Автореферат и диссертация по медицине (14.01.14) на тему:Повышение эффективности остеоинтеграции титановых дентальных имплантантов путем оптимизации их формы, структуры поверхности и применения клеточных технологий в эксперименте

На правах рукописи УДК: 616.314-089.843:611.018.1

МАЛЬГИНОВ НИКОЛАИ НИКОЛАЕВИЧ

ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ОСТЕОИНТЕГРАЦИИ ТИТАНОВЫХ ДЕНТАЛЬНЫХ ИМПЛАНТАТОВ ПУТЕМ ОПТИМИЗАЦИИ ИХ ФОРМЫ, СТРУКТУРЫ ПОВЕРХНОСТИ И ПРИМЕНЕНИЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

14.01.14 - «Стоматология» (медицинские науки) 14.03.03 - «Патологическая физиология» (медицинские науки)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

2 6 МАЙ 2011

4847588

Москва-2011

4847588

Воложин Александр Ильич

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Минздравсоцразвития России

Научные консультанты:

Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Лебеденко Игорь Юльевич

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Заслуженный врач РФ,

доктор медицинских наук, профессор Олесова Валентина Николаевна доктор медицинских наук, профессор Широков Юрий Евгеньевич доктор медицинских наук, профессор Малышев Игорь Юрьевич

Ведущая организация: Федеральное Государственное Учреждение «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится"^_" _2011 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.041.03 при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Минздравсоцразвития России

(127006, г. Москва, ул. Долгоруковская д. 4).

Почтовый адрес: 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20, стр.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Минздравсоцразвития России

(127206, Москва, ул. Вучетича, д. 10а). Автореферат разослан_2011 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Гиоева Ю.А.

Актуальность исследования

Успешная интеграция имплантатов и трансплантатов в тканевую среду является основным требованием восстановительной медицины. Для этого используются клеточные и тканевые технологии, которые считаются целесообразными, когда происходит биологическое объединение и функционирование собственных тканей и интегрированных с ними чужеродных материалов (Шумаков В.И. и соавт., 2004; Ярыгин В.Н. и соавт., 2004; Кулаков A.A., Григорьян A.C., 2007 и другие). Достижение долговременного равновесия в адаптационных реакциях между живой тканью и имплантированным материалом (синтетического, природного и биологического происхождения) является важнейшей задачей тканевой инженерии. Эта проблема актуальна в медицине, особенно в таких ее разделах как стоматология и челюстно-лицевая хирургия, что обусловлено большой потребностью в искусственных костно-замещающих материалах, необходимостью восстановить не только анатомию, но и жевательную функцию с помощью дентальных имплантатов. Ожидается, что эти технологии в перспективе существенно повысят эффективность традиционных методов лечения (Воложин А.И. и соавт., 2004-2007; Денисов-Никольский Ю.И. и соавт., 2004, 2005;). Как прежде, так и в настоящее время, целью остеопластики совместно с постановкой дентальных имплантатов является интеграция искусственных материалов с тканевой средой и продолжительное функционирование этого комплекса как единого целого (Плотников H.A., 1967; Воложин А.И. и соавт., 1998-2006; Никитин A.A., 2000-2005; Топольницкий О.З., 2004; Дробышев А.Ю., 2005 и многие другие). В качестве основного материала для изготовления дентальных имплантатов применяется титан медицинского назначения, так как оксидные соединения на его поверхности способствуют фиксации и функционированию морфогенетических протеинов и белков крови, участвующих в построении и перестройке костной ткани. Интеграционные процессы между дентальным имплантатом и костью изучаются много лет, однако технологические трудности и неизбежные артефакты не позволяют в точности проанали-

зировать морфофункциональную эволюцию интерфейса «поверхность титана - кость». К настоящему времени сложилось устойчивое представление о том, что в образовании костной ткани на поверхности имплантата участвуют 2 типа костеобразовательных процессов: остеогенез «контактный» - на поверхности имплантата и «дистантный» - со стороны материнской кости (Кулаков A.A., Григорьян A.C., 2007). Эти механизмы имеют свою специфику, но их объединяют единые клеточные процессы, заключающиеся в пролиферации и остеогенной дифференцировке собственных стволовых мезенхи-мальных клеток, формировании клеток остеобластического ряда, создающих кость, которая в дальнейшем подвергается перестройке. Таким образом, узловым моментом в процессе интеграции дентального имплантата является число и функциональная активность стволовых клеток пациента, что зависит от многочисленных факторов: общесоматических (наследственность, заболевания внутренних органов, остеопороз, возраст, иммунитет) и местных условий (объем вмешательства, биомеханические характеристики системы «им-плантат-челюсть», инфекция и др.). Поэтому одной из актуальных задач тканевой инженерии является создание оптимальных условий для функционирования собственных стволовых клеток и, при необходимости, увеличения их числа. Создание необходимой массы стволовых клеток, условий для их остеогенной дифференцировки, доставка их в место репаративной регенерации является важной задачей тканевой инженерии в стоматологии, ипланто-логии и челюстно-лицевой хирургии. Разработаны технологии выделения и идентификации стволовых клеток из костного мозга, жировой ткани, пупо-винной крови у человека. Свойства клеток, полученных из разных тканей не одинаковы, что хорошо известно из литературы (Slack J.M.W., 2000; BlauH.M. et al., 2001; Donovan P.J. et al., 2001). Полипотентными являются клетки, выделенные из костного мозга и жировой ткани. Мезенхимальные стромальные стволовые клетки, полученные из этих тканей, могут быть дифференцированы в мышечные, нервные, фибробласты, а также в клетки костной ткани (ВоложинА.И. и соавт., 2003-2005; Barry F.P., Murphy J.M.,

2004). Разработана технология формирования слоя костных клеток на искусственных носителях и в биоматериалах путем направленной остеодифферен-цировки мезенхимальных стромальных стволовых клеток (Роговая О. С. с со-авт. 2004; Сергеева Н.С., 2007). Эти технологии используются для замещения костных дефектов после цистэктомии, коррекции размеров и формы челюсти, других операций в челюстно-лицевой области (Воложин А.И. с соавт., 2005; Киселева Е.В. с соавт., 2009). Практически отсутствуют научные исследования о возможности применения клеточных технологий для повышения эффективности непосредственной и отстроченной дентальной имплантации. Актуальность этой проблемы заключается в том, что оптимизация ос-теоинтеграции при дентальной имплантации особенно важна в случае восстановления эстетики лица и функции зубо-челюстной системы при отсутствии передних зубов, в пожилом возрасте, при компенсированной форме сахарного диабета и при других общесоматических заболеваниях, ограничивающих в обычных условиях костную регенерацию и требующих применения клеточных технологий. На современном этапе развития этого нового направления и состояния законодательной базы разработка данной проблемы стоматологии и патологической физиологии к моменту начала настоящего диссертационного исследования могла быть осуществлена только в лабораторных условиях и эксперименте.

Цель исследования

Разработать и обосновать для клинических исследований технологию оптимизации костной регенерации и остеоинтеграции в системе «имплантат-кость», используя различные мезенхимальные стромальные клетки и усовершенствованную конструкцию дентального имплантата.

Задачи исследования

1. Провести комплексное (клиническое, рентгенологическое, гисто-морфологическое, ультрамикроскопическое) изучение результатов применения мезенхимальных стволовых клеток (живых и инактивированных) на образцах титановых дентальных имплантатов и пластин в динамике заживления костного дефекта бедренной кости и дефекта челюсти у экспериментальных животных.

2. Предложить усовершенствованную конструкцию титановых дентальных имплантатов для применения в комплексе с мезенхимальными стромальными стволовыми клетками.

