Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Сравнительный и исторический анализ методического прогресса в аллергологии

На правах рукописи

005008777

ВОРОБЬЕВА ОЛЬГА ВАДИМОВНА

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ И ИСТОРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МЕТОДИЧЕСКОГО ПРОГРЕССА В АЛЛЕРГОЛОГИИ: АЛЛЕРГЕН-СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ИММУНОТЕРАПИЯ

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 ОЕВ 2012

Москва, 2012 г.

005008777

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Государственный научный центр Институт иммунологии» Федерального медикобиологического агентства

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Гущин И.С.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских цаук Курбачева О.М.,

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Балаболкин И.И.

Ведущая организация:

ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздравсоцразвития России

Защита состоится 2012 года в 14 часов на заседании

диссертационного совета }Х208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу: 115478 Москва, Каширское шоссе, 24, корп. 2. Факс (495) 617-10-27

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.

Автореферат разослан

года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Л.С. С^юґавина

Актуальность проблемы. Метод аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ) имеет 100-летнюю историю и принадлежит к числу эффективных, активно применяемых современных способов лечения таких IgE-опосредованных заболеваний, как риноконъюнктивиты, вызванные сезонным воздействием пыльцы деревьев и трав, а также круглогодичным контактом с домашней пылью, перхотью животных, плесенью, атопическая бронхиальная астма, реакция на яды жалящих насекомых.

Метод АСИТ после его создания в 1911 г. развивался и модифицировался в Европе и США. В России он начал применяться с 1960-х годов благодаря трудам А.Д. Адо и его школы. В этот период Ю.А. Порошина разработала и внедрила в практику АСИТ, ее модификации, схемы применения, установила клиническую значимость блокирующих антител в поддержании лечебного действия АСИТ и др. Т.С. Соколова внедрила АСИТ в педиатрическую аллергологию. С.М. Титовой был налажен выпуск диагностических и лечебных аллергенов. В.А. Фрадкин организовал и возглавил государственный контроль производства и качества аллергенов в стране. А.И. Остроумов (Краснодар) стал инициатором и создателем аллергологической службы, в том числе АСИТ, в зонах широкой распространенности аллергических заболеваний.

Открытие в 1966 г. IgE дало мощный толчок развитию и совершенствованию метода АСИТ. Появилась огромная литература по данному вопросу, которая требует постоянной текущей и прогностической оценки, а в отдельных случаях - и ретроспективной. Если 25-30 лет назад отмечалось абсолютное преобладание зарубежных источников (Norman P.S., Lichtenstein L.M., Frankland A.W., Creticos P.S., Scadding G.K., Bukantz S.C., Bousquet J., Lockey R.F., Mailing H.-J. и др.), то в последние десятилетия стало нарастать число отечественных публикаций (Петров Р.В., Хаитов P.M., 2011; Хаитов P.M., 1993, 1994, 2002; Гущин И.С., 1998, 2002, 2007, 2010; Балаболкин И.И., 1996, 1997, 2000, 2006; Ярилин А.А.; 1994, 1998; Ильина Н.И., 1999, 2001, 2004, 2006; Курбачева О.М., 2003, 2007, 2011 и др.; Лусс Л.В., 1999, 2003, 2004; Федосеева В.Н., 1999, 2009; Федоскова Т.Г., 2004, 2010 и др.). Был выполнен ряд диссертаций по проблеме АСИТ, среди них кандидатские работы Павловой К.С. (2005), Студеникиной Е.В. (2006), Филянской Е.Г. (2003); Дробик О.С. (2006), Разваляевой А.В. (2006) и др. Была защищена докторская диссертация О.М. Курбачевой (2007). Поэтому

представляется целесообразным проведение специальных аналитических исследований

по суммированию и анализу информационных данных.

I ' . '

Согласно научным традициям, особенно тщательный сравнительноисторический анализ принято приурочивать к крупным юбилейным датам. К ним относится и широко отмечаемое научной общественностью 100-летие открытия АСИТ английскими исследователями Л. Нуном и Дж. Фрименом. За рубежом на это историческое событие отреагировал ряд специалистов, что выразилось как в целенаправленных публикациях, конференциях, так и в выпуске специальных номеров профильных журналов. На организованном РААКИ XI Международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» в Москве в июле 2011 года 100-летней дате со времени открытия АСИТ было также уделено внимание. Однако в отечественной литературе пока не наблюдается активности, сравнимой с таковой иностранных аллергологов.

В связи с вышеупомянутым представляется актуальным проведение систематического историко-медицинского исследования проблемы АСИТ с позиций отечественной аллергологической школы и общепринятых мировых стандартов. За рубежом имеется ряд высокопрофессиональных обзоров и глав в руководствах по проблеме АСИТ, выполненных в историческом аспекте (Cohen Sh.G., Evans R., 2008; Silverstein A.R., 2009). Тем не менее анализ литературы на русском языке выявил, что этой теме не придается должного значения: исторический ракурс обычно

преподносился конспективно, схематично, без соответствующего анализа. В отечественных специальных книгах, посвященных истории иммунологии или аллергологии, тема АСИТ разработана, как правило, без углубления в детали.

Помимо юбилейного аспекта, целенаправленное историко-медицинское исследование развития и совершенствования метода АСИТ позволяет сделать необходимые выводы путем систематизации и обобщения разрозненных, преемственно накопленных фактов. Особенно это значимо для всестороннего анализа эффективности и безопасности существующих вариантов метода, а также поиска новых перспективных подходов, включая улучшение стандартизации аллергенов, диверсификацию путей их введения, внедрение рекомбинантных технологий и др.

Цель исследования - провести сравнительно-исторический анализ базовой отечественной и мировой литературы о развитии теории, методологии и практики метода АСИТ с момента его открытия до настоящего времени.

Задачи исследования:

1. Изучить и классифицировать исторические предпосылки, обстоятельства открытия и ключевые события начального периода совершенствования метода АСИТ (до 1920-х годов).

2. Дать историческую ретроспективную оценку развития метода АСИТ в 1920— 1960-е годы (до обнаружения 1§Е).

