Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Сравнительная характеристика мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, жировой ткани и плаценты человека

003493248

На правах рукописи

ПЕТРОВСКИЙ ЯРОСЛАВ ЛЕОНИДОВИЧ

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА, ЖИРОВОЙ ТКАНИ И ПЛАЦЕНТЫ ЧЕЛОВЕКА

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2009

003493248

Работа выполнена в Учреждении РАМН Научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Останин Александр Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Идова Галина Вениаминовна

кандидат медицинских наук Повещенко Ольга Владимировна

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (г. Москва)

Защита состоится «2009 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 001.001.01 НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан « Цг, ИлЛ^ Л 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Кудаева Ольга Тимофеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В связи с развитием клеточных подходов в регенеративной медицине все больший интерес привлекает возможность получения достаточного количества клеточного материала за счет экспансии клеток in vitro. В этих целях наиболее перспективными и востребованными признаются мезенхимальные стромальные клетки (МСК).

МСК относятся к классу соматических стволовых клеток, которые характеризуются способностью к самоподдержанию и дифференцировке в клетки тканей мезодермального происхождения [Caplan A.I., 1994]. В 2006 году Комитетом по стволовым клеткам Международного общества клеточной терапии была проведена согласительная конференция и определены «минимальные» критерии, специфичные для МСК: а) адгезия к пластику и фибробластоподобная морфология, б) характерный иммунофенотип (экспрессия CD73, CD90, CD 105 и отсутствие экспрессии CD34, CD45, HLA-DR) и в) способность дифференцироваться в остеогенном, адипогенном и хондрогенном направлении [Dominici M., 2006].

Кроме того, на различных экспериментальных моделях показана способность МСК дифференцироваться в клетки тканей экто- и эндодермального происхождения. Например, клетки нервной, мышечной тканей, а также эпителиальные клетки, что предполагает наличие у МСК потенциала плюрипотентных стволовых клеток [Barry F., 2001; Bianco P., 2001; Bruder S.P., 1997; Gronthos S., 2003; Pittenger M.F., 1999]. Не менее важной биологической особенностью МСК является их низкая иммуногенность, способность к миграции в очаг повреждения, гемопоэзстимулирующая и иммуномодулирующая активность, что позволяет рассматривать их, как потенциально активных индукторов/регуляторов репаративных процессов [Зубов Д.А., 2008; Шевцов В.И., 1999; Haynesworth S.E., 1996; Kim H.J., 1999]. Так, в настоящее время активно обсуждается возможность использования МСК с целью ускорения восстановления кроветворения и профилактики развития РТПХ при трансплантации стволовых кроветворных клеток пациентам с гемобластозами после высокодозовой химиотерапии [Ball L.M., 2008; Le Blanc К., 2006]. Разрабатываются новые подходы по использованию МСК для восстановления репаративного остеогенеза [Деев Р.В., 2004; Зорин B.JI., 2004; Шевцов В.И., 1999], а также в терапии ряда других патологий [Аскаров М.Б., 2009; Черных Е.Р., 2007].

Как правило, МСК выделяют из костного мозга, где они и были впервые идентифицированы Фриденштейном А.Я. с соавт. [Friedenstein A.J., 1976]. Однако получение аспирата костного мозга из крыла подвздошной кости представляет инвазивную и травматичную процедуру. Кроме того, показано, что с возрастом человека количество, дифференцировочный потенциал и жизнеспособность костномозговых мезенхимальных клеток резко снижается [Stolzing А., 2008]. В этой связи проводится поиск альтернативных источников получения МСК. Одним из таких источников может быть жировая ткань [Zuk P.A., 2002], другим - плацента [Fukuchi Y., 2004; Igura К., 2004]. Однако, морфо-функциональные характеристики жировых и плацентарных МСК, а также их иммунорегуляторные свойства в настоящее время изучены недостаточно полно.

Сравнительный анализ МСК различного тканевого происхождения имеет немаловажное теоретическое и практическое значение. С фундаментальной точки зрения важно понимать, имеются или нет какие-либо специфические отличия МСК в зависимости от их локализации в тех или иных тканевых нишах (например, в строме костного мозга или в жировой клетчатке), а также в зависимости от их принадлежности к развивающимся (плацента новорожденного) или зрелым, дефинитивным тканям (костный мозг, жировая ткань взрослого человека).

Результаты сравнительных исследований различных типов МСК могут иметь и практическую ценность, например, для оптимизации технологий трансплантации МСК. В

клинической практике наиболее безопасным считается использование аутологичного клеточного материала. Однако использование МСК в целях аутотрансплантации диктует необходимость предварительной оценки их функционального состояния. Очевидно, что эффективность лечения с использованием МСК во многом будет определяться их биологической активностью, которая, в свою очередь, может непосредственно зависеть от таких факторов, как источник их получения и особенности экспансии in vitro. Цель исследования. На основе анализа морфо-функциональных и иммунорегуляторных свойств фибробластоподобных клеток, выделенных из костного мозга, липоаспирата и плаценты человека, провести сравнительную характеристику мезенхимальных стромальных клеток различного тканевого происхождения. Задачи исследования.

1. Оценить фибробластоподобные клетки, выделенные из костного мозга, жировой и плацентарной ткани, с позиций требований Международного общества клеточной терапии (TSCT) на их соответствие критериям МСК.

2. Провести сравнительный анализ исходного содержания клоногенных прекурсоров МСК в исследуемых тканях, а также оценить пролиферативный и дифференцировочный (остеогенный) потенциал МСК.

3. Провести сравнительную оценку уровня конститутивной, спонтанной и ЛПС-индуцированной продукции биологически активных медиаторов (цитокинов, хемокинов, ростовых факторов, ММР-9 и TIMP-1) в цельных и стандартизированных культурах МСК различного тканевого происхождения.

4. Исследовать влияние МСК на пролиферацию активированных Т-лимфоцитов, стимулированных митогеном и аллоантигенами, а также изучить клеточно-молекулярные механизмы иммуносупрессорной активности МСК различного тканевого происхождения.

5. Провести сравнительный анализ гемопоэзстимулирующей активности МСК костного мозга, жировой и плацентарной ткани.

Научная новизна

Впервые установлено, что в жировой ткани количество клоногенных прекурсоров МСК достоверно выше, чем в костном мозге и плаценте. Вне зависимости от типа тканей показана способность МСК к самоподдержанию и активному клеточному росту. Впервые установлено, что в популяции плацентарных клеток в отличие от КМ- и Ж-МСК преобладают клетки с диаметром менее 20 мкм. При этом П-МСК характеризуются наиболее выраженным пролиферативным потенциалом, о чем свидетельствует количество клеток, генерируемых в первичных культурах, а также динамика удвоений клеточной популяции в процессе культивирования.

Впервые выявлено, что костномозговые МСК обладают более выраженным остеогенным потенциалом, чем П-МСК и, особенно, Ж-МСК. После культивирования в индукционной среде пик продукции депозитов кальция регистрируется в культурах КМ-МСК, в которых количество клеток в 2 и 8 раз меньше, чем в культурах П-МСК и Ж-МСК, соответственно.

На основе анализа конститутивной продукции 24 биологически активных медиаторов впервые показано, что МСК различного тканевого происхождения обладают функциональным потенциалом для поддержания кроветворения (через продукцию G-CSF, GM-CSF, эритропоэтина), иммуномодуляции (через продукцию IFN-y, IL-2, IL-6, IL-ip, TNF-a и хемокинов - IL-8, МСР-1, MIP-1P) и стимуляции репаративных процессов (через продукцию VEGF, FGF-basic, IGF-1, IL-6, TIMP-1/ММР-9). Впервые установлено, что по характеру и уровню спонтанной (базальной) продукции цитокинов Ж-МСК в большей степени проявляют провоспалительный (IL-ip, TNF-a), иммунорегуляторный (IFN-y, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, MCP-1, MIP-ip) и гемопоэзстимулирующий (G-CSF, GM-CSF) фенотип, но при этом характеризуются более низкой чувствительностью к ЛПС-стимуляции, чем КМ- и П-МСК.

Показано, что МСК исследуемых тканей обладают иммупосупрсссорной активностью, которая проявляется в ингибиции пролиферативного ответа активированных Т-лимфоцитов. При этом впервые установлено, что КМ-МСК отличаются наиболее выраженной супрессией в отношении Т-клеток, активированных анти-СОЗ-антителами, тогда как Ж- и П-МСК - в отношении Т-лимфоцитов, активированных аллоантигенами в CKJ1. При изучении клеточно-молекулярных механизмов анти-пролиферативного эффекта МСК получены новые данные о том, что иммуносупрессорная активность МСК сопряжена со снижением экспрессии на Т-клетках активационных молекул (CD25, HLA-DR), а также реализуется через продукцию растворимых изоформ HLA-G и простагландина Ег. Кроме того, действие МСК частично может опосредоваться через модуляцию функциональной активности дендритных клеток.

