Автореферат и диссертация по медицине (14.00.30) на тему:Дифференциальная сывороточных иммуноглобулинов у грызунов в практике эпидемиологического надзора в природных очагах чумы

На правах рукописи

МЕЗЕНЦЕВ Владимир Матвеевич

ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ СЫВОРОТОЧНЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ У ГРЫЗУНОВ В ПРАКТИКЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО НАДЗОРА В ПРИРОДНЫХ ОЧАГАХ ЧУМЫ

14.00.31»-эпидемиология 14.00.3б-аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Ставрополь,1998

Работа выполнена в Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте

1аучные руководители:

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Г.М. Грижебовский, .

доктор медицинских наук, профессор K.M. Мохин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник В.П. Топорков кандидат медицинских наук A.B. Подсвиров

Ведущая организация:

Иркутский Ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока

Автореферат разослан « /3 » /У ¿Ii?/'

Защита состоится «

199 Рг.

199fr. в «

» час. на

заседании диссертационного совета Д.0^4.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб"

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук,

профессор Г.А. Корнеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что на территории стран СНГ насчитывается 43 природных очага чумы, обладающих различной эпизоотической и эпидемической активностью. По прогнозам многих исследователей в конце 20 - начале 21 веков сохранится напряженная эпидемиологическая обстановка, обусловленная эпизоотическими проявлениями чумы среди грызунов. В связи с этим для поддержания эпидбла-гополучия на первый план выступают вопросы непрерывного слежения за эпизоотической активностью в природных очагах и своевременного проведения эффективных мер по предупреждению заражения человека чумой и дальнейшего распространения этой инфекции.

Объективность и достоверность прогноза, разрабатываемого по результатам эпизоотологического обследования, во многом зависят от выбора тактических приемов и качества исполнения методов исследования. На основании многолетнего опыта работы с полевым и экспериментальным материалом определены основные методики лабораторных исследований на чуму. Частью из них являются иммунологические тесты, приспособленные для одновременного исследования большого количества проб. Высокая эффективность метода выявления специфических антител к фракции 1 (Рга 1) чумного микроба позволяет не только констатировать наличие эпизоотий, но и проводить их ретроспективную оценку, а в сочетании с другими методами исследований выдавать более качественные краткосрочные эпизоотологические прогнозы.

Исследование метаболизма белков в динамике иммуногенеза представляет значительный интерес, который обусловлен особо важной ролью процессов белкового обмена в становлении иммунологической защиты организма (Здродовский П.Ф., 1963; ХасманЭ.Л., 1964; Прокопенко Л.Г., Равич-Щербо М.И.,'1974; Гауровиц Ф., 1969).

В научной литературе широко представлены данные, касающиеся общих и частных закономерностей синтеза специфических иммуноглобулинов при ответной реакции организма на действие тканевых и бактериальных антигенов. Однако влияние антигенных субстанций чумного микроба на белковый обмен организма ещё недостаточно изучено. Преимущественно, приводятся результаты определения уровня специфических анти тел в динамике поствакцинального иммунитета в сыворотке крови. В го же время известно, что сложный процесс иммуногенеза затрагивает обмен веществ всего организма и, в первую очередь, белковый обмен в лимфо-идных органах (Учитель И .Я., Хасман Э.Л., 1963, 1968; Равич-Щербо М.И., Прокопенко Л.Г., 1966; Исупов И.В., 1970).

Существенно отметить, что подавляющее большинство исследований становления активного иммунитета при чумной инфекции было проведено на моделях поствакцинальных реакций после введения в организм им-муногенных субстанций или вакцинных штаммов чумного микроба. Изу-

чению же механизма постинфекционного иммунитета, развивающегося после заболевания чумой в естественных условиях, посвдщено небольшое число работ. В то же время знание закономерностей формирования постинфекционного иммунитета к чуме у .грызунов и, в частности, изменений в обмене белков представляет не только теоретический интерес, но и может послужить теоретической базой в решении практических задач, стоящих перед противочумной службой.

При эпизоотологическом обследовании в природных очагах для выявления мест циркуляции чумного микроба, наряду с бактериологическим методом, широко используются серологические методы исследований, которые позволяют выявлять как специфический для чумного микроба антиген - Fra 1, так и антитела к нему. Обнаружение у грызунов специфических антител, как фактора постинфекционного имйунитета, может служить индикатором, способным ретроспективно определить очаг чумной эпизоотии (Гненюк A.B. с соавт., 1982; Маматканов О.М. с соавт., 1974; Топорков В.П. с соавт., 1982).

Исследования по выявлению у грызунов специфических антител при чуме обычно проводят с сывороткой или с суспензией сгустков крови из органов грудной полости ("смывами"). Однако есть свидетельства, что антитела к некоторым бактериальным и тканевым антигенам первоначально выявляются в лимфатических узлах, а затем уже в сыворотке крови (Гурвич А.Е., Шумакова Г.В., 1960; Здродовский П.Ф., 1963; Фонталин Л.Н., 1967). Естественно возникает необходимость решения вопроса о возможности выявления специфических антител к чуме в более ранние сроки путем серологического исследования гомогенатов лимфоидных органов.