3. Проанализировать современный этап развития метода АСИТ, начиная с открытия 1§Е и внедрения в аллергологию методов клеточной и молекулярной биологии.

4. Исследовать вопрос об эффективности и безопасности метода АСИТ на основе анализа контролируемых исследований, в том числе одно- и многоцентровых исследований и мета-анализов.

5. Проследить процесс раскрытия и оценить нынешнее состояние проблемы механизмов АСИТ.

6. Рассмотреть вопрос стандартизации аллергенов, включая современные подходы с использованием генно-инженерных технологий.

7. Суммировать и обобщить прогностические оценки перспектив развития метода АСИТ.

Научная новизна. В отечественной литературе не предпринимались подобные историко-медицинские исследования проблемы АСИТ с широкой постановкой задач. В результате проведенного исследования впервые удалось воссоздать преемственную историческую динамику развития метода АСИТ, провести периодизацию основных этапов его модификации и совершенствования, в том числе характеризацию предшествующей фазы, создавшей предпосылки создания метода, выделить выдающихся исследователей, знаковые события, факты и публикации по данному вопросу.

Впервые был сделан акцент на специальный ретроспективный анализ персонального вклада отдельных иностранных и российских ученых в развитие метода АСИТ.

Впервые в отечественной литературе осуществлен суммарный анализ в историческом аспекте работ по АСИТ, проведенных с применением методов доказательной медицины, включая одно- и многоцентровые контролируемые исследования, а также мета-анализы.

Практическая значимость.

Полученные в результате исследования данные, представляющие собой обобщение как исторической, так и современной информации в области теории, методологии и практики АСИТ, имеют значение для профильных специалистов (аллергологов, иммунологов) и других медицинских специальностей.

Материалы диссертации могут быть использованы в подготовке методических рекомендаций и пособий для практических врачей.

Обнаруженные в процессе работы закономерности и особенности исторического развития метода АСИТ могут быть применены при составлении учебных курсов в системе непрерывного последипломного образования, в том числе при проведении образовательных школ для аллергологов и иммунологов, а также специалистов сопряженного профиля: дерматологов, ЛОР-врачей, врачей общей практики и др.

Собранная, классифицированная и интегрированная база данных о развитии метода АСИТ может оказаться полезной при проведении научно-методической работы по данной проблеме.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. На основании проведенного анализа делается заключение, что АСИТ является наиболее адекватным методом лечения ^Е-опосредованных аллергических реакций, обладающим эффективностью, безопасностью и экономической целесообразностью.

2. Сублингвальный вариант АСИТ становится реальной альтернативой традиционно применяемому подкожному способу введения аллергена из-за сравнимых показателей лечебной эффективности и особенно безопасности.

3. Перспективы развития метода АСИТ представляются во внедрении рекомбинантных технологий в производство аллергенов и ДНК-вакцин, совершенствовании стандартизации метода, диверсификации путей введения аллерговакцин.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на XI Международном конгрессе «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммунофармакологии» (Москва, 2011), VII Междунаро " конференции по

реабилитологии (Москва, 2011), X Всероссийском конгрессе , , эфессия и здоровье»

(Москва, 2011). /

Апробация диссертации проводилась на заседания секции № 3 Ученого совета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России 13 декабря 2011 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 8 статей - в изданиях, рекомендованных ВАК для печатания научных результатов кандидатских и докторских диссертаций.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа изложена на 159 страницах машинописного текста, включает в себя 5 таблиц, 10 рисунков и состоит из: «Введение», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Практические рекомендации», «Список литературы», содержащий 342 наименования, в том числе 89 опубликованных в отечественной, 253 - в зарубежной печати.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили массивы информации, посвященные проблеме АСИТ за 100-летний период ее применения. Всего за 4 года исследования было изучено более 1000 отдельных источников литературы, из них была отобрана базовая литература в объеме свыше 300 первоисточников, которые были исследованы по правилам историко-медицинского исследования.

Источником информации являлись как разрозненные публикации по теме, так и обобщенные сведения в виде обзоров, рефератов, монографий, руководств, диссертационных исследований, согласительных документов международных и национальных организаций, научных обществ и ассоциаций (ВОЗ, WAO, EAACI, РААКИ и др.), «белых книг», консенсусов специальных групп экспертов и т.д. Работа, как правило, велась по оригинальным публикациям. Вторичная информация принималась во внимание только по обзорам авторитетных исследователей и руководствам или в качестве ключа при осуществлении информационного поиска.

Важную информационную базу представляли такие периодические информационные издания с интегральными данными, как «Index Medicus», РЖ «Биология» (с 1950-х годов) с акцентом на специальный выпуск серии 53 «Иммунология. Аллергология» (с 1978 г.; ныне - серия 04к); «Итоги науки и техники» ВИНИТИ по иммунологии (1968-1992) и др.

Был осуществлен выборочный просмотр за последние 30 лет ведущих отечественных профильных журналов («Физиология и патология иммунной системы», «Иммунология» и др.). Среди зарубежных журналов изучались такие авторитетные журналы, как «J. of Immunology», «J. of Allergy and Clinical Immunology», «Allergy».

Постоянно отслеживались все базовые документы международных и национальных организаций (WAO, EAACI, РААКИ и др.), вышедшие за последние годы. Кроме того, проводился тотальный анализ за последние 10 лет публикаций по теме АСИТ в базовых российских и иностранных журналах по аллергологии и иммунологии.

Объектом пристального изучения явились основные руководства и монографии научных лидеров в области аллергологии, вышедшие в свет за столетний период применения АСИТ.

Особо следует подчеркнуть значение электронных источников информации. Здесь были максимально использованы Интернет-ресурсы: базы данных PubMed, MEDLINE, Embase, Cochrane и др., а также проводилось отслеживание текущей информации в постоянном режиме (наряду с электронными архивными документами).

Методы. В работе использовался метод сравнительного анализа, принятый в историко-медицинских исследованиях. Он состоит в сочетании двух подходов: предметного анализа и персонального анализа.

Для решения вопроса об эффективности и безопасности АСИТ в историческом и текущем аспекте привлекались исследования, выполненные с применением методов доказательной медицины (то есть контролируемые исследования), в том числе одно- и многоцентровые исследования и мета-анализы.

