Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Сравнительное изучение действия различных по химическому составу токсинов чумного микроба на ферментный спектр сыворотки крови и систему РЭС чувствительных и резистентных животных

з ^ ' (?■

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

Веесогаши. ордена Трудового Красного Знамени нпучно-исследовагельсшы противочушш. институт "Цикроб"

На правах рукописи

КИСЕЛЕВА Адла Константиновна

уда 57У.842.23:612.017.4:5Ы. 111.1+591.III.8

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ДЕЙСТВИЯ РАЗЛИЧНЫХ ПО ХИМИЧЕСКОМУ СОСТАВУ ТОКСИНОВ ЧУ1.1НОГО МИКРОБА НА ФЕРМЕНТНЫЙ СПЕКТР -СЫВОРОТКИ КРОВИ И СИСТЕМУ КЗС ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ И РЕЗИСТЕНТНЫХ ШВОТНЫХ

14.00.16 - патофизиология

Автореферат

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Сара ¿он - 19 9 0

/ С-

Работа выполнена в РостоЕоком-на-Дону ордена Трудового Краоного Знамени- научно-иооледоЕательоноы противочумном институте.

Научные руководители: член-корр. АМН СССР И.В.Домарадокий; кандидат бдологичесиих наук В.И.Крупенина

Официальные оппоненты: доктор иедициноких наук, отарший научный оотрудник ЛЕДВАНОВ Ы.Ю.

ындидаг.биологичеакнх на*к, огарший научный оотрудник СЕРГЕЕВА Т.Н.

Ведущая организация:

Иркумкий НИПЧИ Сибири и Дальнего Воахока

Автореферат разоолан " -/Л" ■//_1990 г.

Защита ооотоитоя " " /«2_1990 г. на заоеданяи

специализированного СоЕета К 074 32 01 по защите диосертаций на соискание ученой отепени кандидата наун при Всесоюзном ордена Трудового Красного Знамени шучло-исследоЕательоноы противочумном инотитуте "Микроб" (410071, г.Саратов, Университетская .ул., 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Ученый секретарь специализированного Совета

ДВДАРШНИ З.Л.

i - 3 -

, j

_ , ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вирулентность патогенных бактерий определяется способностью микроорганизмов к осуществлению целого ряда этапов агреосии: проникновению, размножению в тканях организма хозяина и выбросу токсинов. Многие иссладовате-ли основную патоганетичаокую роль при чумной инфекции отводят продукции токсинов, споообных в .отсутотзио микроба вызывать сходные с заболеванием патологические изменения в тканях мэк-рооргзнизма и его гиболь (Заболотный Д.К., 1956; Донсков В.В,, 1978; SchSr М. , Meyer К.Р. , 1956; Scheidegger

S. ,1957).

К настоящему времени у чумного микроба выявлено насколько токсических компонентов (Домарадений И.В., 1966; Burrows т.в., 1963), из которых особенно ваяно а значение придается белковому токсину (II фракция Бейкера или "мышиный" токоин). и липополисахаридноыу эндотоксину. Хотя'эти токсические фракции были выделены, очищены и подробно охарактеризованы, шшгое д . проблеме чумной интоксикации остается невыясненным. Не определены точки приложения действия токоизов ( VTeuaerstrom D.K. et al., 1977), не установлена причина резистентности некоторых видов кивотных к ."шинному" токсину чу lino го микроба. Эти и еще многие другие на районные иопрооы являются серьезным ограничением оагодняшних попыток понять генез и механизм чумной интоксикации.

*

- Несомненный вклад в. решение проблемы чумной интоксикации долины внести исследования, связанные о выяснением механизмов устойчивости отдельных видов животных к разным токсическим компонентам чумного микроба.

. -Цель работы. Изучить ферментный опектр сыворотки крови и состояние лизосомного аппарата у животных чувствительных и нечувствительных .к различным по химическому составу, токсина;* чумного микроба для раскрытия некоторых патогенетических механизмов резистентности к чумной интоксикации.

.Задачи работы.. На модели чувствительных и розистентных к токспам чумного микроба зивотных определить:

I. Еозмокность использования данных об измонянии актиг-

- li -

ности ряда ферментов сыворотки крови для получения сведений о преимущественном повреадении отдельных органов или систем sn-вотных различными гокоичеокими фракциями чумного микроба.

.. 2. Способность токсинов чуиного микроба вызывать высвобождение гидролитических ферментов из лизосом печени чувствительных и устойчивых ЙИВОТНЫХ.

-3. Способность беоклеточных экотрактов тканей еивотпых, содорзащих гидролитические ферменты лизосом, инактивировать in vitro токсины чумного микроба.

Возыошшсть исолодовать токоические фракции чумного микробе на приоутотвие в них активных ферментативных белков.