Для оценки эпизоотической ситуации весьма ценной могла бы быть информация о сроках контакта отдельных грызунов с чумным микробом и давности выявляемых эпизоотий. Был использован метод, предложенный R. Prigge (1953),-для ориентировочного разделения 7S- и 19Ё5-аьтител. Дифференциацию классов М и G сывороточных иммуноглобулинов при чумной инфекции в пробе с 2МЕ впервые применили S. Suzuki et all. (1974); K.M. Мохин с соавт. (1978). В основе метода лежит учёт закономерностей смегы синтеза IgM- на IgG-антитела в динамике иммуногенеза. Обнаружение специфических IgM-антител даёт основание констатировать недавние контакты грызунов с возбудителем чумы, а выявление IgG-антител указывает на контакты в более отдаленные сроки (Мохин K.M. с соавт., 1978; Хииц И.В. с соавт., 1980; Топорков В.П. с соавт., 1981).

Сроки смены синтеза IgM-антител на IgG-антитела не являются стандартными, а зависят от ряда факторов: физико-химической природы антигена, его дозы, кратности и места введения в организм, от индивидуальных особенностей организма, а также от вида животного. Этот вопрос еще не получил должного освещения в литературе. В связи с этим представляется перспективным комплексное изучение состава белков в сыво-

ротке крови и лимфоидных органах с акцентом на анализ динамики образования специфических антител различных классов иммуноглобулинов в зависимости от особенностей взаимодействия антигенов чумного микроба с макроорганизмом.

Использование методов, тестирующих сроки заболевания животных -носителей чумы в природе, приобретает особую значимость для уточне-. ния характера развития эпизоотии чумы во времени, для составления эпп-зоотологических прогнозов и, в конечном итоге, для планирования профилактических противочумных мероприятий.

Цель работы. Целью работы является изучение профиля специфнче ских белков в динамике развития иммунитета у отдельных видов три нов при чумной инфекции применительно к практике эпизоотологическо-го обследования.

Задачи исследования:

1. Изучить динамику синтеза IgM- и IgG-антител к Fra 1 чумного mi ;. роба в сыворотке крови и в лимфоидных органах у вакцинированных и зараженных чумой животных.

2. Проанализировать сроки пребывания чумного микроба в opi ami s\k-сраженных животных и динамику синтеза специфических иммуноглобч-шнов М и G.

3. Изучить возможность использования иммуноглобулинового профиля специфических антител у грызунов для оценки эпизоотической остановки.

4. Определить достоверность и содержательность оценок динамики шизоотического процесса на основании традиционных показателей количество положительных бактериологических находок, активность :ывороток в РПГА и РНАг) и на основании использованных методов дафференциации антител.

Научная новизна.

Впервые установлены закономерности в изменении количественных оотношений специфических белков в сыворотке крови и в лимфоидных >рганах в динамике поствакцинального и постинфекционного противо-[умного иммунитета.

Выявлено влияние различных вакцинирующих и заражающих доз. 1еста и кратности введения комплекса чумных антигенов на интенсив-юсть синтеза специфических IgM- и IgG-антител.

Установлен класс иммуноглобулинов полных (агглютинирующих) и [еполных (антигеннейтрализующих) антител к Fra 1.

Показана возможность использования стафилококкового реагента, одержащего белок А (СБА), в сочетании с 2-меркаптоэтаноловой (2МЕ) робой для определения классового состава специфических антител в сы-оротке крови у кроликов и малых сусликов как в начальные, так и в от-алённые сроки иммуногенеза.

Впервые в опытах на малых сусликах установлено, что в организме

животных в течение 20 суток одновременно присутствуют вирулентные клетки чумного микроба и ГцМ-антитела в сыворотке крови - нестерильный иммунитет.

Показана принципиальная возможность использовании дифференциации специфических антител у грызунов на уровне иммуноглобулинов М и в для анализа эпизоотической обстановки в природных очагах чумы сусликового типа.

Практическая ценность работы.

Разработаны: "Методические рекомендации по применению сыворотки чумной 1«М-антикапсульной для контроля дифференциации ^М- и ^О-антител в пробе с 2МЕ", утвержденные директором РосНИПЧИ "Микроб" (протокол 7 от 12 апреля 1983 г.); "Методические рекомендации по повышению эффективности эпизоотологическрго обследования в сусликовых очагах чумы на основе иммуноглобулиновой дифференциации специфических антител", утвержденные директором СтавНИПЧИ (протокол № 1 от 30 января 1998 г.); "Инструкция по изучению взаимоотношений чумного микроба с организмом блохи", утвержденная первым заместителем Министра здравоохранения -РФ от 15 августа 1997 г.; "Временные методические указания по организации и проведению эпидемиологического надзора в природных очагах чумы России в условиях ограниченных финансовых и материально-технических ресурсов" (МУ 3.1.700 - 98), утвержденные первым заместителем Министра здравоохранения РФ Г.Г. Онищенко от 22 апреля 1998 г.

Положения, выноснмые на защиту:

!. Динамика синтеза ^М- и 1цО-ангитсл к Рга 1 чумного микроба у вакцинированных животных (кролики, малые суслики, полуденная и гребенщиковая песчанки).

