химико-фармацевтический журнал. -2008. - Т.42. - N5. - С.40-42.

7. Исследование высвобождения и однородности дозирования этинилэстрадиола и левоноргестрела из таблетированных форм гормональных контрацептивных средств / Денисова Т.А., Садчикова Н.П. // Проблемы репродукции. - 2010. - N3. - С.117-124.

8. Разработка методики хроматографического определения этинилэстрадиола и ципротерона ацетата в комбинированных пероральных контрацептивах / Денисова Т.А., Садчикова Н.П., Нечаева Е.Б. // XX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство»: сб. материалов конг. - Москва,15-19 апреля 2013. - С.327 - 328.

9. Определение содержания этинилэстрадиола и ципротерона ацетата в комбинированном препарате методом ВЭЖХ / Денисова Т.А., Нечаева Е.Б., Садчикова Н.П. // Ведомости НЦ ЭСМП. - 2013. - N4. - С.4 - 7.

10. Исследование однородности дозирования и высвобождения этинилэстрадиола и ципротерона ацетата из гормональных комбинированных пероральных контрацептивных средств / Карева E.H., Денисова Т.А., Тихонов Д.А., Садчикова Н.П. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2014. - Nil. -С.45-50.

Денисова Т.А.

Стандартизация комбинированных пероральных контрацентивов, содержащих в своем составе этинилэстрадиол

Директор издательства Г.В. Кондратов

Подписано в печать 08.10.2015. Формат 60x84/16. Гарнитура Newton. Бумага офсетная. Печать цифровая. Тираж 90 экз. Заказ № 151033.

Издательство Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М. Сеченова 119991, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2. Тел.: (495) 609-14-00 (доб. 3018) Официальный сайт: www.mma.ru