Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Сравнительное изучение аналгетических и подкрепляющих свойств антагонистов рецепторов возбуждающих аминокислот

РГ6 од

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ ИМЕНИ АКАДЕМИКА И. П. ПАВЛОВА

РГб од ~

На правах рукописи

П ' к.1. ■

БЕСПАЛОВ Антон Юрьевич

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ АНАЛГЕТИЧЕСКИХ И ПОДКРЕПЛЯЮЩИХ

СВОЙСТВ АНТАГОНИСТОВ РЕЦЕПТОРОВ ВОЗБУЖДАЮЩИХ АМИНОКИСЛОТ

14.00.25 — фармакология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских паук

Санкт-Петербург 1994

Работа выполнена на кафедре фармакологии и в лаборатории фармакологии наркотиков Научно-Исследовательского Центра Санкт-Петербургского медицинского института имени академика И. П. Павлова.

Научный руководитель —

доктор медицинских наук, профессор Э. Э. Звартау.

Научный консультант —

кандидат химических наук Л. Б. Пиотровский.

Официальные оппоненты —

доктор медицинских наук, профессор И. П. Лапин, доктор медицинских наук, профессор Ю. С. Бородкин

Ведущее учреждение —

Военно-Медицинская Академия им. С. М. Кирова.

Защита состоится 17 июня 1994 г. в 13 часов 15 минут на заседании специализированного совета К 074.37.02 в Санкт-Петербургском медицинском институте имени академика И. П. Павлова (197089, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6/8) в зале заседаний Ученого совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан «_»_1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, профессор

а Э. ЗВАРТАУ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Лктузлмюсп. настоящей работп определяется несколькими обстоятельствами. Хорошо известно, что большинство синапсов в центральной нервной системе млекопитающих (ЦПС) в качестве возбуждающих медиаторов используют кислые аминокислоты, такие как глутампновая и аспарагиповая кислоты (возбуждающие аминокислоты, ВАК) (Watkins, 19SS). В настоящее время доказано существование как минимум пяти подтипов рецепторов ВАК - четырех понотропных (N-mctiui-D-аспартатнии, NM DA; каинатный; AMPA; L-AP1) и одного метаботропного (Пиотровский Л.Б., Думгшс М.А., 19S9). Возможное участие различных подшпоп рецепторов ВАК в патогенезе разнообразных нарушений функционирования ЦНС стало d последние годы ооьек г о \( особого внимания исследователей. Появляются i.ce более многочисленные свидетельства значения патологии глутамагергическои передачи в происхождении судоро:кных состояний (включая эпилепсию), нейроде1 оперативных расстройств (хорея Гстиипоиа, Соле?»». Лчьнгейчера. боковой амнотрофический склероз и др.) и повреждении мозг:, соуслопдсппух возденет гием гипоксии, ишемии, гипогликемии (Dinjledine et а!., 1970: Mekbuin and Gan!)v,Tiitc, 1990). Многими пссягдопатсяими подчеркивается важная роль глутаматертческой передачи в процессах памяти и обучения, т.';. процессах нсПропальмой пластичности (McDonald and Johnsion, 1990). Частным вило1.! нейрональиой пластичности являются эффекты, возникающие при длительном применен;!» оппзтных аналгетикоэ - толерантность и зависимость Ранее было показано, что антагонисты ВАК предупреждают разкцтие толерантности/ сенситнзацш! к эффектам различных пенротропных средств (этанол, кокаин, амфетамин, нмнпрамин и др.) (Marek et al., 1991; Ds Montis et al., 1993; Wolf ami Jeziorski, 1993). Поэтому изучение веществ, избирательно воздействующих па глутлматергическуга передачу, как.потенциально активных средств предупреждения развития оннатной толерантности и зависимости является актуальной проблемой. При этом желательно, чтобы эти вещества, замедляя развитие толерантности к положительным эффектам опиатов, не уменьшали их аналитическую активность.

Глутаматергпческая передача играет так;ке существенную роль в процессах функционирования базальных ядер и структур лпмбичеекой системы (Mogenson, 1987; Pulvircnti et al., 1987; Krebs et al., 1991; Kalivas, 1993; Dourinap and Costentia,

1994). Поэтому при исследовании возможной терапевтической ценности сочетания антагонистов ВАК с ониатными аналгетпками нужно учитывать, что эти вещества (например, МК-801) могут обладать активирующим действием на мозговую систему "награды" и, следовательно, адциктивным потенциалом. Тем более, что клиническое применение опнатных аналгегиков во многом ограничено из-за иемедицинского использования, обусловленного наличием иозитшшо-нодкреплнющих свойств (Вальдман A.B. и соавт., 1988).

Настоящая работа выполнена в рамках Государственной научно-технической программы "Создание новпх лекарственных средств методами химического и биологического синтеза", тема "Изыскание новых болеутоляющих к психотропных средств, регулирующих рецепторы физиологически активных веществ и опосредованных ими эффекторных процессов (проницаемость ионных каналов, метаболизм вторичных мессенджеров, взаимоотношение, рецепторов с лшшднои фазой биомембран)" (N гос. регистрации 01.94.0001125), Государственной научно-технической программы России "Национальные приоритеты в медицине и здравоохранении" по направлениям: 05. "Наркомании, токсикомании, алкоголизм", тема "Изыскание и изучение средств патогенетической фармакотерапии наркотоксикоманий"; 07.. "Фундаментальные и прикладные проблемы создания лекарственных средств", тема "Изыскание болеутоляющих средств и изучение механизма их действия".