Научная новизна:

- проведено первое систематическое экспериментальное, изучение ферментного профиля сыворотки крови у животных, отравленных двумя разными токсическими фракциями чумного микроба -белковым токсином и липошлисахаридныц эндотоксином, и дана оценка диагностического и патогенетического значения методу ферментной диагностики бактериальных интоксикаций;

... . .т впервые показать что лизосовдшЕ аппарат клеток ретйку-лозндотолиальной системы являатоя одной из точек приложения действия токсинов чумного микробе в организме пиво mux;

- установлены видовые различия в стапеии лабильности.. . мембран и активности гидролитических формантов лизосом.клеток ретикулоэндотвлиальной скстош у чувствительных и резистентных к белковому, токсину чумного микроба животных, коррелирующие с чувствительностью животных к "мышиному" токсину в

Теоретическая и прзктлчаская знзчишотъ. Проведен анализ результатов исследования активности 15 формантов сыворотки крови при действии двух токсических фракций чу много, .микроба, различных по.химическому составу. Обнаружено, что энзимный . профиль лизосоыных гидролаз цаняется неоднотиппо и.зависит как от химичеокого состава токоичеокой фракции, так и от чувствительности животных к ной.

- Установлена взаимосвязь ыекду видовой чувствительностью животных к "мышиному" токсину чумного микроба и степенью ла-

билыюсти иецбран лнзосом, характерной для данного вида.

- Получаны новые данные о том, что белковый и липополиса-харидный токсины чумного микроба вызывают у белых крыо и морских свинок различающиеся изменения активности гидролити- • чеоких ферментов оышротки крови и овободной и общей активноо-ти гидролитических ферментов лизооои з печени»

- Показано, что лизосимиые гидролазы печени белых крыс опособны in vitro детокоицировать "мышиный" токсин чумного микроба.

- Установленные факты вносят новые представления о причинах резистентности отдельных видов аивотных к "мышиному" токсину чумного микроба.

. - По результатам проведенных исследований разработаны методические рекомендации определения резистентности нивотных к токсическим фракциям чумного микроба. Методические рекомендации утверждены Ученым Советом Ростовокого-на-Дону государственного научно-исследовательского противочумного института и внедрены в практику в ряде лабораторий института.

На защиту выносятся слодующпв положения:

- - I. Токсические фракции чумного микроба, имеющие разный химический состав - белковый токоин и липополисахаридный эн-дотокоин - вызывают как ряд одинаковых изменений ферментного опектра сыворотки крови животных, связанных или с наспецифи-ческими реакциями организма, или являющихся вторичными, так и различные изменения, обусловленные особенностями патогенеза этих интоксикаций.

2. Белые крысы и морские свинки имеют достоверные видовые отличия в активности ряда кислых гидролаз сыворотки крови и печени.

3. Введение нивотным токсических фракций чумного микроба вызывает изменения свободной и.общей активности ферментов ли-зосом печени, уровень активности которых зависит как от химической природы токсина, так и от степени чувствительности яивотных к нему.

4. Фракция лизосом печени белых крыс облздаот способ-

- б -

воотыо инактиваровать vitro белковый токоин,но не инак-тивирует липополисахаридный эндотоксин Y.peBtis . Фракция ли-зосом печени белых крыс, предварительно получивших 3 ID^q "шинного" токсина, утрачивает способность ниактивиров-ть in vitro белковый токсин чумного микроба.

.5. В токсичеоких фракциях чумного, холерного и брюшнотифозного шшробов, полученных общепризнанными методами, достаточно хорошо очищенных и подробно охарактеризованных, содержится ряд ферментов разных классов.

Апробация работы. Основные полонения и выводы диссерта-- ционной работы были изложены и обсундены на общеинститутских н пеклабора торных научных конференциях Росговского-на-Дону государственного научно-исследовательского противочумного института, Ростов-на-Дону, I973-I976 гг. На 1У Северо-Кавказской биохимической конференции, Нальчик, 1979 г. На 2 Всесоюзной симпозиуме "Структура и функции лизосом", Новосибирск, 1980 г. Диссертаушобсукдена и одобрена на научной конференции Противочумного института, Ростов-на-Дону, 1989 г.

.. Публикация результатов исследования. Результаты исследования опубликованы в 5 печатных работах.

Объем и структура работы. Текст работы.изложен на.165 страницах машинописг, иллюстрирован II таблицами, II рийунка-ми. Работа состоит из введения, обзора литературы,"описания материалов и методов исследования, изловения собственных исследований (5 глав), заключения и выводов..Библиографический указатель содержит 165 источников отечественной и129 - зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы. В работе использовались беспородные баше крысы массой 200-250 г, морские свинки - 250-300 г, баша мыши массой 18-20 г. Были исслодоваш две токсические фракции, выделенные из чумного микроба: белковая (II фракция Бойкера или "мышиный" токсин3*) и липополисахаридная, получен-

*Вырэвавы глубокую благодарность за,любезно предоставленную возможность осуществить эти эксперименты Грибоедову A.B., Канчух A.A., Лосевой Н.Л., Яговкину 8.А., Дальвадянцу С.М., получившим эти препараты.