2. Динамика синтеза специфических 1цМ- и 1«С-антител у животных, зараженных вирулентным чумным микробом (малые суслики, полуденная и гребенщиковая песчанки).

3. Возможность испс;,-зования сочетанной обработки иммунных сывороток СБА и 2МЕ для г дифференциации ^М- и 1«0-антител к Рга 1 чумного микроба у малых сусликов, полуденных и гребенщиковых песчанок.

4. Закономерности пребывания чумного микроба в организме заражённых чумой животных в зависимости от класса специфических антител.

5. Сравнительный анализ оценки динамики эпизоотического процесса на основании современных методов дифференциации антител и традиционных показателей (количество положительных бактериологических находок, активность сывороток в РПГА и РНАг).

6. Возможность использования метода дифференциации специфических антител на уровне иммуноглобулинов М и в в практике эпизоотоло-гического обследования для целей ретроспективного анализа и краткосрочного прогноза.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на ежегодных научно-производственных советах Уральской противочумной станции в 1980 - 1991 гг., рабочем совещании "Современное состояние и задачи по профилактике особо опасных инфекций в Северо-Западном Прикаспии" (Астрахань, 1986), итоговой юбилейной конференции РоеНИПЧИ "Микроб" (Саратов, 1990), конференции по проблеме "Животный мир Казахстана, его изучение, охрана и рациональное использование" (Алма-Ата, 1991), объединенной научной конференции СтавНИПЧИ (Ставрополь, 1998).

Публикации. Основные результаты и положения диссертации отражены в 13 печатных работах.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 150 страницах машинописи, иллюстрирована 15 таблицами, 19 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения собственных исследований, состоящих из 3 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 176 работ отечественных и 20 работ зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В настоящей работе представлены материалы собственных исследований, а также анализ результатов зпизоотологиче-ского обследования, проводимого отдельным«; лабораториями Уральской противочумной станции на территории Волго-Уральского степного очага чумы в 1978-1989 г.г.

В качестве биологических моделей для изучения динамики синтеза IgM- и IgG-антител были взяты резистентные к чумной инфекции кролики (33), полиморфные по резистентности к вирулентным штаммам чумного микроба левобережные полуденные песчанки (713). среднечувствитель-ные малые суслики (760) и высокочувствительные гребенщиковые песчанки (57).' С целью изучения динамики антителообразования у малых суслико» при заражении укусами блох были использованы 54 блокированных Neopsylla setosa и 34 Citellophilus tesquorum.

При проведении экспериментальных исследований использованы вирулентный музейный штамм Y. pestis 231(708), выделенный от трупа алтайского сурка в 1947 г., слабовирулентный штамм № 38, выделенный от гребенщиковых песчанок в 1968 г. на территории, обслуживаемой Уральской противочумной станцией, а также - коммерческая живая чумная вакцина ЕВ, типичные штаммы возбудителя чумы №№ 6354, 744, 641, изолированные от малых сусликов, и №№ 21,1292 - от полуденных песчанок.

Экспериментальные исследования на кроликах проводились на базе РоеНИПЧИ "Микроб", на диких животных - на базе лабораторий Уральской ПЧС.

Антитела.к Fra 1 чумного микроба определялись в системе РПГА -

РНАг на микротитраторе системы "Такачи" согласно "Инструкции по применению серологических методов диагностики при эпизоотологиче-ском обследовании природных очагов чумы" (Саратов, 1974) и "Инструктивно-методических материалов по применению серологических методов диагностики при эпизоотологическом обследовании природных очагов чумы" (Москва, 1983).

Исследование лимфоидных органов и образований у кроликов на содержание специфических антител проводили после перфузии органов физиологическим раствором. Гомогенаты из органов готовили в стеклянном гомогенизаторе типа Potter-Elveheim и разводили охлажденным физиологическим раствором. Экстракты инактивировали при 56° С 30 мин., центрифугировали при 6000 об/мин 30 мин. и после 2-часовой адсорбции 50% взвесью формалинизированных эритроцитов использовали для постановки РПГА-РНАг.

Дифференциацию IgM- и IgG-антител к антигену Fra 1 чумного микроба определяли по степени их чувствительности к действию 0,1 M 2МЕ (конечная концентрация) и в пробе со стафилококковым реагентом, содержащим белок А.

Специфические антитела по принадлежности их к классам IgM и IgG дифференцировали в пробе с 2МЕ. Антитела, которые утрачивали ге-магглютинпрующую активность после воздействия 2МЕ, относили к классу IgM, резистентные к воздействию 2МЕ - к классу IgG. Частичное снижение тигра антител расценивали как присутствие в исследуемом материале одновременно и IgM-, и IgG-антител. .

Снижение титра антител в сыворотках, обработанных СБА, расценивали как положительный результат на IgG-антитела, отсутствие снижения титра - как преимущественное содержание IgM-антител.

Статистическую обработку полученных результатов с нахождением среднеарифметических и среднегеометрических показателей, среднеквад-ратического отклонения, ошибки репрезентативности, сглаживание эм лирических кривых осуществляли на микрокалькуляторах МК-51 и БЗ-З^ по соответствующим программам (Дьяконов В.П., 1986). Построенш графиков проводили на компьютере (Excel, Quattro Pro, Statgraph).