Как правило, осуществлялись прогностические оценки тех или иных концепций или практических разработок. Для этих целей использовали форсайтные анализы, проведенные крупными специалистами в области АСИТ.

В работе применяли общепринятые методы составления таблиц с хронологией событий (периодизация), с систематизацией данных по классификационным признакам (общность темы, временная динамика, авторская принадлежность и т.д.). При необходимости использовались обычные статистические методы обработки данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исторические предпосылки создания метода аллерген-специфической иммунотерапии

1.1. Периодизация открытия и развития метода

Вначале была осуществлена систематизация базовой литературы и проведена периодизация событий, фактов и персональных вкладов в создание и дальнейшее развитие метода АСИТ. При этом были выделены четыре стадии:

- донаучная стадия - от древних мифов до константинопольской вариоляции XVIII века;

- эмпирическая стадия - от Э. Дженнера до Л. Нуна и Дж. Фримена (1911);

- «интуитивная» стадия (стадия гипотез) - от работ А.Ф. Кока, Р. Кука, Праусница - Кюстнера (20-30-е годы XX века) и до открытия IgE Ишизака (1966);

- стадия «истинного» (достоверного) знания - от открытия IgE до настоящего времени.

1.2. Суть открытия

1911 год стал рубежным - отсюда ведет начало аллерген-специфическая иммунотерапия. Несмотря на эмпирику и использование некорректных теоретических основ исследования Леонарда Нуна и Джона Фримена дали клиницистам убедительные доказательства эффективности метода лечения аллергии, что во многом обеспечило его скорейшее внедрение во всем мире. Авторы открытия впервые дали исследователям и клиницистам надежный инструмент лечения вначале поллинозов, а затем более широкого спектра аллергических IgE-опосредованных заболеваний. Протоколы экспериментов Нуна и Фримена хорошо известны и неоднократно описаны в литературе. В диссертации данный вопрос освещен более подробно, с описанием личного вклада обоих исследователей и анализом их первых публикаций 1911-1914 гг.

Вопрос о приоритетности открытия Нуна и Фримена не требует специальных изысканий и решается однозначно: существуют две первые в мире публикации 1911 года в авторитетнейшем медицинском журнале «Lancet» под именами Леонарда Нуна и Джона Фримена.

Следовательно, в данном направлении был проанализирован и оценен ряд конкретных вопросов: о предпосылках и предшественниках открытия, приоритете, внедрении и развитии метода, дана общая историко-медицинская оценка этого заметного события в аллергологии. Подчеркнута роль научной школы выдающегося английского иммунолога А. Райта в инициации применения иммунотерапии как эффективного гипосенсибилизирующего средства.

2. Анализ развития и совершенствования АСИТ (на протяжении столетия)

2.1. 20-60-е годы XX века

Проанализированный период 1920-1960 гг. свидетельствует о значении научных школ и научных лидеров. Это видно и на примере европейских школ (Пастеровский

институт, Институт Райта, кафедра Пфейфера в Бреслау), так и американских, которые бурно развивались в начале XX века, имея прочную базу подготовки в лучших университетах Европы и фундамент знаний медицины XIX столетия.

Важно подчеркнуть также, что в части исследований по проблеме АСИТ и вообще аллергологии 20-60-х годов нередко опережался уровень существовавших на то время представлений.

2.2. Открытие IgE

При анализе исторического развития метода АСИТ целесообразно более подробно рассмотреть значение открытия IgE (этой теме посвящено довольно много сообщений, в основном ретроспективного характера). К моменту активизации в начале 1960-х годов поисковых работ по выявлению антитела - носителя реагиновой активности (будущего IgE) - уже были известны три Ig: IgG, IgA (1959 г.), IgM; четвертый Ig - IgD был идентифицирован в процессе этих исследований в 1965 г. Rowe D.S., Fahey J.L. Сам факт открытия IgE по достоинству оценен специалистами, однако обстоятельства данного события часто преподносятся без детализации. Между тем существуют воспоминания главных его участников, которые целесообразно объективно прокомментировать, поскольку имеется элемент предвзятости в оценках. Абсолютный приоритет открытия IgE, безусловно, принадлежит работавшим в Денвере (США) супругам Кимишеги и Терука Ишизака: и по реальному времени (1966 год) - на один год раньше Г. Йоханссона, (1967), и по предшествующей серии работ, последовательно приближавшейся к цели.

Итак, открытие IgE и установленная его связь с аллергической реакцией I типа создали реальную основу для углубленных исследований химических и клеточных механизмов аллергии и соответственно поиска средств лечения.

2.3. Формирование современных представлений об аллергических реакциях

1970-1980-е годы стали периодом интенсивного накопления фактов в аллергологии и иммунологии (открытие Б.И. Самуэльсоном лейкотриенов, за что он был удостоен Нобелевской премии в 1980 г.; обнаружение лимфокинов, описание интерлейкинов различных типов - IL-4 и др.). Это позволило создать первую интегральную схему аллергической реакции I типа, которая получила наименование аллергического (или воспалительного) каскада. На фоне тех лет она обладала преимуществом перед современными сложными, утяжеленными деталями схемами -

ясностью и относительной простотой, поскольку строилась на немногочисленных, но достаточно достоверных данных.

За прошедшие почти полвека после открытия IgE молекулярно-биологический уровень исследований позволил значительно продвинуться в понимании сущности аллергического процесса. Исторический метод позволяет проследить преемственность накопления фактов и подвести к высокой планке современного состояния данной проблемы. Здесь имеются и веховые теоретические события (как, например, открытие МНС I-рестрикции при Т-клеточном распознавании П. Догерти и Р. Цинкернагелем, всесторонний анализ цитокинов, простагландинов и т.д.), были и методические прорывы (разработка гибридомной техники, получение МАТ, ПЦР-метод, генная инженерия, геномные и постгеномные технологии).

В результате сейчас теоретики и практики аллергологии имеют возможность опираться на руководства, включающие в себя обобщенные схемы, подготовленные специалистами. Принято выделять три фазы IgE-опосредованной аллергической реакции I типа: сенсибилизация и память, ранняя фаза, поздняя фаза.

