Автореферат и диссертация по медицине (14.00.11) на тему:Сравнительная иммуноморфологическая характеристика клеток воспалительного инфильтрата, участвующих в реакции гиперчувствительности замедленного типа у больных псориазом и болезнью Девержи

На нравах рукописи

Катунина Оксана Рахимовна

Сравнительная иммуноморфологическая характеристика клеток

воспалительного инфильтрата, участвующих в реакции гиперчувствительности замедленного типа у больных псориазом

и болезнью Девержи.

14.00 11- кожные и венерические болезни 14.00.15- патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Москва-2005

Работа выполнена в отделении патоморфологии Федерального Государственного учреждения «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Александр Михайлович Вавилов доктор медицинских наук, профессор Владимир Николаевич Мордовцев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Геннадий Иванович Суколин доктор медицинских наук, профессор Валентина Павловна Быкова

Ведущее учреждение: Российский Государственный Медицинский Университет

Государственном учреждении «Центральный научно-исследовательский кожно-венерологический институт Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 107076, г. Москва, ул. Короленко,д.З, корп.4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ «ЦНИКВИ Росздрава». Автореферат разослан _ 2005 г.

Защита диссертации состоится ___

заседании Диссертационного совета Д208.115.01

года в 12 часов на при Федеральном

Учёный секретарь Диссертационного совета. Кандидат медицинских наук

Наталия Константиновна Иванова

M4W4

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Псориаз и красный отрубевидный волосяной лишай Девержи относятся к генетически обусловленным хроническим заболеваниям кожи, которые протекают длительно и сопровождаются чередованием периодов рецидивов/обострений и ремиссий (Скрипкин Ю.К., 1999). Несмотря на многочисленные исследования, до сих пор причина этих заболеваний остается невыясненной. Выделяют ограниченные и распространенные формы псориаза и болезни Девержи. Их объединяют не только сходство клинических проявлений, но и трудности дифференциальной диагностики, особенно эритродермических форм, изолированных поражений ладоней и подошв (Смольянникова В.А., 2004).

В последние годы получены данные, свидетельствующие о важной роли иммунных реакций, опосредованных Т-яимфоцитами при псориазе (Суханова Н.М., 2003; Рыбкина М.И., 2005; Nikoloff В. et al., 2000; B.Baker, 2000). При болезни Девержи, в отличие от псориаза, нет определенных сведений о роли в формировании воспалительной реакции иммунокомпетентных клеток (Цветкова Г.М. и др., 2003).

Комплексное фенотипирование клеток воспалительного инфильтрата поможет расширить наши представления о патогенезе этих заболеваний. Полученные данные могут быть использованы для разработки новых лечебных методов с использованием иммунотерапии.

Цель исследования. Изучение тканевого распределения и количественная характеристика клеток, участвующих в реакции гиперчувствительности замедленного типа в коже больных псориазом и красным волосяным лишаем Девержи.

Задачи исследования

Изучить:

1. тканевое распределение в коже здоровых лиц CD4, CD8, CD25.CD40, CD45RA, CD68, CD83, HLA-DR, Ki67 позитивных клеток.

2. количественную характеристику тканевого распределения CD4, CD8, CD25, CD40, CD45RA, CD45RO, CD68, CD83, HLA-DR, Ki67 позитивных клеток в коже больных псориазом и определить их роль в развитии воспаления по механизму гиперчувствительности замедленного типа.

3. количественную характеристику тканевого распределения CD4, CD8. CD25,CD40, CD45RA, CD68, CD83, HLA-DR, Ki67 позитивных клеток в коже больных красным волосяным лишаем Девержи и определить их роль в развитии воспаления по механизму гиперчувствительности замедленного типа.

4. Провести сравнительную оценку распределения клеток в структурах кожи у больных псориазом и красным волосяным лишаем Девержи.

Научная новизна

проведено фенотипирование клеток кожи здоровых лиц с использованием 10 маркеров, выявлены взаимоотношений клеток иммунной системы в коже здоровых лиц, что важно для изучения патогенеза хронических дерматозов.

-на основании иммуногистохимических исследований с применением широкой панели моноклональных антител изучена развернутая морфофункциональная характеристика иммунного воспаления при псориазе.

-установлена роль иммунных реакций, опосредованных Т-клетками в патогенезе болезни Девержи.

- выявлены особенности количественной характеристики распределения маркеров ГЗТ при изучаемых заболеваниях.

Практическая значимость

По сравнению с рутинным гистологическим методом иммуноморфологический метод позволяет получить более широкую морфофункциональную характеристику патологического процесса с определением конкретных активированных клеток. С учетом детальной характеристики иммунного воспаления, возможно осуществление терапевтической коррекции с применением продуктов активации клеток или моноклональных антител к ним, направленной на отдельные звенья патогенеза. Полученные данные могут быть использованы для оценки эффективности проводимого лечения.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У здоровых лиц отсутствуют маркеры ГЗТ в зоне эпидермиса

и базальной мембраны. Так как кожа постоянно испытывает постоянную антигенную нагрузку, единичные иммунокомпетентные клетки дермальных инфильтратов определяют фоновый уровень «контрольного» режима ожидания контакта с антигенами.

2. Как при псориазе, так и при красном волосяном лишае Девержи иммунное воспаление развивается по механизму гиперчувствительности замедленного типа, что позволяет отнести не только псориаз, но и красный волосяной лишай Девержи к иммунозависимым дерматозам.

3. При морфометрическом анализе не обнаружено статистически значимой разницы количественного распределения клеток при различных клинических формах псориаза.

4. Выявленные изменения могут служить дополнительными диагностическими критериями.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на научно-практической конференции ГУ 11НИКВИ МЗ РФ в сентябре 2004 г., на пленарном заседании Московского научного общества дерматологов и

венерологов имени А.И. Поспелова в марте 2005 г., на научно-практической конференции ГУ ЦНИКВИ МЗ РФ в марте 2005г.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследований внедрены в лекционный курс для врачей ординаторов ГУ ЦНИКВИ а также цикла последипломного усовершенствования для врачей патологоанатомов.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав с описанием данных литературы и результатов собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, содержащего 51 источник на русском и 68 источников на иностранных языках. Диссертация изложена на 105 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 49 рисунками, 7 графиками, 15 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования.

Клинические исследования. Критериями включения больных в исследование явились возраст старше 14 лет, наличие типичной картины заболевания. Учитывались мел оды ранее проводимой терапии: в исследование были включены пациенты с впервые установленным диагнозом (24 человека) либо пациенты, которые не получали лечения в течение 6 предыдущих месяцев (14 человек).

Группы больных псориазом и болезнью Девержи были сопоставимы по полу, возрасту, продолжительности заболевания и длительности последнего рецидива.

Под наблюдением находились 21 пациент с диагнозом псориаз и 17 пациентов с диагнозом красный волосяной лишай Девержи. Из них 26 мужчин

и 12 женщин. Продолжительность заболевания варьировала от 2 недель до 30 лет. Длительность последнего рецидива колебалась от 1 до 7 месяцев. Распространенность высыпаний оценивали в % и колебалась oi 5% до 95%

В группу больных псориазом входили 10 человек, больных бляшечным псориазом, 6 каплевидным и 5 эритродермическим псориазом.

Конгрольную труппу составили 10 условно здоровых лиц, у которых биоптаты кожи для исследования были получены при косметических операциях.

Гистологические и иммуногистохимические исследования кожи.