3. В эксперименте на лабораторных животных оценить эффективность предложенной методики дентальной имплантации с применением аутологичных мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из жировой ткани, и изучить процесс остеоинтеграции титанового имплантата с костью челюсти при непосредственной и отсроченной имплантации.

4. Сформулировать предложения для клинической апробации усовершенствованных титановых дентальных имплантатов в комплексе с мезенхимальными стволовыми клетками для оптимизации процесса интеграции имплантата с костной тканью.

Научная новизна

Разработана оригинальная конструкция титанового дентального имплантата, позволяющая улучшить остеоинтеграцию за счет увеличения площади поверхности внутрикостной части имплантата и увеличения числа доставленных в зону имплантации мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Получен патент РФ на изобретение № 2405497 «Дентальный имплантат».

Установлено, что предварительное культивирование мезенхимальных стволовых клеток на специально обработанной поверхности образцов дентальных имплантатов из титана приводит к оптимизации процессов восстановления костных дефектов при их использовании для закрытия дефектов бедренной кости у крыс. На ранних сроках регенерации в присутствии ство-

ловых клеток происходит стимуляция ангиогенеза, что, по-видимому, обеспечивает активный остеогенез в дальнейшем. Использование инактивиро-ванных этанолом стволовых клеток не оказывает подобного действия, их потенциал недостаточен для построения полноценного костного регенерата.

Научно доказано в эксперименте на кроликах, что использование титановых пластин с культивированными на поверхности стволовыми клетками, для заживления критического костного дефекта нижней челюсти позволяет повысить низкий регенераторный потенциал костной ткани нижней челюсти и обеспечить заживление дефекта.

Результаты морфометрического анализа подтвердили, что нанесение стволовых клеток на поверхность титанового имплангата позволяет ускорить процессы регенерации как в центральных, так и в периферических участках дефекта костной ткани нижней челюсти.

Для изучения динамики костной регенерации при непосредственной и отсроченной дентальной имплантации дополнительно применена микрофокусная рентгенография и результаты лучевого исследования верифицированы с данными сканирующей электронной микроскопии.

Получены новые данные в эксперименте на собаках о том, что дентальные титановые имплантаты оптимизированной формы с культивированными аутологичными стволовыми клетками жировой ткани на их поверхности ускоряют процессы остеоинтеграции по сравнению с имплантатами без стволовых клеток или с нежизнеспособными стволовыми клетками.

Патогенетически обосновано усовершенствование формы титанового дентального имплантата, что приводит к увеличению площади интеграции с костной тканью в результате врастания новообразованных костных структур в профили имплантата. Этот эффект особенно выражен в присутствии стволовых клеток при отсроченной имплантации в сравнении с непосредственной и подтвержден данными сканирующей электронной микроскопии и микрофокусной рентгенографии.

Практическая значимость

На основании комплекса проведенных исследований научно обоснованы и разработаны методы улучшения остеоинтеграции титановых имплан-татов с костной тканью, которые заключаются в следующем: предварительная обработка поверхности имплантатов (предпочтительнее пескоструйная обработка или плазменное напыление титанового порошка); применение клеточных технологий - аллогенных или аутологичных стволовых клеток; изменение формы контактирующей с костью поверхности имплантата.

Предложен и апробирован в эксперименте имплантат с профилированной поверхностью, получен патент РФ на изобретение № 2405497 «Дентальный имплантат».

Результаты проведенных сравнительных экспериментальных исследований непосредственной и отсроченной дентальной имплантации показали, что процессы остеоинтеграции во всех сериях эксперимента протекают эффективнее при отсроченном варианте имплантации.

На основании полученных данных выработаны предложения по клинической апробации дентальных имплантатов в комплексе с мезенхималь-ными стволовыми клетками, которые заключаются в том, что отсроченная имплантация предпочтительнее непосредственной. Проведенные исследования позволяют утверждать, что поверхность титана следует обрабатывать пескоструйно или проводить плазменное напыление титанового порошка, культивировать на поверхности имплантата мезенхимальные стволовые клетки и перед использованием тестировать их на жизнеспособность, используя скрининговые тесты.

Показано, что применение модифицированного дентального имплантата в сочетании с аутогенными стволовыми клетками после соответствующей клинической апробации позволит расширить показания для дентальной имплантации при наличии патологических процессов, снижающих остеоген-ный потенциал костной ткани, в том числе в челюстно-лицевой области.

Подтверждено, что применение микрофокусной рентгенографии является высокоинформативным методом оценки динамики регенерации костной ткани в эксперименте на животных.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Мезенхимальные стволовые клетки, культивированные на поверхности титановых имплантатов, при закрытии костных дефектов бедра у крыс и нижней челюсти у кроликов и собак способствуют в начале регенераторного процесса возникновению остеогенной соединительной ткани с выраженным ангиоматозом с последующим образованием костных структур. Инактивированные этанолом мезенхимальные стволовые клетки на поверхности титановых имплантатов непродолжительно влияют на течение репара-тивного процесса, ускоряя образование костной ткани лишь в начальном периоде.

2. В эксперименте по закрытию дефекта нижней челюсти кролика использование титановых пластин с нежизнеспособными мезенхимальными стволовыми клетками не восстанавливает дефект кости, образуя грубоволок-нистую соединительную ткань, в то время как имплантаты с жизнеспособными мезенхимальными стволовыми клетками значительно стимулируют ос-теогенез, что приводит к заполнению критического дефекта ветви нижней челюсти кролика полноценным костным регенератом.

3. В эксперименте на животных показано, что процессы костеобра-зования и остеоинтеграции при непосредственной дентальной имплантации проходят слабее, чем при отсроченной дентальной имплантации, а нанесение мезенхимальных стволовых клеток на поверхность титановых имплантатов улучшает процессы интеграции, как при отсроченной, так и при непосредственной имплантации.

4. Образование костного компонента интеграции образцов титановых дентальных имплантатов при использовании в комплексе с мезенхимальными стволовыми клетками больше, чем без них.

5. Усовершенствование конструкции титанового дентального им-плантата путем создания технологических полостей улучшает остеоинтегра-цию в эксперименте.

Личный вклад автора

Автором были освоены и применены клеточные технологии, связанные с выделением, культивированием, индукцией в остеогенном направлении, сохранением жизнеспособности стволовых клеток животных и человека. Получен патент на изобретение усовершенствованного дентального имплан-тата путём нанесения профилей перпендикулярно его винтовой части.

Соискатель лично планировал проведение экспериментальных исследований, готовил опытные образцы имплантатов и участвовал в составе операционной бригады по установке дентальных имплантатов животным, проводил все манипуляции по обеспечению эксперимента, связанного с клеточными технологиями. Освоены и применены современные методы статистического анализа.

Диссертантом проведён всесторонний анализ полученных результатов, используя методы сканирующей электронной микроскопии, гистологического и морфологического анализа, микрофокусной рентгенографии и других. По определенным биометрическим критериям проведена количественная оценка состояния костного регенерата и статистическая обработка результатов исследования.