Таким образом, во втором направлении был рассмотрен в историческом плане период 20-60-х годов, когда происходило дальнейшее развитие метода АСИТ. Этот период обычно ускользал от внимания исследователей, и поэтому он был изучен автором особенно тщательно. Был сделан акцент на анализе гипотез о реагинах, блокирующих антителах; модификации оригинального метода Нуна и Фримена: терапия «ударными» («rush») дозами аллергенов, применение депо-вакцин и адъювантов; осуществлении в 1950-1960-е годы первых контролируемых исследований эффективности и безопасности АСИТ. Был рассмотрен вклад отечественных ученых (в основном АД. Адо и его школы) в развертывание масштабов применения АСИТ в стране. Показано значение открытия IgE для прогресса метода АСИТ. Проанализирована динамика накопления фактов клеточно-молекулярного уровня для исследования отдельных элементов и фаз аллергической реакции.

3. Анализ контролируемых исследований эффективности и безопасности АСИТ

3.1. Рандомизированные, двойные слепые, плацебо-контролируемые исследования

Контролируемые исследования 1980-х и последующих лет. Первые контролируемые исследования аллерген-специфической иммунотерапии, как уже указывалось, проведены в 50-60-х годах XX века, однако это были единичные работы,

не соответствовавшие правилам доказательной медицины. Лишь только начиная с 1980-х годов появились исследования, отвечающие современным требованиям, в том числе рандомизироваиные, двойные слепые, плацебо-контролируемые, одно- и многоцентровые, мета-анализы. При этом продолжало нарастать число контролируемых исследований (randomized controlled trials - RCT) по наиболее распространенному, давно используемому варианту АСИТ - подкожной иммунотерапии (ПКИТ) - и постепенно увеличивалось количество работ по сублингвальной иммунотерапии (СЛИТ), предложенной в 80-е годы и набирающей все большее число приверженцев в Европе, Южной Америке, Австралии (кроме США, где пока нет разрешения FDA на ее клиническое применение). К 2010 г. вышло 139 RCT по ПКИТ, к 2009 году 81 - по СЛИТ. Параллельно появлялись аналитические обзоры, согласительные документы, руководства, Кокрановские обзоры, клинические рекомендации международных и национальных организаций, обществ, ассоциаций, включая ВОЗ, WAO, EAACI, AAAAI, РААКИ и др. Определенное время важную рекомендательную функцию для специалистов разных стран выполняла WHO position paper 1997 (Bousquet J., Lockey R.F., Mailing H-J., 1998), но в последние годы появились новые, более современные руководства (Canonica G.W., 2007; Canonica G.W., Bousquet J., 2009; Cox L., Nelson H., 2011 и др.).

Анализ контролируемых исследований АСИТ 80-х годов XX века - 2000-х годов. Для получения общего представления о контролируемых исследованиях за указанный период был выбран ряд работ, наиболее часто цитируемых в литературе. Их краткая характеристика с изложением сути проведенных масштабных исследований дана в таблице 1 (ПКИТ и СЛИТ не разделялись)

Таблица 1. Контролируемые исследования АСИТ

№ п/п Литературная ссылка ' Диагноз, число больных, метод Результат

1 Norman P.S, 1982 Поллиноз. Пыльца амброзии. П/к инъекции аллергоида амброзии в сравнении с плацебо и ВСЭ амброзии (аллергеном). Оценка симптомов в двух группах с аллергоидом и аллергеном дает лучшие значения по сравнению с плацебо. Некоторое преимущество отмечается в группе с введением аллергоида.

2 Bousquet J., 1989 Поллиноз. Р ино коньюнктивит и БА. П/к инъекции различных аллергоидов пыльцы трав: фракционированный, высокомолекулярный формалинизированный и нефракцнонированнын аллергоиды. Контроль - плацебо и стандартный ВСЭ аллергена. Фракционированный аллергоид вызывает меньшие системные реакции (как при плацебо), тогда как у 20% пациентов, получавших нефракционированный аллергоид, и у 5,5% больных, получавших стандартный ВСЭ аллергена, отмечались тяжелые системные реакции.

3 Olsen O.T., 1997 БА. Клещ домашней пыли. П/к инъекции. 31 взрослый пациент (23 закончили исследование) Через 1 год отмечается достоверное уменьшение потребления лекарств: ингаляционных стероидов (38%), агонистов р2-адренорецептороа (46%). Оценка симптомов - подавление на 57%.

4 Litwin A., 1997 Поллиноз. Пыльца амброзии. Оральное введение (новый метод микроинкапсулирования аллергена). 21 взрослый пациент. Показатели симптомов и расходов на лекарства меньше в основной группе, чем в группе плацебо. Различия достоверны в подгруппе, устойчивой к высоким дозам аллергена - более 20 мкг (19 из 21 больного).

5 Naclerio R.M., 1997 Поллиноз. Пыльца амброзии. Аллергический ринит. П/к введение. 20 взрослых пациентов. Длительность лечения - 3 года. Через 1 год после проведения АСИТ назальные симптомы частично возобновлялись.

6 Adkinson N.F., 1997 БА (круглогодичная). П/к инъекции нескольких аллергенов. Педиатрия. 121 ребенок. Результат отрицательный - АСИТ в течение более 2 лет оказалась неэффективной.

7 Passalacqua G., 1999 Поллиноз. Пыльца Parietaria. Сезонный риноконъюнктивит. 30 взрослых больных (из них 13 с легкой БА). Сублингвальное введение: ударные дозы. СЛИТ в ударных дозах безопасна и клинически эффективна - снижает опосредованную иммунными механизмами воспалительную реакцию.

8 Walker S.M., 2001 Поллиноз. Сезонный ринит и БА. 44 взрослых пациента. П/к инъекции. Иммунотерапия улучшает качество жизни при сезонном аллергическом рините и снижает симптомы и бронхиальную гиперреактивность сезонной БА.

9 Pajno G.B., 2002 БА. Клещ домашней пыли. Педиатрия. 24 ребенка 8-15 лет. Сублингвальное введение. Длительность лечения - 2 года. СЛИТ клинически эффективна и безопасна, достоверно снижает респираторные симптомы у детей с астмой от легкой до умеренной степени тяжести, чувствительных к клещу домашней пыли.

