Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Сравнительная характеристика кардиотропных эффектов уридина и уридиновых нуклеотидов

На правах рукописи

РОДИОНОВА Ольга Михайловна

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАРДИОТРОПНЫХ ЭФФЕКТОВ УРИДННА И УРИДИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ

14 00 25 - фармакология, клиническая фармакология 03 00 13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2007

2 4 МАЙ 2007

003060031

Работа выполнена в отделе нейрофармакологии им С В Аничкова ГУ Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН

Научные руководители: Заслуженный деятель науки РФ,

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, Николай Сергеевич Сапронов

Лауреат Государственной премии СССР, доктор медицинских наук, Самойленко Анатолий Васильевич

Официальные оппоненты: Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор, Цырлин Виталий Александрович

Доктор биологических наук, профессор, Кривченко Александр Иванович

Ведущее научное учреяедение: Санкт-Петербургская Государственная

медицинская академия им И И Мечникова

Защита состоится «. 3-/ » ¿^¿У^^ОО г в часов на заседании

Диссертационного совета Д001 022 03 при ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН в конференц-зале ГУ НИИЭМ РАМН по адресу 197376 Санкт-Петербург, Каменноостровский пр , 69/71

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу 197376 Санкт-Петербург, ул Академика Павлова, 12

Автореферат разослан «

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

шЫ)

Л В Пучкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. По данным Всемирной Организации Здравоохранения около половины всех причин человеческих смертей в высокоразвитых странах и почти 60% в России приходится на болезни системы кровообращения, среди которых первое место занимает острая ишемия миокарда (Захаров, 2001) При данном патологическом состоянии лекарственная терапия направлена прежде всего на повышение выживаемости миокарда и ограничение зоны инфаркта, снижение нагрузки на сердце и ус гранение нарушений сердечного ритма Наряду с применением традиционных фармпрепаратов, которые улучшают коронарное кровоснабжение и максимально снижают потребность кардиомиоцитов в кислороде и энергетических субстратах, большое внимание уделяется метаболической защите миокарда Исследование возможностей лечебного применения природных метаболитов, являющихся естественными факторами адаптации миокарда к патологическим воздействиям, определяется возрастающим интересом к использованию в кардиофармакологии эндогенных регуляторов (Галенко-Ярошевский, Гацура, 2001) К числу таких соединений можно отнести нуклеозиды и нуклеотиды, которые обладают большим набором регуляторных функций, реализующихся на рецепторном уровне, при регуляции метаболических процессов и пластического обмена В настоящее время хорошо изучены кардиотропные свойства таких представителей этого класса соединений, как аденозин, аденозин-монофосфат, аденозин-трифосфат, гуанозин-монофосфат, инозин, а созданные на их основе лекарственные препараты используются в клинике (Николаева и др , 1975, Stanley et al, 1997, Lopaschuc, 1998)

Потенциальными средствами профилактики и терапии инфаркта миокарда, а также постишемического реперфузионного повреждения сердца могут выступать пиримидиновый нуклеозид уридин и его фосфонуклеотиды уридин-5'-монофосфат (УМФ), уридин-5-дифосфат (УДФ) и уридин-5'-трифосфат (УТФ) В экспериментальных и клинических исследованиях была установлена высокая терапевтическая активность уридина и его нуклеотидов при центральной и периферической нейропатиях, дисфункции печени, нарушении репродуктивной функции, при врожденной оротоацидурии и цистическом фиброзе (Connolly, Duley, 1999) В то же время фармакологическая активность этих соединений в отношении сердечнососудистой системы остается малоизученной

Известно, что в условиях ишемии уридин усиливает липидный и углеводный обмен в миокарде, предотвращая гибель кардиомиоцитов, а также восстанавливает функциональную активность мышечных волокон (Зайчик, Чуринов, 2000) Имеются данные о том, что уридин и его нуклеотиды поддерживают энергетический метаболизм миокарда, особенно в условиях дефицита кислорода (Aussedat et al, 1984) Уридиновые нуклеотиды участвуют в синтезе РНК и биомембран, что является важным элементом в регуляции как нормального физиологического, так и патологического состояний (Connolly,