Внедрение результатов исследования

Получен патент на изобретение № 2405497 «Дентальный имплантат». Материалы исследования включены в лекции и практические занятия на кафедре ГОС, кафедре ОСЭиЭП ФПДО, кафедре СОП и ПЗТ ФПДО МГМСУ для студентов, клинических ординаторов, аспирантов и слушателей факультета последипломного образования. Материалы исследования используются в клинических исследованиях, проводимых в ФГУ ЦНИИСиЧЛХ Минздрав-

соцразвития РФ. Работа выполнена по плану НИР МГМСУ № государственной регистрации 01200411435 по проблеме 30.05.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены, обсуждены и одобрены на:

• Межрегиональной конференции, посвященной 100-летию создания Саратовского одонтологического общества, Саратов, 2005

• III Международной конференции «Болезни цивилизации в аспекте учения В.И. Вернадского», Москва, 2005

• Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении», Москва, РГМУ, 2006

• Пятой международной конференции «Высокие медицинские технологии XXI века», Испания, Бенидорм, 2006

• Всероссийском совещании «Биокерамика в медицине», Москва,

2006

• III Всероссийском симпозиуме с международным участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии», Москва, 2007

• IX ежегодном научном форуме «Стоматология 2007», посвященном 45-летию ЦНИИС, Москва, 2007

• VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; Концепции болезней цивилизации», Москва, 2007

• V всероссийской научно-практической конференции «Образование, наука и практика в стоматологии» по объединенной тематике «Имплантология в стоматологии», Москва, 2008

• Научно-практической конференции стоматологов и челюстно лицевых хирургов ЦФО РФ с международным участием «Технологии XXI века в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии», Тверь, 2008

• Конференции «Инновационные технологии в трансплантологии органов, тканей и клеток», Самара, 2008

• Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Лучевая диагностика в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии», Москва, 2008

• III Всероссийском национальном конгрессе лучевых диагностов и терапевтов «Радиология - 2009», Москва, 2009

• на совместном заседании кафедры ГОС, кафедры ФХС и И, кафедры СОП и ПЗТ ФПДО, кафедры ОС ЭЭП ФПДО, кафедры патологической физиологии стоматологического факультета МГМСУ 29 сентября 2010 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 31 печатная работа, в том числе получен 1 патент РФ на изобретение и 13 статей в журналах, рекомендованных ВАК России.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 287 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с изложением материалов и методов исследования, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Обзор литературы содержит 140 источников, из которых 36 - отечественных и 104 - иностранных авторов. Текст диссертации иллюстрирован 26 таблицами и 264 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

В работе использованы образцы титановых дентальных имплантатов, изготовленные на отечественном предприятии «Конмед» из чистого титана марки Grade 4 ASTMF-67-00 (аналог сплава ВТ 1-0 по ГОСТ 19807-91).

В эксперименте на бедренной кости крыс использовали образцы овальной формы с гладкими краями максимальным диаметром 5 мм минимальным 2 мм, толщиной 1,5 мм, поверхность которых была подвергнута пескоструйной обработке.

В опытах на нижней челюсти кроликов образцы имели прямоугольную форму размерами 12 х 10 х 1,5 мм с отпескоструенной поверхностью и круглыми отверстиями диаметром 1 мм в углах для внутрикостной фиксации титановыми шурупами.

Поверхность пластин была отпескоструена электрокорундом с диаметром частиц 300-350 мкм.

В экспериментах на собаках использовали титановые дентальные им-плантаты 2-х видов: цилиндрические имплантаты модели 201.33 фирмы «Конмед» диаметром 3,3 мм, длиной 10 мм и имплантаты усовершенствованной авторской конструкции, также изготовленные на отечественном предприятии «Конмед».

Создание усовершенстованной конструкции титанового дентального имплантата, способного обеспечить доставку клеточных элементов, ускоряющих костеобразование, в сегмент интеграции дентального имплантата и челюстной кости, было одной из важных задач настоящей работы. Это достигнуто за счет того, что дентальный имплантат погружного типа выполнен в виде монолитного титанового конуса, имеющего полированную поверхность и внутрикостную часть, которая представлена горизонтальной упорной резьбой на наружной поверхности с постоянным профилем по всей ее длине, а

вершина внутрикостной части закруглена по радиусу 2,5 мм и выполнена с тремя выборками для самонарезания, а так же тремя вертикальными дополнительными поверхностями в соотношении площадей 60 к 40 для введения в сегмент интеграции дентального имплантата и челюстной кости мезенхи-мальных стволовых клеток. Сущность предложения поясняется чертежом (рис.1) предлагаемого дентального имплантата. Он представляет собой монолитный титановый конус, имеющий полированную поверхность 1 и внут-рикостную часть 2. Внутрикостная часть 2 выполнена с резьбой круглого профиля разной высоты 3, при этом длина впадин между витками резьбы постепенно увеличивается по направлению погружения имплантата, и выборками для самонарезания 4, а также тремя вертикальными дополнительными поверхностями 5, в соотношении площадей 60 к 40, для введения в сегмент интеграции дентального имплантата и челюстной кости мезенхимальных стволовых клеток.

Рис. 1. Дентальный имплантат усовершенствованной конструкции (пояснения в тексте).

Для проведения экспериментов были использованы мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека и мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани собак.

5

4

Для выделения мезенхималымх стволовых клеток костного мозга человека использовали аспираты костного мозга взрослых доноров (5-10 мл), полученные для трансплантации костного мозга в научном гематологическом центре РАМН, но не использованные из-за индивидуальной несовместимости с реципиентом. Клеточные суспензии разводили 1:2 фосфатным буфером Дульбек-ко (ФБД), наслаивали на градиент плотности Histopaque 1.077 (Sigma), центрифугировали 30 минут, 400 g и отбирали интерфазные мононуклеарные кольца. Для отмывки центрифугировали дважды в ФБД, осадки ресуспензировали, помещали в среду культивирования и высевали во флаконы (Т 25 «Coming»). Культуральная среда состояла из среды ДМЕМ с низким содержанием глюкозы с добавлением 25 мМ Hepes, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 10% ЭТС. Для выделение мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани у каждой собаки из паховой области забирали фрагмент жировой ткани; полученные в ходе операции фрагменты помещали в ФБД в соотношении 1:3 и интенсивно встряхивали на вортексе в течение 2-3 мин. После центрифугирования (10 мин при 600 g) жировое кольцо и супернатант удаляли, осадок стромальных клеток ресуспендировали в среде культивирования описанной выше. Флаконы помещали в СОг-инкубатор (37°С, 5% СОг) выдерживали 48 часов для прикрепления клеток. Использовали культуры максимум семи пассажей, минимум трех.

Клетки индуцировали в остеогенном направлении добавлением дек-саметазона, бетта-глицерофосфата и фосфата аскорбиновой кислоты.

Культивировали от 18 до 24 суток МСК на поверхности образцов титановых имплантатов перед операцией имплантации, так как в предыдущих наших исследованиях совместно с сотрудниками ВИЛАР была изучена динамика дифференцировки МСК.

Для исследования эффективности применения титановых дентальных имплантатов в комплексе с аутологичными МСК проводили забор жировой ткани из паховой области собак, выделяли стволовые клетки, культивировали

и дифференцировали МСК в остеогенном направлении на поверхности образцов титановых дентальных имплантатов для каждой собаки индивидуально. Лабораторные исследования, а также некоторые эксперименты на крысах и кроликах проведены аспиранткой Фроловой E.H. при нашем участии и научном руководстве совместно с А.И. Воложиным, а также сотрудниками НИИ ВИЛАР, по методикам, принятым в ВИЛАР.

В качестве экспериментальных животных были использованы 54 крысы самцы линии Вистар весом 180-220 г, 18 кроликов шиншилла, 5 беспородных собак. Все оперативные вмешательства, содержание и кормление животных проводили в соответствии с современными требованиями в вивариях ФГУ ЦНИИС и ЧЛХ и ГОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России.

В опытах на бедренной кости крыс под гексеналовым наркозом по задней поверхности бедра делали линейный разрез кожи, тупым путём раздвигали мышцы, обнажали бедренную кость и фиссурным бором на небольшой скорости с стерильным водяным охлаждением формировали продольное отверстие посередине диафиза длиной около 5 мм.