10 Torres L., 2002 Поллиноз. Сезонный аллергический риноконъюнктивит. 56 взрослых (длительность исследования - свыше 18 мес.). Сублингвальное введение. Улучшение по сравнению с предыдущими годами. В сравнении с плацебо нет различий (по оценке симптомов и потребности в лекарствах).

11 Pajno G.B., 2004 Респираторная аллергия. Пыльца постенницы (Parietaria). Педиатрия. Сублингвальное введение. Устранение сезонной гиперреактивности бронхов.

12 Khinci M.S., 2004 Поллиноз (пыльца березы). П/к инъекции и сублингвальное введение (ПКИТ и СЛИТ). 3-летнее исследование. 71 взрослый пациент. ПКИТ и СЛИТ одинаково эффективны по сравнению с плацебо. СЛИТ представляется более безопасным методом.

13 Marogna М., 2004 Аллергический ринит (с БА). Педиатрия. 511 детей (группы сравнения: 319 получали медикаментозную терапию + АСИТ; 192 - только лекарства). Сублингвальное введение. Двукратное снижение выраженности симптомов заболевания, уменьшение бронхиальной гиперреактнвности. Профилактический эффект против новых видов сенсибилизации.

14 Frew A.J., 2006 Поллиноз. Аллергический риноконъюнктивит. 410 больных (закончило исследование 347). П/к инъекции аллергена в дозах 10000 и 100000 SQU (standardized quality units). АСИТ снижала симптомы и потребность в лекарствах при умеренной форме заболевания. Доза 100000 5(^и более эффективна, но 10000 Зри дает меньше осложнений.

15 Mauro М., 2007 Поллиноз (пыльца березы, ольхи, орешника). П/к инъекции и сублингвальное введение. 37 взрослых пациентов. ПКИТ и СЛИТ примерно одинаково эффективны при лечении аллергического пыльцевого риноконъюнктивита. СЛИТ безопаснее ПКИТ* однако не вызывает сходного действия на аллерген-специфические антитела изотипов и в сыворотке крови.

16 Marogna М., 2008 Аллергический ринит (с или без перемежающейся БА). Педиатрия. 216 детей. Сублингвальное введение (3 года). СЛИТ снижала частоту возникновения сенсибилизации к новым аллергенам и подавляла симптомы легкой персистирующей БА, уменьшала гиперреактивность бронхов.

Примечание: п/к - подкожные; ВСЭ - водно-солевой экстракт; БА - бронхиальная астма

3.2. Мета-анализы, Кокрановские обзоры, согласительные документы

Необходимо пояснить значение мета-анализов и систематических обзоров, особенно Кокрановских. Чаще всего цитируются мета-анализы ПКИТ, проведенные Abramson M.J. et al. в 1995-2010 гг., и СЛИТ, осуществленные Wilson D.R. et al. (2003, 2005) и Penagos М., Passalacqua G. (2008). ,

Первый мета-анализ по проблеме АСИТ был осуществлен в 1995 году австралийскими авторами Abramson M.J., Puy R.M., которые представили результаты оценки 20 RCT по бронхиальной астме. С тех пор они наращивали объем исследований. Через 3 года этими же авторами был подготовлен второй мета-анализ применения АСИТ при лечении БА, в котором были исследованы дальнейшие 34 RCT (в дополнение к первым 20), выполненные в 1957-1997 гг. (Abramson M.J., Puy R.M., 1998). Показан положительный лечебный эффект АСИТ, обнаруживающийся в подавлении симптомов БА, уменьшении потребности в лекарствах, снижении аллерген-специфической бронхиальной гиперреактивности. В 1999 г. вышел еще один систематический анализ, охватывающий 62 RCT, опубликованных в 1954-1998 гг., в котором была приведена сводная таблица этих исследований и дан соответствующий комментарий (Abramson M.J., PuyR.M., 1999).

Этапным исследованием явился Кокрановский обзор Abramson M.J., Puy R.M. (2003). В нем проанализированы максимально доступные по базам данных контролируемые исследования по АСИТ бронхиальной астмы на июнь 2001 г. Из отобранных для обзора 75 контролируемых исследований 54 уже оценивались в предыдущих анализах этих же авторов 1998 и 1999 гг. Из указанных 54 работ в обзор 2003 г. были включены 52 RCT и к ним прибавлены 23 новых исследования. Таким образом, в общее число 75 RCT вошли 36 работ, изучавших влияние АСИТ при аллергии, вызванной клещом домашней пыли, 20 - пыльцой трав и растений, 10 -

перхотью животных, 2 - плесневым грибом Cladosporium, 1 - латексом, 6 -множественными аллергенами. Выявлена эффективность ПКИТ при лечении БА.

Важным итоговым документом по клинической эффективности АСИТ при лечении бронхиальной астмы служит Кокрановский обзор Abramson M.J., Puy R.M. (2010), обобщивший опыт 88 контролируемых исследований на 2005 год (включая 13 новых по сравнению с предыдущим обзором 2003 года). В число новых 13 работ вошли б RCT, посвященных заболеваниям, вызванным клещом домашней пыли, 7 - пыльцой растений. Результаты этого последнего обзора принципиально подтверждают основные выводы предыдущих Кокрановских обзоров и мета-анализов.

В работе Wilson D.R., Torres Lima М. (2005) мета-анализ выполнен на материале 22 двойных слепых, плацебо-контролируемых исследований, в которых 979 пациентам проводили СЛИТ. Показано, что СЛИТ достоверно подавляет симптомы и снижает потребность в лекарствах при лечении аллергического ринита, особенно когда заболевание вызывается пыльцой трав и других широко распространенных растений. Тестировались разные аллергены, включая круглогодичные, например, клещ домашней пыли и перхоть кошки. При этом подавление симптомов и уменьшение потребности в медикаментах при использовании аллергенов клеща домашней пыли были статистически не достоверными и имелась лишь тенденция к улучшению состояния пациентов.