Материалом для этих исследований служили биоптаты кожи, взятые с добровольного согласия пациентов до лечения из очагов пораженной кожи иод местной анестезией 2% раствором новокаина Биоптаты фиксировали в 10% растворе забуференного формалина, подвергали стандартной гистологической обработке, заливали в парафин. Из парафиновых блоков на микротоме изготавливали срезы толщиной 4-5 микрон, растягивали на стеклах с полилизиновым покрытием, окрашивали гематоксилин - эозином. Иммуноморфологическое исследование проводилось по стандартной методике: после депарафинации в ксилоле проводили процедуру антигенного демаскирования путем кипячения в цитратном буфере рН-6,0 в СВЧ-печи тремя циклами по 5 минут с 1-минутными перерывами. После остывания при комнатной температуре стекла промывали в растворе ТРИС - буфера рН-5,54, на срезы наносили 0,3% paciBop перекиси водорода не метаноле (1:1) для предотвращения эндогенной пероксидашой активности. Затем проводили иммуногистохимическую реакцию с применением моноклонадъных антител фирмы «Novokastra» (Великобритания): CD4, CD8, Ki 67 - антитела, готовые к употреблению, CD25 в рабочем разведении 1:150, CD68 1:60, CD45RO 1:150, CD45RA 1 50, CD83 1:40. HLA-DR 1:40, СШО 1.100. Срезы с нанесенными сыворотками инкубировали в течение 60 минут при комнатной температуре. Для визуализации использовалЬ системе Novostain SuperABC- Kit universal («Novokastra» Laboratories Ltd, Великобритания). Во всех случаях проводили

докрашивание ядер гематоксилином. Определение количества позитивных клеток в эпидермисе и в зоне дермо-эпидермальной границы проводили в 40 полях зрения при увеличении X 1000, подсчитывая абсолютное количество меченых клеток. При оценке содержания клеток в инфильтратах кожи в 5 периваскулярных инфильтратах произвольно выбирали по 100 клеток, среди которых проводили подсчет количества клеток, меченных указанными антителами, после чего для каждого биоптата рассчитывали средние значения относительного содержания клеток Определение количества К.1б7-позитивных клеток в эпидермисе проводили в расчете на 100 клеток базального слоя.

Статистическая обработка материала. Статистический анализ проводили с применением пакета прикладных программ Statistica'99 (StatSoft, США) Описание распределений признаков в выборках представлено в виде медиан и границ интерквартильного отрезка. При сравнении групп друг с другом использовали критерии Вилкоксона и Манна-Уитни. Корреляционный анализ проводили непараметрическим методом Кендалла. Различия считали статистически значимыми при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение.

При гистологическом исследовании кожи здоровых лиц выявлен, что эпидермис состоял из 1 ряда базальных клеток, 4-5 - шиповатых клеток, 2-3 -зернистых клеток. Поскольку в отсутствие повреждающих и стимулирующих воздействий кератиноциты выполняют исключительно барьерную функцию, полученные результаты подтверждают отсутствие иммунных процессов в коже здоровых лиц.

При подсчете лимфоцитов лиц контрольной группы настоящего исследования в эпидермисе и дермо-эпидермальной границе клетки, экспрессирующие изучаемые белковые антигены, не обнаружили. Количественный анализ клеток в периваскулярных инфильтратах дермы

здоровых лиц показал фоновый уровень «контрольного» режима ожидания с пониженным содержанием «дежурных» Т- хелиеров, цитотоксических Т-клеток. «наивных» лимфоцитов, клеток «памяти», макрофагов, HLA-DR+ клеток, а также полное отсутствие активированных клеток с рецептором к ИЛ-2 (CD 25+).

По данным литературы (Ярилин A.A., 1999; Shimizu У., 1992) в нормальной коже всегда присутствует небольшое количество Т-лимфоцитов, которые, как правило, располагаются вокруг посткапиллярных венул поверхностного сплетения или придатков кожи. При этом соотношение «хелперы/супрессоры» по данным разных авторов составляет 0,93-0,96. Соотношение «хелперы /супрессоры» в периваскулярных инфильтратах кожи здоровых добровольцев контрольной группы в среднем составило 0,67.

При гистологическом исследовании кожи больных псориазом выявляли следуюгцую картину: акантоз эпидермиса, гилеркераюз, паракератоз с наличием внутрироговых микроабсцессов Мунро, экзоцитоз лимфоцитов в эпидермис, истончение или отсутствие зернистого слоя, извитые сосуды поверхностного сплетения, в части биоптатов полнокровные. Периваскулярно выявляли умеренные инфильтраты лимфо-шстиоцитарного характера, в отдельных биоптатах с примесью единичных эозинофильных гранулоцитов. У больных бляшечным псориазом акантоз был более выраженным. У больных каплевидным псориазом был менее выраженный акантоз, зернистый слой в большинстве случаев был сохранен, отмечалась менее выраженная интенсивность воспалительной инфильтрации. В биоптатах больных эритродермическим псориазом также обнаруживали умеренно выраженный акантоз эпидермиса. В дерме был более выражен отек. Периваскулярная инфильтрация была средней интенсивности.

В большинстве случаев выявлен низкий уровень содержания CD4+ клеток, особенно в эпидермисе. У 4 больных содержание Т-хелперов был умеренным (20-30% популяции). В 4 случаях уровень Т-хелперов был высоким (около 50% инфильтрата). Какая-либо зависимость содержания CD4-

клеток от давности заболевания и распространенности высыпаний нами не выявлена, однако в 4-х случаях с высоким уровнем Т-хелперов клинически было констатировано обострение кожного процесса.

При анализе локализации и содержания CD8^ лимфоцитов обнаружено явное преобладание этой субпопуляции у 12 больных псориазом, у 6 больных количество CD8 цитотоксических клеток было примерно равно количеству Т-хелперов. Соответственно, показатель соотношения CD4/CD8 был низким.

CD45R04- клетки «памяти» выявляли у большинства обследованных больных. В эпидермисе реактивные мигрирующие клетки обнаруживали между кератиноцитами на разных уровнях эпителиально! о пласта. В периваскулярных инфильтратах клетки «памяти» составляли практически субтотальную популяцию.

У подавляющего большинства больных выявлено отсутствие клеток с экспрессией рецептора CD45RA+ в эпидермисе. В периваскулярных инфилыратах количесхво их составляло от 10% до 25% популяции. В частности, у 2-х больных бляшечным псориазом с клиническими признаками обострения «наивные» лимфоциты составляли около 25%.

Анализ содержания клеток с рецептором CD40 выявил диффузную положи 1ельную реакцию в эпидермисе с градиентом ослабления по направлению к верхним рядам, в паракератотическом слое реакция была отрицательная. Выявляли выраженную реакцию в клетках периваскулярных инфильтратов вокруг сосудов поверхностного и глубокого сплетения.

Единичные CD68-1- клетки обнаруживали в эпидермисе в виде мелких скоплений в составе внутрироговых микроабсцессов. Небольшие скопления из нескольких клегок присутствовали на вершинах дермальных сосочков, особенно в участках под истонченным эпидермисом, при этом чаоь клеток располагалась между кератиноцитами базального слоя Среди клеток периваскулярных инфильтратов количество их было невелико и колебалось от единичных клеток до 10-20 % .

С083-! дендроциты в эпидермисе отсутствовали или обнаруживались единичные клетки. В периваскулярных инфильтратах сосудов поверхностного сплетения, вдоль базальной мембраны обнаруживали немногочисленные клетки с положительной реакцией.

Положительную реакцию к СЭ25 наблюдали в цитоплазме керагиноцитов и эпителиальных структур придатков. Выраженная реакция была в кератиноцитах шиповатого слоя, в паракератотичсском и роговом слоях отсутствовала.. Положительная реакция была в многочисленных клетках периваскулярных инфильтратов. Такая интенсивность и локализация клеток с экспрессией рецептора к ИЛ-2 была характерна для большинства случаев в группе больных псориазом.

В эпидермисе присутствовали НЬА-01*+ клетки с четко видимыми отростками, единичные или в виде небольших скоплений, которые располагались на разных уровнях эпителиального пласта. Многочисленные клетки располагались вдоль базальной мембраны и между базальными кератиноцитами. Вокруг сосудов поверхностного сплетения клетки с положительной реакцией формировали густые конгломераты из переплетающихся отростков с трудно различимыми границами. Подобный характер интенсивности и распределения экспрессии рецептора был присущ большинству больных.