В работе не пользовали результаты полевых наблюдений в Урало Кушумском междуречье за 1978-1989 г.г. и созданную автором компью терную базу данных. Всего исследовали бактериологическим методов 6?677 малых сусликов и 169711 эктопаразитов, изолировали 761 штамп ч; много микроба. В системе серологических реакций исследовали 3883( малых сусликов, из них 616 для определения класса иммуноглобулинов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе нашей работы изучили синтез специфических к Fra k;M- и lgG-антчтел в динамике поствакцинального иммунитета у кроли ков. Установлено, что поспе введения живой чумной вакцины ЕВ в на

чальном периоде иммуногенеза синтезируются антитела класса ^М, а затем происходит переключение на синтез антител класса ^О (рисунок 1).

12

311 а „„

а

I 9

0 8

<3.

1 7

3 6

5

5 8 12 15 19 27 35 Дни .

Рис. I. Динамика образования и класс иммуноглобулинов агглютинирующих и антигеннейтрализующих антител к Рга 1 чумного микроба у кроликов при внутривенном введении чумной живой вакцины ЕВ

Примечание: П- антигеннейтрализующие, ЕЗ- ]цМ агглютинирующие, п - антигеннейтрализующие, Й- агглютинирующие

Сроки обнаружения последних в сыворотке крови и в лимфоидной ткани зависят от метода введения вакцины. При внутривенном способе иммунизации агглютинирующие ^С-антитела появляются на 12 сутки в сыворотке крови и на 19 сутки во всех лимфоидных органах и образованиях. При подкожном введении вакцины ^¿-антитела в сыворотке крови зарегистрированы у отдельных животных на 15 сутки, а в лимфоидных органах - на 16 сутки. При подкожном способе иммунизации названные антитела на 16 сутки выявлены только в регионарных лимфоузлах, однако и в них они обнаруживаются непостоянно. В опытах на кроликах установлено, что сочетанная обработка исследуемых сывороток СБА и 2МЕ приводит к утрате их серологической активности и позволяет получить полное1 представление о классе иммуноглобулинов агглютинирующих и антигеннейтрализующих антител к Рга I чумного микроба как в начальные, так и в отдаленные сроки иммуногенеза.

При подкожном введении убитой чумной вакцины, выращенной при . 37° С, первоначальное депонирование корпускулярного антигена происходит в регионарных лимфатических узлах, откуда он попадает в кровь и далее в отдалённые лимфоидные органы и образования с последующей активизацией синтеза специфических антител. В начальный период (1-3 сутки) в лимфатических узлах, в селезенке и в крови выявляли циркуляцию антигена Рга 1, на 4 сутки в крови одновременно определялись спе-

цифические антитела и тот же антиген, в последующие сроки - только специфические антитела. Эти данные указывают на перспективность разработки высокочувствительных методов обнаружения иммунных комплексов. Подтверждение установленных закономерностей динамики образования и ^О-антител у основных носителей чумы значительно расширило бы возможности анализа в практике эпизоотологического обследования.

Экспериментальное изучение антителообразования у высокочувствительных к чуме гребенщиковых песчанок при подкожном введении авиру-лентного штамма чумного микроба показало, что динамика выявления ^М- и ДО-ант ител у них характеризуется практически такими же временными параметрами, как и у кроликов. Повторное антигенное раздражение в период синтеза ^М-антител приводит к более быстрому перераспределению соотношения сначала неполных ^М- и ^О-антител в сторону последних, а затем и полных антител. Аналогичными оказались закономерности синтеза антител к Рга I чумного микроба и у относительно резистентных к чуме левобережных полуденных песчанок в процессе как поствакцинального, так и постинфекционного иммуногенеза (рисунок 2).

80 т

< ??0

£60

£50 ю

5 40

|зо

н

1?о

Ею

ш о

О

>

ч

у

/

/ с

/ ф ■ - _ т ш < ^ < щ

--1- _—, -1 1 1

■г 100

•■90

■■80

с

■■70 ш

£

• НИ X

да

■•50 О

га

••40 к

•30 г СП

и

•10

+ 0

Дни

7-8

9-10 12-14 15-19 21-22 29 Дни Рис. 2. Выявляемость антител у полуденных песчанок в динамике после однократного заражения возбудителем чумы У. реэ^ 1292

Примечание: —о—- серопозитивные (в %), " 0 только в РНАг (в %), в РПГА (в %),М^ЙЗ. из них с (в %),1-из них с ^М (в %)

Выработкой специфических антител на заражение вирулентным штаммом реагировали до 75% полуденных песчанок. Появление специфических антител регистрировали в РНАг на 5 сутки у 4,9% животных. К 7 - 8 суткам доля серопозитивных грызунов возрастала до 58,9%, при этом полные антитела класса ^М были обнаружены у 32,9%. Максимальное количество животных с 1§М-антителами приходилось на 9 - 22 сутки

после заражения, у части животных в течение 22 - 29 дней выявлялись только неполные антитела. ^С-антитела были выявлены через 15 - 19 суток, а к 29 суткам они обнаруживались у 31,2% животных.