В мета-анализе Penagos М., Passalacqua G. (2008) из общего числа 73 исходных работ отобрано 9 исследований эффективности СЛИТ при аллергической БА у детей. Эти работы отвечали требованиям, предъявляемым к современным контролируемым исследованиям. В рамках этих 9 исследований 232 пациента получали СЛИТ, 209 -плацебо. Было выявлено, что СЛИТ с применением стандартизированных экстрактов аллергенов подавляет симптомы заболевания и снижает потребность в лекарствах (и соответственно расходы на них).

3.3. Общий анализ контролируемых исследований АСИТ

Таким образом, к 2011 г. в результате проведения многочисленных контролируемых исследований выработана консолидированная позиция профессиональных объединений специалистов в отношении того, что АСИТ эффективна при лечении IgE-опосредованных аллергических заболеваний -аллергического ринита и/или конъюнктивита, аллергической БА и гиперчувствительности к ужалению насекомыми. Это однозначно показано для взрослых, однако в детских контингентах отмечается вариабельность результатов.

СЛИТ является взаимодополняющей альтернативой обычной подкожной АСИТ и имеет большие перспективы развития. Надо подчеркнуть, что мета-анализы установили больший эффект при сублингвальной терапии, чем при подкожных инъекциях аллергенов. Впечатляет и показатель безопасности СЛИТ: ни одного смертного случая за 30 лет применения.

Оральный, интраназальный и другие пути введения аллергенов при АСИТ пока не обоснованы достаточной доказательной базой, сравнимой с таковой ПКИТ или СЛИТ.

В целом итоги контролируемых исследований эффективности и безопасности АСИТ позволяют сделать окончательный вывод о положительном лечебном действии этого метода. Основная масса обобщающих работ, обзоров, согласительных документов, мета-анализов и руководств высоко оценивает клиническую эффективность и относительную безопасность АСИТ.

Прогнозы на будущее многие специалисты связывают с дальнейшим повышением лечебной эффективности и безопасности метода, поиском различных оптимальных путей введения аллергенов, стандартизацией аллерговакцин, получением генно-инженерных препаратов, улучшением профессиональной подготовки аллергологов и др.

4. Вопросы стандартизации АСИТ

4.1. Общие положения.

Начиная с 1997 г. аллергологами всего мира достигнуто соглашение о соблюдении трех необходимых условий стандартизации аллергенных препаратов: 1) по суммарной аллергенной активности; 2) по биологической активности; 3) по содержанию главных аллергенов в единице массы препарата (Воиэяие! 1., 1,оскеу Я.Б., 1998). Такой подход сохраняется поныне, но отмечаются некоторые отличия в методах стандартизации в разных странах.

4.2. Стандартизация в Европейском Союзе

Рекомендательные функции в ЕС по стандартизации аллергенных препаратов осуществляют ВОЗ, Комитет по стандартизации аллергенов при Международном союзе аллергологических обществ, ЕААС1, Европейское медицинское агентство и другие структуры. Контрольные функции выполняются Институтом Пауля Эрлиха (Германия). В Европе в качестве стандарта приняты биологические единицы (В1)). Такие биоэквивалентные единицы оцениваются с помощью прик-теста (на выборке из 20

пациентов). 1000 BU/мл эквивалентны кожной реакции на раствор гистамина в концентрации 10 мг/мл. При проведении процедур стандартизации, связанных с определением состава аллергенного препарата, применяются методы гель-электрофореза, изоэлектрического фокусирования, перекрестного

иммуноэлектрофореза, РАСТ. В Европе также признается стандарт международных единиц - IU, регламентированный ВОЗ и Международным союзом иммунологических обществ. Существуют соответствующие клинические рекомендации и руководства па этот счет.

4.3. Стандартизация в США

Вопросы стандартизации в США разрабатывает Американская академия аллергии, астмы и иммунологии (AAAAI). Лицензирование аллергенных препаратов для клинического использования осуществляет FDA, точнее, ее структура - Центр по биологической оценке и исследованиям (CBER). В отличие от ЕС, в США за стандарт принимают аллергенную единицу (AU). В 1991 г. AU была заменена на BAU (Bioequivalent Allergy Unit). Она рассчитывается по кожной реакции: путем измерения диаметра эритемы в мм, которая возникает при внутрикожном титровании аллергена (тестирование проводят на группе из 15-20 лиц с выраженной аллергией).

4.4. Стандартизация в России

В РФ клинические рекомендации по АСИТ, в том числе по вопросам стандартизации, готовятся РААКИ. Контроль качества и чистоты аллергенных препаратов возложен на ГНИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. В настоящее время стандартизацию производимых в стране диагностических и лечебных аллергенов проводят по содержанию в них единиц белкового азота (PNU), а их аллергенную активность оценивают качественно с помощью кожного теста. Кроме того, в России зарегистрированы стандартизированные за рубежом препараты: Фосталь - «Аллерген пыльцы деревьев» для подкожной АСИТ, Сталораль - «Аллерген пыльцы березы» для сублингвальной АСИТ.

4.5. Текущие вопросы и перспективы

Несмотря на определенные достижения в стандартизации аллергенов на национальном и международном уровнях остается проблема унификации стандартов во всех странах по единым эталонам. В этом плане считается перспективным разработка рекомбинантных аллергенов. Особенно это касается главных аллергенов. В связи с этим следует отметить итоги реализации проекта «CREATE». Благодаря нему удалось

рекомендовать три аллергена в качестве международных референс-стандартов: rBet v 1, rPhl р 5а, rDerp 2. В данном направлении ведутся активные исследования.

5. Механизмы АСИТ: клеточно-молекулярные основы

За 100-летний период применения АСИТ как десенсибилизирующей терапии сформировалось достаточно полное представление о механизмах ее лечебного действия.

Во-первых, оно состоит в раннем десенсибилизирующем эффекте, модуляции ответов Т- и В-клеток и связанных с ними изотипов антител, миграции эозинофилов, базофилов и тучных клеток к тканям, а также высвобождении их медиаторов.