Положительную реакцию к Кл67 стабильно выявляли в ядрах кератиноцитов базалыгого слоя и 2-3 надбазальных слоев эпидермиса, а также в наружной эпителиальной выстилке волосяных фолликулов. Среди клеток периваскулярных инфильтратов положительная реакция выявлялась в единичных клетках различных гистологических типов

Таким образом, при анализе локализации и интенсивности экспрессии рецепторов на клетках, осуществляющих реакцию гиперчувствительности замедленного типа, у больных разными клиническими формами псориаза установлено, что в целом имеет место стереотипное развитие процесса с некоторыми вариациями показателей, отражающими течение болезни у

каждого конкретного пациента. Это можно объяснить существованием двух субтипов CD8+ Т- клеток с различными профилями цитокинов (Chang E.Y. et al.,2000), которые могут выполнять супрессорно-цитотоксические функции или являются CD8+ эффекторными лимфоцитами, способными поддерживать иммунное воспаление. Так, острый каплевидный псориаз рассматривают как иммунную реакцию на стрептококковую инфекцию глотки, при которой появление высыпаний сопровождается поступлением в кожу активированных CD4+ Т-клеток (рис. 1).

г КОЖА ,

Рис.1

А разрешение высыпаний связано со снижением в коже количества С04 г Т-клеток и увеличением количества СБ8+ Т-клеток, обладающих супрессорно-цитотоксической функцией (рис.2).

Рис.2

Иммунокомпетентные клетки при бляшечном псориазе перекрестно реагируют с эпитопами, общими для М-белков стрептококков и кератинов 1 типа, включая цитокератины 16,17. Полагают, что у больных бляшечным псориазом в стадии обострения имеется рециркулирующая субпопуляция СЭ8+ Т-клеток с рецептором кожного хоуминга, которые специфически реагируют с пептидами кератинов, усиливая продукцию провоспалительных цитокинов и участвуя в формировании самоподдерживающегося аутокринного прцесса. Таким образом, при бляшечном псориазе воспалительная реакция обусловлена продолжительным сосуществование в эпидермисе и дерме активированных С04+ и СБ8+ клеток, получающих и посылающих друг другу стимулирующие сигналы, что способствует поддержанию патологического процесса (рис.3).

При эритродермическом псориазе роль эпидермиса, как реактивной структуры, становится менее существенной. Подтверждением этому служит снижение пролиферативной активности кератиноцитов и уменьшение толщины эпидермиса в исследуемой группе больных эритродермическим псориазом.

КОЖА

Рис.3

Вероятно, в результате нарушения баланса соотношения иммуннокомпетентных клеток и беспорядочного поступления сигналов от эффекторных клеток процесс приобретает черты неконтролируемой реакции. И основной точкой приложения становится не кожа, а микроциркуляторное русло, что в конечном итоге приводит к развитию эритродермии, артропатии и других системных нарушений.

При гистологическом исследовании в коже больных красным волосяным лишаем Девержи наблюдали акангоз эпидермиса, умеренный гиперкератоз, скопления роювого вещества в устьях волосяных фолликулов, очаговый паракератоз, у некоторых пациенюв очаги паракератоза в периферических отделах фолликулярной воронки. У двух больных обнаружили внутрироговые микроезикулы и умеренный межклеточный отек в шиповатом слое Зернистый слой был сохранен, однако гипергранулез наблюдали не во всех биоптатах. В ряде случаев отмечали экзоцитоз лимфоцитов в эпидермис, вокруг сосудов поверхностного сплетения лимфо-гистиоцитарные инфильтраты различной степени интенсивности

У 13 больных уровень содержания Т-хелперов в эпидермисе был низким. ГП4+ лимфоциты располагались преимущественно в базальном слое. У 4 больных количество Т-хелперов в эпидермисе было выше, их обнаруживали также и в шиповатом слое. В периваскулярных инфильтратах количество Т-хелперов почти у всех пациентов было достаточно высоким, составляя от 20 до 50%.

Количество СВ8+ лимфоцитов было высоким у 4 больных, у остальных больных (13 человек) количество Т-цитотоксических клеток было приблизительно равно количеству Т-хелперов.

Единичные СП45КО+ лимфоциты (Т-клетки «памяти») присутствовали между кератиноцитами на разных уровнях эпителиального пласта. В периваскулярных инфильтратах клетки памяти составляли с небольшими вариациями субтотальную популяцию.

У подавляющего большинства больных единичные С04511А+ лимфоциты, локализовались по ходу базальной мембраны. В периваскулярных инфильтратах они составляли не более 10-20% без четко выявляемой связи с продолжительностью процесса.

Анализ экспрессии рецептора костимулирующей молекулы С040 у 10 пациентов выявил в эпидермисе диффузную слабо положительную с градиентом ослабления по направлению к верхним рядам, реакция была отрицательной в клетках паракератотического и рогового слоя. Умеренно выраженную реакцию обнаружили у 5 пациентов. У всех пациентов на клетках периваскулярных инфильтратов обнаруживали умеренно выраженную реакцию, охватывающую от 1/3 до 2/3 клеток.

У 6 пациентов в эпидермисе СЭ68~ клетки отсутствовали, у 6 единичные СВ68^ клетки обнаруживали в базальном слое, у 5 довольно значительное количество в шиповатом слое. Среди клеток периваскулярных инфильтратов их количество колебалось от единичных клеток до 15%.

У 12 пациентов единичные СБ83+ клетки наблюдали в эпидермисе, > 5 пациентов они отсутствовали. В периваскулярных инфильтратах сосудов

поверхностного сплетения, вдоль базальной мембраны были немногочисленные клетки с положительной реакцией (около 5%).

У 9 пациентов положительную реакцию к СБ25 выявляли в кератиноцитах. Реакция была положительной в клетках шиповатого слоя, оставалась положительной в клетках зернистого слоя и исчезала в паракератотическом и роговом слоях. Положительную реакцию наблюдали в клетках периваскулярных инфильтратов вокруг сосудов поверхностного сплетения и многочисленных веретеновидных клетках, расположенных в интерстициальных пространствах дермы.

У большинства больных красным волосяным лишаем Девержи в эпидермисе обнаруживали клетки с четко видимыми отростками,

единичные или в виде небольших скоплений, которые располагались на разных уровнях эпителиального пласта. Многочисленные клетки располагались вдоль базальной мембраны. Вокруг сосудов поверхностного сплетения клетки с положительной реакцией формировали густые конгломераты из переплетающихся отростков с трудно различимыми границами.

Положительную реакцию к Кл67 в эпидермисе выявляли в ядрах кератиноцитов базального слоя, местами в 2-3 надбазальных слоях эпидермиса и наружной эпителиальной выстилки волосяных фолликулов. Среди клеток периваскулярных инфильтратов положительную реакцию выявляли в единичных клетках разного типа.

Таким образом, изменения, выявленные нами в биоптатах кожи 1

пациентов с красным волосяным лишаем Девержи, характеризовались повышенным количеством клеток с экспрессией маркеров, принимающих "

участие в развитии воспалительной иммунной реакции по механизму гиперчувствительности замедленного типа. Красный волосяной лишай Девержи можно отнести к хроническим дерматозам, характеризующимся гиперпролиферацией кератиноцитов, опосредованной Т-клетками

С044 Т-клетки чаще обнаруживали в эпидермисе и в дермальных инфильтратах больных болезнью Девержи, чем у больных псориазом, особенно

при недавно возникшем обострении (рис.4) Такая локализация эффекторных клеток может свидетельствовать о возможности экзогенной антигенной стимуляции.