пая нами методом холодной фенольной экстракции из штамма еу

В экспериментах по выявлению ферментативных активностей в токсических фракциях бактерий исследованы следующие препараты,

"Мышиный" токсин чумного микроба из вирулентного бескап-сульного штамма 1253, полученный высаливанием сернокислым аммонием (от 40 до 50 % насыщения).

Токсическая фракция из штамма БУ , полученная в более широком диапазоне насыщения сернокислым аммонием - 40-67

Липополисахэрид чумного микроба из штамма 358 Р/Ш, полученный методом Востфаля с соавт. (1952) сотрудником Саратовского института "Микроб".

Для сравнения нами исследованы токсины, полученные из других видов бактерий.

Холерный антиген, полученный по методу Буавена с соавт. (1935) из штамма 33/165, Препарат получен в производственном отделе Иркутского противочумного института.

Липополисахэрид эльтор вибриона соротыа Огавэ, штамм 2913, содержаний до 2 % белка. Препарат получон методом фенольной экотракцин.

Холероген-анатоксин Саратовского института "Микроб", использовавшийся для профилактических прививок.

Брюшнотифозный эндотоксин, полученный по мотоду Востфаля с соавт. (1952).'

ы>50 липополисахарида чумного микроба при внутрибрюшинном введении составляла 8 мг для белых крыс и 5 мг для морских свинок. И>5о II фракции Бойкора для крыс составляла 0,06 мг. Морским свинкам, нечувствительным к ней, вводили дозу, равноценную той, которую давали крысам, в пересчета на массу тела. Дозы токсинов, способ введения и экспозиция отработаны в нашей лаборатории ранее (Крупенина В.И., 1963). Токсические фракции раст-ворялк в блдистиллировэнЕой вода л вводили яизотным знутрибрп-аинно з дозо ЗЬВ50 . Чороз 3-3,5 ч '¿квотных тотально обескровливали, собирая кровь из зонной артерии. Кровь центрифугировали 10 мин при I 500 об/мин, отбирали сыворотку и исследовали в ней активность ферментов.

Активнооть l -идитолдегидрогеназы определяли колориметрическим методом Шеволэ и Товарека в модификации Гетта З.П. (1964). Активность лактатдегидрогеназы - колориметрическим методом Шевела и Товарека в модификации Коровкина Б.Ф. с ооавт. (1963). Каталазу определяли титрометрическиы методом Баха и Зубковой (1953). Активность фермента Еыранали в мкМ HgOg/SO мин/0,1 мл сыворотки. Трансэыиназы исследовали по методу Пасхи-ной T.G. (1965). Активность креатинкиназы определяли колориметрическим методом MacCrimmon А. , Lev/in К (1967). Щелочную И киолую фосфатазы определяли колориметрическим методом по

Bessey о.et в1.(19^в); Активность J, -амилазы - амилокласти-ческш методом в модификации А.П.Рыковой (1965); активность выражали в единицах Энгелггардта и Горчука. Нейраминидазу определяли колориметрическим методом Warren I» (1959), выраная активность как А Е^/шш/г белка. Активности ß -глюкозидазы и J> -галактозидазы определяли 2©лориыатрнческим .методом Покровского А;А; с созвт. (1969). Аминотрипоптидэзу исследовали коло-риметричеоким методом Haschen R J. (1961), активность выр8нали как ЛЕз^/мин/г белка. Активность катапсина Д - спектрофото-метрическшл методом А.А.Покровокого о соавт.' (1969).' Пептидил-пептидгидролазу последовали колориметрическим методом Charney J. , Tomareni R (1947). Активность фермента выражали как ¿Е^/мии/г белка.

Активность кеюзо-1-фосфатальдолазы и фруктозодпфосфат-альдолазы определяли колориметрическим методом Кулганокз В.' и Клашки В, (1961); Глюкозофосфатизоморазу - колориметрически по Консистариуму А.В;' (1962). Активнооть ферментов в сыворотке вира sa ли в нанокэталах на I мл сыворотки, согласно рекомендациям международного биохимического союза (1979). При определении активности ферментов в токсических фракциях бактерии и в тканях активность пересчитывали на г болка, количество которого определяли по методу Лоури;

Субклеточную фракцию почени животных получали по методу , ХогеСума Д; и Енейдара В;- (1957). йивотных тотально обескровливали, собирая кровь из оонной ортории, брали часть печени, отмывали от крови холодным физнологичеоким раотвором, подсушивали на фильтровальной бумага и готовили 10 $ гомогеиаты (вео/объэм) в 0,25 U растворе сахарозы в фосфатном буфере pH 7,4;- Ткани