Целью настоящей работы являлось изучение собственных аналгетнческих и подкрепляющих свойств веществ, блокирующих глутаматергическую передачу, и оценка антагонистов ВАК как потенциальных средств фармакотерапии при синдроме наркотической зависимости и толерантности.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Оценить собственные аналитические свойства антагонистов ВАК при различных путях введения, а также при сочетанием введении с опнатным аналготнком морфнног/.

2. Изучить влияние антагонистов ВАК па развитие и проявление эффектов длительного применения морфина (толерантность, синдром отмены).

3. Исследовать на различных моделях собственные подкрепляющие свойства ■ипагонистов ВАК, а также их влияние на адлпктпвнын потенциал морфина.

Научная новизна работы. Выявлена зависимость аналгетнческой активности антагонистов ВАК и их комбинации с морфином от пути введения. Получены новые данные о том, что антагонисты ВАК замедляют развитие и/или проявление толерантности к морфину и опизтного абстинентного синдрома. Показана роль глутаматергнческой передачи в развитии ассоциативного компонента толерантности канал гетическому эффекту морфина. Продемонстрировано ннгибирующес действие антагонистов ВАК по отношению к подкрепляющему действию морфина и электрической стимуляции зон "награды". Впервые показано наличие глутаматергнчеекпх механизмов условнорефлекториой активации системы "награды".

Научно-практическое значение работы. Установлена роль глутаматергическнх механизмов в процессах электрической, фармэколопиескоГшусловнорефлекгорпон активации системы "награды". Полученные данные могут служить основой для дальнейшего изучения антагонистов ВАК как средств фармакотерапии наркотическойздвисимости.Показанавозможлгость комбинированного применения этих соединений с опиатнымн аналгетиками с целью повышения эффективности последних и предотвращения нежелательных сопутствующих явлении.

Положения, выносимые на защиту.

1. Сущестоуют, как минимум, дна - снинальный и супрясппнальный, уровня, определяющие направленность влиянии антагонистов ВАК на ноцииепгнвные реакции при ¡полированном и сочетанием с морфином системном применении.

2. Глугамагсргическне механизмы играют важную роль в процессах ненроиальнон пластичности, лежащих в основе развития и/или проявления толерантности к аналгетнческому эффекту морфина и опиатной физической зависимости. ,

3. Фармакологическая (морфин), электрическая и услопиорефлскторная стимуляция системы "награды" активирует нейрональные пути, использующие в качестве медиатора возбуждающие аминокислоты.

4. Антагонисты ВАК имеют терапевтический потенциал как вещества, обладающие антагонистическим действием в отноч.-'-нин подкрепляющих свойств морфина, а также способные, увеличивая или не изменяя аналитическую активность морфина, замедлять развитие толерантности и физш/ескои записи иостп.

Реализация результатов нсследоазшп. Данине о потенциальной активности

антагонистов ВАК при фармакотерапии синдрома наркотической зависимости и толерантности внедрены в учебный процесс на кафедре фармакологии СПбМИ им.акад. И.П.Павлова. Данные об аналгетической активности антагонистов рецепторов ВАК .различных подтипов внедрены в научную работу отдела нейрофармакологии им.С.В.Аничкова НИИЭМ РАМН. Разработанная методика условнорефлекторной активации реакции электрической самостимуляции мозга внедрена в научную работу отдела фармакологии НИЦ СПбМИ им.акад.И.П.Павлова.

Апробация материалов диссертации и публикации. Материалы работы доложены и обсуждены на I конференции Российской Ассоциации по изучению боли (Москва, 1993), 18-ой международной летней школе по изучению мозга (Амстердам, 1993), на совместных заседаниях кафедры фармакологии, отдела фармакологии и лаборатории фармакологии наркотиков НИЦ СПбМИ им. акад. И.П.Павлова (19921994).

По результатам исследования опубликовано 5 работ, направлено в печать - 6

работ.

Структура работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы ( источников, из них зарубежных авторов). Иллюстрации представлены 38 рисунками и 8 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Эксперименты выполнены на 2362 белых беспородных крысах-самцах массой 180-400 г. В работе использовали следующие вещества: морфина гидрохлорид, налоксона гидрохлорид (Endo, США); МК-801 [(5К,108)-(+)-5-метил-10,11-дигидро-5Н-днбензо [а,с)]циклогептен-5,10-им11н малеат, дизоцилпина малеат, RBI, США|; кинуреновая кислота (KVNA, 4-гидрокси-хинолин-2-карбоновая кислота, Sigma, США); капновая кислота (Sigma, США); DNQX (6,7-динитрохиноксалин-2,3-дион); D-серни (Sigma, США); Ы-метил-О.Ь-аспарагиновая кислота (NMDLA); 3N-1)к:ллил-Ь-2,3-лнаминопрапионовая кислота (ODAP); ЗК'-глутарнл-Ь-2,3-

Таблица 1. Дозы и пути введения фармакологических агентов, использованных в работе