Количество С08+ лимфоцитов статистически достоверно было выше у больных псориазом (рис.5).

Рис.4 Содержание С04- лимфоцитов при Рис 5 Содержание СОХ-^ лимфоцитов при при псориазе и болезни Девержи псориазе и болезни Девержи

Соответственно соотношение С04ч-/СВ8+ было низким у больных псориазом, особенно в зоне эпидермиса и дермо-эпидермальной границы. Соотношение С04+/С08+ у больных болезнью Девержи приближалось к показаниям такового у здоровых лиц (рис.6).

Рис.6 Соотношение СП4--7С08т лимфоцитов

при псориазе и болезни Девержи.

Количество «наивных» СБ45КА+ лимфоцитов в периваскулярных инфильтратах было больше у больных красным волосяным лишаем Девержи, чем у больных псориазом (рис.7). Количество СЭ45КО+ клеток «памяти» у больных болезнью Девержи было ниже, чем при псориазе (рис.8).

Рис 7 Количество СП4511А+ «наивных» клеток Рис 8 Количество С045Я0н клеток при псориазе и болезни Девержи «памяти» при псориазе и болезни Девержи

Количество СБ68+ макрофагов было выше в эпидермисе и периваскулярных инфильтратах у больных болезнью Девержи.

Показатели количества клеток, несущих НТ.Д-БЯ и рецептор к ИЛ-2 (СБ25+), при данных заболеваниях не отличались.

В эпидермисе количество кератиноцитов, экспрессирующих универсальный маркер пролиферации Ю67, в расчете на 100 клеток базального слоя, было выше при псориазе.

Таким образом, результаты исследования, полученные с помощью гистологического и иммуногистохимического методов свидетельствуют об общем патогенетическом пути развития воспалительного процесса в коже при псориазе и красном волосяном лишае Девержи с активацией антигенпредставляющих клеток, гиперпролиферацией керагиноциюв, которые видимо, приобретая черты иммуноцитов, способствуют поддержанию патологического процесса. Каждой нозологии соответствует определенное соотношение клеточных элементов в структурах кожи.

Выводы

1. При иммуногистохимическом исследовании кожи здоровых лиц установлено отсутствие в эпидермисе и дермо-эпидермальной границе С04+, СБ8+, СБ83+, СБ451Ю+, С045ИА+. СБ68+ клеток и наличие единичных НЪА-1Ж+ клеток. В периваскулярных инфильтратах кожи здоровых добровольцев выявлено наличие единичных СТ)4+, С08-, С083+, С045Я0+, С045КА+, НЬА-ОЯ4- клеток и отсутствие СТ>25+ клеток, что создает условия для контакта с антигеном и его распознавания.

2. В эпидермисе, дермо-эпидермальной границе и периваскулярных инфильтратах больных псориазом выявлено повышенное количество иммунокомпетентных клеток, осуществляющих реакцию гиперчувствительности замедленного типа. Несмотря на разнообразие клинических проявлений, процесс носит стереотипный характер.

3. Изменения в биоптатах кожи больных красным волосяным лишаем Девержи характеризуются повышенной экспрессией маркеров, принимающих участие в развитии воспалительной иммунной реакции по механизму гиперчувствительности замедленного типа. Это позволяет отнести красный волосяной лишай Девержи к группе хронических дерматозов, опосредованных иммунным воспалением.

4. При сравнительном морфометрическом анализе выявлено, что у больных болезнью Девержи доминируют С04+ Т-клетки и «наивные» С045ЯА+ лимфоциты; у больных псориазом доминируют СП8+ цитотоксические лимфоциты и СЭ451Ю+ клетки «памяти». Показатели количества НЬА-ОЯ в эпидермисе и дерме и рецептора к ИЛ-2 (С025+) при данных заболеваниях не отличались. Эти признаки могут служить дополнительными диагностическими критериями в трудных случаях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1 .Катунина O.P. ГЗТ как патогенетическая основа хронических дерматозов -псориаза и болезни Девержи.// Избранные вопросы дерматовенерологии и медицинской косметологии. Выпуск №6. Материалы научно-практической конференции, посвященной 80-летию ГККВД г. Владивостока. - Владивосток,

2004,- с.94-97.

2. Катунина O.P., Вавилов A.M. Фенотипическая характеристика клеток воспалительного инфильтрата у больных псориазом и болезнью Девержи.// Сборник тезисов научных работ Всероссийской конференции дерматовенерологов «Современные направления диагностики, лечения и профилактики ИППП и дерматозов»,- Нижний-Новгород, 2004.-е. 18.

3. Кагунина O.P. Участие микроциркуляторного русла в патогенезе псориаза и болезни Девержи.// Материалы Всероссийской научной конференции «Микроциркуляция б клинической практике».-

Москва, 2004.-c.ll.

4. Катунина O.P. Иммуноморфологическая характеристика клеток воспалительного инфильтрата при псориазе.'/ Сборник тезисов научных работ VIII Всероссийской конференции дерматовенерологов «Новые технологии в организации Дерматовенерологической помощи населению Российской Федерации»,- Москва, 2004.-C.5.

5. Катунина O.P. Иммунная система кожи и ее роль в патогенезе псориаза.// Вестник дерматологии и венерологии.-2005.-№1 .-с.19-22.

6. Катунина O.P. Сравнительная иммуноморфологическая характеристика клеток воспалительного инфильтрата при псориазе и болезни Девержи.// Материалы X междисциплинарного симпозиума «Новое в дерматовенерологии, андрологии, акушерстве и гинекологии: наука и практика».- Москва, 2005.-с.15.

7. Иммуноморфологическая характеристика клеток воспалительного инфильтрата у пациентов с псориазом.// Вестник дерматологии и венерологии.-

2005.-№2.-с 25-28.

Подписано в печать 15.04.05. Заказ № 65. Тираж 100 экз.

ООО "Фирма Печатный двор" г. Москва Лопухинский пер ,6 Тел,- 269-80-41

8 3 25

РНБ Русский фонд

2006-4 6019

Актуальность проблемы.

Псориаз и красный отрубевидный волосяной лишай Девержи относят к генетически обусловленным хроническим заболеваниям кожи, которые протекают длительно и сопровождаются чередованием периодов рецидивов и ремиссий (Скрипкин Ю.К., 1999). Несмотря на многочисленные исследования, причина этих заболеваний до сих пор остается невыясненной. Поражения кожи при псориазе и болезни Девержи нередко характеризуются сходными клиническими проявлениями. Особые трудности возникают при дифференциальной диагностике эритродермических форм этих заболеваний. Морфологические изменения при псориазе и болезни Девержи имеют сходную картину и характеризуются усилением пролиферации эпидермоцитов с нарушением их дифференцировки, а также развитием иммунного воспаления в дерме. Использование традиционных гистологических методов исследования не всегда позволяет выявить четкие критерии, необходимые для проведения дифференциальной диагностики. Нередко клинические и морфологические данные противоречат друг другу.

В литературе дискутируется вопрос о первичности изменений в дерме и эпидермисе у больных хроническими дерматозами (Nikoloff B.et al., 2000). Изменения в эпидермисе более наглядны и поэтому чаще привлекают внимание исследователей. С нашей точки зрения, изменения в дерме и эпидермисе при этих заболеваниях следует рассматривать в комплексе.

Данные многих исследователей свидетельствуют о важной роли в развитии воспалительного процесса в коже больных псориазом иммунных реакций, опосредованных Т-лимфоцитами (Рыбкина М.И., 2005; Nikoloff В. et al. 2000; Baker В.,2000). В частности, установлено повышенное содержание CD4+ и CD8+ лимфоцитов в коже больных псориазом, по сравнению со здоровой кожей (Вавилов A.M. и др., 2001, Суханова Н.М, 2003). Однако результаты исследований весьма противоречивы: одни авторы отмечают преобладание CD4+ лимфоцитов, другие CD8+.