Повторное заражение, проведённое через 7-10 суток на фоне продукции ^М-антител большей дозой (10 млн м.т.), привело к тому, что уже на 16 сутки в сыворотках у значительного количества грызунов (35%) содержались ^О-антитела. К тому же неполные антитела выявлялись в течение очень короткого периода - до 9 суток, а на 16 сутки после повторного заражения животные с антигеннейтрализующими антителами уже не выявлялись.

Характерной особенностью высеваемости возбудителя чумы от серо-позитивных полуденных песчанок как после однократного, так и после двукратного заражения являлось то, что чумной микроб чаще обнаруживался у грызунов в период синтеза неполных и полных ^М-антител и гораздо реже в период выявления ^в-антител.

Экспериментальные исследования на полуденных песчанках показали, что на обнаружение антител в "смывах" оказывали влияние продолжительность и температура хранения забитых животных, а также исходные титры антител в сыворотках. Недооценка влияния этих факторов может привести к искажению информативности результатов эгшзоотологическо-го обследования, поэтому необходимо начинать исследование отловленных животных не позднее 6 часов после их умерщвления. При невозможности соблюсти это условие допускается хранение трупов животных в течение суток при 4° С. Одновременно с этим, для повышения информативности бактериологического метода исследования полуденных песчанок на стационарах и со специальными научными целями, необходимо дополнительное исследование лимфатических узлов.

В опытах по изучению иммуногенеза у малых сусликов также использовали чумную вакцину ЕВ и вирулентные штаммы возбудителя чумы. Антигенное воздействие вакцинного штамма в относительно малой дозе (10 млн м.т.)'показало, что ответная реакция организма животных регистрировалась в виде обнаружения неполных и полных ^М-антител в течение примерно первых четырех недель. Увеличение дозы вакцинного штамма на один порядок приводило к повышению серологической активности сывороток в РПГА и РНАг (до 1:160 - 1:320). 1§М-антитела появлялись уже на 4 сутки наблюдения, на 18-23 сутки также отмечалось одновременное обнаружение ^М- и ^О-антител. Однако полной замены 1{>М- на 1цС-антитела мы не обнаружили и через 2 месяца наблюдений. При введении 1 млрд м.т. вакцинного штамма максимальные титры анти-геннейтрализующих ^М-антител регистрировались в течение 4-14 суток. Повышение вакцинирующей дозы сопровождалось увеличением доли животных с наличием полных и 1цО-антител в те же сроки до 40 %. Соответственно сократились и сроки обнаружения антител.

Изучение- иммунологической реактивности малых сусликов в динами-

ке постинфекционного иммунитета при заражении их вирулентными штаммами чумного микроба показало, что в начале инфекционного процесса специфические антитела были представлены иммуноглобулинами М, а с 16-20 суток в сыворотках крови стали обнаруживаться антитела класса ^Ст (рисунок 3).

100

Рис. 3. Образование антител различных классов иммуноглобулинов у малых сусликов в динамике после заражения У. ревПз 6354 в дозе 250 м.т. Примечание: -в РНАг, в РПГА,

из них: 1-1 с 1ёМ, ШШ с 1ёМ и 1ёО, ^^ с 1ЕС

У молодых особей их появление в сыворотке крови было сдвинуто на более поздние сроки, чем у взрослых грызунов. В лимфатических узлах специфические антитела класса ^М стали обнаруживаться только через 26 суток после заражения.

Изучение иммунореактивности малых сусликов при заражении укусами блокированных блох показало, что основные закономерности образования специфических антител различных классов иммуноглобулинов сохраняются и для этого метода заражения.

С учетом полученных результатов, в Волго-Уральском степном очаге чумы, где в 1978 г. после 28-летнего перерыва вновь зарегистрированы эпизоотии чумы в поселениях малых сусликов, были проведены специальные полевые наблюдения в плане оценки возможности использования данных об иммуноглобулиновой принадлежности антител к Рга I чумного микроба для анализа, краткосрочного прогноза эпизоотической активности природного очага и повышения эффективности бактериологического исследования.

Работа проведена на малых сусликах, отловленных на эпизоотических и свободных от эпизоотий чумы участках. У 14,7% взятых в опыт грызу-

нов были обнаружены антитела к Рга I чумного микроба. Из них у 81,3% агглютинирующие антитела были представлены ^О, у 10,9% -(таблица 1).

Таблица 1. Результаты бактериологического и серологического исследования малых сусликов, отловленных на эпизоотической территории, после заражения возбудителем чумы

Характер Сроки Результаты Выявлено с Из них(%)

животных взятых в опыт после заражения, (сут.) бактериологического исследования* антителами (абс./ %) IgM IgG Только вРНАг

0 - 64/14,7 10,9 81,3 7.8

Серопози- 7 4/1 55/85,9 13.0 74.0 п.о

тивцые 14 3/- 57/95,5 7.1 83.9 9.0

21 39/1 54 / 94,7 11.3 75,5 13.2

39 18/- 18/100 27.8 66.7 5.5

0 - 374 / - - - -

Серонега- 7 70/67 54/ 14.4 22,2 1 l.l 66.7

тивные 14 92 / 32 104/34.2 43.3 15.4 41.3

21 178/5 74 / 34.9 31.1 14.9 54,0

39 34/- 28 / 82,4 10.7 64.3 25.0 !