Во-вторых, выход на первый план Т-регуляторных (Treg) клеток как основных регуляторов иммунных процессов в ходе развития периферической толерантности к аллергенам (Akdis С.А., Akdis М. 2009 и др.). Сдвиг аллерген-специфических эффекторных Т-клеток к регуляторному фенотипу, по-видимому, является ключевым событием в развитии нормальной иммунной реакции на аллергены и успешном исходе лечения у больных, подвергшихся АСИТ. Естественно встречающиеся Foxp3+ CD4+CD25+ Т-регуляторные клетки и индуцируемые Тг1 клетки вносят вклад в контроль аллерген-специфических иммунных ответов с помощью нескольких воздействий:

- супрессии дендритных клеток, что подтверждает генерация эффекторных Т-клеток;

- супрессии эффекторных Thl, Th2 и Thl 7 клеток;

- супрессии аллерген-специфического IgE и индукции IgG4;

- супрессии тучных клеток, базофилов и эозинофилов;

- подавления миграции эффекторных Т-клеток к тканям.

Описанные процессы представлены на рисунке 1.

На этом рисунке видно, что как СКИТ, так и СЛИТ сначала влияют на местные АПК - дендритные клетки в месте введения аллергена и в дренажных лимфоузлах. ДК индуцируют Foxp3+ CD4+CD25+ Т-регуляторные клетки и Trl-клетки (IL-10-положительные) (Akkoc Т., Akdis М., and Akdis С.А., 2011). Затем запускается вышеупомянутая цепь событий.

Если сравнить приведенные последние данные о механизмах АСИТ с известным ВОЗовским руководством WHO Position Paper более чем 10-летней давности (1998 г.),

то становится ясно, насколько существенно продвижение в понимании молекулярно-биологических основ этого процесса.

Следует указать на отдельные интересные гипотезы и факты. Так, высказано предположение, что Т-регуляторные клетки непосредственно супрессируют аллерген-специфический ТЬ2-ответ. В работе с использованием математического моделирования показано, что ключевыми ответами при АСИТ являются пролиферация Treg клеток и супрессия Th2 клеток, а высокодозовый режим инъекций с короткими интервалами может усиливать эти эффекты (Gross F., Metzner G., 2011).

Рис. 1. Схема, отражающая механизмы аллерген-специфической иммунотерапии. Обозначения: SLIT - сублингвальная иммунотерапия; SCIT - подкожная иммунотерапия;

Treg - Т-регуляторные клетки; TGF-P - трансформирующий фактор роста-Р; IFN-y -интерферон-у; DC - ДК (дендритная клетка) (по Akkoc Т., Akdis М., and Akdis С.А., 2011)

Принято говорить о едином механизме СКИТ и СЛИТ, хотя отмечается специфика их толерогенного эффекта.

Следовательно, в пятом направлении была проанализирована проблема механизмов и молекулярно-биологических основ АСИТ. Бурный прогресс клеточной и молекулярной биологии привнес в аллергологию и иммунологию качественно новую информацию, которая требует исторического осмысления. В диссертационной работе такой подход был реализован: проанализированы отдельные звенья аллергической реакции с целью определения места и значения воздействия аллергенов при АСИТ, даны современные интегральные схемы, суммирующие последние достижения в этой области.

В большинстве обобщающих исследований делается вывод о том, что при АСИТ важнейшее место отводится сдвигу аллергической реакции в сторону преобладания влияния Т-регуляторных клеток, обусловливающих толерантность. В ряде теоретических положений по данному вопросу подчеркивается, что фундаментальным механизмом АСИТ является модификация входным сигналом (аллергеном) реакции иммунной системы в том же самом организме, который ранее выработал аллергический способ реактивности на такой же аллерген, только воздействовавший в другом дозовом и временном режиме.

6. Прогноз будущего развития АСИТ

В заключительном шестом направлении были собраны и проанализированы мнения известных специалистов о перспективах развития АСИТ. Большинство из них считает, что в будущем прогресс АСИТ будет обусловлен получением рекомбинантных аллерговакцин. Все эксперты отмечают в своих прогнозах значение внедрения молекулярно-биологических подходов, в том числе геномных и постгеномных технологий. В целом АСИТ будущего видится как метод, кроме действия на поллинозы, аллергию на клеща домашней пыли, перхоть животных и яды жалящих насекомых, расширяющий свои возможности на пищевую аллергию, латексную аллергию и атопический дерматит. Параллельно ставится задача дальнейшего расширения способов введения аллергена: помимо традиционных подкожного и сублингвального - чрескожный, интралимфатический, использование липосом, мукоадгезивных веществ и др.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, полученные в результате выполнения диссертации данные позволили сделать ряд важных выводов относительно теории, методологии и практики АСИТ за 100-летний период его клинического использования. Целесообразно отметить ключевые события, связанные с применением этого метода (рис. 2). На рисунке видна последовательная, преемственная динамика развития метода, свидетельствующая о его совершенствовании, эффективности, востребованности и перспективности.

В заключение следует указать на то, что работа над диссертацией завершается в год 100-летия со времени открытия метода АСИТ. Вполне естественен отклик мировой печати на эту дату (Durham S.R., Nelson Н., 2011; Incorvaia С., Frati F., 2011; Ring J.,

Ои1епш1Ь1., 2011), который чаще всего формален по существу, без глубокого анализа вековой динамики развития метода.

О—

1 у III

о у £

1911 1921 1928 1935 1940-е 1954

; о ч

1 I I

2 г?

* § § I 111 ||| 111 и 5

in in

о ^ t cr -

§ g_ ® 5 S Q.

3 § S£- 2 < i§

1966 1980-e 1990-e 2000-e 2000-e 2011

О Бактериальные вакцины (1950-1960 rr.)

Рис. 2. Ключевые события, связанные с АСИТ, за 100 лет (1911-2011)

Тем не менее хочется обратить внимание на публикацию S. Durham et al. (2010)

- известного английского специалиста, фактического прямого «правообладателя» выдающегося наследия своих соотечественников Л. Нуна и Дж. Фримена, работающего в том же историческом месте Лондона (Imperial College), в котором трудились и они. Статья вышла под весьма символическим названием «Сто лет аллергенной иммунотерапии: пора звонить в колокола об изменениях», предопределившим ее концовку, в которой говорится о необходимости модернизации методологии в связи с чрезмерной диспропорцией между традиционным подходом в виде СКИТ и новыми про1рессивными методами, в частности, СЛИТ: «Новые подходы, включая

сублингвальный путь, который позволяет достичь эффективной толерантности, безопасен, более удобен и превосходит по критерию «цена-эффективность», требуют активной поддержки и дальнейшего развития, а не продолжающаяся приверженность к традиционной подкожной иммунотерапии с ее известными ограничениями» (Durham S. & Leung D., 2010, p. 5).