При болезни Девержи, в отличие от псориаза, нет определенных сведений о роли в формировании воспалительной реакции иммунокомпетентных клеток (Цветкова Г.М. и др., 2003).

Изучение состава клеток воспалительного инфильтрата может послужить основой для более глубокого понимания механизмов развития воспалительных, активационных и пролиферативных процессов у больных псориазом и болезнью Девержи, поможет расширить наши представления о патогенезе этих дерматозов, полученные данные могут быть использованы для разработки новых лечебных методов с использованием иммунотерапии (Курдина М.И., 2005; Mehlis S.L., 2003; Gudjonsson J.E., 2004).

Цель исследования.

Изучение тканевого распределения и количественная характеристика клеток, участвующих в реакции гиперчувствительности замедленного типа в о коже больных псориазом и красным волосяным лишаем Девержи.

Задачи исследования

Изучить:

1. тканевое распределение в коже здоровых лиц CD4, CD8, CD25,CD40, CD45RA, CD45RO, CD68, CD83, HLA-DR, Ki67 позитивных клеток.

2. количественную характеристику тканевого распределения CD4, CD8, CD25,CD40, CD45RA, CD45RO, CD68, CD83, HLA-DR, Ki67 позитивных клеток в коже больных псориазом и определить их роль в развитии воспаления по механизму гиперчувствительности замедленного типа.

3. количественную характеристику тканевого распределения CD4, CD8, CD25,CD40, CD45RA, CD68, CD83, HLA-DR, Ki67 позитивных клеток в коже больных красным волосяным лишаем Девержи и определить их роль в развитии воспаления по механизму гиперчувствительности замедленного типа.

4. Провести сравнительную оценку распределения клеток в структурах кожи у больных псориазом и красным волосяным лишаем Девержи.

Научная новизна:

-проведено фенотипирование клеток кожи здоровых лиц с использованием 10 маркеров, выявлены взаимоотношений клеток иммунной системы в коже здоровых лиц, что важно для изучения патогенеза хронических дерматозов.

-на основании иммуногистохимических исследований с применением широкой панели моноклональных антител дана развернутая морфофункциональная характеристика иммунного воспаления при псориазе.

-установлена роль иммунных реакций, опосредованных Т-клетками в патогенезе болезни Девержи.

- выявлены особенности количественной характеристики распределения маркеров ГЗТ при изучаемых заболеваниях.

Практическая значимость

По сравнению с рутинным гистологическим методом иммуноморфологический метод позволяет получить более широкую морфофункциональную характеристику патологического процесса с определением конкретных активированных клеток. С учетом детальной характеристики иммунного воспаления, возможно осуществление терапевтической коррекции с применением продуктов активации клеток или моноклональных антител к ним, направленной на отдельные звенья патогенеза. Полученные данные могут быть использованы для оценки эффективности проводимого лечения.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У здоровых лиц отсутствуют маркеры ГЗТ в зоне эпидермиса и базальной мембраны. Так как кожа постоянно испытывает постоянную антигенную нагрузку, единичные иммунокомпетентные клетки дермальных инфильтратов определяют фоновый уровень «контрольного» режима ожидания контакта с антигенами.

2. Как при псориазе, так и при красном волосяном лишае Девержи иммунное воспаление развивается по механизму гиперчувствительности замедленного типа, что позволяет отнести не только псориаз, но и красный волосяной лишай Девержи к иммунезависимым дерматозам.

3. При морфометрическом анализе не обнаружено статистически значимой разницы количественного распределения клеток при различных клинических формах псориаза.

4. Выявленные изменения могут служить дополнительными диагностическими критериями.

Апробация работы.

Основные результаты работы доложены на научно-практической конференции ГУ ЦНИКВИ МЗ РФ в сентябре 2004 г., на пленарном заседании Московского научного общества дерматологов и венерологов имени А.И. Поспелова в марте 2005 г., на научно-практической конференции ГУ ЦНИКВИ МЗ РФ в марте 2005г.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав с описанием данных литературы и результатов собственных наблюдений, заключения, выводов и указателя литературы, содержащего 51 источник на русском и 68 источников на иностранных языках. Диссертация изложена на 105 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 49 рисунками, 15 таблицами, 7 графиками.

Выводы

1. При иммуногистохимическом исследовании кожи здоровых лиц установлено отсутствие в эпидермисе и дермо-эпидермальной границе CD4+, CD8+, CD83+, CD45RO+, CD45RA+, CD68+ клеток и наличие единичных HLA-DR+ клеток. В периваскулярных инфильтратах кожи здоровых добровольцев выявлено наличие единичных CD4+, CD8+, CD83+, CD45RO+, CD45RA+, HLA-DR+ клеток и отсутствие CD25+ клеток, что создает условия для контакта с антигеном и его распознавания.

2. В эпидермисе, дермо-эпидермальной границе и периваскулярных инфильтратах больных псориазом выявлено повышенное количество иммунокомпетентных клеток, осуществляющих реакцию гиперчувствительности замедленного типа. Несмотря на разнообразие клинических проявлений, процесс носит стереотипный характер.

3. Изменения в биоптатах кожи больных красным волосяным лишаем Девержи характеризуются повышенной экспрессией маркеров, принимающих участие в развитии воспалительной иммунной реакции по механизму гиперчувствительности замедленного типа. Это позволяет отнести красный волосяной лишай Девержи к группе хронических дерматозов, опосредованных иммунным воспалением.

4. При сравнительном морфометрическом анализе выявлено, что у больных болезнью Девержи доминируют CD4+ Т-клетки и «наивные» CD45RA+ лимфоциты; у больных псориазом доминируют CD8+ супрессорно-цитотоксические лимфоциты и CD45RO+ клетки «памяти». Показатели количества HLA-DR в эпидермисе и дерме и рецептора к ИЛ-2 (CD25+) при данных заболеваниях не отличались. Эти признаки могут служить дополнительными диагностическими критериями в трудных случаях.

Заключение.

По данным литературы (Ярилин А.А., 1999) в нормальной коже всегда присутствует небольшое количество Т-лимфоцитов, которые, как правило, располагаются вокруг посткапиллярных венул поверхностного сплетения или придатков кожи, соотношение хелперы/супрессоры по разным данным составляет 0,93-0,96. По данным Bos J.D. и соавт., внутриэпидермальные Т-клетки в здоровой коже составляют менее 2% от общего числа лимфоцитов и являются преимущественно CD8+ клеткам. CD4+ Т-клетки взаимодействуют с молекулой главного комплекса гистосовместимости на поверхности антигенпрезентирующих клеток. Их функция как Т-клеток «помощников» заключается в помощи В-клеткам, продуцирующим иммуноглобулины. Кроме того, посредством CD4+ клеток осуществляется индукция и созревание цитотоксических CD8+ лимфоцитов, через продукцию ряда цитокинов.

При подсчете лимфоцитов в контрольной группе нашего исследования в эпидермисе и дермо-эпидермальной границе клетки, экспрессирующие исследованные нами белковые АГ, не были обнаружены. В отсутствие повреждающих и стимулирующих воздействий кератиноциты выполняют исключительно барьерную функцию и не имеют отношения к иммунным процессам (Ярилин А. А., 1994). Картина, свойственная физиологии покоящихся кератиноцитов, существенно меняется в условиях повреждения эпидермиса, когда они приобретают основные черты иммуноцитов, то есть начинают сами продуцировать цитокины и выполнять функции антигенпрезентирующих клеток. Это подчеркивает роль эпителиального пласта как основной реактивной структуры, способной продуцировать многочисленные и разнообразные цито- и хемокины, факторы роста и другие биологически активные субстанции в виде стереотипной реакции на внедрение чужеродного белка, что сопровождается формированием типичных морфологических структур с гиперпластическими изменениями и нарушением процессов дифференцировки по мере развития патологического процесса, выражением чего при псориазе является морфологический феномен акантоза, паракератоза и редукции гранулярного слоя. При болезни Девержи характер нарушения процессов дифференцировки несколько иной, сопровождается очаговым паракератозом, однако в большинстве случаев отсутствует редукция зернистого слоя.