Duley, 1999) В последнее время возрос интерес к УДФ и УТФ, являющимися агонистами пиримидиновых P2U - рецепторов (Abracchio, Burnstock, 1998, Kugelgen, Wetter, 2000, Yitzhaki et al, 2005) Этот тип рецепторов был обнаружен в кардиомиоцитах (Yitzhaki et al, 2005), эндотелии и гладкомышечных клетках кровеносных сосудов (Webb et al ,1996, Kugelgen, Wetter, 2000) Активация пиримидиновых рецепторов капилляров и других кровеносных сосудов приводит к улучшению кровотока в кардиоваскулярной системе (Froldi et al, 1994, Зиганшин и др , 1998, 1999) УТФ и УДФ, находясь во внеклеточном пространстве, могут играть роль универсальных модуляторов (Anderson, Parkinson, 1997)

Большое значение в защите миокарда от ишемического и постишемического повреждения придается ишемической адаптации (нрекондиции) Конечным эффектором в реализации ее кардиопротективных влияний выступают АТФ-зависимые калиевые каналы (Катф каналы) (Gross, Fryer, 1999) Принципиально новым в лечении и предупреждении сердечных заболеваний является развиваемый в последнее время подход, связанный с активацией этих каналов (Garlid et al, 1997, Liu et al, 1998, Fryer et a! , 2000, Маслов и др , 2002) Имеется предположение, что нуклеотид уридина УДФ играет роль эндогенного регулятора АТФ-зависимых К+каналов (Mnonova et al, 1999)

Способность уридина проникать внутрь клетки и включаться в различные метаболические пути, наличие у его нуклеотидов рецепторного механизма действия, а также предположение о возможности активации с помощью уридиновых соединений внутриклеточных процессов адаптации к ишемии делают этот класс соединений перспективным для разработки новых кардиотропных лекарственных препаратов

Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение кардиотропных эффектов уридина, УМФ, УДФ и УТФ при ишемическом и реперфузионном повреждении миокарда

В задачи исследования входило:

1 Сравнительное исследование действия уридина и уридиновых нуклеотидов на сократительную способность изолированных перфузируемых сердец крыс на моделях регионарной и тотальной ишемии с последующей реперфузией

2 Оценка антиаритмического и проаритмогенного действия уридина и уридиновых нуклеотидов на изолированных перфузируемых сердцах крыс при моделировании ишемических и реперфузионных аритмий

3 Сравнительное изучение антиишемического и антиаритмического действий уридина, УМФ, УДФ, УТФ на модели острого инфаркта миокарда у крыс

4 Изучение возможного участия уридина и его нуклеотидов в регуляции митохондриальных АТФ-зависимых К+ каналов

Научная новнзна. Впервые проведено сравнительное изучение кардиопротекторного действия уридина, УМФ, УДФ и У1Ф при ишемическом и реперфузионном повреждении миокарда Показано, что все испытуемые соединения препятствуют депрессии сократительной функции миокарда при регионарной ишемии изолированных перфузируемых сердец крыс Уридин и УМФ предотвращают развитие контрактуры УДФ и УТФ усиливают коронарный ток

Впервые показано, что уридин и УМФ на модели регионорной и тотальной ишемии изолированных перфузируемых сердец крыс уменьшают развитие реперфузионных повреждений миокарда, ограничивая возникновение реперфузионных аритмий и препятствуя развитию миокардиального станнинга

На модели острого инфаркта миокарда у крыс впервые обнаружено, что наибольшей кардиопротекторной активностью обладают уридин и УМФ, которые оказывают как антиишемическое, так и антиаритмическое действие В ходе исследования показано, что антиишемическая активность уридина и УМФ связана с активацией АТФ-зависимых К+ каналов митохондрий

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Уридин и его нуклеотиды ограничивают снижение сократительной функции миокарда при регионарной ишемии изолированных перфузируемых сердец крыс