Показано, что как КМ-МСК, так и П-МСК и Ж-МСК характеризуются наличием гемопоэзстимулирующей активности, которая проявляется в их способности усиливать дифференцировку гемопоэтических клеток-предшественников в эритроидном и гранулоцитарно-макрофагальном направлении. Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая значимость работы заключается в получении новых сведений о морфо-функциональных свойствах мезенхимальных стромальных клеток в зависимости от локализации в различных тканевых нишах (костного мозга и жировой ткани), а также в зависимости от их принадлежности к развивающимся (плацента новорожденного) или зрелым, дефинитивным тканям (костный мозг, жировая ткань взрослого человека).

Практическая значимость работы заключается в разработке нового метода полуколичественной оценки интенсивности остеогенной дифференцировки МСК (Патент 2370771 РФ «Способ оценки остеогенного потенциала мезенхимальных стромальных клеток»). Предложенный метод может повысить эффективность использования МСК, например, в травматологии и ортопедии, поскольку позволяет определять наиболее оптимальные условия функционирования МСК в зависимости от типа тканевого источника, клеточной плотности МСК, кратности/длительности пассирования МСК in vitro, концентрации ростовых сывороточных факторов в микроокружеиии.

Результаты исследований по изучению костномозговых МСК были использованы при разработке новой медицинской технологии «Использование совместной трансплантации мезенхимальных стволовых стромальных клеток и стволовых кроветворных клеток при гемобластозах и аутоиммунных заболеваниях», зарегистрированной Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (ФС № 2008/014 от 30 января 2008 г).

Полученные данные, характеризующие функциональные свойства плацентарных МСК, а также разработанные протоколы по их выделению и количественной экспансии могут послужить основой для расширения сферы деятельности существующих Банков пуповинной крови.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Фибробластоподобные клетки, выделенные из костного мозга, жировой и плацентарной ткани, в целом соответствуют критериям мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, однако различаются между собой по уровню пролиферативной активности и по способности дифференцироваться в остеогенном направлении.

2. МСК, выделенные из костного мозга, жировой и плацентарной ткани, через продукцию растворимых факторов обладают функциональным потенциалом для поддержания кроветворения, иммуномодуляции и стимуляции репаративных процессов.

3. КМ-МСК, П-МСК и Ж-МСК оказывают анти-пролиферативный эффект на активированные Т-клетки, а также индуцируют дифференцировку стволовых

кроветворных клеток в эритроидном и гранулоцитарно-макрофагальном направлении. Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Всероссийских научно-практических конференциях «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2006; Омск, 2007; Томск, 2008); via XI и XIII Всероссийских научно-практических форумах «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007; 2009); на 3-ей Международной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2007); на II Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), а также на ежегодном конгрессе Европейской Группы по гематологии и трансплантации костного мозга - 34lh Annual Congress ЕВМТ (Florence, 2008). Апробация диссертации состоялась 5 ноября 2009 года на расширенном семинаре НИИ клинической иммунологии СО РАМН. Публикации.

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, а также получен 1 патент. Объем и структура диссертации:

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 109 страницах машинописного текста, включающего 21 таблицу и 13 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 177 литературных источников, в том числе, 164 иностранных.

Работа выполнена в лаборатории клеточной иммунотерапии НИИ КИ СО РАМН (зав. лабораторией - д.м.н., проф. Черных Е.Р.). Образцы тканей для получения МСК были любезно предоставлены д.м.н., проф. Добряковой О.Б. и к.м.н. Дробинской А.Н. Автор выражает искреннюю признательность научному руководителю д.м.н., проф. Останину A.A. Реализация диссертационной работы была бы невозможна без квалифицированной помощи и активного участия в моделировании экспериментов к.м.н. Шевела Е.Я., технической поддержки Сычёвой Н.В. и Салимовой Г.М., а также без всесторонней поддержки д.м.н., проф. Черных Е.Р. Всем им, а также многим другим сотрудникам НИИ клинической иммунологии СО РАМН автор выражает искреннюю признательность и благодарность.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Диссертационная работа основана на результатах исследования МСК, выделенных из костного мозга (п=30), жировой (п=41) и плацентарной ткани (п=31) человека.

Получение и культивирование мононуклеарных и ядросодержащих клеток

Костный мозг получали путём трепанобиопсии из крыла подвздошной кости. МНК выделяли страндартно центрифугированием на градиенте плотности фиколла-верографина. Определяли количество клеток и их жизнеспособность. Ткань плаценты получали после физиологических родов, при наличии информированного согласия матери. Ткань измельчали, отмывали в PBS от остатков крови и обрабатывали раствором 0,25% трипсина, 0,02% ЭДТА и 0,1% коллагеназы 1а типа (Sigma-Aldrich, США) в течение 40 минут. После отмывки полученные клетки ресуспендировали в среде а-МЕМ, подсчитывали количество и жизнеспособность ядросодержащих клеток. Жировую ткань получали в ходе операций эстетической хирургии, при наличии информированного согласия пациента. Липоаспираты отмывали в PBS и обрабатывали 0,1% раствором коллагеназы la (Sigma-Aldrich, США) в течение 40 минут. Полученную клеточную суспензию отмывали в PBS с удалением оставшихся фрагментов ткани. Клетки ресуспендировали в среде а-МЕМ, определяли их количество и жизнеспособность.

Для получения популяции МСК костномозговые МНК и ядросодержащие клетки жировой/плацентарной ткани культивировали в среде а-МЕМ («БиолоТ», С-Пб) с 20% FCS («БиолоТ», С-Пб) в СОг-инкубаторе. Через 24 ч неприкрепленные к пластику клетки удаляли, а фракцию адгезивных клеток культивировали до покрытия клетками 80-90% площади флакона. Отделение МСК от поверхности флакона при пассировании осуществляли посредством раствора 0,25% трипсина (Sigma-Aldrich, США) и 0,02% ЭДТА (ICN, США) в течение 10 минут. Исследовали МСК после 1-3 пассажей.

Исходное количество клоногенных прекурсоров МСК в исследуемых тканях определяли по числу фибробластных колониеобразующих единиц (КОЕ-Ф). Для этого 1x10" МНК костного мозга или ядросодержащих клеток жировой ткани/плаценты культивировали в чашках Петри (Nunclon, Дания) в среде аМЕМ с 20% FCS в течение 14 суток. По окончании культивирования клетки окрашивали по Романовскому-Гимза, затем подсчитывали число колоний, содержащих не менее 50 фибробластоподобных клеток.

Интенсивность деления МСК оценивали по времени достижения конфлюэнтного роста в первичных культурах (1-й пассаж) и по количеству генерированных «дочерних» клеток в пересчете на 1 КОЕ-Ф. Количество удвоений клеточной популяции оценивали по формуле logN/log2, где N - частное от деления количества клеток, полученных при первом пассаже, на исходное количество КОЕ-Ф.

Морфометрию МСК проводили в мазках, окрашенных азур-эозином, с использованием компьютеризированной видеосистемы со встроенным интерфейсом (MicroMed Images 1.0) с последующей оценкой характера распределения клеток по величине их диаметра в интервале <10 — >60 мкм с шагом 10 мкм.

Фенотипический анализ МСК проводили методом проточной цитофлюориметрии на лазерном клеточном анализаторе FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием FITC- или РЕ-меченных моноклональных анти-СОЗ, -CD14, -CD16, -CD20, - CD34, -CD73, -CD90, -CD 105, -HLA-DR антител.

Клеточный цикл и уровень апоптоза в популяции CD90+MCK оценивали методом проточной цитометрии с окрашиванием клеток пропидиум иодидом (Propidium iodide, Sigma-Aldrich).

Оценка остеогенной и адипогенной дифференцировки МСК.