В отверстие устанавливали титановый имплантат, кожу и мышцы укладывали на место и накладывали шёлковые швы. Каждому животному устанавливали по 1 имплантату. Животных выводили из эксперимента через 15, 30 и 60 суток. В зависимости от нанесения МСК на поверхность имплантата крысы были разделены на 3 группы: 1-я (контроль) без МСК, 2-я с живыми МСК, 3-я с инактивированными этанолом МСК.

Кроликов оперировали под гексеналовым наркозом, делали разрез кожи, тупым путем отодвигая мышцы, обнажали угол и ветвь челюсти, с помощью фрезы создавали круглый дефект диаметром 8 мм. Дефект закрывали одним из имплантатов внахлест, укрепляя его по углам в кости титановыми шурупами, ушивали рану.

Экспериментальные образцы титановых имплантатов были заселены МСК, индуцированными к остеогеиной дифференциоровке в течение 18 суток. Животных выводили из эксперимента через 1, 2 и 4 месяца.

В зависимости от нанесения МСК на поверхность титановых пластин кролики были разделены на 3 группы: 1-я (контроль) без МСК, 2-я - с живыми МСК, 3-я - с инактивированными этанолом МСК.

Оперативные вмешательства на собаках (2 кабеля и 3 суки) имели свою специфику. Вначале для каждой собаки готовили образцы титановых дентальных имплантатов с культивированными на их поверхности аутоло-гичными МСК, выделенными из жировой ткани паховой области.

Чтобы имитировать отсроченную имплантацию удаляли премоляры и моляры на правой стороне нижней челюсти одновременно с забором жировой ткани, а имплантацию проводили через 3 недели после подготовки образцов с МСК. Для имитации непосредственной имплантации в день операции по отсроченной имплантации на правой части нижней челюсти на левой половине нижней челюсти удаляли премоляры и моляры и устанавливали 3 образца дентальных титановых имплантатов. Всего установлено 30 имплантатов 5 групп: 1-я (контроль) имплантаты стандартной формы без МСК , 2-я - имплантаты стандартной формы с МСК, 3-я - имплантаты стандартной формы с инактивированными этанолом МСК, 4-я - имплантаты усовершенствованной формы с МСК, 5-я - имплантаты усовершенствованной формы с инактивированными этанолом МСК. Животных выводили из эксперимента через 3, 6 и 9 мес.

В динамике эксперимента проводили рентгенологическое исследование зоны имплантации микрофокусным портативным рентгеновским аппаратом «Пардус-Стома».

Из бедренных костей крыс и нижних челюстей кроликов в участках расположения имплантатов из титана готовили срезы толщиной 10-12 мкм. Тканевой материал кости с имплантатом фиксировали в 10% нейтральном

формалине, после освобождения от мягких тканей декальцинировали в Три-лоне Б, заливали в парафин, срезы окрашивали гематоксилин-эозином.

Гистоморфометрическое исследование проводили по микрофотографиям гистологических срезов на микротоме Микром НМ-325 (ФРГ), толщиной 8 мкм. По четыре среза размещали на каждом предметном стекле. Микрофотосъемку осуществляли в оптической системе Axioplan - 2 фирмы Zeiss, анализировали фотографии при увеличении х25; хЮО; х200. В фотошопе на микрофотограммах (хЮО) проводили биометрические исследования, вычисляя отношения площадей, занятых определенными структурными детерминантами, по отношению к площади костного матрикса: костный матрикс; пластинчатый костный матрикс; фиброзный костный матрикс; низкодиффе-ренцированный костный матрикс; костные лакуны (костномозговые пространства); фиброзная соединительная ткань в составе костного регенерата.

Изучение интеграции образцов титановых дентальных имплантатов и кости бедра крыс, нижней челюсти кроликов и собак проводили методом сканирующей электронной микроскопии в микроскопе Philips SEM 515 (Голландия). Фрагменты костей лабораторных животных с имплантатами для удаления мягких тканей и исследования методом сканирующей электронной микроскопии обрабатывали 5% раствором гипохлорита натрия для деорга-нификации. После отмывки и высушивания образцы напыляли медью в атмосфере аргона в напылителе Baezers SCD 040 (Лихтенштейн) и исследовали в электронном сканирующем микроскопе. Затем образцы раскалывали так, чтобы скол проходил по поверхности винтовой части имплантата, вновь напыляли медью и изучали поверхность сколов. После удаления имплантатов и дополнительного напыления на тех же образцах изучали рельеф фронта минерализации их костного ложа.

Полученные результаты подвергали статистической обработке в программе Statistica.

Результаты собственных исследований

Первый этап нашего исследования был посвящен изучению влияния материала имплантата и его структурных особенностей на морфо-функциональные характеристики стволовых клеток и фибробластов, культивированных на его поверхности. Совместное культивирование клеточных ассоциаций с титановыми образцами разного вида выявило отсутствие цито-токсического эффекта, что проявилось в сохранении жизнеспособности клеток, определяемой по относительной оптической плотности клеточного пула (табл.1).

Таблица 1.

Оптическая плотность культуры стволовых клеток, культивированных с титановыми образцами.

Номер образца контроль 1-я группа титановых образцов 2-я группа Титановых образцов 3-я группа титановых образцов

1 0,497 0,486 0,492 0,469

2 0,493 0,478 0,484 0,485

3 0,599 0,495 0,476 0,474

Среднее значение 0,53±0,049 0,48±0,009 0,48±0,008 0,47±0,008

Относительная оптическая плотность % 100±9,8 92±1,7 91±1,6 90±1,6

Для всех образцов титана зафиксирован высокий уровень прикрепления клеток, о чем свидетельствовали данные морфологического исследования, проведенного с применением флуоресцентного окрашивания клеточных ассоциаций, а также результаты электронномикроскопического исследования образцов. Количественный анализ клеточного пула на поверхности титановых пластин через 3 дня культивирования показал, что число прикрепленных

клеток увеличилось в 2-2,5 раза (рис. 2), что свидетельствует не только о хорошей адгезии клеток на поверхности образцов, но и об их пролиферативной активности.

титан 1 титан 2 титан 3

-титан 1 -титан 2 - титан 3

Рис. 2. Характеристика адгезивных свойств стволовых клеток на титановых поверхностях, обработанных различными способами

Рис. 3. Динамика культивирования клеточного пула на титановых образцах, обработанных различными способами.

Последний факт был подтвержден при изучении числа клеток в динамике при культивировании их на поверхности титановых образцов в течение 14 суток, когда было показано, что титановые образцы независимо от способа обработки не препятствуют пролиферативной активности стволовых клеток, поскольку число клеток увеличилось, причем на образце с напылением порошка титана это увеличение было более чем в 7 раз (рис. 3).

Остеогенные свойства образцов титановых дентальных имплантатов с МСК исследовали методом экспериментального моделирования на крысах линии Вистар путём изучения динамики регенерации искусственного костного дефекта бедренной кости. Показано, что в области имплантата формировалась грануляционная ткань, которая со временем созревала. В прилегающей материнской ткани активно происходили процессы резорбции. Затем формировалась фиброзная соединительная ткань, кнаружи от которой образовывалась трабекулярная костная ткань, заполняющая вместе с фиброзной костномозговой канал.

Изучение остеогенных свойств титановых пластин с нежизнеспособными (инактивированными этанолом) МСК показало незначительную стимуляцию процессов остеогенеза на ранних сроках заживления, которые к концу наблюдения нивелировались, и состояние костного регенерата незначительно отличалось от полученного в первой группе (титановые пластины без МСК).