Вещество Дозы при различных путях введения

Системное введение (мг/кг) Интратекаль-ное введение (нмоль) Внугрижелу-дочковое введение (нмоль) Внутрнмозго-вое введение (мкг)

Морфин 1.5-10' 1-20* 1-20« -

Налоксон Г - - -

МК-801 0.05-0.2® 2.5-50 25-400 1.5-6

KYNA 50-1502 ' 2.5-25 25-400 2.5-10

DNQX 50-150' 5-50 50-400 2.5-10

G1DAP 10-30® 0.25-50 25-400 1.5-6

NMDLA - 0.5-5 -

Каинат - 0.1-0.5 ' - -

ODAP - 0.5-5 - -

D-Cepmi - - - 2.5-10

Примечания. 'и 1 - подкожный и ЕнугрпбрюппппшП пути сведения, соответственно; * - доза указана в микрограммах.

диампноиропиоповая кислота (G1DAP) (последние синтезированы в лаборатории синтеза лекарственных веществ отдела нейрофармакологии им.С.В.Аничкова НИИЭМ РАМН). Морфин, налоксон, МК-801, G1DAP, О DAP, NMDLA, каинат и D-серин растворяли п изотопическом растворе Хлорида натрия, KYNA и DNQX - в 2% растворе Твина-80. При отклонении pH раствора от 7.2-7.4 нейтральную реакцию среды восстанавливали с помощью растворов NaOH или HCl. Для интратекального и внутрижелудочкового введения вещества растворяли в сбалансированном ионном растворе (130 ммоль NaCl, 2.6 ммоль KCl, 2 ммоль MgCl2 and 1.3 ммоль СаС12 на 1000 мл дистиллированной воды).

Для осуществления шпратекальных инъекций животным под нембугаловой анестезией (40 мг/кг, внутрнбргошшшо) вжиаляли катетер в субарахноидальное пространство согласно процедуре, описанной ранее (Yaksh and Rudy, 1976). В опыт брали животных без признаков неврологического дефицита через 5-7 дней после операции. Исследуемые вещества вводили в объеме 5 д/л.

Для выполнения внутрнжелудочковых и внутримозговых инъекции за 5-7 дней до начала эксперимента животным под нембутаповой анестезией вживляли кашоли по координатам стерсотаксического атласа (Paxinos and-Watson, 1986). Вещества вводили в латеральный желудочек в объеме 3 цл и в прилежащее ядро перегородки в объеме 1 цл.

Дозы изучаемых веществ, примененные в настоящем исследовании, приведены в таблице 1.

Результаты экспериментов обрабатывали с помощью пакета программ статистической обработки "Мебиетат-фарм" (центр "Фармаколог") на ПЭВМ IBM PC/AT 286. Применяли процедуры регрессионного анализа, одно- и двухфакторного дисперсионного анализа. Огличия между выборками оценивали с помощью критериев Стьюдента, хи-квадрат, Ныомана-Кельса и Манна-Унгпи.

1. Влияние антагонистов ВАК на болевое реагирование.

Для изучения изменения болевого реагирования после фармакологического воздействия исцользовали методики "отдергивания хвоста" (D'Amour .and Smith, 1940), клипсировашш хвоста (Звартау Э.Э., Коваленко B.C., 1986), "горячей пластины" (Гацура В.В.,1974). Ноиицептивное действие исследуемых веществ или их комбинаций оценивали по показателю "степень аналгезни", рассчитываемой по формуле, учитывающей уровень болевой реакции до фармакологического воздействия. Действие airrai онистов ВАК в бчльших дозах сопровождается моторным дефицитом. Поэтому наряду с тестированием аналгетической активности веществ оценивали степень вызываемых ими моторных расстройств в тесте "вращающийся стержень" (Гацура В.В., 1974). Интратекальное введение агоиистов рецепторов ВАК сопровождается появлением "самокусания", что считается поведенческим коррелятом гипералгетического состояния (Rai^orodsky and Urca, 1990). Для оценки профиля антагонистического действия исследуемых соединений изучали их влияние на поведение "самокусания", вызванное NMDLA, каинатом и агонистом АМГА-рецепторов ODAP.

Влияние исследуемых соединений на болевое реагирование оценивали: через 30 мин после системного введения, через 3 мин в случае внутрижелудочкового и

Таблица 2. Суммарные результаты, получении в опытах по изучению ноцицептивной активности шггаготгстов рецепторов возбуждающих аминокислот

МК801 вЮАР КТОА DNQX

Собственная аналитическая активность при:

- гнугрпбрюшшгном введении ■ 0 0 0 0

- илтратекальном введешв! + ++ ++ ++

- внутрижелудочковом введении 0 0 0 0

Влияние на аналгетнческий эффект морфина:

- при Енутрпбрюиппгном введении 1 0 1 Г

- при шггратекалыюм введении » )» ! » t

- при внутрижелудочковом введеню! » 1 0

Нарушения моторной функции при:

- Енутрнбрюшишюм введении + + + +

- интратекалыюм введении + + + +

- в]гутрижелудочховом введении + + +

Антагонистическая активность в отношении

поведения "самокусания", вызвашого ' :

- Ы-метил-В,Ь-аспартатом ++ ++ -

- кагаттом - + +

- ЗИ-оксалил-Ь-З.З-диаминопротганатом - - ± +

Обозначения. ++, эффект снпыю выражен; +, есть эффект; ±, эффект слабо выражен; 0, нет эффекта; 1, усиление эффекта; I, ослабление эффекта; при шггратекалыюм введении. Наличие ■ эффекта подразумевает статистически значимые отличия от контроля.