раотирали в ручном стеклянной гомогенизатора типа Поттера-Злъ-вегейма. Полученные гомогенаты подвергали дифференциальному центрифугированию. Ядра и неразрушенные клетки осаждали центрифугированием гомогзнэтов при 3 ООО об/мин (720g ) а течение 5 мин в центрифуге ЦУЫ-Х. Безъядерные супернатанты центрифугировали при 17 ООО об/ыин (17 OOOg ) 10 мин в центрифуге ЦЛР-1. При этом осаждалась "фракция больших частиц". Надосадочная фракция содержала свободную активность гидролитических ферментов лизосом, активность цитохромоксидазы - маркерного фермента митохондрий, - не обнаруживалась;' Для определения общой активности лизосомных гидролэз, выявляемой в присутствии детергентов, печень гомогенизировали в 0,25 Л забуференном растворе сахарозы рН 7,4 a Z % тритоном Х-100, как предложено Satta ъ. et ai. (1964) и подвергали центрифугированию по описанной выие схеме'.'

Дифференцированное определение свободной и общей активности маркерных ферментов лизосом являотся одним из методов оценки стабильности лизосомных мембран (Дпн Р;Т., 1980).

Опыты по прямому дойотвию гидролитических ферментов лизолом на "мышиный" токсин-in vitro проводили по следующей методике. Из органов (печень или почки) белых крыс, интактных или получивших, внутрибрюишшо ЗЫ)50 IX Фракции Бейкера, под действием которой они находились 3-3,5 ч, готовили гомогенаты и получали фракцию, содержащую лизосомы, по описанной выие схеме. Один мл такой фракции, содержащей 8 мг белка, инкубировали 30 мин при 37 °С с X мл раствора II фракции Бейкера ( ЗЫ>50 . для крыс). Два мл праинкубированной смеси раствора токсина и фракции лизосомных гидролаз печени или почки вводили внутри-брышшшо белым крысам. Результаты титрования учитывали через 16 ч.'. Контрольным группам животных вводили исследуемыо субклеточные фракции печени и почек интактных и отравленных чумным . токсином крыс и нативный раствор II фракции Бейкерз ( зи»^ )•

Статистическая обработка полученных результатов проводи-лаоь по критерию "t" Стьюданта - Фишера (Ашмзрин И.П., Воробьев А.А., 1962) и о использованием непарзметрического критерия " и " Мэнна-Уитная (Гублор К.В., Генкин А.А., 1973). Статиотичеокую обработку результатов опытов по детоксикации "мыииного" токсина in vitro проводили по критерии X2 (Аыыа-

-ТО-

рин it.ll., Воробьев А.А., 1962).

Результаты исследовании

Исследования начали со сравнительного изучения изменения активности ферментов в сыворотке крови белых крис при введении разных по химическому составу токсических фракций чумного микроба. Резулылы, представленные в таблице I, показывают, что из 15 исследованных ферментов у 8 (креатинкиназа, каталаза, кислая фосфатаза, ^ -глюкозидаза, аспзртатаминотрансфераза, (¿.-амилаза, глюкозофосфатизоцерэза, кетозо-1-фосфатальдолаза) реакция была однотипной при дзйствии обоих токсических фракций чушюго микроба, но активность 7 фарментов изменялась по-разному в зависимости от химической природы вводимого токапна. Лакцатдегидрогеназа, фруктозодифосфатальдолаза и ^р -галакто-видаза достоверно возрастали при инъокцнп ."мышиного" токсина и не изменялись при введении лппополисахаридного эндотоксина. Активность .Ь-идитолдегидрогеназы, аланинаминотранеферазы, щелочной фосфатазы при введении II фракции Бейкера не'изменялась, но достоверно увеличивалась при действии липополисахаридной токсической фракции. Активнооть кзтепешш менялась разнонаправленно: "мышиный" токсин вызывал сникенпе активности фермента, липополисахаридный - увеличение.

Получешша данные показали, что, несмотря на различия в химическом составе и степени чувствительности к ним балых крыо, в действии исследованных токсических фракций чумного микроба на ферментный спектр сыворотки крови много сходного. Наши данные во противоречат мнению многих исследователей о том, что действие токсинов грамотрицательных бактерий индуцирует в организме сходные изменения, несмотря на вырзконную специфичность в серологических тостах, и о том, что такого рода гиперформентемии являюгоя кеспацифичоской реакцией организма на действие сильного патогенного раздражителя, в данном случае бактэриальных токсинов.