МСК, полученные при первом пассаже, культивировали 24-48 ч, после чего в опытных образцах полностью заменяли культурапьную среду на индукционную, содержащую ß-глицерофосфат, дексаметазон и аскорбиновой кислоты-2-фосфат в случае остеогенной дифференцировки, либо дексаметазон, З-изобутил-1-метилксантин и индометацин в случае адипогенной. В контрольных культурах клетки культивировали в стандартной среде. Через 18 суток оценивали эффективность дифференцировки МСК с помощью окраски по von Kossa в первом случае и Oil Red О (Sigma-Aldrich, США) во втором. Маркером остеогенной дифференцировки являлась продукция кальций-содержащего матрикса, окрашиваемого нитратом серебра в черный цвет, адипогенной -появление в цитоплазме клеток липидных вакуолей, окрашиваемых в красный цвет.

Полуколичественный метод оценки остеогенного потенциала МСК

Для сравнительного анализа выраженности/интенсивности остеогенной дифференцировки МСК нами был разработан полуколичественный метод (Патент 2370771 РФ), основанный на измерении оптической плотности культур МСК в заданном диапазоне 2-х кратно возрастающих клеточных концентраций после их культивирования в остеогенной индукционной среде и окрашивания депозитов кальция по von Kossa. МСК помещали в лунки 96-луночного плоскодонного планшета в 2-кратно возрастающей концентрации от 625 до 10 000 клеток/лунку. Через 48 ч в культуральную среду в опытных образцах полностью заменяли на индукционную остеогенную среду. Через 18 сут оценивали эффективность дифференцировки, окрашивая культуры клеток по von Kossa. Интенсивность цветовой реакции оценивали на фотометре Multiskan Ascent (Thermo Electron Corp., Финляндия) при длине волны 492 нм. Интенсивность

дифференцировки выражали в виде Индекса Остеогенной Дифференцировки (отношение оптической плотности в опытных образцах к таковой в контрольных).

Исследование функциональной активности МСК.

Спектр и концентрацию секретируемых биологических медиаторов изучали в супернатантах МСК, полученных в стандартизованных условиях культивирования (50х103 МСК/лунку; 48 ч). Оценивали уровень спонтанной и ЛПС-стимулированной продукции медиаторов (липополисахарид E.coli в дозе 10 мкг/мл; Sigma-Aldrich, США).

Определение концентраций цитокинов проводили на анализаторе BioPlex Protein Assay System (BioRad, США) с использованием набора Human Cytokine 17-Р1ех Panel (IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, IFN-7, MCP-1 (MCAF), MIP-lß, TNF-a). Методом ИФА оценивали содержание эритропоэтина (Pro-Con EPO-HS, Протеиновый контур, Россия), инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1, Diagnostic System Laboratories, США), основного фактора роста фибробластов (Human FGF basic, Biosource, Бельгия), эпидермального ростового фактора (Pro-Con EGF, Протеиновый контур, Россия), сосудисто-эндотелиального фактора роста (Human VEGF Immunoassay Kit, Invitrogen, США), матричной металлопротеиназы-9 (Human ММР-9, R&D Systems, США) и тканевого ингибитора металлопротеиназ-1 (Human TIMP-1 Immunoassay Kit, Biosource, Бельгия).

Влияние МСК на пролиферативный ответ активированных Т-клеток оценивали в анти-СОЗ-стимулированных культурах МНК и двунаправленной смешанной культуре лимфоцитов (CKJI). МСК культивировали в течение 24 ч в питательной среде в плоскодонных 96-луночных планшетах. После этого к моносолою МСК добавляли МНК здоровых доноров в различных соотношениях. В случае двунаправленной СКЛ в лунки вносили по 0,1x106 МНК от двух доноров и культивировали в течение 5 сут в среде RPMI-1640 с 10% FCS. Митоген-индуцированный пролиферативный ответ оценивали в 3-суточных культурах МНК доноров, активированных анти-СОЗ моноклональными антителами ICO-90 (анти-СОЗ, «Медбиоспектр», Москва) в концентрации 1 мкг/мл. Интенсивность пролиферации оценивали по включению 3Н-тимидина. Контролем служил уровень пролиферативного ответа МНК в отсутствии МСК.

Для изучения роли простагландинов и индоламин-2,3-диоксигеназы (ИДО) в реализации иммуносупрессорной активности МСК использовали индометацин (ингибитор секреции простагландинов), и ингибитор ИДО - 1-метилтриптофан (1-МТ). В экспериментах по изучению влияния МСК на пролиферацию Т-клеток в анти-СОЗ-стимулированных культурах и в СКЛ, дополнительно оценивали эффект предобработки МСК (45 мин, 37°С) индометацином (100 мкг/мл) и 1 -МТ (500 мМ).

Для изучения возможной роли растворимых молекул HLA-G в реализации иммуносупрессорной активности МСК определили уровень продукции HLA-G в супернатантах цельных культур МСК на этапе их конфлюэнтного роста методом ИФА (sHLA-G ELISA, Exbio, Чехия).

Для оценки влияния МСК на экспрессию активационных молекул на Т-лимфоцитах МНК доноров помещали на монослой МСК (в соотношении МНК:МСК=10:1) в RPMI-1640 с 10% FCS, и стимулировали моноклональными анти-СОЗ-антителами (1 мкг/мл). Через 72 ч собирали неприкрепленные к пластику клетки, и методом проточной цитометрии оценивали относительное количество CD25+ и HLA-DR+ клеток в лимфоцитарном гейте. Контролем служили анти-СОЗ-стимулированные МНК, культивированные в отсутствии МСК.

Для оценки влияния МСК на аллостимуляторную активность ДК, последние генерировали из прилипающей к пластику фракции МНК здоровых доноров по «интерфероновому» протоколу. Моноциты выделяли путем прилипания к пластику МНК. Полученные моноциты культивировали в RPMI-1640 с 10% FCS, дополненной GM-CSF (Sigma, США) и IFN-a (Роферон-А, Roche, Швейцария). Через 48 ч отлипшие от пластика предшественники ДК переносили на монослой МСК в соотношении 1:1. Через 48 ч

индуцировали конечное дозревание ДК с помощью ЛПС (10 мкг/мл, LPS E.coli 0114:В4, Sigma, США). Через 24 ч получали популяцию ДК, аллостимуляторную активность которых оценивали в СКЛ при сокультивировании с МНК доноров в соотношении 1:10. Ин тенсивность пролиферации МНК оценивали на 5 сут по включению 3Н-тимидина.

Влияние МСК на колониеобразующую активность гемопоэтических предшественников оценивали по количеству эритроидных, гранулоцитарно-макрофагальных и смешанных колоний, полученных в результате 14-дневного культивирования МНК костного мозга в отсутствие/присутствии МСК (1:1 и 1:10) в полужидкой метилцеллюлозной среде MethoCult (Stem Cell Technologies, Канада).

Математическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы «STATISTICA 8.0».

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка фибробластоподобных клеток, выделенных из костного мозга, жировой и плацентарной ткани, в соответствии с требованиями Международного общества по клеточной терапии (ISCT, 2006)

Сравнительная характеристика клеток, выделенных из различных тканей, на их соответствие минимальным критериям МСК показала, что вне зависимости от источника тканей исследуемые клетки отличались адгезивностью, имели фибробластоподобную морфологию (рис. 1), были способны к количественной экспансии in vitro, в результате которой образовывали достаточно однородную популяцию клеток, экспрессирующих МСК-специфичные маркеры (CD73, CD90, CD105) (рис. 2), а также были способны к билинейной (остео-адипогенной) дифференцировке (рис. 3 и 4).

'4Ju!eLk*V\

Рис. 1. Фибробластоподобные адгезивные клетки (на примере костномозговых клеток) Окраска по Романовскому-Гимза; увеличение х250 (1) и Х1250 (2).

100 80 60 40 20 О

■ КМ-МСК

зп-мск

■ ж-мск

ш те .ш

CD86 HLA-DR CD73 CD90

Рис 2. Фенотипическая характеристика фибробластоподобных клеток Представлено относительное содержание клеток, экспрессирующих соответствующие маркеры, в популяции фибробластоподобных клеток, выделенных из костного мозга (КМ-ФПК), плацентарной и жировой ткани (П-ФПК и Ж-ФПК, соответственно).

чу.

дг;

ад

KdtHXponw.-; v~ * Ч 1

Рис. 3. Остеогенная дифференцировка. Окраска матрикса по Ван Коса.

Ж*

bftja

Рис. 4. Адипогенная дифференцировка. Окраска липидных вакуолей Oil Red О.

Наличие вышеперечисленных свойств у фибробластоподобных клеток, выделенных нами из исследуемых тканей, подтверждает их принадлежность к классу мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.

Морфо-функциопалъпая характеристика МСК.