интратекального путей введения.

Для изучения влияния антагонистов ВАК на аналгетнческий эффект морфина МК-801, КУЫА и вводили через 10 мин (системный путь введения) или 1

мин (впутрпжелудочковый и интратекальный пути введения) после морфина. Тестирование проводили через 30 или 3 мин после системной или локальной инъекции морфина, соответственно.

Контрольные группы животных получали инъекции растворителей вместо исследуемых веществ.

Суммарные результаты опытов приведены в таблице 2.

При впутрибрюшннном и внутрижелудочковом введении ни один из исследованных антагоннстов ВАК не обладал аналгетнческои активностью во всем диапазоне изученных доз. При введении этих веществ в высоких дозах были отмечены выраженные моторные расстройства, которые х" • истери"овались

нарушениями координации движений, а также достоверным ухудшением показателей в тесте "вращающийся стержень". После введения МК-801 во всех исследованных дозах возникало двигательное возбуждение, затруднявшее оценку эффекта вещества.в тесте "вращающийся стержень". Интратекальное введение веществ приводило к дозозависнмому повышению болевых порогов. По аналитической активности исследованные вещества можно расположить в следующий ряд: G1DAP>KYNA>DNQX>MK-801. Интратекальное введение антагонистов ВАК также сопровождалось моторными расстройствами, что затрудняет интерпретацию активности веществ в ноцицептивных тестах. Однако сравнение ED30 в тестах "отдергивания хвоста" и "вращающийся стержень" показало, что исследованные вещества вызывают повышение болевых порогов в дозах, меньших тех, которые необходимы для проявления моторных расстройств. Более того, при интратекальном введении эти вещества обладали активностью в тесте, учитывающем генерализованную реакцию на болевой раздражитель (тест клипснрования хвоста) (Hoffeister and Kroneberg, 1966; Plummer et al., 1991). Исследование активности веществ в отношении поведения "самокусания", вызванного агонистами различных подтипов рецептороз ВАК, выявило следующий профиль антагонистического действия: МК-801 и G1DAP - антагонисты NMDA-подтипа рецепторов, KYNA - неселективный антагонист, DNQX - антагонист не-NMDA-пддтипов рецепторов.

Аналгетический эффект комбинации антагонистов ВАК с морфином зависел от пуги введения веществ. При интратекальном пути введения для всех изученных веществ отмечено потенцирующее действие в отношении морфиновой аналгезии (эффект наиболее выражен для G1DAP и KYNA). При внутрнжелудочковом введении аналгетический эффект морфина достоверно ослабевал при сочетанном введении веществ, обладающих NMDA-антагоиистическои активностью (МК-801>KYNA;>G1DAP).

Известно, что ВАК принадлежат к числу основных медиаторов болевой чувствительности на спинальном уровне (Haley et al., 1990; Raigorodsky and Urca, 1990; Nasstrom et al., 1992). Поэтому неудивительно, что интратекальное введение антагонистов ВАК блокирует болевую афферентацию и усиливает морфиновую аналгезию. В то же время на супраспиналыюм уровне одним из важнейших

субстратов аналитического действия опиатов является центральное околоводопроводное вещество (ЦОВ). Стимуляция опиатных рецеторов в ЦОВ опосредованно через тормозный ГАМКергический нейрон приводит к активации возбуждающих влияний ЦОВ на нисходящие серотошшергические пути. Активация NMDA-рецептороз влечет за собой аналогичные изменения в активности ЦОВ (Jacquet, 1988). Поэтому при центральном введении агонисты NMDA-рецепторов обладают аналгетичсской активностью, а антагониста - блокируют опнатную и стресс-вызванную аналгезшо (Lipa and Kavaliers, 1990; Lutfy et al., 1993).

Учитывая неодинаковую активность антагонистов ВАК при различных путях введения, можно предполагать, что при системном введении их действие определяется суммой спиналыюго и супраспннального эффектов. Вещества, обладающие антагонистической активностью в отношении ne-NMDA-подтипов рецепторов BAK(KYNA, DNQX), потенцировали аналгетнческий эффект морфина, скорее всего, за счет преимущественного взаимодействия иа спинальном уровне. Вещества, являющиеся селективными антагонистами NMDA-рецепторов, уменьшали (MIC-S01) или не оказывали влияния (G1DAP) па морфиновуго аналгезиго. Причем их взаимодействие с аналгетическим эффектом морфина при системном введении коррелировало с собственной апалгстической активностью при интратекальном введении (G1DAP>MK-801).

2. Влияние антагонистов ВАК на развитие и/пли проявление толерантности к морфину и опиатного абстинентного синдрома.

Толерантность к аналгетическому эффекту морфина индуцировали путем повторных инъекций морфина в дозе 20 мг/кг в течение'8 дней. Аналгетнческий эффект тест-дозы морфина (10 мг/кг) оценивали до и после хронического фармакологического воздействия - в тесте "отдергивания хвоста". Возможность раздельного анализа развития ассоциативного н неассоциативного компонентов толерантности проводили по методике "discriminative control of tolerance" (Siegel, 1983). В этом случае животным в течение 16 дней чередовали инъекции морфина в помещении А (всего 8) и изотонического раствора NaCl в помещении Б (ьсего 8).