Однако ебнарунон и ряд характерных отличий в спектра ферментов оыаоротки, касавщийоя главным обрезом гидролитических ферментов лизоссм. Повышенна активности.этих фьрмонтов в сыворотки крови рассматривав! как показатель нарушения проницаемое-

- и -

Таблица I

Активность ферментов в сыворотке крови крыс при действии белковой и полисахарядной токсических фракций чумного' мякроба

Ферменты Интавгные животные П франция по Бейкеру ¡Ляпополисаха-¡ридшй токсин

I 2 з I 4

х.-адитолде гидро- 0,016ч0,003 0,01740,004 0,02640,004

гепаза л ^ 23 ' п= 14 п ^ 12

> Ръ < 0,005

Лактатдегидроге- 4,23ч0,03 6,3940,03 4,7 + 0,02

яаза п = 18 п = 14 д «= 14

Р1. <0,05

Каталаза 31,88+1,59 65,6040,48 53,18+5,54

л = 19 л *= II д = 16

• Р1; < 0,01 Р,. <0,05

Асшртаташшо- 0,810,05 1,1310,08 1,78+0,13

трансфераза л — 20 л = 19 д = 15

^ 0,05 • Р^ 0,001

Алашшшдно- 0,8910,006 0,7840,006 1,2+0,006

трансфераза л = 19 п = 19 д =-П

Р^0,01

Креатшшиназа 1,1740,07 1,8840,17 2,310,26

п = 15 п = Ю п 6.

0,05 Ь Р <0,01 т.

Щелочная 0,195+0,009 0,2+0,019 0,673+0,089

фосфатаза п = 48 п = 18 а в 16

Р4< 0,05

Кислая 0,050^0,002 0,14140,01 0,1'940,01

фоофатаза п = 64 д = 29 л - II

]?ъ 4. 0,001 ' Р. <-0,001 ъ

об -амилаза 34824541 29164287 38074416

п =23 п = 10 • Д « 18

Продолжению таблицы I

i ! ! 2 1 з !

А -глюкозидазэ 0,009+0,001 0,028+0,002 0,018+0,002

<J " п"= 40 п = 15 ' - ¿1=7'

Pt ^ 0,05 Pt Q.,02

J> -галактозидаза 0,0X5+0,0001 0,048+0,007 0,016+0,0001

' П = 40 " ' п = 14 п I 6

Vt< 0,05

К а 1 а п о и и 30 -кг6 8.I-I0"6 44,8-10~б

п = 24 п = 6 П и 6

Pt < 0,02 Pt <Г 0,05

Кетозо-1-4оофат- 0,26+0,003 0,23+0,002 0,25+0,003

альдолаза п я 20 " 15 п « II

Фруктозодифосфат- 1,54+0,01 4,9+0,01 1,9+0,02

ольдолаза п = 28 п = 18 п = 13

Pt < 0.G0I

Глюкозофосфат- 0,95+0,08 0,98+0,07 1,1+0,06

изомераз8 п~= 8 ' п'= 8 ' п = 6

ти лизосомцых мембран вследствие патологического процесса (По кровокий A.A., Тутельян Б.А., 1976; Двв К., 1987 и другие). Изменение активности лизосомных ферментов в наших опытах свидетельствует, во-первых, об учаотии лизосом в обезвреживании чумных токсинов в организме, во-вторых, показываот, что взаимодействие токсинов с лизосомами иеодпогипно и зависит, очевидно, от хииичоского состава и структур токсических компонентов чумного микроба.

Лизосомы - вааный фактор неспецифической резистентности, поэтому иптореоно было сравнить реакцию лизосом чувствительных ко П фракции Бейкера белых крыс с реакцией лизосом прпро; норезистентных к ней морских свинок. Результаты этих опытов представлены в таблице 2. Установлено, что уровень гидролитических форыонтов в сыворотка интактных животных имеет видовые отличия. Активности кислой фосфатазы и ¡ь -глюкозидазы в сыве

Азгаалосхь лясез гдзролаз s сызоротие Се.их в рас a морсвшс овгдоа пра дэйотвяа П срамил со Еейесу я

ла^ополлсахарьм умного ммроСа

AsîZBHOOTb фермеhtos (s яиат/«£я пря 37 °С)

вермеат . Б а me а р ы с и j Пор сяие cazan а

Коятсоль П ..-.ояяця Еейяепя ! Л?попэлясахяояд ' Ноятпсте !П t-гяупгя Eeít?eca 'Ляпспсллсзхягм;

Наглая фсо$агаза 0,050 * 0,002 0,141 + 0,01 0,149 + 0,01 0,093 ± 0,009 0,128 ± 0,012

а = 64 а = 29 а = п а= 15 ~ a I.I4 а «=_П

st < 0,001 pt с 0,001 P. 0,05s Pt * 0,05 ï^c 0,001

3 -глизозказа 0,005 ± 0,001 . 0,023 + 0,002 0,01В * 0,002 0,012 i O.OOOS 0.01Э ¿0,0006 0,022+0,001

J п. •= 40 a «-IS п = п а =.34- а «.Л а = П

ít < °'С5 *t < 0,02 . pt < a,es* ?„< 0,05

В -гагзгюзияаза 0,015 * 0,0001 0,048 + 0,007 0,016 i 0,0001 0,009 ¿ 0,0008 0,003 + 0,001 0,013-0,0001

J а «= 48 . а» 14 а = 6 a -.35 - д « 14 а - I?