2 Уридин и УМФ предупреждают развитие миокардиального станнинга при реперфузии после тотальной ишемии

3 Уридин и его нуклеотиды обладают антиаритмическим действием в отношении ранних постокклюзионных аритмий Уридин и УМФ проявляют антиаритмический, а УТФ проаритмогенный эффекты при реперфузионных нарушениях сердечного ритма

4 Уридин и УМФ оказывают антиишемическое действие на ранних сроках острой ишемии миокарда

5 Механизм кардиопротекторной активности уридина и УМФ связан с активацией АТФ-зависимых К+ каналов митохондрий

Личный вклад соискателя. Соискателем были выполнены анализ литературы по теме исследования, планирование и проведение экспериментов, статистическая обработка и анализ полученных результатов, а также основные публикации по теме работы Автор выражает признательность профессору ГД Мироновой - руководителю лаборатории митохондриального транспорта Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино) за помощь в проведении работы на нативных митохондриях и на модельной системе бислойных липидных мембран (БЛМ)

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные свидетельствуют о перспективности дальнейшего доклинического углубленного изучения уридина и УМФ с целью разработки на их основе новых кардиопротекторных средств

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на Всероссийской научной конференции "Нейрофармакология в XXI веке" посвященной 110-летию академика С В Аничкова (Санкт-Петербург, 2002), на Международных конференциях "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2003, 2005), на Конгрессе кардиологов стран СНГ (Санкт-Петербург, 2003), на Российском национальном конгрессе кардиологов (Москва, 2003), на Международной конференции "Biological Motility" (Пущино, 2004), на 4-ой Международной конференции Mitochondrial Physiology (Vorarlberg, Austria,

2005), на 8-ом Международном конгрессе по адаптационной медицине (Москва, 2006), на 2-ой Российско-китайской научной конференции «Фундаментальная фармакология и фармация — клинической практике» (Пермь,

2006), на 6-ой Международной конференции «Hypoxia in Medicine» (Milan, Italy, 2006) По теме диссертации опубликовано 14 научных работ

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста, иллюстрирована 17 рисунками, содержит 12 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы, содержащей результаты собственных исследований и их обсуждения, а также выводов и списка цитированной литературы, из которых 40 отечественных и 174 иностранных источников

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты выполнены на 535 самцах крыс линии Вистар массой 250-300 г и на 85 беспородных мышах-самцах массой 18-20 г (питомник "Рапполово" РАМН) Исследования проводились in vivo на крысах и мышах, in vitro на изолированных сердцах крыс и на нативных сердечных митохондриях, выделенных из сердец крыс При выполнении работы использованы следующие методы

Острая регионарная и тотальная ишемия сердца крыс (in vitro) Получение препаратов изолированного перфузируемого сердца Модели острой регионарной и тотальной ишемии воспроизводились на изолированных перфузируемых по Лангендорфу (Dorling, Dehnert, 1988) сердцах крыс Животных наркотизировали парами эфира, после чего вскрывали грудную клетку, извлекали сердце, промывали его охлажденным до 4°С раствором Кребса-Хенселейта и соединяли с системой для перфузии Перфузию осуществляли раствором Кребса-Хенселейта (состав в ммоль/л NaCl — 118 0, KCl - 4 7, СаС12 - 2 5, КН2Р04- 1 2, MgS04 - 1 6, NaHC03 - 25 0, Na-ЭДТА -0 5, глюкоза - 5 5 ммоль/л, РН 7 4), оксигенированным смесью 95% 02 и 5% СОг при 37°С и постоянном давлении 97 см водн ст Через разрез левого предсердия в полость левого желудочка помещали латексный баллончик, соединенный катетором с полупроводниковым преобразователем давления ЕМТ-746 («Siemens-Elema», Швеция)

Модель регионарной ишемии Для создания модели регионарной ишемии левого желудочка после 30- минутного периода стабилизации изолированного