Сравнительный анализ течения костно-репаративного процесса у крыс 3-х групп показал, что оно зависит от свойств имплантата, используемого для закрытия костной раны. В отсутствии МСК остеогенез был выражен слабее, в периимплантационной зоне формировались поля фиброзной соединительной ткани, кнаружи от них шло формирование трабекулярной костной ткани, которая вместе с фиброзной заполняла костномозговой канал. Нанесение на поверхность имплантата нежизнеспособных МСК изменяло картину регенерации незначительно и в основном в первые 15 суток. В последующие 30 и 60 суток положительная динамика, выявленная ранее, исчезала и к концу срока наблюдения соотношение новообразованной кости и соединительной ткани уравнивалось. В присутствии МСК происходила выраженная стимуляция ангиогенеза в первые 15 суток (табл.2).

Таблица 2.

Площадь сосудистого русла периимплантационной зоны.

Показатель Сроки эксперимента

15 суток 30 суток 60 суток

контроль 2-я группа контроль 2-я группа контроль 2-я группа

Площадь сосудистого русла в 10 полях зрения (мкм2) - 345±48,6 126±24,1 187±34,4 87±14,0 121±21,6

Как следует из представленной таблицы, к 15 -м суткам эксперимента площадь микроциркуляторного русла является максимальной, достигая в

среднем 345 мкм2. С развитием грубоволокнистой ткани имеет место естественное уменьшение площади сосудистого русла, что еще более заметно при остеотрансформации соединительной ткани. Выраженный ангиоматоз, наблюдаемый в первые 15 суток эксперимента, стимулированный, по-видимому, жизнеспособной клеточной популяцией стволовых клеток, обеспечил полноценный уровень метаболизма в тканях, граничащих с импланта-том, что привело к формированию полноценного костного регенерата, имеющего все структурные компоненты типичной кости, что подтвердило гипотезу, которая легла в основу эксперимента, о стимулирующем влиянии МСК на процессы репаративной регенерации костной ткани.

Задачей следующего этапа работы было экспериментальное выявление влияния МСК на репаративный остеогенез в кости нижней челюсти кроликов. Серия экспериментальных исследований на кости нижней челюсти кроликов в целом повторила результаты эксперимента на бедренной кости крыс, несмотря на то, что существует мнение о низкой репаративной активности челюстных костей при травме. Нанесение на поверхность имплантата нежизнеспособной культуры МСК в конечном счете не усиливало репара-тивные процессы, а даже наоборот, способствовало возникновению лимфо-макрофагалыюй инфильтрации, что является признаком хронического воспалительного процесса. Иная картина наблюдалась в 2-й группе, в которой на имплантат была нанесена жизнеспособная культура МСК: происходила оптимизация регенераторного процесса, который завершался заполнением дефекта ветви челюстной кости костным регенератом в течение 4-х месяцев.

Следовательно, недостаточный регенераторный потенциал костной ткани нижней челюсти можно усилить путем добавления в систему «дефект - имплантат» жизнеспособных МСК.

Проводя биоморфометрические исследования, мы рассматривали костный регенерат не как одно целое, а выделяли 3 части: центральную и 2 периферические или краевые.

На всех сроках наблюдения в группе №3 с нежизнеспособными МСК отмечалось преобладание грубоволокнистой соединительной ткани. Удельный вес соединительнотканной составляющей выражался в цифрах следующим образом: (87±2,4), (30±4,5), (23±1,7) соответственно 1,2,4 месяцы.

На 2 и 4 месяц регенерат характеризовался значительной структурной гетерогенностью. В центральной части регенерата определяется преимущественно фиброзный костный магрикс, который явно преобладает над пластинчатым. Наряду с элементами созревания появляется недифференцированное костное вещество - грубоволокнистая соединительная ткань, которая, как правило, образуется между новообразованной костью и имплантатом в виде прослойки. Причем это происходит параллельно с увеличением удельного веса пластинчатого типа костного матрикса к 4-му месяцу наблюдений (40±9,7) и (53±18,5) (р<0,009). В концевых отделах регенерата к 4-му месяцу, наоборот, происходило уменьшение площади пластинчатого матрикса (46±11,8) и (25±15,2) (р = 0,00084). Параллельно с уменьшением площади пластинчатого матрикса происходило увеличение доли недифференцированного матрикса, и появлялась грубоволокнистая ткань. Эти процессы свидетельствуют о деградации костной ткани наряду с регенерацией. То есть возникает парадоксальная ситуация: параллельно идут 2 процесса: созревания и снижения уровня дифференцировки костной ткани в периферических отделах регенерата.

Таким образом, динамика регенераторных процессов в костном дефекте нижней челюсти во второй группе животных следующая: в 1-й месяц формируется соединительно-тканный регенерат, во 2-й месяц происходит его замещение костным регенератом, 4-й месяц продолжается образование костного регенерата. На 2-м и 4-м месяцах нарастают структурные отличия в разных участках костного регенерата. В центральной части удельный вес пластинчатой костной ткани возрастает, а в периферических участках наоборот уменьшается.

В группе №2 с живыми МСК, в которой на титановую пластину наносили культуру стволовых клеток костного мозга человека, анализ площади фиброзной соединительной ткани в составе регенерата показал, что она сокращалась в сроки 1, 2, 4 месяца и составляла (32±15,8); (9±7,1) до полного отсутствия, что соответствует процессу созревания регенерата.

Изучение центральной части и периферических участков регенерата показало, что они отличаются по структурным детерминантам. Через 1 месяц после имплантации в центре регенерата зрелой костной ткани было больше, чем на периферии, и она составляла (10±4,6) и (7±1,4) соответственно (р=0,002). А соединительнотканные элементы, наоборот, преобладали в периферической части регенерата (21±7,7), а в центральной (15±14,6 р=0,08). На периферии также определялось больше недифференцированного костного вещества (8±2,2), в то время как в центре регенерата (2±1,4 р<0,0001), что свидетельствует о снижении динамики процессов регенерации в центре и на периферии: в центре они протекают несколько быстрее по сравнению с периферическими участками.

Через 2 месяца уменьшается доля пластинчатого матрикса, снижаясь в центральной части с (10±4,6) до (2±0,9); на периферии наоборот, возрастает с (7±1,4) до (12±7,2). При этом в центральной части к 2-м месяцам увеличивается количество недифференцированного костного матрикса с (2±1,4) до (16±5,1) (р<0,0001), а на периферии опять наоборот, недостоверно снижалось с (7±2,2) до (6±2,2), а вот число костных лакун уменьшается как в центральной части, так и в периферической части регенерата с (21±4,4) до (7±4,9) и с (29±5,6) до (13±7,96) соответственно. То же самое относилось и к фиброзной соединительной ткани её доля - уменьшается с (15±4,6) до 0 и с (21±7,7) до (10,3±8,9) (р=0,000817). Таким образом, после 2-х месяцев регенерации процессы костеобразования преобладают в центральных отделах над периферическими.

К 4 месяцам наблюдения регенерат в центральном участке характеризуется преобладанием фиброзно-костного матрикса, отсутствием недиффе-

ротированного костного матрикса, уменьшением доли соединительной ткани. В периферической части регенерата также преобладает фиброзный костный матрикс (52±2,6), но сохраняется недифференцированный костный мат-рикс (4±0,4) и в большем количестве, чем в центре - фиброзная соединительная ткань (5,3±0,7).

Сравнение данных морфометрии по группам кроликов показало, что в 1-й группе регенерация в первый месяц происходила за счет фиброзной соединительной ткани, но к 4-м месяцам удельный вес костного компонента возрастал и составлял (65±8,7). При этом в 3-й группе он был выше, но самый высокий в 2-й группе (с живыми МСК). Соотношение костной и соединительной ткани в регенерате к 4 месяцу было в пользу 2-й группы животных. Что касается пластинчатого и низкодифференцированного костного матрикса в центральной части регенерата они свидетельствовали о досозре-вании: к 2-му и 4-му месяцам количество образовавшихся костных структур увеличивалось.