Обстановочные стимулы в помещениях А и Б различались. Условнорефлекгорный компонент Т выявляли после субхронического введения путем сравнения эффекта тест-дозы морфина в "привычной" (ассоциированной с эффектом морфина) и "непривычной" (ассоциированцой .с эффектом изотонического раствора) обстановках.

Толерантностьканалгетическому эффекту интратекально вводимого морфина вызывали путем введения морфина в возрастающих дозировках (20-40 мкг) втечение 8 дней. Аналгетический эффект тест-дозы морфина (5 мкг) оценивали до и после субхронического введения с помощью методики "отдергивания хвоста".

Для изучения влияния антагонистов ВАК на развитие толерантности к морфину через 10 (системное введение) или 1 мин (интратекальное введение) после каждой из 8 инъекций морфина животным вводили МК-801, КУКА, БЫОХ или их растворители.

Формирование физической зависимости от морфина проводили путем введения морфина 2 раза в день в возрастающих дозировках (10-100 мг/кг). На 9-й день через 30 мин после утренней инъекции морфина в дозе 100 мг/кг вводили налоксон в дозе 1 мг/кг. Через 5 мин после этого животных помещали в экспериментальные боксы и -в течение 15 мин наблюдения регистрировали количество поведенческих (прыжки, потягивания, отряхивания), а также наличие сомато-вегетатзтных (птоз, пилоэрекция,тремор, диаррея)признаковабстинентного синдрома. У абстинентных животных оценивали также уровень болевой реакции (методика "горячая пластина"). Животные .контрольных групп получали изотонический раствор натрия хлорида вместо морфина.

Для изучения влияния антагонистов ВАК на формирование зависимости от морфина МК-801, КУКА, БИС^Х или их растворители вводили ежедневно через 10 мин после каждой инъекции опиата или изотонического раствора натрия хлорида.

Для изучения влияния антагонистов ВАК на проявления преципитированной морфиновой абстиненции МК-801, КУКА, ОЫС>Х или их растворители вводили однократно за 20 мин до инъекции налоксона.

Суммарные результаты экспериментов приведены в таблице 3.

Сочетанное системное введение морфина с антагонистами ВАК приводило к

Таблща 3. Суммарные результата, полученные в опытах по изучению влияния антагонистов рецепторов возбуждающих аминокислот на развитие и проявление толерантности к морфину и omiaiHoro абстинентного синдрома.

МК801 GIDAP KYNA DNQX

Толерантность к морфнновой аналгез!В1

А. При внугрнбрюиппшом введении

- ассоциативный компонент t - ( (

- неассоциатиБнът компонент 1 - t t

Б. При интратекальном введении 1 » 1 1

Абстинентный оплатный синдром

- при сочеташюм хроническом введении с

морфином t - ; to

- прн однократном введении за 30 мин

до тестироваши 1 - i 0

Обозначения. I, ослабле!те толерантности/выраженности абстинентного синдрома; 10, эффект слабо выражен; 0, нет эффекта. Наличие эффекта подразумевает статистически значимые отличия от контроля.

достоверному уменьшению неассоциативного компонента толерантности: аналитический эффект тест-дозы морфина не отличался от такового у интактных животных. Рядом авторов подчеркивается существенная роль супраспинального уровня для развития толерантности к аналгетическому эффекту морфина (Advocat, Gulati, 1991). Поэтому можно предположить, что, противодействуя эффекту морфина на супраспинальном уровне (см. табл. 2), антагонисты ВАК способны замедлять развитие толерантности. Исключение составляет DNQX, знутрижелудочковое введение которого не сопровождается снижением аналгетнческой активности морфина.

При интратекальном введении антагонисты ВАК в дозах, потенцирующих морфиновую аналгезию, также предотвращают развитие толерантности. Поэтому другим возможным объяснением является взаимодействие этих веществ с адаптивными процессами, сопутствующими развитию толерантности на уровне клетки. Тем более, что антагонисты ВАК способны предотвращать и другие частные формы нейрональной пластичности, лежащие в основе развития долговременных изменений чувствител ьности к нейроактивным веществам (например, сенситиза ним) (Robinson and Berridge, 1993).

Все исследованные вещества при сочетанием введении с морфином устраняли

ассоциативный компоненттолерантности, что подтверждает вовлечение рецепторов ВАК в процессы памяти и обучения. В частности, известно, что рецепторы ВАК участвуют в индукции и поддержании долговременной потснциации (Collingridge and Singer, 1990). NMDA-рецспторы ' взаимодействуют также с механизмами консолидации памятных следов, поэтому отсроченное применение МК-801 по отношению к морфину (2 часа спустя) не позволило оценить фактор обученияво влиянии этого вещества на развитие толерантности (Marek et al., 1991).