Анализ исходного количества прекурсоров МСК показал, что в костном мозге количество КОЕ-Ф составляло в среднем 27 колоний на 106 МНК. Количество КОЕ-Ф в плацентарной ткани было сопоставимым, а в жировой ткани - в 2,5 раза выше (табл. 1).

Табл. 1. Количество клоногенных прекурсоров МСК в различных тканях

Источник тканей N Количество КОЕ-Ф /106 исходных клеток

М ± S.E. (медиана; квартальный диапазон)

костный мозг 14 27 ±5 (22; 14-37)

плацента 18 32 ±6 (31; 9-48)

жировая ткань 7 78 ± 17 (100; 28- 100) **

Примечание: ** - р<0,01; достоверность различий по сравнению с оппозитными подгруппами (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни)

Тем не менее, клетки всех тканей были способны к интенсивному делению (табл. 2). Так, конфлюэнтный рост костномозговых и жировых МСК наблюдался в среднем через 14-16 сут. За этот временной интервал происходило около 11 удвоений клеточной популяции, в результате чего из одной КОЕ-Ф образовывалось около 2 тысяч «дочерних» клеток. МСК плаценты достигали субслияния за более короткий период времени (12 сут.), и генерировали в 2 раза больше клеток-потомков, что свидетельствует об их более выраженном пролиферативном потенциале.

Табл. 2. Пролиферативная активность МСК

Показатель МСК, полученные в первичных культурах

КМ-МСК (п=14) Ж-МСК (п=9) П-МСК (п=14)

Время до субслияния (сут) 15,6 + 0,9 (16) 14 ±2 (14) 13,5+0,9 (12) *

Выход МСК на 1 КОЕ-Ф 4996+1498 (2414) 2004±231 (2125) 825012190 (4591 )*#

Количество удвоений клеточной популяции 11,6 + 0,4(11) 11,7 + 0,8(11) 12,310,5(12)

Г

Примечание: данные представлены в виде М ± S.E. (Median) * - р<0,05, достоверность различий по сравнению с костным мозгом; # - р<0,05, достоверность различий по сравнению с жировой тканью (критерий Вилкоксона-Маннз-Уитни)

Исследование фаз клеточного цикла в популяции С090-позитивных МСК показало, что в первичных культурах большинство клеток костного мозга или плаценты, находится в состоянии покоя. Среди жировых МСК покоящихся клеток было достоверно меньше, и обнаруживалась тенденция к увеличению числа циклирующих клеток (рис. 5).

г

<20

20-30 >30

диаметр клеток

Рис. 5. Распределение МСК по фазам клеточного цикла.

Рис. 6. Распределение МСК по диаметру клеток.

* - р<0,05 по сравнению с КМ-МСК (критерий Вилкоксона-Мана-Уитни)

Известно, что наибольшей способностью к самоподдержанию обладают МСК размером около 10 мкм [Sekiya I., 2002]. Морфометрическая оценка показала, что в первичных культурах популяция МСК гетерогенна. При этом среди КМ- и Ж-МСК относительно мелкие клетки (менее 20 мкм) составляли около 30%. В то же время, среди П-МСК отмечалось самое низкое содержание клеток диаметром более 30 мкм, тогда как количество мелких клеток было в 1,5 раза выше (рис. 6).

П-МСК, содержащие наибольшее количество (почти 50%) относительно мелких клеток, были способны совершить 33 удвоения клеточной популяции к 90 дню культивирования. В то время как МСК жировой ткани, среди которых доля мелких клеток составляла около 30%, такого же количества удвоений достигали лишь к 130 суткам. По-видимому, более высокий пролиферативный потенциал П-МСК связан с общей биологией фетальных клеток, имеющих в отличие от стволовых клеток взрослого человека большую длину теломер, и отличающихся более высокой способностью к самоподдержанию. В целом наши данные показывают, что МСК, особенно П-МСК, могут быть получены in vitro в достаточно больших количествах.

Для того, что провести сравнительное исследование остеогенного потенциала различных типов МСК нами был разработан новый метод полуколичественной оценки (см. Материалы и методы). Из данных рисунка 7 видно, что КМ-МСК наиболее эффективно дифференцировались в остеогенном направлении при концентрации 1250 клеток/лунку. Именно в этих культурах отмечался пик продукции депозитов кальция и максимальные значения оптической плотности (ИОД = 1,63 расч.ед.). В то же время, П-МСК и, особенно, Ж-МСК дифференцировались при более высоких клеточных концентрациях (2500 и 10000 клеток/лунку, соответственно). Таким образом, костномозговые МСК обладают более выраженным остеогенным потенциалом.

| 0.8

1250 2500 5000

количество клеток на лунку

Рис. 7. Индекс остеогенной дифференцировки КМ-, П- и Ж-МСК

Задачей следующего этапа работы стало определение цитокинового профиля МСК. Для этого была проведена серия экспериментов, в которой культуры МСК были стандартизованы по количеству клеток-продуцентов (50x103 МСК/лунку) и длительности культивирования (в течение 48 ч).

Из данных рисунка 8 видно, что МСК различного тканевого происхождения (п=10) спонтанно продуцируют ШЫ-у, 1Ь-6, хемокины - 1Ь-8 и МСР-1, а также некоторые ростовые факторы - РСР-Ьаэю, в-СЭР, УЕОР и ЮР-1 на достаточно высоком уровне (сотни и тысячи пг/мл).

Th1 / провоспалительные

Th2 / противовоспалительные

IL-17 IL-12 TNF-a IL-1b IL-2 IFN-y

EGF FGF-basic 1GF-1 VEGF ЕРО(мМЕ/мл} GM-CSF G-CSF IL-7

Ш 2

IL-6 IL-13 IL-10 IL-5 IL-4

I 3,3

1000

Ростовые факторы

100 Хемокины

• _

1

1........ 1

1 1 )

1 SS 2

.. . til 3,3

I

MIP-1b вшшишмяа ¡1

мср-1 954

- |

JL-8

-1-1-1-

10

1000 10000

Рис. 8. Спонтанная продукция цитокинов в культурах МСК (п=10) (представлены медианные значения, пг/мл).

По сравнению с КМ-МСК плацентарные МСК спонтанно продуцировали достоверно более высокие уровни 1L-8, но отличались более низкой продукцией VEGF, IGF-1 и М1Р-1Ь (рис, 9). Наибольшие различия были выявлены для МСК жировой ткани. Как и П-МСК они отличались от КМ-МСК повышенной спонтанной продукцией IL-8, при этом продукция М1Р-1Ь и VEGF у них не была снижена. Кроме того, Ж-МСК в отличие от костномозговых и плацентарных МСК более активно секретировали IFN-y, IL-2, IL-lb, TNF-a, IL-4, IL-6, G-CSF, GM-CSF и все хемокины. Таким образом, по характеру и уровню базальной продукции цитокинов МСК, выделенные из жировой ткани, в большей степени проявляют провоспалительный, иммунорегуляторный и гемопоэзстимулирующий фенотип.

Поскольку известно, что МСК экспрессируют toll-like рецепторы, в том числе TLR-4 [Pevsner-Fischer М., 2007], нами была исследована также ЛПС-стимулированная продукция цитокинов. Из рис. 10 видно, что КМ- и П-МСК характеризуются высокой ЛПС-реактивностью, поскольку в митоген-стимулированных культурах активно продуцировали (ИВлпе ^ 3,0) Thl/провоспалительные (IFN-y, IL-1J3, TNF-a, IL-17) и Th2 цитокины (IL-4, IL-6), все хемокины (IL-8, МСР-1, М1Р1-|3), а также ростовые факторы гемоиммунопоэза (G-CSF и GM-CSF).

|РМ.у

РМ-у

----км-мск

- п-мск

- ж-мск

У8. КМ-МСК: I 11--13, 1и-8; 1 УЕвР, ГОРИ, М1Р-1Ь

Рис. 9. Спонтанная продукция цитокинов (пг/мл) в культурах МСК КМ-МСК (п=3); П-МСК (п=3); Ж-МСК (п=4) * ри<0,05 уэ КМ-МСК; # ри <0,05 ув П-МСК

Ж-МСК характеризовались более низкой чувствительностью к ЛПС-стимуляции, однако и у них в ответ на ЛПС интенсивность продукции цитокинов возрастала, но только в меньшей степени. Полученные нами данные свидетельствуют, что функциональный потенциал МСК, который реализуется через продукцию широкого спектра цитокинов, может играть значительную роль в регуляции репаративных процессов не только в физиологических условиях, но и при различных повреждающих воздействиях, например в рамках иммунного ответа на бактериальные инфекции.