В периферических участках регенерата образование и созревание костной ткани происходило медленнее, чем в центральных, что было справедливо для всех сроков наблюдения и всех экспериментальных групп. Во всех группах процессы костеобразования не заканчивались к 4-му месяцу наблюдения, но во 2-й и 3-й группах уже в конце первого месяца в регенерате преобладающей была костная ткань, а в 1-й группе - фиброзная соединительная; к концу 2-го и 4-го месяцев во 2-й и 3-й группах нарастало количество костной ткани, а соединительной - сокращалось (рис.4).

центральная часть 2-й месяц

периферическая часть 2-й месяц

центральная часть 4-й месяц

периферическая часть 4-й месяц

□ костный матрикс

□ фиброзный костный матрикс

□ костные лакуны

□ пластинчатая кость

□ недифференцированная кость

Рис.4. Соотношения костных элементов в центральных и периферических зонах регенерата в разные сроки эксперимента.

Таким образом, проведенные экспериментальные исследования и данные биоморфометрического анализа убедительно доказали, что нанесение жизнеспособных стволовых клеток на поверхность титанового имплантата позволяет ускорить процессы регенерации как в центральных, так и в периферических участках дефекта костной ткани нижней челюсти кроликов.

Изучение процессов остеоинтеграции в отдаленные сроки после непосредственной и отсроченной имплантации с использованием жизнеспособных и нежизнеспособных стволовых клеток, а также оценку результатов использования имплантата усовершенствованной конструкции провели в эксперименте на собаках в сроки 3, 6 и 9 месяцев. Проведенное исследование показало, что в срок 3 месяца, по данным СЭМ, выраженность костного компонента интеграции выше при отсроченной имплантации, чем при непосредственной, как без МСК, так и при их использовании.

Рис.5. Многочисленные участки Рис.6. Пространство, отделяющее костные

интеграции на уровне резьбы имплантата трабекулы от имплантата. Образец с МСК. Образец с МСК. Отсроченная Непосредственная имплантация, 3 мес. СЭМ.

имплантация,срок 3 мес.СЭМ. Ув.37,4.

Ув.25,4.

Анализ образцов, полученных через 3 месяца, показал, что во всех образцах обнаружены отчетливые признаки костно-фиброзной интеграции им-плантатов. Выраженность костного компонента интеграции выше при отсроченной имплантации (рис.5), чем при немедленной, как без МСК, так и при их использовании (рис.6).

При использовании МСК в конической части имплантата при непосредственной и отсроченной имплантации, отмечено формирование фиброзной капсулы, которая более выражена при непосредственной имплантации. В резьбовой части костная интеграция хорошо выражена в обоих случаях.

С увеличением срока эксперимента с 3 до 6 месяцев увеличивается интеграция имплантатов с костными структурами. Сравнение числа участков интеграции при непосредственной и отсроченной имплантации на сроке 6

мес. в пользу последней. Изучение костного ложа показало, что общая площадь участков интеграции в образце с МСК больше, чем при отсроченной имплантации без МСК (рис.7,8) и непосредственной имплантации с МСК.

Рис.7. Расположенные у имплантата костные структуры со сформированным рельефом поверхности и многочисленными прободающими волокнами. Образец с МСК, срок 6 мес. Отсроченная имплантация. СЭМ. Ув. 101

Рис.8. Участки контакта костных структур с поверхностью металла на уровне конической части имплантата. Образец без МСК. Отсроченная имплантация. СЭМ. Ув.17,2

Обобщенный сравнительный анализ образцов, полученных через 6 месяцев, показал наличие выраженных признаков костно-фиброзной интеграции имплантатов. Костный компонент интеграции обусловлен образованием участков непосредственного контакта минерализованных костных структур с поверхностью металла. Интеграция имплантатов с костными структурами более выражена, чем в предыдущем сроке. Выраженность костного компонента интеграции без МСК выше при отсроченной имплантации. Выраженность костного компонента интеграции имплантатов с культивированными на их поверхности МСК выше, чем при использовании имплантатов без клеток или с инактивированными клетками.

Сопоставительный анализ образцов, полученных через 9 месяцев, показал, что интеграция имплантатов с костными структурами увеличивается, начиная с 6 месяцев, а затем сохраняется на том же уровне. Выраженность костного компонента интеграции имплантатов в отсутствии МСК выше при отсроченной имплантации. При использовании МСК эти отличия менее выражены. Положительный эффект при использовании МСК проявляется в том,

что после 6 и 9 месяцев костный компонент интеграции больше, чем при использовании имплантатов без клеток или с инактивированными клетками.

Технологические полости в винтовой части имплантата усовершенствованной формы полностью заполняются структурами, что существенно увеличивает площадь контакта (рис.9,10).

1»гв.вки 2.3 4 Е 1 0в44'вЗ ия12-»н

Рис.9. Взаимоотношение имплантата Рис.10. Костные структуры, заполняющие

с костными структурами на сколе образ- технологические полости в имплантате. Им-

ца. Трабекулы заполняют технологиче- плантат усовершенствованной формы с МСК.

ские полости в имплантате. Имплантат Отсроченная имплантация, срок 9 месяцев,

усовершенствованной формы без МСК. СЭМ. Ув.40,8. Отсроченная имплантация, срок 9 месяцев. СЭМ. Ув.25,4.

Таким образом, проведенное морфометрическое исследование образцов и сравнительная оценка полученных результатов показала, что отсроченная имплантация сопровождается более высокой скоростью репаративного процесса, определяемой по формированию полноценной костной ткани, заполняющей пространства между металлом имплантата и тканью хозяина.

Процессы остеоинтеграции идут во всех группах животных с применением разных вариантов имплантатов. В то же время, хорошо видно, что процессы остеотрансформации имеют некоторые различия. Так, при использовании МСК процессы оссификации начинаются раньше, при этом площадь костных участков уже на 3-м месяце значительно выше, чем без использования стволовых клеток. Более того, в группах животных с использованием МСК активнее идут процессы созревания кости, они начинаются в более

ранние сроки и завершаются образованием полноценной пластинчатой кости, обеспечивающей высокую прочность образованной конструкции (рис. 11, 12).

%

юо -( 80

60 40 20 О

3 мес 6 мес 9 мес

□ Типовой И РУсоверш. И

□ Типовой И + МСК □ Усоверш. И + МСК

Рис. 11. Динамика нарастания доли костной ткани в системе имплантат-кость при непосредственной имплантации

80 60 40 20 о

3 мес 6 мес 9 мес

□ Типовой И □Усоверш. И

□ Типовой И + МСК □ Усоверш. И + МСК

Рис. 12. Динамика нарастания доли костной ткани в системе имплантат-кость при отсроченной имплантации

Костная интеграция на всех сроках эксперимента достоверно выше в группах с применением имплантата усовершенствованной конструкции и особенно при нанесении на его поверхности стволовых клеток, которые не только стимулируют ход регенераторного процесса, но и гармонизируют его, поскольку провоцируют более раннее образование зрелых костных структур, обеспечивающих жесткость и стабильность конструкции. Технологические полости в имплантате усовершенствованной формы заполняются костными структурами, что увеличивает площадь поверхности контакта с костью.

выводы

1. Клиническими, рентгенологическими, гистоморфометрическими, ультрамикроскопическими методами установлено, что культивирование ксеноген-ных стволовых клеток на поверхности титанового имплантата, используемого для закрытия костного дефекта, позволяет усилить процессы регенерации костной раны бедренной кости у крыс и нижней челюсти кролика.

2. Морфометрическими исследованиями и статистическим анализом определено, что нанесение стволовых клеток ускоряет процессы регенерации тотально, как в центральных, так и в периферических участках костного дефекта.