Длительное введение морфина сопровождается не только понижением его аналгетичсской активности, но и формированием физической зависимости. Как следует из таблицы 3, исследованные вещества уменьшали как формирование физической зависимости (сочетапное введение с возрастающими дозами морфина), так и проявления абстинентного синдрома, возникавшего при отмене морфина (однократное применение). Эффект был наиболее выражен для МК-801 и KYNA, т.е. соединений с NMDA-антагонистической активностью. Полученные результаты подтверждают чувствительность неироадаптивиых изменении, сопровождающих формирование физической зависимости от морфина, к блокаде глутаматергической передачи (Trujillo and Akil, 1991). Кроме того, предполагается, что экспрессия опиатного синдрома отмены приводит к гиперакгивности NMDA-ергическон передачи в ряде структур (например, голубом пятне) с последующей гиперпродукцней оксида азота (проявление синдрома отмены предотвращается блокаторами синтеза оксида азота) (Adams et al., 1993; Hong et al., 1993).

Таким образом, изученные нами антагонисты ВАК эффективно предотвращают развитие и/или проявление опиатпой толерантности и абстинентного синдрома.

3. Познтавно-подкреплякмше свойства .иггагонистов РАК и их комбинации с морфином.

Для проведения экспериментов с электрической самостимуляцией мозга животным под нембуталовой анестезией вживляли монополярные (в медиальный переднемозговой пучок) или биполярные (в вентральную тегментальную область) электроды по координатам стереотаксического атласа (Paxinos and Watson, 1986).

После выработки навыка педальной самостимуляции реакцию самостимуляцин (РСС) изучали в камерах Скиннера, предназначенных для изучения оперантных рефлексов, в режимах постоянного и непостоянного подкрепления (Звартау, 1988). В различных группах животных регистрировали: 1) уровень пороговой интенсивности стимуляции, достаточный для поддержании FCC; 2) количество нажатий на награждающую педаль за определенный промежуток зременп (3 мин) при интенсивности Стимуляции, равной 60, 70, 100, 120, Ы0 % от пороговой интенсивности; 3) количество нажатий на награждающую педаль за 1 мин после двухкратного предъяачения светового стимула, ассоциированного с награждающей стимуляцией. Ежедневно с интервалом 1,5 ч проводили 2 тестирования. Эксперименты проводили на животных, имеющих стабильные показатели РСС в течение нескольких дней.

Для изучения влияния системного введения исследуемых веществ на РСС их вводили-за 30 (морфин) или 20 мин (МК-801, KYNA и DNQX) до второго тестирования. Для изучения влияния антагоннстовров ВАК на активирующий эффект морфина на РСС исследуемые вещества или их растворители вводили через 10 мин после морфина, т.е. за 20 мин до второго тестирования.

Для исследования эффектов внутримозгового введения МК-801, KYNA, DNQX, G1DAP и D-серин на РСС вещества или их растворители вводили в прилежащее ядро за 1 мин до начала эксперимента.

Вторично-подкрепляющие свойства антагонистов ВАК и их комбинации с морфином исследовали на модели условной реакции предпочтения места (УРПМ) 6 автоматизированной челночной камере (Звартау Э.Э. и соавт., 19S4; Звартау Э.Э., Коваленко B.C., 1986). Эксперименты проводили в челночных камерах, разделен пых перегородкой на два одинаковых по размеру и различающихся по освещенности, цвету и тактильным характеристикам отсека (условно- светлый и темный отсеки). Эксперимент состоял из: 1) претеста, во время которого фиксировали исходное предпочтение животным одного из отсеков в условиях свободного выбора; 2) обусловливания на протяжении четырех последующих дней, при котором введение растворителя сочетали с посадкой животного в исходно предпочитаемый отсек, а введение исследуемого вещества - с посадкой в исходно непредпочитаемыи итсск па 45 минут; 3) повторного тестирования предпочтения, проводимого в условиях

аналогичных претесту через 2 дня после последнего обусловливания. •Подкрепляющие свойства веществ оценивали по увеличению времени пребывания в исходно непредпочитаемом отсеке после фармакологического обусловливания.

Для изучения влияния антагонистов ВАК на выработку УРПМ, ассоциированного с морфином, перед второй посадкой (в исходно иепредпочитаемый отсек) животные получали инъекции морфина и антагониста ВАК (или его растворителя) с интервалом в 3 минуты. Для изучения влияния антагонистов ВАК на проявление УРПМ, ассоциированного с морфином, антагонисты ВАК или их растворители вводили за 20 мин до заключительного тестирования, но не во время фазы обусловливания.

Для изучения способности антагонистов ВАК вызывать условнорефлекторное избегание места (УРИМ) эксперименты проводили по схеме, описанной выше, с некоторыми изменениями. В этой серии экспериментов животные получали инъекцию антагонистов ВАК за 5 мин перед посадкой в исходно предпочитаемый отсек челночной камеры. Перед второй посадкой (в исходно непред почитаемый отсек) животным вводили растворитель. Контрольные группы получали инъекции растворителей вместо исследуемых веществ. Разница во времени, проведенном животным в отсеке, ассоциированном с исследуемым веществом, до и после обусловливания служила критерием выработки УРИМ.