?t < 0.05 Pt < 0,001*

Катзпсин ЗО-ЕГ6 8,1*10 44,8 •ТО-6 22-Ю-6 0,44-Ю~° ГЭ.Э-Ш"6'

а » 24 . д е С в « 6 a - 18 а »-S а « 22

?t < 0.02 0,05 Pt 0,01

*S0CT0Espa00Tb различай определял: ыезд? резулиагаыа, полученпаг са ноатролзшд белах араоах и мороязх сггшзх.

- в -

ротке морских свинок достоверно выше, а $ -галактозидазы -нике, чем у белых крыс. Введение П фракции по Байкеру резистентным к ней морским свинкам вызывало более слабое, чем у крыс повышение активности кислой фосфатазы и £ -глюкозидазы» Обнаружены качественные отличия в спектре лизосомальных ферментов: у морских свинок активность ]Ь -галоктозидазы не изменялась, тогда как у крыс подъем активности достигал 320 $ от нормального уровня. Результаты опытов по определению активности катепсина показали, что у крыс его активность сшгаалась до 27 % от нормального уровня, а у свинок - до 2

Иная картина наблюдалось при введении липополисохаридного токсина чумного микроба. У.обоих видов почти в равной степени увеличивалась активность кислой фосфатазы. Активность ^-глюкозидазы и наголенна у свинок оставалась в норме, а у крыс до-стоворно возрастала.

Насмотри на отличия, установленные в опытах по определению активности ферментов в сыворотке крови, на удалось пол5-чить четкого ответа на Еопрос о причине различной чувствительности ко П фракции Байкера у исслодуемых видов. Возможно, это • связано с там, что активность ферментов в крови представляет собой суммировании!', итог изменений активности соответствующих формантов в различных органах и тканях, и этот интегрированный показатель но даст представления об альтерациях ферментативной активности в отдельных тканях. Особый инторос представляла для нао печень, поскольку известно, что именно этот орган, богатый элементами РЗС, является главным барьером, защищающим организм от интоксикации. Выявлены видовые отличия в активности лизосоы-ных. гидролаз. В печени морских свинок выше активность^ -глюкозидазы, £ -голактозидазы и катепсина, кроме того, установлено, что у нормальных свинок значительная часть гидролитических формантов находится в свободном состоянии (габЛоЗ)«

Инъекция II фракции Бейкора вызывало в печени крыс ряд серьезных энзиматических расстройств: увеличивалась свободная активность кислой фосфатазы при неизменившейся общей активности, повысилась свободная и общая активность -глюкозидазы.' Свободная активность катепсина снизилась до 0, при этом общая активность этого фермента уволичилааь на 85 %. У морских сви-

- ia -

C4 -Л

И f. и U

i

Цн

о «

tí Ii,

O CJ

к н

ч си t=î о

El U

U (ц

ЙЯ

•M

о ri с: я,

ий

N CJ i-j t)

a,

i1; ^

*i 9-• » t-

ШШ

• t Ci -t

О

о* m t-

■ « - CJ qi r-

œ S

oo m

r-> o*

» • rj

M

t- vu I

» » ГЧ

с) «0 »- ir\ •

• (Jh гл о .»•«-»

8 -c

VOON » • o>

спел

a«vD i

« •> tT( П1Л счг\ t

I

cr»

♦ I Я

V£> rj a

» ♦ eu en . «

a (1

Г»

о C« о о

n OJ

С» о а)

1 V "Vi a

n ex

Й4

СЧ Г» ГЛ о

ГЛ e-i

M й)

♦I q ♦» 4| fl -и

OMTV ri - * •

. «OIA

°vi :

СГ> о ITV i

• tN • * 1Л1Л VI О

m rj

♦ I fl +1

ttJlTi ГЧ 1ЛГ)

vO CD С)

• » • ы

о» о

CD ГЧ •

en rj о » » » о

cw * v<

UNO. fJ О

vû » (J,

♦ r\ тсч i

О С* О и>

СП О OJ о

ч*со m • • •

. I

<74 «J-• » t-

Ovo

ir»

О <\i CM ГЧС.'