Количественный анализ маркеров в периваскулярных инфильтратах дермы здоровых лиц контрольной группы демонстрирует фоновый уровень «контрольного» режима ожидания с пониженным содержанием «дежурных» Т-хелперов, цитотоксических Т-клеток, «наивных» лимфоцитов, клеток памяти, макрофагов, HLA-DR+ клеток, а также полным отсутствием клеток с активированным рецептором ИЛ-2 (CD 25+). Вероятно, в покоящейся коже большая часть этих клеток выполняет функции, не связанные непосредственно с иммунной защитой организма.

Соотношение «хелперы/супрессоры» в периваскулярных инфильтратах кожи здоровых добровольцев контрольной группы, в среднем, составило 0,67.

У пациентов с псориазом достоверно увеличивается экспрессия практически всех маркеров, что указывает на активизацию клеток посредством системы микроциркуляции периферического звена лимфо-эпителиальной системы.

В обследованной нами группе в большинстве случаев длительно существующего бляшечного псориаза было выявлено выраженное преобладание CD8+ клеток над CD4+ лимфоцитами вне зависимости от давности заболевания, его распространенности, пола и возраста больных.

Современные данные свидетельствуют о наличии 2 субпопуляций Т-цитотоксических клеток при псориазе: одна из них «выключает», а вторая поддерживает псориатический процесс и обе действуют посредством функционального взаимодействия с CD4+ Т- клетками. Два субтипа CD8+ Т-клеток с различными профилями цитокинов и функциями, аналогичными Th 1 и Th2 клеткам (Chang E.Y., 1999) выполняют супрессорно-цитотоксические функции, либо являются CD8+ эффекторными лимфоцитами, способными поддерживать иммунное воспаление.

Так, острый каплевидный псориаз рассматривают как иммунную реакцию на стрептококковую инфекцию глотки, при которой появление высыпаний сопровождается поступлением в кожу и активацией CD4+ Т-клеток. А разрешение высыпаний связано со снижением количества CD4+ Т-клеток и увеличением количества CD8+ Т-клеток, обладающих супрессорной функцией. В случае самопроизвольно разрешающегося каплевидного псориаза, весьма вероятно, что активированные Т4+ клетки уничтожаются активированными Т8+ клетками благодаря связыванию FAS, притом, что сами Т8+ клетки устойчивы к FAS- апоптозу. Косвенно это подтверждают наши данные, демонстрирующие высокое содержание CD8+ Т-клеток в коже больных каплевидным псориазом, особенно в эпидермисе.

Для хронического бляшечного псориаза характерны признаки аутоиммунного воспаления с волнообразно текущим процессом.

Доказано, что иммунокомпетентные клетки при бляшечном псориазе перекрестно реагируют с эпитопами, общими для М-белков стрептококков и кератинов 1 типа, включая цитокератины 14,16,17. Отмечено, что цитокератины 16 и 17 отсутствуют или показывают слабую экспрессию в здоровой коже, однако их экспрессия резко возрастает при воспалении, что является дополнительным стимулирующим фактором для механизма активации CD8+ Т-клеток. Установлено, что реакция Т-клеток на аминокислотную последовательность, общую для М-белков стрептококков и кератинов усиливается у больных псориазом в стадии обострения и отсутствует во время ремиссии. Полагают, что у больных псориазом в стадии обострения имеется рециркулирующая субпопуляция CD8+ Т-клеток с рецептором кожного хоуминга, которые специфически реагируют с пептидами кератинов, усиливая продукцию провоспалительных цитокинов и участвуя в формировании самоподдерживающегося аутокринного процесса ( Gudjonsson J.E., 2004).

Таким образом, при бляшечиом псориазе иммунное воспаление обусловлено продолжительным сосуществованием в эпидермисе и дерме активированных CD4+ и CD8+ клеток, получающих и посылающих друг другу стимулирующие сигналы, как полагают, за счет 3 патогенетических факторов:

1) персистенции стрептококковых АГ в коже, возникающей вследствие врожденной патологии иммунной системы;

2) перекрестно реагирующих кожных детерминант, обусловленных, в частности, структурной гомологией М-серотипов белка стрептококков и кератинов, особенно цитокератина 14, в больших количествах присутствующим в кератиноцитах;

3) стимуляции суперантигенами Vp2+ субпопуляций Т-клеток, специфичных для аутоантигенов. (Baker В., 2000).

Косвенным подтверждением ослабления супрессорной функции по мере «хронизации» процесса в нашем исследовании является тенденция к снижению числа CD8+ лимфоцитов в сравнительном ряду каплевидный - бляшечный -эритродермический псориаз, а также уменьшение количества CD8+ лимфоцитов у пациентов, болеющих более 1 года, по сравнению с пациентами, болеющими менее 1 года. Анализ 2 случаев эритродермической формы выявил резко выраженное снижение числа Т-клеток. В эпидермисе, дермо-эпидермальной границе и дерме Т-хелперы были представлены буквально единичными клетками, что в свою очередь привело к значительному снижению соотношения CD4/CD8, создавая впечатление «истощения» звена активации.

Анализ количества «наивных» лимфоцитов (CD45RA+) выявил их низкое содержание в эпидермисе и незначительное (10-25 % всех клеток) в периваскулярных инфильтратах. Последние показатели, как правило, характерны для недавно появившихся элементов острого каплевидного псориаза и при обострении бляшечного псориаза.

Клетки «памяти» (CD45RO+), напротив, составляли доминирующую популяцию в периваскулярных инфильтратах практически у всех больных исследуемой группы, что вполне закономерно, поскольку, начиная с 7 дня после первичной презентации АГ, начинает формироваться клон лимфоцитов, осуществляющий иммунный ответ на повторное поступление антигена (Ярилин А.А., 1999). Таким образом, количественное снижение «наивных» лимфоцитов по мере развития заболевания, отражает динамику контакта с антигеном и предопределяет увеличение числа клеток памяти, предполагая их предварительный контакт с АГ посредством молекулы МНС - II класса в периферических лимфатических узлах, рекрутирование Т-клеток из кровотока и готовность к повторным контактам с экзогенными антигенами или перекрестной презентации.

Экспрессию рецептора CD68 обычно связывают с присутствием макрофагов, хотя эта молекулу можно обнаружить на моноцитах, гранулоцитах, базофилах и натуральных киллерах. Макрофаги принимают участие в индуктивной фазе ГЗТ, в результате чего Т-хелпер дифференцируется в Thl клетку, которая в эффекторной фазе, взаимодействуя с макрофагом, презентирующим АГ, активирует его через у- ИФН, в результате чего активированный макрофаг выделяет широкий спектр цитокинов, в значительной степени опосредующих проявление ГЗТ (Ярилин А.А., 1999). Анализ локализации и величины экспрессии в нашей выборке показывает, что в эпидермисе больных псориазом CD68+ клетки либо не выявляются, либо представлены единичными клетками, обычно в очагах миграции лейкоцитов (микроабсцессах Мунро). Возможно, функция присутствующих в эпидермисе макрофагов заключается в утилизации лейкоцитарного детрита, образующегося после гибели лейкоцитов. В периваскулярных инфильтратах количество CD68+ клеток существенно колеблется - от единичных клеток до 10- 25%. Увеличение количества CD68+ клеток, как правило, наблюдаются либо в свежих высыпаниях каплевидного псориаза, либо при бляшечном псориазе, осложненном артропатией. У 9 больных относительно высокое содержание CD68+ клеток коррелировало с повышенным содержанием Т-хелперов, что вполне может отражать факт повышения активности Thl- клеток в ответ на повторную антигенную стимуляцию.