11римечаиие: * - п числителе - исследовано (абс.).

в знаменателе - выявлено зараженных (абс.)

При ширицсвом заражении вирулентным штаммом ч\ много микроба основная часть ссронегатнвных малых сусликов реагировала синтезом неполных и полных антител класса 1цМ, однако у 11.1"» грызунов уже на 7 сутки появлялись ^О-антнтела. К 39 суткам (срок наблюдения) количество особей с 1йС]-ан ппелами достигало 64.3"». тогда как максимум живот-пых с ^М-аптнтелами приходился на 14-21 сутки. В этот период чаще выявлялись локализованные формы чумной инфекции, а высевасмоеть возбудителя из лимфатических узлов была несколько выше, чем из печени и селезенки. При бактериологическом исследовании животных, павших от чумы на 7-14 сутки после заражения, чаще наблюдалась генерализованная ее форма.

Результаты серологического исследования серопозитивных малых сусликов были характерны для животных, повторно встретившихся с возбудителем чумы. Соотношение животных с агглютинирующими антителами класса ^М, кО и только антигеннейтралнзующими антителами как

до заражения, так и во все сроки исследования после заражения, заметно не изменилось (до 39 суток).

Результаты эпизоотологического обследования с определением класса иммуноглобулинов специфических антител у серопозитивных сусликов и дополнительным бактериологическим исследованием лимфатических узлов выявили определенную закономерность протекания эпизоотии в зависимости от фенологических сроков жизнедеятельности малого суслика, что позволило нам выделить три периода эпизоотической активности (рисунок 4). .

Период с момента пробуждения малых сусликов из зимней спячки до выхода молодняка на поверхность характеризуется незначительной эпизоотической активностью. Обнаружение возбудителя в этот период представляет большие трудности. На территории с активным течением эпизо-отий на протяжении последних трех лет к началу нового обследовательского сезона, как правило, имеются серопозитивные животные. Величина иммунной прослойки в ранневесеннем периоде ретроспективно отражает интенсивность прошлогодних эпизоотий. Однако обнаружение в этот период животных с полными антителами класса IgM или неполными антителами в титре 1:80 и выше указывает на ранневесеннюю циркуляцию чумного микроба, а обнаружение зверьков с титром антител в РПГА 1:1280 и выше свидетельствует о повторном контакте с возбудителем чумы. Выявление свежих контактов в этот период представляется важным с позиций эпизоотологической оценки и краткосрочного прогноза возможности и интенсивности весенне-летних эпизоотий чумы на конкретных участках, а следовательно, необходимости проведения профилактических мероприятий.

У грызунов, добываемых в ранневесеннем периоде на прошлогодних эпизоотических точках, в основном, определялись антитела класса IgG, однако на некоторых точках единичные грызуны содержали антитела класса IgM, что указывало на недавний контакт с возбудителем чумы.

При последующем заборе материала с этих точек был выделен возбудитель чумы, тогда как при неоднократном заборе материала с точек, на которых в ранневесенний период обнаружены малые суслики с антителами класса IgG, выделить возбудителя чумы не удалось во все периоды обследования.

Вероятно, обострение эпизоотий на точках, где в ранневесеннем периоде обнаруживались животные с антителами IgM, в какой-то мере зависело от величины иммунной прослойки, которая препятствовал."* обострению эпизоотий на этих точках и способствовала формированию локальных и затяжных форм чумы. В таких случаях исследование лимфатических узлов повышало результативность бактериологического метода исследования.

12 10 8 6 4 2 ; о

3

> 8 6 4 2 0

12 3 Апрель Первый пер йог

" "Второй период

Третий период

О..........I

Рис. 4. Результаты подекадного эпизоотологического обследования на чуму юго-западной части Урало-Кушумского междуречья за 1978-89 г.г. и периоды эпизоотической активности в поселениях малого суслика

Примечание: по оси У1- зараженность малых сусликов, блох го шерсти и из нор (в %), серопозитивные малые суслики (в %); по оси У2- соотношение ^М-, ^С- и неполных антител (в %)

'—' - неполные антитела, - ^М-антитела, ®® - ^О-антитела,

- серопозитивные суслики,

- -о- - .

■ зараженность блох из шерсти,

зараженность норовых блох, " - зараженность сусликов

Второй период эпизоотический активности совпадает с выходом на поверхность, началом миграционной активности молодых особей малого суслика и характеризуется обострением эпизоотий. В этот период выявляются новые эпизоотические точки с различной экстенсивностью зараженности грызунов и эктопаразитов. Среди серопозитивных животных основную группу представляют особи с полными антителами класса ^М и неполными антителами. Доля серопозитивных сусликов с антителами класса постепенно нарастает к концу периода.