Влияние антагонистов ВАК на первично-подкрепляющие свойства морфина исследовали с помощью методики внутривенного самовведения, описанной ранее (Ramsey and van Ree, 1990). За 7 дней до начала эксперимента животным под нембуталовои анестезией имплантировали в правую яремную вену силиконовые канюли. Эксперименты проводили в стандартных камерах Скиннера в условиях инвертированного светового режима и ограниченного доступа к пище (вес животного 80 % от исходного уровня). В течение 5-ти последовательных дней животные получали инъекции антагонистов ВАК или их растворителей и сразу после этого их помещали в экспериментальные камеры на 180 мин, в течение которых, нажимая на одну из педалей, животное получало внутривенную микроинфузию морфина в дозе 0.16 мг/кг. В течение 5-ти дней эксперимента регистрировали количество нажатий на "награждающую" и "ненаграждающую" педали, а также количество инфузий за 3 часа каждой сессии.

Таблица ■). Суммарные результаты, полученные в опытах по изучению подкрепляющих и антпподкрепляющих cboiîctd аитагошстов рецепторов возбуждающих аминокислот.

МК.801 G1DAP KYNA DNQX Серии

Влияние 1ы реакцию самостимуляцни ' - при пнутрибрюшшшоч введении - при локальном введении !3 0 0 t 1 t »0 « 0

Влияние на активирующий эффект морфина при внутрибрюишнном введении ' t 1 t

.Влияние на услог.порефл:кторную активацию реакции самостимуляцни 3 (0 ( 10 !

Способность вызыпатъ реакцию условно-рефлекторного предпочтения места + 0 0

Слияние на выработку/эксирессшо реакции предпочтения места, обусловленного с морфином t/0 -/* t/» I/O -/-

Влияние на приобретение навыка внутривенного самопведешш морфина 0 - 10 -

Обозначения. I, ослабление; t, усиление; 10 или 10, эффектслабо выражен; 0, нет эффекта;+, есть эффект; -, нет данных. ' - режим постоянного подкрепления;2 - режим непостоянного подкрепления с переменной интенсивностью подкрешшощей стимуляции;3 - локальное введение в прилежащее ядро перегородки. Наличие эффекта подразумевает статистически значимые отличия от контроля.

Суммарные результаты экспериментов по изучению подкрепляющих и антпподкрепляющих свойств антагонистов ВАК представлены в таблице 4.

IIa модели РСС исследованные вещества обладали разнонаправленным эффектом. 1CYNA и DNQX, но не МК-801 при внутрнбрюшинном введении дозозаписимо уменьшали частоту подкрепляемых нажатии п тесте электрической самостимуляцни мозга. При этом KYNA н DNQX повышали пороговую интенсивность стимуляции, достаточную для поддержания реакции самостимуляпни, что позволяет исключить влияние нарушении моторной функции на оперантную реакцию (Liebman, 1983). Кроме того, при введении в прилежащее ядро KYNA, DNQX и G1DAP в дозах, не влияющих на моторную сферу, дозозавпеимо угнетали РСС, в то время как MK-S01 проявлял активирующее действие.

На модели условиорефлекторной активации РСС антагонистыов ВАК -KYNA, DNQX, G1DAP, но не МК-801, дозоз;.впсимо подавляли, а обладающий глугаматомиметпческими свойствами D-серин потенцировал оперантную реакцию, вызванную условнорефлекторныч стимулом (световой сигнал). В этой серии

экспериментов вещества вводили в прилежащее ядро. Поэтому можно предполагать, что предъявление условнорефлекгорного стимула в использованной нами модели приводит к активации глутаматергической передачи в прилежащем ядре, которая, следовательно, является суШественным фактором в реализации условнорефлекгорного растормаживания навыка самостимуляции.

Исследованные антагонисты ВАК обладали также разнонаправленным действием на подкрепляющий эффект. морфина. На модели реакции самостимуляции, активированной морфином, KYNA дозозависимо уменьшала эффект морфина, причем ее действие становилось достоверно различимым уже в дозе 100 мг/кг, в крторой вещество не обладает собственным эффектом на модели РСС. Было также показано, что DNQX обладает аналогичным действием, в то время как МК-801 потенцируетэффектморфииа. Аиалопгаыерезулътаты были получены при использовании методики УРПМ. KYNA и DNQX дозозависимо подавляли экспрессию и/или выработку предпочтения места, ассоциированного с морфином. При этом было показано, что KYNA и DNQX per se не являются стимулом, достаточнымдля формированияусловнорефлекгорного предпочтения или избегания места. Однако, учитывая способность антагонистов ВАК (как конкурентных, так и неконкурентных) вызывать расстройства • памяти и процессов обучения, наблюдаемый эффект этих веществ на модели УРПМ может являться следствием "побочного" действия на процессы возникновения и проявления ассоциативных связей (Shapiro and Caramanos, 19S0; LaLonde and Joyal, 1993). Поэтому необходимо учитывать, что для МК-801 было обнаружено усиление вторично-подкрепляющих свойств морфина в тесте УРПМ.

Было изучено также влияние антагонистов ВАК на первично-подкрепляющие свойства морфина с помощью методики внутривенного самовведешш у необученных крыс. У контрольных животных наблюдалось приобретение навыка самовведешш морфина, что проявляется увеличением количества нажатий на подкрепляемую педаль и полученных инфузий морфина на протяжении 5 дней эксперимента. Предварительное введение KYNA в максимальной дозе 150 мг/кг перед каждой из 5-ти экспериментальных сессий достоверно замедляло приобретение навыка самовведення. Этот эффект был менее выражен для DNQX (150 мг/кг) и отсутствовал при предварительном введении МК-801 (0.05-0.2 мг/кг).