CD83+ мембранная молекула из семейства иммуноглобулинов принимает участие в презентации АГ и экспрессируется на активированных В- и Т-клетках, а также на дендритных (вуалевых ) клетках. В нашем исследовании мы выявили этот маркер во всех 3 компартментах, но экспрессия его, особенно в эпидермисе, была низкой. В периваскулярных инфильтратах в основном при бляшечной и эритродермической форме псориаза меченые CD83+ клетки составляли примерно 3-5% популяции. Каплевидная форма характеризовались низкой экспрессией этого рецептора.

Экспрессия CD40+ молекулы костимуляции выявлена в жизнеспособных клетках эпидермиса с четкой отрицательной реакцией в зоне паракератоза. Уровень экспрессии рецептора в клетках периваскулярных инфильтратов сосудов поверхностного сплетения, ретикулярной дермы, интерстициальных клеток дермы колебался от субтотального у 10 из 21 пациентов, до снижения разной степени у остальных. При этом прослеживалась определенная тенденция снижения уровня экспрессии CD40+ рецептора при эритродермии, которая одновременно сопровождалась снижением экспрессии рецептора ИЛ2. Активированные CD4+T-лимфоциты вырабатывают ИФН-у и ФНО-а, которые индуцируют экспрессию кератиноцитами молекулы ICAM-1, принимающей совместно с молекулой LFA-1 в процессе взаимодействия лимфоцит -кератиноцит, последнее через взаимодействие CD40/CD40L ведет к торможению апоптоза кератиноцитов и выделению цитокинов, стимулирующих пролиферацию кератиноцитов и инфильтрацию лейкоцитов (Baker В.,1999).

Относительно высокое содержание рецептора ИЛ-2 в эпидермисе и высокое в клетках периваскулярных инфильтратов было характерно для большинства обследованных больных псориазом. Поскольку ИЛ2 способствует реализации функции Т-хелперов, усиливая выработку ИФН-у, снижение его рецепции косвенно может быть связано с понижением секреции этого цитокина, а в случаях длительно текущего процесса, например при эритродермии, возможно развитие иммунологической толерантности.

Для экспрессии рецептора HLA-DR у большинства больных псориазом были характерны особенности локализация: в эпидермисе в виде единичных и сгруппированных клеток на разных уровнях эпителиального пласта, в периваскулярных инфильтратах - в виде густых конгломератов по ходу сосудов. Пониженное содержание выявлено у 4 больных острым каплевидным псориазом, продолжительностью от 3 недель до 3 месяцев. Молекула главного комплекса гистосовместимости II класса может определяться на поверхности клеток разных гистологических типов: антигенпредставляющих клеток -дендритных, активированных макрофагов, В-лимфоцитов, активированных эндотелиальных клеток, эпителиальных и тучных клеток, Т-хелперов. В работе по исследованию динамики экспрессии CD8+, CD4+, CD8+HLA-DR+ Т-клеток при каплевидном псориазе (Valdimarsson Н. et al.) показан постепенный рост популяции CD8+HLA-DR+ клеток начиная с 8 недели от момента появления высыпаний с максимумом к 16 неделе, что клинически сопровождалось разрешением клинических признаков. Параллельно было отмечено выраженное снижение популяции Т-хелперов. Согласно данным В. Baker и соавт., в персистирующих бляшках выявляется приблизительно равное соотношение CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов с экспрессией маркера HLA-DR. Возможно, выявленная нами пониженная экспрессия HLA-DR+ клеток отчасти связана с подобным процессом,.

При определении показателя пролиферативной активности Ю67 нами выявлена положительная реакция в ядрах кератиноцитов 2-3 надбазальных слоев эпидермиса и наружной эпителиальной выстилки волосяных фолликулов. При этом какой-либо четкой корреляции с морфологическими проявлениями акантоза не отмечено. Среди клеток периваскулярных инфильтратов положительная реакция выявлялась на единичных клетках разного типа. При сравнении количества меченых клеток в эпидермисе у больных разными формами псориаза выявлена тенденция снижения этого показателя в последовательном ряду каплевидный псориаз - бляшечный псориаз -эритродермия. Наряду с низким количеством клеток лимфоидного типа, макрофагов, АПК, рецепторов цитокинов, это косвенным образом указывает на ослабление роли эпидермиса в качестве основной реактивной структуры, опосредующей развитие клеточной иммунной реакции по типу ГЗТ по мере «хронизации» псориатического процесса.

Нами был проведен сравнительный анализ количественных показателей различных субпопуляций клеток у больных псориазом в зависимости от давности заболевания, при всей условности подобной группировки. Общая группа пациентов была разделена на две подгруппы: давностью заболевания более 1 года и менее 1 года.

Вне зависимости от давности процесса во всех трех зонах отмечено статистически достоверное преобладание CD8+ цитотоксических лимфоцитов, наиболее выраженным оно было в эпидермисе недавно появившихся очагов.

Соотношение CD4/CD8 было резко снижено в эпидермисе, дермо-эпидермальной границе и дермальных инфильтратах вне зависимости от давности процесса.

Выявленное нами достоверное увеличение CD68+ клеток в эпидермисе очагов, существующих менее 1 года, мы не можем сравнивать с данными других авторов, поскольку в доступной нам литературе подобных сведений не обнаружили.

При сравнении различных по характеру очагов поражения у больных каплевидным, бляшечным и эритродермическим псориазом не было выявлено статистически достоверной разницы в количественном содержании исследуемых субпопуляций Т клеток.

Таким образом, анализ локализации и количества клеток, осуществляющих реакцию ГЗТ при разных клинических формах псориаза, показывает, что в целом имеет место стереотипное развитие процесса с некоторыми вариациями показателей, отражающими течение болезни у каждого конкретного пациента.

В доступной нам литературе мы не нашли сведений о фенотипической характеристике клеток воспалительного инфильтрата у больных красным волосяным лишаем Девержи. При иммуноморфологических исследованиях, проводимых при данной патологии, изучались в основном нарушения процессов кератинизации. В частности, в исследованиях З.В. Куклиной (1998) было показано наличие цитокератинов 14 и 17 в супрабазальной зоне эпидермиса, а также нарушение экспрессии кератинов б и 16. С помощью моноклональных антител D40-10 подтверждено наличие антигена кератогиалиновых гранул в очагах паракератоза. В исследованиях И.В. Завариной (2003) изучались особенности нарушения терминальной дифференцировки с применением моноклональных антител к цитокератинам 16 и 17 у взрослых и детей, страдающих красным волосяным лишаем Девержи. В исследованиях Komine М. (1994) установлено, что кератин 17 обнаруживается при заболеваниях, сопровождающихся гиперпролиферацией эпидермиса, в основе которых лежит иммунное воспаление по типу гиперчувствительности замедленного типа. Изучение иммунных нарушений при болезни Девержи по данным доступных нам литературных источников проводилось лишь в крови пациентов, путем определения различных субпоуляций иммунокомпетентных клеток.

Изменения, выявленные нами в биоптатах кожи больных красным волосяным лишаем Девержи, характеризовались повышенной экспрессией маркеров, принимающих участие в развитии воспалительной иммунной реакции по типу гиперчувствительности замедленного типа.

CD4+ Т-клетки чаще обнаруживались в эпидермисе у больных болезнью Девержи, чем у больных псориазом, особенно при недавно возникшем обострении. Такая локализация эффекторных клеток может свидетельствовать о возможности экзогенной антигенной стимуляции. Количество CD8+ цитотоксических лимфоцитов было приблизительно равно количеству CD4+ лимфоцитов.