С окончанием массового расселения наступает третий период, характеризующийся снижением реактивности животных и напряженности эпизоотических контактов среди молодых особей, однако и в этот период возможно обнаружение чумного микроба на новых точках даже при отлове единичных грызунов. Наличие у молодых особей антител класса 1§М

ж-

или неполных антител свидетельствуем о продолжающейся циркуляции чумного микроба, а исследование лимфатических узлов и в этот период позволяет повысить результативность бактериологического метода исследования.

По результатам многолетних наблюдений на территории Волго-Уральского степного очага чумы в первом периоде эпизоотологической активности доля проб с положительным результатом составила 1,4%, во втором периоде - .15,5% и в третьем - 14.8%. Распределение проб с зараженными малыми сусликами и эктопаразитами в эти же периоды было 1.8%, 89,4% и 8,8% соответственно.

Корреляционная связь между наличием у малых сусликов ^М-антител и носительством бактерий чумы составила 0,7, с зараженными блохами из шерсти грызунов - 0,8.

На точках с регистрацией эпизоотических проявлений в течение 1-3 лет заражённые грызуны выявляются со 2-3 декады мая по 2 декаду июля, на отдельных точках отмечается большая доля заражённых грызунов и эктопаразитов, серопозитивные животные обнаруживаются со 2 декады мая. На следующий год эпизоотии регистрируются повторно на отдельных точках. Наблюдается кратковременная циркуляция возбудщ'еля чумы среди малых сусликов и их эктопаразитов, которая приходится на 3 декаду мая и (или) на 1-2 декады июня. На третий год следы эпизоотии регистрируются, как правило, только серологическим методом. Отмечаются единичные точки с выделением возбудителя чумы от норовых блох.

На точках г длительной циркуляцией возбудителя чумы в первый год выявления эпизоотий заражённые животные обнаруживаются со 2 декады мая по 3 декаду июля. Среди серопозитивных малых сусликов во 2-3 декадах мая выявляются особи только с %М-антителами. Первые малые суслики с наличием антител класса IgG регистрируются в 1 декаде июня, а во 2-3 декадах июня - начале июля их количество доходит до 100%. Во второй декаде июля среди серопозитивных малых сусликов увеличивается доля особей с ^М-антителами, связанная с дальнейшим вовлечением в эпизоотию молодых и взрослых особей.

При обследовании точек во 2,3,4 и последующие годы сроки обнаружения заражённых сусликов всё более сдвигаются на середину июня - начало июля. Отмечается постепенное затухание эпизоотического процесса. В отдельные годы происходит обострение эпизоотий, однако оно, как правило, носит случайный слабо выпаженный характер.

Установленная закономерность смены синтеза 1§М- на ^Б-антитела при первичном и повторном антигенном воздействии дает возможность использовать этот критерий для определения давности контакта с возбудителем чумы в каждом конкретном случае и при необходимости целенаправленно интенсифицировать поиск возбудителя.

Анализ результатов дифференциации ^М- и ^О-антител к Рга I чумно-гг> микпоба в иммунных сыворотках применим, несомненно, для всех оча-

гов сусликового типа и может найти следующие аспекты применения:

- совершенствование тактики эпизоотологического обследования;

- оценка эпизоотической обстановки во времени для целей ретроспективного анализа и краткосрочного эпизоотологического прогноза;

- оценка эффективности проведенных истребительных работ.

ВЫВОДЫ

1. Неполные (антигеннейтрализующие) антитела, выявляемые в начальные сроки иммуногенеза у экспериментальных животных, представлены, в основном, IgM; в последующие сроки быстро повышается содержание антигеннейтрализующих антител класса IgG. Подобная динамика только в более отдаленные сроки характерна и для агглютинирующих антител.

2. Определение принадлежности антител к классам иммуноглобулинов М или G позволяет ретроспективно установить сроки контакта грызунов с возбудителем чумы. Выявление серопозитивных животных с антителами класса IgM свидетельствует о недавнем контакте с возбудителем чумы.

3. На эпизоотических точках с длительной циркуляцией чумного микроба в популяции малого суслика происходит накопление иммунных особей; при этом доля серопозитивных грызунов в отношении того или иного класса антител, установленная в ранневесенний период, косвенно отражает интенсивность эпизоотий, протекавших в прошлом.

4. Впервые в опытах на малых сусликах установлено, что в организме животных в течение 20 суток одновременно присутствуют вирулентные клетки чумного микроба и IgM- антитела в сыворотке крови. По мере нарастания титров IgG- антител возбудитель чумы не обнаруживается.

5. В процессе длительного протекания эпизоотий на одних и тех же участках происходит естественный отбор более резистентных особей малого суслика к возбудителю чумы, способствующий повышению общей резистентности популяции и формированию скрытых, локальных и затяжных форм инфекции.

6. При эпизоотологическом обследовании в очагах чумы сусликового типа бактериологическое исследование лимфатических узлов позволяет повысить высеваемость возбудителя чумы от зараженных грызунов, что представляет интерес при проведении обследований со специальными научными целями.

7. Экспериментально установлено, что эффективность серологического метода исследования "смывов" от "левобережных" полуденных песчанок обеспечивается лишь при соблюдении основного условия: начало исследования . грызунов не позднее 6 часов с момента их вылова или сохранение трупов зверьков должно быть не более одних суток при температуре 4° С.