Таким образом, из всех исследованных антагонистов ВАК только МК-801 обладал аддитивным потенциалом, так как приводил к выработке УРПМ, обладал облегчающим эффектом на РСС, а также потенцировал подкрепляющее действие морфина. В настоящее время накоплено достаточно много данных, доказывающих вовлечение других нейромедиаторных систем (серотонинергических, катехоламинергических)впроявлениеэффектов неконкурентных антагонистов ВАК (например, МК-801) (Wedzony et al., 1992; Murata and Kawasaki, 1993). Остальные антагонисты ВАК эффективно блокировали подкрепляющие свойства фармакологической, электрической и условнорефлекторной стимуляции системы награды. Ранее было показано, что функциональная активность прилежащего ядра, являющегося частью мезолимбической дофаминергической системы (предположительной мишени подкрепляющего действия большинства аддиктивных веществ), контролируется глутаматергическими афферентами из коры, миндалины, гиппокампа и др. (Kelleyand Domesick, 1982; Kelleyet al., 1982; Imperato et al., 1990). Поэтому полученные результаты позволяют предполагать, что прилежащее ядро перегородки является одним из возможных субстратов антиподкрепляющего действия антагонистов ВАК.

ВЫВОДЫ

1. Антагонисты рецепторов возбуждающих аминокислот (ВАК) - МК-801, G1DAP, кинуреновая кислота и DNQX, обладают собственным аналгетическим эффектом при интратекальном, но не внутрижелудочковом и внутрибрюшинном путях введения. Влияние антагонистов ВАК на аналгетический эффект морфина различно при интратекальном (потенцирование) и внутрижелудочковом (ослабление) путях введения веществ. При внутрибрюшинном введении аналгетнческая активность комбинации антагонистов ВАК и морфина определяется взаимодействием спинальных и супраспинальных эффектов.

2. Антагонисты ВАК предупреждают развитие ассоциативного и неассоцнативного компонентовтолерантности к аналгетическому эффекту морфи на при сочетанием введении с морфином при различных путях введения. При однократном введении МК-801 и кинуреновая кислота в отличие от UNOX

подавляют синдром отмены наркотика у морфин-зависимых крыс, в то время как все исследованные вещества при совместном повторном введении с морфином оказывают иыгпбирующее влияние на формирование опиатпой зависимости.

3. МК-801 обладает собственным аддиктивным потенциалом в тестах условнорефлекторного предпочтения места и электрической самостнмуляции мозга. Кинуреновая кислота, СГОАР и ослабляют подкрепляющие свойства электрической и фармакологической (морфин) стимуляции системы "награды".

4. Глутаматергическая передача в прилежащем ядре перегородки играет важную роль в реализации условнорефлекторной активации реакции самостнмуляции,

5. Антагонисты ВАКмогутрассматрнватьсякакпотенциальпыелскарстиенныс средства для терашш опнатного абстинентного синдрома и предупреждения развития толерантности н зависимости при длительном применении оииатпых аналгетнков.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Данные о различии аналитических и подкрепляющих свойств антагонистов ВАК разных классов рекомендуется использовать для направленного поиска новых лекарственных средств. Рекомендуется исследование высокоактивных при системном введении антагонистов ВАКе целью создания клинически эффективных препаратов для фармакотерапии наркотической зависимости. Результаты работы рекомендуется использовать для дальнейшего изучения глутаматергических механизмов реализации подкреплявшего действия стимулов различной природы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Условнорефлекторная активация электрической самостнмуляции мозга: модель ситуационного влечения к наркотпку//Журнал высшей нервной деятельности.-1992,- Т. 42,- С. 759-763 (в соавт. с Звартау Э.Э.)

2. Влияние антагонистов рецепторов возбуждающих аминокислот на развитие толерантности к. морфину//Патофнзиология и фармакологии боли: Тез. докл. I конференции Российской Ассоциации по изучению боли (Москва, 19-21 октября

1993 г).- М., 1993,- С.133, (всоавт. с Думпис М.А., ЗвартауЭ.Э., Пиотровским Л. В).

3. Толерантность к onnaTiioii аналтезин: комплексный эффект антагонистов рецепторов возбуждающих аминокнслот//Г>юлл.эксп.биол.мед.- 1994,- N 5,- С. 494496 (в соавт. с Думпис М.А., Пиотровским Л.Б., Зпартау Э.Э.).

-1. Tolerance to morphine analgesia and sensitization to amphetamine-induced motor stimulation: effect of acute MK-S01 and isradipine//The self-organizing b/ain: from growth cones to functional networks: Proc. 18th International Summer School of Brain Research (Amsterdam, August 23-27, 1993).- Amsterdam, 1993,- P.85.

5. Spinal antin; iccptive and nociccpiive effects of/?-N-oxaly!-L-!i./7-diaininopropionic acid (ODAP) analogues: a pharmacological analysiV/i'hamiacoIcsy Comihimicali'jns.-1994,- Vol. 4 - P. 46-53 (Co-workeis: Dumpis MA, Piotrovsky L.B., Zv.mau E.E.).