3. Во всех экспериментальных группах соотношение костной и соединительной тканей в регенерате нижней челюсти кролика изменялось в зависимости от времени наблюдения и присутствия мезенхимальных стволовых клеток и проявлялось нарастанием количества кости и сокращением соединительной ткани, несмотря на незавершенность костеобразования к концу срока наблюдения (4 месяца).

4. Разработана модифицированная конструкция дентального имплантата, содержащая резервуар для мезенхимальных стволовых клеток, площадь контакта которого с костной тканью увеличена путём нанесения технологических профилей на винтовую поверхность, способствующих врастанию новообразованных костных структур в профили имплантата.

5. Патогенетически обосновано в эксперименте на собаках, что дентальные титановые имплантаты оптимизированной формы с культивированными аутологичными стволовыми клетками жировой ткани на их поверхности ускоряют процессы остеоинтеграции по сравнению с имплантатами без стволовых клеток или с нежизнеспособными стволовыми клетками.

6. Эффект усиления остеоинтеграции более выражен при использовании жизнеспособных аутологичных мезенхимальных стволовых клеток при отсроченной имплантации в сравнении с непосредственной, что подтверждено данными сканирующей электронной микроскопии и микрофокусной рентгенографии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для проведения клинической апробации применения дентальных им-плантатов с мезенхимальными стволовыми клетками с целью оптимизации процесса интеграции с костной тканью рекомендуем использовать имплантаты усовершенствованной формы.

2. Поверхность имплантатов рекомендуем обрабатывать пескоструйно, так как это наиболее технологично, существенно способствует адгезии стволовых клеток и оказывает стимулирующее действие на пролиферацию клеток.

3. При нанесении мезенхимальных стволовых клеток на поверхность дентальных имплантатов индукцию остеогенной дифференцировки стволовых клеток следует проводить в течение 18 суток.

4. Достоверным методом контроля динамики остеинтегративных процессов является микрофокусная рентгенография: полученные этим методом данные достоверно кореллируют с данными сканирующей микроскопии.

5. Для апробации усовершенствованных методик по усилению остеоинте-грации внутрикостных дентальных имплантатов в экспериментах на кроликах или собаках достаточно наблюдения сроком 6 месяцев, т.к. динамика основных остеоинтегративных процессов нарастает постепенно с максимумом на этом сроке, с последующей стабилизацией процесса.

6. Перед применением клеточных технологий необходимо проверять жизнеспособность используемых мезенхимальных стволовых клеток, так как значимый эффект достигается при использовании «живых» клеток, инак-тивированные клетки имеют слабовыраженное стимулирующее действие.

7. Жизнеспособные аутологичные мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани, дифференцированные в остеогенном направлении, нанесенные на дентальные имплантаты усовершенствованной формы, поверхность которых обработана пескоструйно, являются оптимальными для клинического испытания.

8. При использовании титановых дентальных имплантатов, в том числе с нанесенными на их поверхность мезенхимальными стволовыми клетками, предпочтительней остается методика отсроченной внутрикостной имплантации.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Воложин А.И., Денисов - Никольский Ю.И., Татаренко -Козьмина Т.Ю., Лосев Ф.Ф., Матвеева В.Н., Докторов A.A., Дружинина P.A., Матвейчук И.Б., Жилкин Б.А., Краснов А.П., Мальгинов H.H. Клеточные технологии в создании новых материалов для костной пластики // Болезни цивилизации в аспекте учения В.И. Вернадского: Материалы III междунар. конф., Москва, октябрь 2005 г. - М. -С.35-37.

2. Воложин А.И., Татаренко - Козьмина Т.Ю., Денисов - Никольский Ю.И., Лосев В.Ф., Мальгинов H.H., Докторов A.A. Возможность применения стволовых мезенхимальных клеток костного мозга в стоматологии // Актуальные вопросы стоматологии: Материалы межрегион, конф., посвящ. 100-летию создания Саратовского одонтологического общества, ноябрь 2005 г.- Саратов. - С. 113-114.

3. Мальгинов H.H., Фионова Э.В., Ожелевская С.А., Чепель A.A., Воложин Г.А. Клеточные технологии в оценке биосовместимости остеопластических материалов // Болезни цивилизации в аспекте учения В.И. Вернадского: Материалы III междунар. конф., Москва, октябрь 2005 г. - М. - С. 238-240.

4. Воложин А.И., Денисов - Никольский Ю.И., Докторов A.A.,

Лосев Ф.Ф., Татаренко -Козьмина Т.Ю., Матвеева В.Н., Мальгинов H.H., Холодов C.B., Вольперт У.В. Применение мезенхимальных стволовых клеток для придания остеоиндуктивных свойств имплан-тационным материалам // Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении: Материалы ежегодной Всерос. и междунар. науч. конф. - М.:РГМУ, 2006. - С. 56-59.

5. Волошин А.И., Денисов - Никольский Ю.И., Лосев Ф.Ф., Докторов A.A., Татаренко - Козьмина Т.Ю., Матвеева В.Н., Мальги-нов H.H., Холодов C.B. Оптимизация костной регенерации с помощью стволовых клеток-предшественников остеобластов, фиксированных на композитных материалах // Cathedra. - 2006. - № 1. -С.37-42.

6. Денисов - Никольский Ю.И., Татаренко - Козьмина Т.Ю., Воложин А.И., Лосев В.Ф., Лосев Ф.Ф., Докторов A.A., Мальгинов H.H., Холодов C.B., Вольперт У.В., Фролова E.H. Технология применения мезенхимальных стромальных клеток для усиления остеоинте-грации имплантационных материалов // Высокие медицинские технологии XXI века: Материалы пятой междунар. конф., Испания, Бе-нидорм. - 2006. - С.29.

7. Денисов - Никольский Ю.И., Татаренко - Козьмина Т.Ю., Воложин А.И., Докторов A.A., Мальгинов H.H., Краснов А.П. Влияние гидроксиапатита в составе биостабильных композитов на заселение и пролиферацию мезенхимальных стволовых клеток // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2007. - № 2. - С. 8387.

8. Воложин А.И., Денисов - Никольский Ю.И., Докторов A.A., Мальгинов H.H., Лосев Ф.Ф., Татаренко - Козьмина Т.Ю., Жилкин Б.А., Тетюхин Д.В., Вольперт У.В., Янушевич О.О., Фролова E.H., Воложин Г.А. Характеристика пролиферативных свойств стволовых клеток костного мозга на поверхности титана и золота // Материалы IX ежегодного научного форума «Стоматология 2007», посвященного 45 - летию ЦНИИС. - М., 2007. - С. 226-229.

9. Воложин А.И., Татаренко - Козьмина Т.Ю., Денисов - Никольский Ю.И., Мальгинов H.H., Докторов A.A., Лосев В.Ф., Тетюхин Д.В., Вольперт У.В., Фролова E.H., Янушевич О.О. Цитотоксичность имплантационных материалов на основе биосовместимых металлов и их влияние на прикрепление и пролиферацию мезенхимальных стволовых клеток человека // Актуальные вопросы тканевой и клеточной

трансплантологии: Материалы III Всерос. симпоз. с междунар. участием, Москва, 25-26 апреля 2007 г. - С. 60.

10. Мальгинов H.H., Фролова E.H. Остеостимулирующая активность ксеногенных мезенхимальных стволовых клеток костного мозга И Материалы IX ежегодного научного форума «Стоматология 2007», посвященного 45 - летию ЦНИИС. - М., 2007. - С. 277-279.

11. Мальгинов H.H., Фролова E.H. Репаративная регенерация кости крыс при введении титановых имплантатов, заселенных ксено-генными мезенхимальными стволовыми клетками // Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии : Материалы III Всерос. симпоз. с междунар. участием, Москва, 25-26 апреля 2007 г. - С. 83-84.