«•»■ я „

со о • * г-

О и\ л * ш

Г-ЧЭ

о о С >

•« » Cl »

<MPJ CJ

о»- в

wo «-. » » п

CJ **

U>vO

r- . 4 I

CM •>

о ■ V

oo

«. • N

1ЛГЛ

-s

I

<4

«I

ÜO irv

СП ЧЛ

voevj

+

1Г\ о

• • о»

и и

а

+1

♦I

♦ I И Рч

+ | О Í4

H

•> • Ui

<\J

m «и r\(J I

u> »r

С) f^ I

нок, получивших инъекцию II фракции Байкера, отмечено лишь одно достоверное изменение - вдвое снизилась общая активность катепсина; Мы на'оплатили корреляции изменений активности этих ферментов в сыворотке и в лизосоыах печени ни у крыс, ьи у свинок. Не было отмочено параллельного и одновременного освобождения ферментов лизосом, что, по мнению некоторых исследователей, можно объяснить различной степенью прочности связи гидролитических ферментов с мембраной лизосом (Покровский A.A., Тутельян В.'А.', 1976).

Заслуживает внимания факт значительного снижения свободной активности катепсина в печени крыс. Возможно, что этот фермент ингибируется белковым токсином, образуя о ним неактивный комплекс. Возможно также, что катепсин используется токсический белок в качества субстрата, истощая свою активность.

Полученные результаты позволяют предполагать, что резистентность морских свинок ко II фракции Байкера связана с отмоченными специфическими видовыми особенностями - значительной лабильностью мембран их лизосом. После инъекции липополисаха-рида у крыс отмечали достоверное увеличение свободной.и общей активности катапсина и снижение общей активности гликозидаз. В печени морских свинок липополисахаридный эндотокопн не вызывал достоверных изменений свободной активности ни одного из иссла-дованных ферментов, однако, снижалась общая активность катеп-оина и гликозидаз. Таким образом, результаты позволили сделать вывод, что в реакции лизосом на дейстзие чумных токсических фракций имеют значение и химическая природа'исследуемого антигена, и специфические видовые особенности в отруктура момбран лизосом, отмеченные и в данных исследованиях, и в литературе (Блинова Т.В. о соавт», 1980).

Дополнительным доказательством участия лизосом в защите организма от повреждающего действия патогенных раздражителей может служить их способность инактивировать in vitro различные, антигены, ингибируя их. о помощью гидролитических ферментов. Поэтому для выяснения вопроса о роли и о степени участия лизосомных гидролаз печени в инактивации чумных токсинов изучалась способность этих ферментов инактивировать in vitro исследуемые токсические фракции чумного микроба. Установлено,

что лизосомные гидролазы печени нормальных белых крыс способны in vitro инактивировать дозу II фракции Бейкора, соответствующую 2,3 ы>5о для крыс (X2 = 13,6807). Аналогичная лизо-сомная фракция из печени крыс, которые предварительно получили ЗЬЛ^о токсина, а такие фракция почек интактных и отравленных крыс прэктичооки не инактивирует эту токсическую фракцию: гибнут 75-80 % животных, взятых в опыт (X2 = 0,0054). В контрольных группах, которым внутрибрюшнно вводили субклеточные фракции печени и почек, взятых как от интактных, так и от отравленных токсином животных, крысы но погибали. Одно из возможных объяснений данного явления заключается в том, что токсин может нарушать детоксицирующую функцию клеток РЭС, подобно бло-катору. Не исключено также, что существует связь между наблюдавшимся исчезновением свободной активности катепсина и утратой детоксицируюцей способности печени. Мы допускаем предположение, что катопсин или другие ферменты, содержащиеся в лпзосомах клеток РЭС, могут играть ванную роль в инактивации белкового токсина чумного микроба. Исследования детоксицирующей функции пе-чони в отношении липополисахаридиого чумного эндотоксина не дали положительных результатов. . но инактивировались ни I мл лизосомной фракции почони (8 мг белка), ни 3 мл (24 мг белка).

Известно,'что многио бактериальные токсины представляют собой ферменты или образуют с ними прочные трудиорэзделяемые^ комплексы. Мы сочли необходимым исследовать использованные в данной работе фракции на наличие в них ферментов, в'связи с тем, что некоторые ферменты микррорганизмов могут играть роль факторов патогенности (Езепчук Ю.В., 1985). Во II фракции по Бейкеру содержатся катзлаза и #-глюкозидэз8. В исследованных холорных антигенах обнаружены JL -амилаза и протеаза. Брюшнотифозный эндотоксин содержал протоазу и катепсин. Содержание формантов в токсических препаратах зависело от того, какой штамм микроорганизма был использован для получения препаратов и от степени очистки. Так, в токсическом препарате из птамма 1253 aitTHBHOvTb каталазы выие приблизительно в 5 раз,- Jj -глюкозида-зы - в 3 раза; обнаружены еще 2 фермента: щелочная фосфатзза и фруктозодифосфатэльдолаза. Токсины из одного и то*о же птамма ИТ , полученные в разных интервалах насыщения сернокислым ямго-