ТЫ / провоспалительные Т(12/противовоспалительные

1 10 Ростовые факторы

&СБР

М1Р-1Ь МСР-1 11.-8

- — ~

■мне

•тт $

Рис. 10. Индексы влияния ЛПС на продукцию цитокинов КМ-, П- и Ж-МСК. Цаетовая кодировка и обозначение статистически достоверных различий соответствуют рис. 9.

тда-а* #

11.-17 #

у». КМ-МСК: | И.-«. У5. П-МСК: | 11.-6. М|Р-1Ь.

у*. КМ-» П-МСК | !РЧ-у, 1Ь2. |и-1Ь, ТЫР-э, 11.-4, ОМ-СБР, 11.-8, МСР-1.

Целью завершающего этапа работы стал сравнительный анализ и изучение клеточно-молекулярных механизмов иммуносупрессорной активности МСК, а также исследование их способности к поддержанию кроветворения.

В целом по группе МСК дозозависимо подавляли пролиферацию Т-кпеток, активированных анти-СБЗ-анителами. Максимальный ингибиторный эффект наблюдался при соотношении МСК:МНК, равном 1:1 (уровень супрессии 62,1±6,2%; п=29). Тем не менее, и при меньших концентрациях МСК (1:2 и 1:4) их супрессорная активность сохранялась на достаточно высоком уровне (48,8±6,5% п=29 и 30±5,6% п=18, соответственно). В данной экспериментальной модели КМ-МСК отличались наиболее выраженным эффектом (рис. 11), и подавляли пролиферацию Т-клеток в различных соотношениях в среднем на 50-65%. Анти-пролиферативная активность П- и Ж-МСК в соотношении 1:1 была сопоставимой, однако при уменьшении числа МСК отмечалось достоверное ослабление их иммуносупрессорного потенциала в среднем до 20-30%.

100 80 60 40 20 0

КМ-МСК - - п-мск -*—Ж-МСК

1:1 1:2 1:4

соотношение МСК:МНК

-»-КМ-МСК - -■- - П-МСК

100

■*— ж-мск

1:1 1:2 1.4

соотношение МСК:МНК

ж 80

I 60

I 40

* 20

Рис. 11. Супрессорный эффект КМ-МСК Рис. 12. Супрессорный эффект КМ-МСК (П=5), П-МСК (п=16) и Ж-МСК (п=8) в (п=13), П-МСК (п=4) и Ж-МСК (п=6) в

анти-СОЗ-стимулированных культурах двунаправленной СКЛ

* ри <0,05 га КМ-МСК

Анти-пролиферативный эффект МСК регистрировался также в отношении Т-лимфоцитов, активированных аллоантигенами в модели двунаправленной СКЛ. Но в этом случае, Ж- и П-МСК в соотношении 1:1 и 1:2 проявляли более выраженный супрессорный эффект, чем КМ-МСК. При этом различия жировых клеток были статистически значимы, а плацентарных - из-за малого количества наблюдений имели характер отчетливой тенденции (рис. 12).

Влияние МСК на экспрессию CD25 (п=17)

80 * 60 £ 40 S 20 0

контроль aCD3 МСК в целом

0

контроль aCD3 МСК в целом

Влияние МСК на экспрессию HLA DR (п=19)

Рис. 13. Влияние МСК на экспрессию CD25 и HLA-DR антигенов на активированных Т-

лимфоцитах

МНК доноров (106/лунку) стимулировали в течение 72 ч анти-СОЗ-антителами в присутствии/отсутствии МСК (МСК:МНК=1;10). По окончании культивирования определяли относительное содержание активированных CD25+ и HLA-DR+ клеток среди СОЗ'Т-лимфоцитов. * - Ри < 0,05 и " - ри < 0,01 - достоверность различия показателей по сравнению с контролем.

Индукция анергии Т-клеток могла быть одним из возможных механизмов иммуносупрессорного эффекта МСК [01епше Б., е( а1. 2005]. Действительно, анализ экспрессии на Т-лимфоцитах активационных молекул показал, что среди анти-СОЗ-стимулированных МНК, сокультивированных с МСК в соотношении 10:1, количество СР25 и НЬЛ-ЭЯ-позитивных Т-клеток снижается в 1,5-2 раза (рис. 13). При этом МСК различного тканевого происхождения не различались между собой по выраженности этого эффекта.

Иммуносупрессорная активность МСК могла быть связана не только с индукцией анергии Т-клеток, но и с участием каких-то других молекулярных механизмов. Так, анализ продукции растворимых изоформ Н1.А-0, которые по данным литературы характеризуются различными иммуносупрессорными эффектами [Коиа5-Рге158 К, 1997], показал, что МСК продуцируют НЬА-С на хорошо детектируемом уровне (рис. ¡4). КМ- и П-МСК были сопоставимы между собой, тогда как Ж-МСК, которые проявляли наиболее выраженную иммуносупрессию в двунаправленной СКЛ, характеризовались более чем 2-кратным увеличением уровня секреции растворимых изоформ НЬА-О.

60 с 40

ш

2 20

23 32 *#

13,4 14,5 Ш

| шш ■

Общая КМ-МСК П-МСК Ж-МСК группа

Рис. 14. Концентрация эНЬЛ-й 1/5 в супернатантах цельных культур МСК * ри<0,05 УЭ КМ-МСК; # ри <0,05 ув П-МСК

Для того, чтобы оценить возможное участие простагландина Е2 и фермента индоламин-2,3-диоксигеназы в анти-пролиферативных эффектах МСК были использованы агенты, ингибирующие синтез этих медиаторов - индометацин и 1-метилтриптофан - конкурентный ингибитор ИДО. Из данных рис. 15 и 16 видно, что 45-минутная предобработка МСК индометацином приводила к статистически достоверному 2-3-кратному ослаблению их анти-пролиферативной активности как в анти-СЭЗ-стимулированных культурах, так и в двунаправленной СКЛ. В то же иремя, аналогичная обработка МСК метилтриптофаном значимо не влияла на их супрессорный потенциал.

3 контроль МНК+МСК

1-метилтриптофан

п-мск ж-мск

Рис. 16. Влияние индометацина и I -метилтриптофана на супрессорную активность МСК в СКЛ.

Рис. 15. Влияние индометацина и 1-метилтриптофана на супрессорную активность МСК в анти-СОЗ-стимулированных культурах. Представлены средние (М ± 5.Е.) значения МСК-опосредованной супрессии {МНК:МСК=1:1). * Ри <0,05 ** Ри<0,01-достоверность различий с контролем. В целом, наши данные показывают, что МСК различного тканевого происхождения характеризуются иммуносупрессорной активностью, которая частично опосредуется через

механизмы, связанные с синтезом простагландинов, но не с экспрессией индоламин-2,3-диоксигеназы.

Оценка влияния МСК на созревание и функциональную активность дендритных клеток показала, что негативный эффект МСК на аплостимуляторную активность ДК в СКЛ регистрируется в ! из 4 случаев для тестированных образцов П-МСК (в 25%), в 2 из 5 (в 40%) случаев для КМ-МСК и в 5 из 6 (83%) случаев для Ж-МСК. В остальных случаях (в 60% - КМ-МСК; в 75% - П-МСК и в 17% - ЖМСК) МСК повышали аллостимуляторную активность ДК. Таким образом, МСК, выделенные из различных тканей могут разнонаправлено (позитивно и негативно) влиять на функциональную активность ДК. Ж-МСК чаще проявляли негативный эффект на ДК, что согласуется с нашими данными об их наиболее выраженной супрессорной активности в СКЛ. Не исключено, что одним из механизмов снижения Т-клеточного пролиферативного ответа в этих условиях может являться МСК-опосредованное нарушение функции антиген-презентирующих клеток.

контроль МНК + МСК

Рис. 17. Влияние МСК на образование Рис. 18. Влияние МСК на образование эритроидных колоний. гранулоцитарно-макрофагальных колоний.

* р < 0,05 - достоверность различия по сравнению с контролем (критерий Викоксона-Манна-Уитни). 1

В завершении исследовали гемопоэзстимулирующую активность МСК. Было выявлено, что МСК, выделенные из различных тканей, стимулируют образование эритроидных (рис. 17) и гранулоцитарно-макрофагальных (рис. 18) колоний в культурах МНК костного мозга. При соотношении 1:1 количество КОЕ-Э и КОЕ-ГМ в целом по группе возрастало примерно в 3-4 раза. Но даже в присутствии более низких концентраций МСК (1:10) колониеобразование сохранялось на достаточно высоком [ уровне, достоверно превышающем контрольные значения. Гемопоэзстимулирующая I активность МСК была в равной степени характерна для всех типов МСК, которые по степени выраженности данной биологической активности не различались между собой.