12. Мальгинов H.H., Фролова E.H., Матвеева В.Н. Остеостимулирующая активность мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, культивированных на титановом носителе // Здоровье и образование в XXI веке. Концепции болезней цивилизации: науч. тр. VIII междунар. конгресса, Москва, 14-17 ноября. - С. 407- 408.

13. Матвеева В.Н., Мальгинов H.H., Холодов C.B., Лосев В.Ф., Татарен-ко - Козьмина Т.Ю. Применение мезенхимальных стромальных клеток, нанесенных на композиционные материалы, для оптимизации регенерации костной ткани // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2007. - № 1. - С. 8-10.

14. Буланова И.М., Воложин А.И., Мальгинов H.H. Микрофокусная рентгенография и рентгеновская компьютерная томография при оценке репаративной регенерации костной ткани // Инновационные подходы в лучевой диагностике: Материалы науч.- практ. конф., 18-19 августа 2008 г., Ереван. - С. 25

15. Васильев А.Ю., Буланова И.М., Воложин А.И., Мальгинов H.H. Микрофокусная рентгенография и рентгеновская компьютерная томография при оценке репаративной регенерации костной ткани в эксперименте // Лучевая диагностика в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии. В рамках реализации инновационно-образовательной программы МГМСУ: Межрегион, науч.- практ.

конф. с междунар. участием, Москва, 18 декабря 2008 г. - М. - С. 2325.

16. Воложин А.Ю. Васильев, И.М. Буланова, Мальгинов H.H., Киселева Е.В., Черняев С.Е., Никулина О.М., Тарасенко И.В. Возможности цифровой микрофокусной рентгенографии при оценке ре-паративной регенерации костной ткани в эксперименте// Вестник рентгенологии и радиологии. - 2008, № 2-3. - С. 21-25.

17. Григорьян A.C., Мальгинов H.H., Воложин А.И., Вольперт У.В., Янушевич О.О., Заживление костных дефектов ветви нижней челюсти кроликов под биоиженерными конструкциями из титана и золотого сплава с ксеногенными мезенхимальными стволовыми клетками // Российский стоматологический журнал. - 2008. - № 5. - С. 5-7.

18. Мальгинов H.H., Григорьян A.C., Фролова E.H. Применение мезенхимальных стволовых клеток для ускорения остеорепаратив-ного процесса при «критических» дефектах челюсти в эксперименте // Технологии XXI века в стоматологии и челюстно-лицевой хирургии: Материалы науч. - практ. конф. стоматологов и челюстно-лицевых хирургов ЦФО РФ с междунар. участием, 30-31 октября, 2008 г.-Тверь, 2008.-С. 81.

19. Мальгинов Н. Н., Киселева Е.В., Черняев С.Е., Григорьян A.C., Воложин Г.А. Процесс заживления дефектов теменной кости кроликов при имплантации в них гранул желатина с аллогенными стволовыми клетками // Инновационные технологии в трансплантологии органов, тканей и клеток, июнь 2008 г., Самара. - С. 7.

20. Мальгинов H.H., Фролова E.H., Григорьян A.C., Воложин Г.А., Матвеева В.Н., Калашникова Т.С., Воложин А.И. Ксеногенные мезенхимальные стромальные клетки на поверхности титана как инициатор остеогенеза (экспериментальное исследование) // Образование, наука и практика в стоматологии по объединенной тематике «Имплантология в стоматологии»: Сб. тр. V Всерос. науч. -практ. конф., 12-15 февраля 2008 г. -М., 2008. - С. 58-61.

21. Мальгинов H.H., Фролова E.H. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга на титановых носителях активируют заживление костного дефекта челюсти кроликов в эксперименте // Инновационные технологии в трансплантологии органов, тканей и клеток, июнь 2008 г., Самара. - С. 18-19.

22. Фролова E.H., Мальгинов H.H., Григорьян A.C., Киселева Е.В., Докторов A.A., Матвеева В.Н., Воложин А.И. Заживление костного дефекта в челюсти кроликов под влиянием ксеногенных ме-зенхимальных стволовых клеток костного мозга, культивированных на титановых носителях // Российский стоматологический журнал. - 2008. - № 3. - С. 12-14.

23. Васильев А.Ю., Буланова И.М., Тарасенко И.В., Воложин А.И. Микрофокусная рентгенография в оценке репаративной регенерации костной ткани челюсти в эксперименте // Материалы III Всероссийского национального конгресса лучевых диагностов и терапевтов «Радиология - 2009», Москва 27-28 мая 2009 г.-С. 10.

24. Вольперт У.В., Янушевич О.О., Григорьян A.C., Мальгинов H.H., Воложин А.И. Заживление костных дефектов нижней челюсти кроликов под биоиженерными конструкциями из титана и золотого сплава с ксеногенными мезенхимальньши стволовыми клетками // Стоматология. - 2009. - № 1. - С. 4-8.

25. Васильев А.Ю., Буланова И.М., Мальгинов H.H., Тарасенко И.В., Тарасенко C.B., Киселева Е.В., Дробышев А.Ю., Воложин А.И. Оценка репаративной регенерации костной ткани челюсти с помощью микрофокусной рентгенографии в эксперименте // Стоматология. - 2009. - № 4. - С. 24-27.

26. Мальгинов H.H., Григорьян A.C., Фролова E.H., Лебеденко И.Ю., Матвеева В.Н., Воложин А.И. Структурная организация костного регенерата в экспериментально воспроизведенных дефектах ветви нижней челюсти под влиянием ксеногенных стромальных клеток // Стоматология, - 2009. - № 4. - С.34-38.

27. Васильев А.Ю., Буланова И.М., Мальгинов H.H., Киселева Е.В., Черняев С.Е., Никулина О.М., Воложин А.И., Серова Н.С. Оценка костной ткани в эксперименте с помощью цифровой микрофокусной рентгенографии и компьютерной томографии // Медицинская радиология и радиационная безопасность.-2010. - № 1. - С.31-35.

28. Воложин А.И., Васильев А.Ю., Буланова И.М., Мальгинов H.H., Григорьян A.C., Киселева Е.В., Черняев С.Е., Тарасенко И.В. Оценка репаративной регенерации костной ткани с помощью микрофокусной рентгенографии в эксперименте с использованием ау-тологичных и аллогенных мезенхимальных стволовых клеток // Российская стоматология. - 2010. - № 1. - С.50-55.

29. Гринина О.В., Григорьян A.C., Воложин А. И., Васильев А.Ю., Мальгинов H.H., Киселева Е.В., Тарасенко И.В., Буланова И.М., Черняев С.Е. Использование мезенхимальных стволовых клеток для активации репаративных процессов костной ткани челюсти в эксперименте // Стоматология. - 2010. - № 1. - С.10-14.

30. Арутюнов С.Д., Янушевич О.О., Лебеденко И.Ю., Мальгинов H.H. Патент РФ на изобретение № 2405497 «Дентальный имплантат» // Официальный бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам «Изобретения, полезные модели». -10.12.2010.- № 34.

31. Мальгинов H.H., Воложин А.И., Лебеденко И.Ю., Васильев А.Ю., Черняев С.Е., Киселева Е.В., Серова Н.С., Петровская В.В., Перова Н.Г. Экспериментальное обоснование применения мезенхимальных стволовых клеток и усовершенствованных титановых имплантатов для ускорения остеоинтеграции // Российский стоматологический журнал. - 2011. - № 2. - С. 13-15.

Отпечатано в РИО МГМСУ 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20, стр. 1. Заказ № 122. Тираж 100 экз.