нием, также отличались и по набору ферментов, и по токсичности« Фракция, полученная в более широком интервала насыщения (40-67 %), менее токсична, в ней самая низкая активность -глюкозидазы и но обнаружена активность каталазы. Для решения вопроса о роли обнаруженных ферментов в патогенном эффекте животным вводили препараты, прогретые при 56° в точение часа, при этом, как известно, денатурируются многие балки и ферменты, в том числе и "мышиный" токсин. После прогревания II фракция Байкера потеряла токсичность, активность каталазы снизилаоь на 80 ^ -глюкозидазы - на 90 %. Брюшнотифозный эндотоксин сохранил и токсичность, и про!сеолитичоокую активность. Холерный антиген по Буавану не утратил токсичности и протеолитической активности, хотя активность о1 -амилазы в нем поело прогревания снизилась.

Таким образом, проведенное нами исследование показало, что ферменты сыворотки при инфекциях и интоксикациях, вызываемых действием бакториалышх токсинов, в том наборе ферментов, который обычно используется в клиниках, на могут служить надежным диагностическим тестом ввиду их налой специфичности. Данныо наших экспериментов показали, что процесс чумной интоксикации у разных видов .животных протекал наоднотипно и зависал как от видовой устойчивости животных и интоксикации, так и от химической природы,, токсической фракции. Показано участие ли-зосом печени в борьбе о чумной интоксикацией. Анализ полученных материалов привал к заключению, что чумные токсины действуют на лизосомы печени чувствительных и резистентных животных по-разному, что, вероятно, объясняется отмеченными нами видовыми особенностями этих субклеточных чаотиц у разных зидов лабораторных животных. Результаты проведанных исследований позволяют надеяться, что дальнейшая разработка вопросов, связанных о направленной стимуляцией функций элементов РБС, в частности, лизосом, при чумной инфекции и интоксикации послужит основой эффективной зпг"шшробной стратегии, направленной из модификацию содержимого фаголизосом для уничтожения этого особо опасного патогенного микроорганизма.

ВЫВОДЫ

1. Наследование пятнадцати ферментов сыворотки крови крыс при интоксикациях, вызванных II фракцией по Бейкеру и липопо-лисахаридом чумного микроба, показало, что восемь форментов изменяли активность синхронно при обеих интоксикациях. Изменения активности семи .ферментов носили специфический характер, что обусловлено особенностями патогенеза интоксикацией, вызываемых разными по химическому составу токоинами чумного микроба о

2. Белые крысы и морские свинки имеют достоверные видовые отличия в активности кислой фосфатазы и гликозидаз сыворотки крови.

3. Белые крысы и морокие свинки имеют достоверные видовые отличия в активности гликозидаз печени. У свинок в отличие от крыс значительная часть' кислой фосфатазы и jS-глюкозк-дазы находится в свободном состоянии.

Белковая и липополисахаридная токсические фракции чумного микроба вызывают изменения свободной и общо*активности ферментов лизосоы печени, уровень которых .зависит как ос химической природы токсина, так и от степени чувствительности животных к нему.

5. Фракция лизосоы печени белых крыо обладает способностью инактивировать in vitro в течение 30 мин 2,3 ы>50 II фракции Байкера чумного микроба, но не инзктивиру'ет липопо-лисахаридный эндотоксин Y.pestia . Фракция лизосом печени белых крыс, предварительно получивших 3LD50 "мышиного" токсина, утрачивает способность инактивировать II фракцию Бейкера чумного микроба in vitro.

.,б. Лнзосомная фракция из почек интактных и отравленных II фракцией Бейкера белых крыс датоксицируищей способности не проявляет.

7. В токсических фракциях чумного, холерного и брюшнотифозного микробов содержится ряд ферментов разных классов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I« Киселева А.К. Влияние различных по химическому составу токсинов чумного микроба на ферменты сыворотки крови//Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 1976. - Вып.4(59). - С.27-30.

2. Киселева А.К., Крупенина В.П. О содержании некоторых ферментов в токоических фракциях чумного, холерного и брюшнотифозного микробов//Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 1977. -Вып. 3(55). - С.13-15 .

. 3. Киселева А.К. Об инактивации чумного токсина тканями орггнов белых крыо//Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 1977. - Вып. 3(55). - С.16-17.

4. Киселева А.К. Влияние белковой и полиоахаридной токоических фракций чумного микроба на активность ферментов лизосом //¿опросы теоретической и клинической медицины. Цитохимические и биохимические исследования в эксперименте и клинике. -

Вып. 8. - Нальчик, 1979. - С.170.

5. Киселева А.К. Дейотвие разных по химическому составу токсинов чумного микроба на катепсин лизосом печени//Структура и функции лизосом: Таз. докл. 2-го Воесоюз. оимп. - Новосибирск, 1980. - С.78-79.