Наивные» CD45RA+ лимфоциты обнаруживали в виде единичных клеток по ходу базальной мембраны, однако количество их в периваскулярных инфильтратах было несколько больше, чем при псориазе. Хотя CD45RO+ клетки «памяти» составляли доминирующую популяцию, количество их у больных болезнью Девержи было ниже, чем у больных псориазом. Такие различия в соотношении этих субпопуляций могут свидетельствовать о том, что антигенная стимуляция при псориазе выражена сильнее, либо о том, что контакт с антигенами происходит чаще, что находит отражение в более выраженной динамике нарастания популяции клеток, способных реагировать на повторное поступление антигена.

Количество CD68+ гистиоцитов в коже больных болезнью Девержи колебалось от единичных до 10-15%клеток, которые обнаруживались как в эпидермисе, так и в периваскулярных инфильтратах. Было выявлено преобладание количества CD68+ гистиоцитов в периваскулярных инфильтратах у больных красным волосяным лишаем Девержи по сравнению с таковым у больных псориазом. Учитывая участие CD68+ клеток в презентации антигенов и в активации эффекторных Т-хелперных клеток, можно таким образом предположить взаимосвязь увеличения количества СБ68+клеток и эффекторных CD4+ клеток у больных болезнью Девержи.

Экспрессия маркера активированных CD83+ антигенпрезентирующих клеток в коже больных болезнью Девержи была незначительной. Однако при сравнении этого показателя с изменениями больных псориазом в периваскулярных инфильтратах было обнаружено более высокое количество клеток этой субпопуляции.

Экспрессия рецептора костимулирующей молекулы CD40, как и у больных псориазом, выявлялась на жизнеспособных клетках эпидермиса и клетках периваскулярных инфильтратов и отсутствовала на клетках рогового и паракератотического слоев. Интенсивность экспрессии рецептора молекулы костимуляции у больных красным волосяным лишаем Девержи была менее выражена, чем у больных псориазом.

Анализ экспрессии рецептора к ИЛ-2 у больных красным волосяным лишаем Девержи выявил высокий ее уровень на клетках эпидермиса и периваскулярных инфильтратов. Цитокины, продуцируемые кератиноцитами и клетками воспаления, являются интегральной частью иммуноопосредованного каскада при развитии иммунного воспаления по механизму ГЗТ. Главным образом их роль состоит в привлечении, адгезии и продвижении лимфоцитов и других иммунокомпетентных клеток в процессе заболевания. Кроме того, кератиноциты, формально не относящиеся к иммунной системе, под влиянием активирующих воздействий, реализуемых с участием цитоконов, способны превращаться в активные иммуноциты. Поэтому их взаимодействие с различными ростовыми факторами обуславливает развитие таких феноменов как гиперпролиферация кератиноцитов, нарушение процессов их дифференцировки. Эти признаки не являются строго специфичными для какого-то определенного дерматоза и, по-видимому, их повышенная экспрессия является одинаково важным фактором иммунного процесса и при псориазе и при болезни Девержи.

При изучении локализации и количественной оценки экспрессии молекулы главного комплекса гистосовместимости (HLA-DR —II) в коже больных красным волосяным лишаем Девержи было установлено наличие этой молекулы в эпидермисе на поверхности единичных и сгруппированных клеток, располагающихся на разных уровнях эпителиального пласта.

Некоторые из клеток имели четко структурированные отростки различной длины. Экспрессию этой молекулы обнаруживали также на клетках периваскулярных инфильтратов по ходу сосудов верхних и средних отделов дермы. Выявленные изменения не носили принципиальных отличий от аналогичных изменений, обнаруженных у больных псориазом. При количественном анализе также не было выявлено достоверных различий.

При анализе показателя универсальной пролиферативной активности Ki67 положительная реакция обнаруживалась в базальном и 2-3 надбазальных слоях эпидермиса, а также эпителиальной выстилке волосяных фолликулов. Связи с морфологическими проявлениями акантоза и нарушениями дифференцировки кератиноцитов выявлено не было. Однако при морфометрическом подсчете меченых клеток обнаружено, что количество пролиферирующих кератиноцитов в коже больных псориазом было достоверно выше такового у больных красным волосяным лишаем Девержи.

Таким образом, повышение в коже больных псориазом и красным волосяным лишаем Девержи количества клеток, участвующих в реакциях гиперчувствительности замедленного типа позволяет отнести эти заболевания к дерматозам, которые характеризуются гиперпролиферацией кератиноцитов, опосредованной Т-клетками. Достоверные признаки, обнаруженные при данных заболеваниях указывают на однонаправленный характер иммунного воспаления при данных дерматозах. Общий патогенетический путь включает распознавание Т-клетками специфического антигена, что в конечном итоге через ряд промежуточных стадий приводит к гиперпролиферации кератиноцитов, которые, приобретая черты иммуноцитов, способствуют поддержанию патологического процесса. В литературе обсуждается несколько возможных факторов антигенной стимуляции, способных индуцировать развитие псориаза. При болезни Девержи вопрос о характере антигена(ов) остается открытым. Воспалительная реакция это динамичный процесс, начиная с фазы инициации и заканчивая фазой разрешения. Каждой фазе воспаления соответствует определенное соотношение клеточных элементов и уровень цитокинов, в результате чего определяется вектор процесса с положительным (переход в стадию ремиссии или разрешения) или отрицательным (переход в стадию обострения или хронизации) значением. Вероятно, основная проблема может заключаться в дизрегуляции кооперативного ответа основных фигурантов воспалительной реакции в силу дефекта регулирующих механизмов в том или ином звене. Это ведет к незавершенности воспалительной реакции, с формированием самоподдерживающегося аутокринного процесса, трудно поддающегося какой либо терапевтической коррекции. В результате чего по мере «хронизации» в процесс вовлекается весь кожный покров, клиническим эквивалентом чего является эритродермия.

Наряду с общими признаками патогенеза, можно отметить некоторые различия: в частности, в исследуемой группе было выявлено достоверное преобладание эффекторных CD4+ Т- клеток у больных болезнью Девержи. У больных псориазом, напротив, было обнаружено статистически значимое преобладание CD8+ супрессорно - цитотоксических клеток. Также были обнаружены различия в количестве «наивных» лимфоцитов и клеток «памяти».

Существующие современные методы лечения воспалительных дерматозов направлены на подавление иммунного воспаления в целом. Это подавление может быть опосредованное различными механизмами. Однако, по данным зарубежных авторов (Gudjonsson J.E., 2004), уже через несколько дней после отмены циклоспорина А или метотрексата в коже больных псориазом обнаруживаются активированные CD4+ и CD8+ лимфоциты. В отличие от лечения цитостатическими препаратами, ультрафиолетовое облучение нередко вызывает ремиссию в течение нескольких месяцев, что, вероятно, обусловлено апоптозом CD8+ активированных Т-клеток. Тем не менее, было показано, что уже в течение 2 недель после окончания УФ облучения, эпидермис пополняется активированными дендритными клетками, поступающими из кровеносного русла.

Полученные нами данные в результате использования иммуноморфологического исследования позволяют получить более широкую морфофункциональную характеристику патологического процесса и могут послужить основой для разработки более тонких и направленных методов терапевтической коррекции. Тем более что в последнее время наметилась явная тенденция к использованию препаратов направленного иммунного действия ( Курдина М.И., 2005; Singri Р., 2002; Mehlis S.L., 2003) Теоретически любой этап иммунного воспаления может явиться мишенью такой коррекции, начиная с презентации антигенов и Т-клеточной активации и заканчивая синтезом провоспалительных биологически активных субстанций. Одним из направлений разработки таких препаратов может явиться создание моноклональных антител к различным детерминантам иммунокомпетентных клеток (анти-СБ4-антитела и др.) и провоспалительным цитокинам. Таким образом, использование препаратов направленного иммунного действия может быть направлено на подавление эффекторных сигналов в различные фазы воспалительной реакции, способствуя тем самым, разрыву порочного круга иммунного воспаления.

90