Таким образом, можно заключить, что МСК различного тканевого происхождения f эффективно стимулируют дифференцировку кроветворных клеток-предшественников, но отличаются по уровню анти-пролиферативной активности в отношении Т-клеток, активированных митогеном (анти-СРЗ-антителами) или аплоантигенами. В основе имуносупрессорного эффекта МСК лежат комплексные механизмы. Определенную (но не исключительную) роль в МСК-опосредованной иммуносупрессии играет индукция анергии Т-клеток, которая сопровождается снижением экспрессии на них активационных молекул (CD25, HLA-DR), а также способность МСК продуцировать растворимые изоформы HLA-G и простагландин Ег, а также, возможно, другие иммуносупрессорные медиаторы и цитокины (TGF-p, HGF, IL1-RA). Кроме того, действие МСК, очевидно, может опосредоваться через модуляцию функциональной активности антиген-презентирующих клеток (ДК), или, например, через генерацию супрессорных регуляторных Т-клеток. |

ЙМСК:МНК 1:1

'I 800 i:

| 600

§ 400 Й

J 200

контроль МНК

SMCK-.MHK 1:10

выводы

1. МСК, выделенные из костного мозга (КМ-МСК), жировой (Ж-МСК) и плацентарной ткани (П-МСК), различаются по уровню пролиферативной активности. По сравнению с КМ- и Ж-МСК плацентарные МСК, содержащие в 1,5 раза больше клеток с диаметром <20 мкм, характеризуются наиболее выраженным пролиферативным потенциалом, о чем свидетельствует 2-кратное увеличение числа «дочерних» клеток, образующихся из 1 клоногенного прекурсора (КОЕ-Ф), а также более короткий период времени, необходимого для достижения клеточного монослоя.

2. Костномозговые МСК отличаются от П-МСК и, особенно, Ж-МСК более выраженным остеогенным потенциалом. Пик продукции депозитов кальция регистрируется в индуцированных культурах КМ-МСК в дозе 1250 клеток/лунку, тогда как в культурах П-МСК и Ж-МСК максимальная минерализация внеклеточного матрикса отмечается при концентрациях 2500 и 10000 клеток/лунку.

3. МСК различного тканевого происхождения обладают функциональным потенциалом для поддержания кроветворения (через продукцию G-CSF, GM-CSF, ЕРО), иммуномодуляции (через продукцию IFN-y, IL-2, IL-б, IL-lb, TNF-a и хемокинов - IL-8, МСР-1, М1Р-1Ь) и стимуляции репаративных процессов (через продукцию VEGF, FGF-basic, IGF-l, IL-6, ММР-9, TIMP-1).

4. По уровню спонтанной (базальной) продукции цитокинов Ж-МСК в большей степени проявляют провоспалительный (IL-lb, TNF-a), иммунорегуляторный (IFN-y, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, MCP-1, MlP-lb) и гемопоэзстимулирующий (G-CSF, GM-CSF) фенотип, но при этом характеризуются более низкой чувствительностью к ЛПС-стимуляции, чем КМ- и П-МСК.

5. МСК обладают иммуносупрессорной активностью, которая проявляется в ингибиции пролиферации активированных Т-лимфоцитов. При этом, КМ-МСК отличаются наиболее выраженной супрессией в отношении Т-кпеток, активированных анти-СОЗ-антителами, тогда как Ж- и П-МСК - в отношении Т-лимфоцитов, активированных аллоантигенами в CKЛ.

6. Иммуносупрессорная активность МСК сопряжена со снижением экспрессии на Т-клетках активационных молекул (CD25, HLA-DR), а также реализуется через продукцию sHLA-G и PGE2. Анти-пролиферативный эффект МСК может также частично опосредоваться через модуляцию функциональной активности дендритных клеток.

7. МСК независимо от источника тканевого происхождения характеризуются наличием гемопоэзстимулирующей активности, которая проявляется в их способности усиливать дифференцировку стволовых кроветворных клеток в эритроидном и гранулоцитарно-макрофагальном направлении.

Список статей, опубликованных по теме диссертации.

1. Петровский Я.Л.. Шевела Е.Я., Меняева Е.В., Останин A.A., Черных Е.Р. Морфо-функциональная характеристика стволовых клеток костного мозга в норме и при патологии // Материалы конференции «Дни иммунологии в Сибири» 20-21 сентября, Красноярск, 2006.-С. 27-28.

2. Петровский Я.Л.. Шевела Е.Я., Курганова Е.В., Тихонова М.А., Кулагин А.Д., Лисуков И.А., Черных Е.Р., Останин A.A. Характеристика мезенхимальных стволовых клеток костного мозга у больных гемобластозами // Материалы XI Всероссийского научного форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге».- Мед. иммунология.- 2007,- Т. 9, №2/3,- С. 283-284.

3. Черных Е.Р., Останин А.А., Леплина О.Ю., Шевела Е.Я., Курганова Е.В., Петровский Я.Л., Старостина Н.М., Ступак В.В., Сизиков М.Ю., Кривошапкин А.Л., Лантух В.В., Козлов В.А. Технологии с использованием стволовых клеток в регенеративной медицине. // Материалы 3-ей международной конференции «Фундаментальные науки

- медицине» (Новосибирск - 2007). - С. 83.

4. Шевела Е.Я., Тихонова М.А., Курганова Е.В., Петровский Я.Л.. Кулагин А.Д., Сергеевичева В.В., Лисуков И.А., Селихова Ю.Б., Останин А.А., Черных Е.Р. Характеристика мезенхимальных стромальных клеток костного мозга в норме и при патологии. // Материалы 3-ей международной конференции «Фундаментальные науки

- медицине» (Новосибирск - 2007). - С. 87.

5. Петровский Я.Л.. Шевела Е.Я., Курганова Е.В., Тихонова М.А., Леплина О.Ю., Черных Е.Р., Останин А.А. Морфофункциональная характеристика мезенхимальных стромальных клеток человека, полученных из различных тканей // Материалы конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Омск, 2007).- Омский научный вестник.-2007,- №3 (61), прил. 2,- С. 39-42.

6. Шевела Е.Я., Петровский Я.Л.. Курганова Е.В., Тихонова М.А., Сахно Л.В., Сергеевичева В.В., Кулагин А.Д., Лисуков И.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Характеристика мезенхимальных стромальных клеток костного мозга у больных гемобластозами // Гематология и трансфузиология,- 2008.- Т. 53, № 2,- С. 32-38.

7. Останин А.А., Петровский Я.Л.. Шевела Е.Я., Курганова Е.В., Дробинская А.Н., Добрякова О.Б., Лисукова Е.В., Черных Е.Р. Новый подход к оценке остеогенного потенциала мезенхимальных стромальных клеток // Клеточные технологии в биологии и медицине,- 2008,- № 4,- С. 219-226.

8. Останин А.А., Петровский Я.Л.. Курганова Е.В., Шевела Е.Я., Черных Е.Р. Характеристика анти-пролиферативного эффекта мезенхимальных стромальных клеток (MSCs), выделенных из костного мозга, жировой ткани и плаценты человека // Материалы II Объединенного иммунологического форума.- Российский иммунологический журнал,- 2008,- Т. 2 (11), № 2/3.- С. 114.

9. Петровский Я.Л.. Шевела Е.Я., Курганова Е.В., Сахно Л.В., Дробинская А.Н., Добрякова О.Б., Черных Е.Р., Останин А.А. Функциональная характеристика мезенхимальных стромальных клеток, выделенных из различных тканей // Материалы конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Томск, 2008).- Сибирский медицинский журнал.- 2008.- Т. 23, №3 (выпуск 1).- С. 106-107.

Ю.Черных Е.Р., Шевела Е.Я., Петровский Я.Л.. Ступак В.В., Сизиков М.Ю., Останин А.А. Трансплантация аутологичных костномозговых клеток в лечении пациентов с травматической болезнью спинного мозга // «Клеточные технологии. Теоретические и прикладные аспекты», Сборник трудов под ред. Козлова В.А., Сенникова C.B., Черных Е.Р., Останина А.А,- Новосибирск: Наука, 2009,- С. 188-202.