выводы

1. При сравнительно-историческом анализе и систематизации данных об открытии и совершенствовании метода АСИТ выделены четыре стадии: донаучная стадия - от древних мифов до константинопольской вариоляции XVIII века; эмпирическая стадия - от Э. Дженнера до Л. Нуна и Дж. Фримена (1911); «интуитивная» стадия (стадия гипотез) - от работ А.Ф. Кока, Р. Кука, Праусница - Кгостнера (20-30-е годы XX века) и до открытия Ишизака (1966); стадия «истинного» (достоверного) знания - от открытия 1«Е до настоящего времени.

2. На основании подробного изучения предпосылок открытия метода АСИТ

обоснована решающая роль научной школы выдающегося английского иммунолога А. Райта в инициации применения иммунотерапии как эффективного

гипосенсибилизирующего средства, что обеспечило активное внедрение в раннем периоде после его появления и долговременное клиническое использование на протяжении столетия.

3. Существенным моментом долгожительства метода АСИТ является его

преемственное развитие в отношении теории, методологии и практики: а) на ранних стадиях развития - разработка гипотез о реагинах и блокирующих антителах, совершенствование и диверсификация процедур диагностики и лечения: расширение спектра нозологий, терапия «ударными» дозами аллергенов, применение депо-вакцин и адъювантов и др.; б) на современных стадиях -всестороннее изучение всех звеньев ^Е-опосредованной аллергической реакции и раскрытие механизмов толерантности, обусловленной Т-регуляторными клетками.

4. На основании расширенного анализа за 50 лет контролируемых исследований АСИТ (включая одно- и многоцентровые исследования и мета-анализы) подтверждается с высоким уровнем доказательности общепринятое международными и национальными согласительными документами заключение о его эффективности, безопасности и экономической целесообразности.

5. При сравнении двух наиболее распространенных вариантов АСИТ - подкожного и сублингвального - обнаруживается сходство в отношении эффективности и механизма действия. Частота побочных реакций в целом сравнима у обоих подходов, хотя при подкожном введении выявляются единичные летальные исходы (в пределах десятков на миллионы инъекций), тогда как при сублингвальном введении за 30 лет его клинического применения не отмечено ни одного

смертельного случая. Таким образом, сублингвальная иммунотерапия стала реальной альтернативой подкожной аллерговакцинации.

6. На основании анализа подходов к стандартизации АСИТ в Европейском Союзе, США, России констатирована тенденция к унификации стандартов в глобальном масштабе. При этом будущее в данном случае, по мнению ведущих специалистов, связывается с использованием рекомбинантных аллергенов.

7. Прогностические оценки перспектив развития АСИТ связываются с получением рекомбинантных аллерговакцин и с дальнейшим внедрением молекулярнобиологических подходов, в том числе геномных и постгеномных технологий, то есть с выходом на принципы персонализированной медицины. В целом АСИТ будущего видится как метод, кроме действия на поллинозы, аллергию на клеща домашней пыли, перхоть животных и яды жалящих насекомых, расширяющий свои возможности на пищевую аллергию, латексную аллергию и атопический дерматит. Параллельно ставится задача дальнейшего расширения способов введения аллергена: помимо традиционных подкожного и сублингвального - чрескожный, интралимфатический, использование липосом, мукоадгезивных веществ и др.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Воробьева О.В., Гущин И.С. Исторические предпосылки создания метода аллерген-специфической терапии (к 100-летию открытия) // Российский аллергологический журнал. -2010.-№5.-С. 17-28.

2. Воробьева О.В. К 70-летию со дня рождения австралийского иммунолога Питера Догерти, лауреата Нобелевской премии // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. - 2010. - Т. 6. - № 3. - С. 63-67.

3. Воробьева О.В. К 50-летию вручения Нобелевской премии Бернету и Медавару за открытие приобретенной иммунологической толерантности // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. — 2010. — Т. б. - № 4. - С. 68-75.

4. Воробьева О.В., Гущин И.С. Развитие метода аллерген-специфической иммунотерапии в 20-60-х годах XX века - до обнаружения ^Е // Российский аллергологический журнал. -2011.-№2.-С. 3-12.

5. Воробьева О.В., Гущин И.С. Контролируемые исследования эффективности и безопасности аллерген-специфической иммунотерапии: исторический аспект // Российский аллергологический журнал. -2011.-№ 4. - С. 3-14.

6. Воробьева О.В. К 100-летию со дня рождения выдающегося иммунолога Нильса Иерне // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. - 2011. - Т. 7. - № 2. - С. 63-72.

7. Воробьева О.В., Гущин И.С. Молекулярно-биологические основы аллерген-специфической иммунотерапии // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. -2011.-Т. 7. -№ 3. - С. 54-71.

8. Воробьева О.В. Современное состояние проблемы стандартизации аллергенов при аллерген-специфической иммунотерапии // Российский аллергологический журнал. - 2011. - № 4. - Вып. 1. - С. 76-77.

9. Воробьева О.В. Возможности аллерген-специфической иммунотерапии в лечении больных латексной аллергией / Материалы X Всероссийского конгресса ((Профессияи здоровье». Москва, 6-8 декабря2011 г.-М., 2011.-С. 109-111.

10. Воробьева О.В. Использование рекомбинантных аллергенов при аллерген-специфической иммунотерапии / Материалы VII международной конференции по реабилитологии. Москва, 27-28 октября 2011 г. - М., 2012. - С. 37-39.

Подписано в печать 18.01.12 Формат 60х84/16

Бумага офисная «ЗуеІоСору». Тираж 100 экз. Заказ № 95 Отпечатано на участке множительной техиники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24