8. Комплексное использование серологического и бактериологическо-

го методов исследования позволило установить три периода эпизоотиче ской активности в Волго-Уральском степном очаге в соответствии с фе нологическими сроками жизнедеятельности малого суслика.

9. Определение специфических антител на уровне иммуноглобулиног М и G у малых сусликов может использоваться для ретроспективного ■и.алпза эпизоотической активности очага и краткосрочного ее прогноза.

СПИСОК

научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мезеннси В.М Динамика синтеза и распределения по классам иммуноглобулинов специфических антител в сыворотке крови и лимфоид-ных органах кроликов при внутривенной иммунизации чумной вакциной ЕВ. // Иммунология и иммунопрофилактика чумы и холеры: Тез. докл. на Всесоюзн. конф. - Саратов, 1980. - С. 54-57.

2. Мохин K.M.. Самойлова Л.В., Мезенцев В.М., Хинц И.В., Плотникова Е.А., Пионтковский С.А. Иммунологический спектр специфических антител агглютинирующих чумных сывороток // Иммунология и иммунопрофилактика чумы и холеры: Тез. докл. на Всесоюзн. конф. - Саратов, 1980.-С. 140-143.

3. Мезенцев В.М., Старокожева О.Н., Яценко А.И. Иммунобиологическая реактивность малых сусликов в динамике поствакцинального иммунитета к чуме // Патологическая физиология особо опасных инфекций. -Саратов, 1981. - С. 8-10.

4. Самойлова Л.В., Мохин K.M., Пионтковский С.А., Касьян А.Ф., Васенин A.C., Плотникова Е.А., Мезенцев В.М. Сравнительная характеристика бактериологического и серологического методов исследования при чуме // Иммунология и профилактика особо опасных инфекций. - Саратов. 1982. - С. 7-14.

5. Мезенцев В.М. Уровень и иммуноглобулиновая природа специфических антител в сыворотке крови и лимфоидных органах кроликов в динамике формирования иммунитета к чуме. - Саратов, 1982. - 8с. - Деп. во ВНИИМИ МЗ СССР 02.08.82, № 5470- 82.

6. Алтухов A.A., Шевченко В.Л., Гражданов А.К., Паршин Б.М., Мезенцев В.М., Катурга Л.Н., Родионова A.A. Некоторые итоги изучения нетрансмиссивного пути передачи чумы у малого суслика // 12-я межреспублик. науч.-пракг. конф. противочумн. учрежд. Ср. Азии и Казахстана по профилакт. чумы. - Алма-Ата, 1985. - С. 54-55.

7. Гражданов А.К., Мезенцев В.М. Результаты испытания чумного моноклонального антительного диагностикума при эпизоотологическом обследовании на чуму // Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций: Тез. докл. Всесоюзн. науч.-практ. конфер. - Ставрополь, 1986. - 4.1. - С. 72-74.

N. Мезенцев В.М., Мохин K.M., Михайлюк Н.И., Сасыкип Г.А., Рах-

нанкулов P.P. О повышении эффективности серологического и бак!еио-тогического обследования на чуму малых сусликов по результатам экспериментальных и полевых наблюдений // Микробиология и биохимия осо-5о опасных инфекций. - Саратов, 1988. - С. 62-69.

9. Мезенцев В.М., Мохин K.M., Гражданов А.К. Класс иммуноглобу-¡пшов полных и неполных антител у кроликов в динамике противочумного иммунитета // Биотехнология, иммунология и биохимия особо опасных инфекций. - Саратов, 1989. - С. 95-100.

10. Мезенцев В.М., Гражданов А.К., Невольников П.В.. Михайлюк Н.И., Цитцер А.О., Тохтаров М.И. Результаты сравнительного изучения микро- и макрометодов в реакциях гемагглютинации при эпизоотологи-ческом обследовании на чуму // Эпизоотоло1 ия и профилактика особо опасных инфекций в антропогенных ландшафтах. - Саратов, 1990. - С. 51-

11. Мезенцев В.М., Гражданов А.К.. Мохин K.M. Некоторые аспекты обнаружения и дифференциации антител по классам иммуноглобулинов у животных при чуме // Прнродноочаговые инфекции и их профилактика. -Саратов, 1991.-С. 52-57.

12. Мезенцев В.М., Ерш ч К.А., Гражданов А.К., Шевченко В.JI., Мезенцева О.Н. Общие закоР -мерности проявления эпизоотии чумы на малых сусликах в Урало-Кушумском Междуречье в 1978-1989 годах // Проблемы особо опасных инфекций. - Саратов, 1994. - № 5(75) - С. 32-40.

13. Мезенцев В.М., Хинц И.В., Мезенцева О.Н., Гражданов А.К. К анализу результатов эшпоотологического обследования западной части Урало-Кушумского междуречья // Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний. - Ставроп« 53.

56.

Зек. Hi ЦЦ Подл, к пен. /0. //. Тир. /00 экз.

РЪтапринт ВНИИОК, Ставрополь, пер.Зоотехнический, 15