11. Черных Е.Р., Сергеевичева В.В., Шевела Е.Я., Сахно Л.В., Петровский Я.Л.. Останин А.А., Крючкова И.В., Лисуков И.А. Влияние стволовых мезенхимальных клеток на восстановление кроветворения гемобластозами с трансплантацией стволовых кроветворных клеток // Материалы XIII Всероссийского научного форума «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»,- Мед. иммунология.- 2009,- Т. 11, № 4-5.- С. 439440.

12. Shevela Е., Petrovsky Y., Kurganova Е., Tihonova M., Sakhno L., Segeevicheva V., Kulagin A., Lisukov I., Ostanin A., Chemykh E. Mesenchymal stromal cells in patients with haematologic disorders // Bone Marrow Transplantation.- 2008.- Vol. 41, Suppl. 1.- P. 131. (P542).

13. Пат. 2370771 РФ. Способ оценки остеогенного потенциала мезенхимальных стромальных клеток / Останин А.А, Петровский Я.Л., Шевела Е.Я., Курганова Е.В.,Э Черных Е.Р. - №2007143233/15; заявл. 21.11.07; опубл. 20.10.09, Бюл. №29.

дк идо

ИОД

мск

КМ-МСК, П-МСК,

ж-мск

мнк

скл

Ahth-CD3

EGF

ЕГО

FGF-basic (bFGF)

sHLA-G 1/5

IGF-1

LPS

MMP-9

PGE2

Thlи Th2

TIMP-1

TLR

VEGF

Список сокращений

Дендритные клетки Индоламин-2,3-диоксигеназа Индекс остеогенной дифференцировки Мезенхимальные стромальные клетки

МСК, полученные из костного мозга, плаценты и жировой

ткани соответственно

Мононуклеарные клетки

Смешанная культура лимфоцитов

Ahth-CD3 антитела

Эпидермальный фактор роста

Эригропоэтин

Основной фактор роста фибробластов Растворимые изоформы HLA-G 115 Инсулиноподобный фактор роста Липополисахарид

Матричная металлопротеиназа 9 типа Простагландин Е? Субпопуляции Т-хелперных клеток Тканевой ингибитор металлопротеиназ 1 типа Toll-like рецептор

Сосудистый эндотелиальный фактор роста

Подписано к печати 19.11.2009 формат 60x84 1/16, Усл. печ. л. 1,5

Бумага: офсетная Печать: трафаретная Тираж 100 экз. Номер заказа № 468 Типография ООО «ЮГУС-ПРИНТ», ИНН 5402467637, г. Новосибирск, ул. Залесского, 4

Актуальность темы исследования

В связи со стремительным развитием клеточных подходов в регенеративной и восстановительной медицине все больший интерес привлекает возможность получения в короткий срок достаточного количества клеточного материала за счет экспансии клеток in vitro. В этих целях наиболее перспективными и востребованными признаются мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки.

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) относятся к классу соматических стволовых клеток, которые характеризуются способностью к самоподдержанию и дифференцировке в клетки тканей мезодермального происхождения [35]. В 2006 году Комитетом по стволовым клеткам Международного общества клеточной терапии была проведена согласительная конференция и определены «минимальные» критерии, специфичные для МСК: а) адгезия к пластику и фибробластоподобная морфология, б) характерный иммунофенотип (экспрессия CD73, CD90, CD 105 и отсутствие экспрессии CD34, CD45, HLA-DR) и в) способность дифференцироваться в остеогенном, адипогенном и> хондрогенном направлении [56].

Кроме того, на различных экспериментальных моделях показана способность мезенхимальных клеток дифференцироваться в клетки тканей экто- и эндодермального происхождения. Например, клетки нервной, мышечной тканей, а также эпителиальные клетки, что предполагает наличие у МСК потенциала плюрипотентных стволовых клеток [22, 28, 32, 74, 136, 138, 168]. Не менее важной биологической особенностью МСК является их низкая иммуногенность, способность к миграции в очаг повреждения/воспаления, гемопоэзстимулирующая и иммуномодулирующая активность, что позволяет рассматривать их, как потенциально активных индукторов/регуляторов репаративных процессов [5, 13, 77, 94, 131, 147, 163]. Так, в настоящее время активно обсуждается возможность использования МСК с целью ускорения восстановления кроветворения и профилактики развития РТПХ при трансплантации стволовых кроветворных клеток пациентам гемобластозами после высокодозовой химиотерапии [106, обзор в 21]. Кроме того, разрабатываются новые подходы по использованию МСК, для восстановления репаративного остеогенеза у пациентов с I различными его нарушениями как местного, так и системного характера [2-4, 6-8, 13], а также в терапии ряда других патологий [1, 10, 11].

Как правило, МСК выделяют из костного мозга, где они и были впервые идентифицированы Фриденштейном А.Я. с соавт. еще в 70-х годах XX столетия [60]. Однако получение аспирата костного мозга из крыла подвздошной кости представляет инвазивную и травматичную процедуру. Кроме того, показано, что с возрастом человека количество, дифференцировочный потенциал и жизнеспособность костномозговых мезенхимальных клеток резко снижается [156].

В этой связи проводится интенсивный поиск альтернативных и более доступных источников для получения достаточного количества МСК, которые по своим основным биологическим свойствам были бы сопоставимы с мезенхимальными клетками костномозгового происхождения.

Одним из таких источников может быть'жировая ткань [176], другим -плацента [63, 83]. Однако, фенотипические н ефункциональные особенности жировых и плацентарных МСК, а также их иммунорегуляторные свойства в настоящее время изучены недостаточно полно и требуют дальнейших исследований. j 1 1

Сравнительный анализ МСК различного тканевого происхождения I имеет немаловажное теоретическое, а также практическое значение. С фундаментальной точки зрения важно понимать, имеются или нет какие-либо специфические отличия МСК в зависимости от их локализации в тех или иных тканевых нишах (например, в строме костного мозга или в жировой клетчатке), а также в зависимости от их принадлежности к развивающимся (плацента новорожденного) или зрелым, дефинитивным тканям (костный мозг, жировая ткань взрослого человека).

Результаты сравнительных исследований МСК, выделенных из различных тканевых источников, могут иметь и практическую ценность, например, для оптимизации технологий трансплантации МСК. В клинической практике наиболее безопасным считается использование аутологичного клеточного материала, что позволяет отказаться от гетеро-или алло-трансплантаций, сопряженных с решением проблем гистосовместимости, этических и юридических вопросов, а также позволяет исключить риск ятрогенного инфицирования. Однако использование МСК в целях аутотрансплантации диктует необходимость предварительной оценки их функционального состояния. Очевидно, что эффективность лечения с использованием МСК во многом будет определяться их биологической активностью, которая, в свою очередь, прямо зависит от множества факторов, таких как источник получения и особенности выделения/экспансии МСК in vitro, а также возраст/генетические особенности больного, характер/распространенность патологического процесса, медикаментозная предлеченность, и т.д.

Исходя из этого, была сформулирована цель работы: на основе анализа морфо-функциональных и иммунорегуляторных свойств фибробластоподобных клеток, выделенных из костного мозга, липоаспирата и плаценты человека, провести сравнительную характеристику мезенхимальных стромальных клеток различного тканевого происхождения.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Оценить фибробластоподобные клетки, выделенные из костного мозга, жировой и плацентарной ткани, с позиций требований Международного общества клеточной терапии (ISCT) на их соответствие критериям МСК.

2. Провести сравнительный анализ исходного содержания клоногенных прекурсоров МСК в исследуемых тканях, а также оценить пролиферативный и дифференцировочный (остеогенный) потенциал МСК.

3. Провести сравнительную оценку уровня конститутивной, спонтанной и ЛПС-индуцированной продукции биологически активных медиаторов (цитокинов, хемокинов, ростовых факторов, ММР-9 и TIMP-1) в цельных и стандартизированных культурах МСК различного тканевого происхождения.

4. Исследовать влияние МСК на пролиферацию активированных Т-лимфоцитов, стимулированных митогеном и аллоантигенами, а также изучить клеточно-молекулярные механизмы иммуносупрессорной активности МСК различного тканевого происхождения.

5. Провести сравнительный анализ гемопоэзстимулирующей активности МСК костного мозга, жировой и плацентарной ткани.

Научная новизна

Впервые установлено, что в жировой ткани количество клоногенных прекурсоров МСК достоверно выше, чем в костном мозге и плаценте. Вне зависимости от типа тканей показана способность МСК к самоподдержанию и активному клеточному росту. Впервые установлено, что в популяции плацентарных клеток в отличие от KML и- Ж-МСК преобладают клетки с диаметром менее 20 мкм. При. этом- П-МСК характеризуются наиболее выраженным пролиферативным потенциалом, о чем свидетельствует количество клеток, генерируемых в первичных культурах, а также динамика удвоений клеточной популяции в процессе культивирования.

Впервые выявлено, что костномозговые МСК обладают более выраженным остеогенным потенциалом, чем П-МСК и, особенно, Ж-МСК. После культивирования в индукционной среде пик продукции депозитов кальция регистрируется в культурах КМ-МСК, в которых количество клеток в 2 и 8 раз меньше, чем в культурах П-МСК и Ж-МСК, соответственно.

На основе анализа конститутивной продукции 24 биологически активных медиаторов впервые показано, что МСК различного тканевого происхождения обладают функциональным потенциалом для поддержания кроветворения (через продукцию G-CSF, GM-CSF, эритропоэтина), иммуномодуляции (через продукцию IFN-y, IL-2, IL-6, IL-1(3, TNF-a и хемокинов - IL-8, МСР-1, М1Р-1(3) и стимуляции репаративных процессов (через продукцию VEGF, FGF-basic, IGF-1, IL-6, TIMP-1/MMP-9). Впервые установлено, что по характеру и уровню спонтанной (базальной) продукции цитокинов Ж-МСК в большей степени проявляют провоспалительный (IL-1Ь, TNF-a), йммунорегуляторный (IFN-y, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, MCP-1, MlP-lb) и гемопоэзстимулирующий (G-CSF, GM-CSF) фенотип, но при этом характеризуются более низкой чувствительностью к ЛПС-стимуляции, чем КМ- и П-МСК.

Показано, что МСК исследуемых тканей обладают иммуносупрессорной активностью, которая проявляется в ингибиции пролиферативного ответа активированных Т-лимфоцитов. При этом впервые установлено, что КМ-МСК отличаются наиболее выраженной супрессией в отношении Т-клеток, активированных aHTH-CD3-антителами, тогда как Ж- и П-МСК - в отношении Т-лимфоцитов, активированных аллоантигенами в CKJI. При изучении клеточно-молекулярных механизмов анти-пролиферативного эффекта МСК .получены новые данные о том, что иммуносупрессорная активность МСК сопряжена: со снижением экспрессии на Т-клетках.активационных молекул (CD25, HLA-DR), а также реализуется через продукцию sHLA-G и PGE2. Кроме того, действие МСК частично может опосредоваться через модуляцию функциональной активности дендритных клеток.

Показано, что как КМ-МСК, так и П-МСК и Ж-МСК характеризуются наличием гемопоэзстимулирующей активности, которая проявляется в их способности усиливать дифференцировку гемопоэтических клеток-предшественников в эритроидном и гранулоцитарно-макрофагальном направлении.

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая значимость работы заключается в получении новых сведений о морфо-функциональных свойствах мезенхимальных стромальных клеток в зависимости от локализации в различных тканевых нишах (костного мозга и жировой ткани), а также в зависимости от их принадлежности к развивающимся (плацента новорожденного) или зрелым, дефинитивным тканям (костный мозг, жировая ткань взрослого человека).

Практическая значимость работы заключается в разработке нового метода полуколичественной оценки интенсивности остеогенной дифференцировки МСК (Патент 2370771 РФ «Способ оценки остеогенного потенциала мезенхимальных стромальных клеток»). Предложенный метод может повысить эффективность использования МСК, например, в травматологии и ортопедии, поскольку позволяет определять наиболее оптимальные условия функционирования МСК в зависимости от типа тканевого источника, клеточной плотности МСК, кратности/длительности пассирования МСК in vitro, концентрации ростовых сывороточных факторов в микроокружении.

Результаты исследований по изучению костномозговых МСК были использованы при разработке новой медицинской технологии «Использование совместной' трансплантации мезенхимальных стволовых стромальных клеток и стволовых кроветворных клеток при гемобластозах и аутоиммунных-заболеваниях», зарегистрированной Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (ФС № 2008/014 от 30 января 2008 т).

Полученные данные, характеризующие биологические свойства плацентарных МСК, а также разработанные протоколы по их выделению и количественной экспансии могут послужить основой для расширения сферы деятельности существующих Банков пуповинной крови.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Фибробластоподобные клетки, выделенные из костного мозга, жировой и плацентарной ткани, в целом соответствуют критериям мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток, однако различаются между собой по уровню пролиферативной активности и по способности дифференцироваться в остеогенном направлении.

2. МСК, выделенные из костного мозга, жировой и плацентарной ткани, через продукцию растворимых факторов обладают функциональным потенциалом для поддержания кроветворения, иммуномодуляции и стимуляции репаративных процессов.

3. КМ-МСК, П-МСК и Ж-МСК оказывают анти-пролиферативный эффект на активированные Т-клетки, а также индуцируют дифференцировку стволовых кроветворных клеток в эритроидном и гранулоцитарно-макрофагальном направлении.

Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Всероссийских научно-практических конференциях «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2006; Омск, 2007; Томск, 2008); на XI и XIII Всероссийских научно-практических форумах «Дни- иммунологии' в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007; 2009); на 3-ей Международной конференции «Фундаментальные науки — медицине» (Новосибирск, 2007); на II Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), а также на ежегодном конгрессе Европейской Группы по гематологии и трансплантации костного мозга - 34th Annual Congress ЕВМТ (Florence, 2008). Апробация диссертации состоялась 5 ноября 2009 года на расширенном семинаре НИИ клинической иммунологии СО РАМН.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 4 статьи в центральной печати (в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации результатов работ на соискание ученой степени кандидата наук), а также получен 1 патент.

Объем и структура диссертации:

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 109 страницах машинописного текста, включающего 21 таблицу и 13 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 177 литературных источников, в том числе, 164 иностранных.

Выводы

1. МСК, выделенные из костного мозга (КМ-МСК), жировой (Ж-МСК) и плацентарной ткани (П-МСК), различаются по уровню пролиферативной активности. По сравнению с КМ- и Ж-МСК плацентарные МСК, содержащие в 1,5 раза больше клеток с диаметром <20 мкм, характеризуются наиболее выраженным пролиферативным потенциалом, о чем свидетельствует 2-кратное увеличение числа «дочерних» клеток, образующихся из 1 клоногенного прекурсора (КОЕ-Ф), а также более короткий период времени, необходимого для достижения клеточного монослоя.

2. Костномозговые МСК отличаются от П-МСК и, особенно, Ж-МСК более выраженным остеогенным потенциалом. Пик продукции депозитов кальция регистрируется в индуцированных культурах КМ-МСК в дозе 1250 клеток/лунку, тогда как в культурах П-МСК и Ж-МСК максимальная минерализация внеклеточного матрикса отмечается при концентрациях 2500 и 10000 клеток/лунку.

3. МСК различного тканевого происхождения обладают функциональным потенциалом для поддержания кроветворения (через продукцию G-CSF, GM-CSF, ЕРО), иммуномодуляции (через продукцию IFN-y, IL-2, IL-6, IL-lb, TNF-a и хемокинов - IL-8, MCP-1, MlP-lb) и стимуляции репаративных процессов (через продукцию VEGF, FGF-basic, IGF-1, IL-6, ММР-9, TIMP-1).

4. По уровню спонтанной (базальной) продукции цитокинов Ж-МСК в большей степени проявляют провоспалительный (IL-lb, TNF-a), иммунорегуляторный (IFN-y, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, MCP-1, MlP-lb) и гемопоэзстимулирующий (G-CSF, GM-CSF) фенотип, но при этом характеризуются более низкой чувствительностью к ЛПС-стимуляции, чем КМ- и П-МСК.

5. МСК обладают иммуносупрессорной активностью, которая проявляется в ингибиции пролиферации активированных Т-лимфоцитов. При этом, КМ-МСК отличаются наиболее выраженной супрессией в отношении Т-клеток, активированных анти-СОЗ-антителами, тогда как Ж- и П-МСК — в отношении Т-лимфоцитов, активированных аллоантигенами в CKJI.

6. Иммуносупрессорная активность МСК сопряжена со снижением экспрессии на Т-клетках активационных молекул (CD25, HLA-DR), а также реализуется через продукцию sHLA-G и PGE2. Анти-пролиферативный эффект МСК может также частично опосредоваться через модуляцию функциональной активности дендритных клеток.

7. МСК независимо от источника тканевого происхождения характеризуются наличием гемопоэзстимулирующей активности, которая проявляется в их способности усиливать дифференцировку стволовых кроветворных клеток в эритроидном и гранулоцитарно-макрофагальном направлении.