4

перфузируемого сердца, осуществляли перевязку нисходящей ветви левой коронарной артерии После окклюзии сердца продолжали перфузировать раствором Кребса-Хенселейта, в который добавляли уридин, УМФ, УДФ или УТФ в концентрации 50 мкмоль/л Восстановление коронарного кровотока осуществляли через 60 мин путем снятия лигатуры Наблюдение продолжалось в течение 60 мин На данной модели оценивали влияние препаратов на сократительную функцию сердца в период острой ишемии, ранние постокклюзионные и реперфузионные нарушения ритма

Модель тотальной ишемии Тотальную ишемию воспроизводили после 30-минутного периода стабилизации изолированного перфузируемого сердца путем прекращения подачи перфузионного раствора в течение 30 мин (сердца находились при 37°С) После этого осуществляли реперфузию сердца основным раствором в течение 30 мин (контрольная группа) или раствором Кребса-Хенселейта, содержащим уридин, УМФ, УДФ или УТФ в концентрации 50 мкмоль/л В период реперфузии определяли влияние препаратов на параметры, характеризующие сократительную функцию миокарда и реперфузионные нарушения ритма

Определение параметров сократительной функции сердца На 5, 10, 20, 30 и 60 мин после окклюзии левой коронарной артерии (модель регионарной ишемии), а также на 10, 20 и 30 мин реперфузии (модель тотальной ишемии) определяли конечное диастолическое давление (КДД), показатели сократительной функции максимальную скорость сокращения (+dp/dtmax) и расслабления (-dp/dtmax) миокарда Развиваемое давление в полости левого желудочка (РД) определяли как разницу между систолическим давлением (Рсист) и КДД Исходную величину КДД устанавливали на уровне 10 мм рт ст В ходе эксперимента определяли частоту сердечных сокращений (ЧСС) и величину коронарного тока (КТ), измеряя количество перфузата, протекающего через сосуды сердца за 1 мин

Определение нарушений сердечного ритма Антиаритмическое или проаритмогенное действие препаратов оценивали в течение 30 мин при регионарной ишемии миокарда левого желудочка и 30 мин последующей реперфузии, а также в течение 30 мин при реперфузии сердца после тотальной ишемии С этой целью регистрировали нарушения ритма в режиме мониторинга Оценивали частоту возникновения и выраженность желудочковой экстрасистолии (ЭС), желудочковой тахикардии (ЖТ) и фибрилляции желудочков (ФЖ) Экспериментальный инфаркт миокарда (in vivo)

Моделирование острого инфаркта миокарда Острый инфаркт миокарда моделировали у крыс по методу Селье (Selye et al, 1960) Животных наркотизировали этаминалом натрия (50 мг/кг), вскрывали грудную клетку, разрезали перикард, накладывали лигатуру на нисходящую ветвь левой коронарной артерии (ЖА) на уровне нижнего края ушка левого предсердия на 60 минут Все оперативные вмешательства осуществляли при искусственной вентиляции легких Тестируемые соединения (уридин, УМФ, УДФ, УТФ), а также ингибиторы АТФ-зависимых К+ каналов вводили наркотизированному

5

животному в яремную вену через полиэтиленовый катетер, заполненный гепаринизированным физиологическим раствором Уридин, УМФ, УДФ или УТФ вводили в дозе 30 мг/кг за 5 мин до окклюзии или сразу после нее Неселективный ингибитор Катф каналов глибенкламид растворяли в смеси из полиэтиленгликоля (ПЭГ), 95% этилового спирта, 0 1 N раствора NaOH и 0 9% физиологического раствора (в соотношении 1112) (Schultz et al ,1997) и вводили в дозе 1 мг/кг за 35 мин до перевязки Селективный ингибитор митохондриальных АТФ-зависимых К+ каналов 5-гидроксидеканоат (5-HD) растворяли в 0 9% физиологическом растворе и применяли в дозе 5мг/кг за 10 мин до окклюзии Дозы и время введения ингибиторов были выбраны на основании данных литературы как оптимальные для оказания ингибирующего действия (Schultz et al, 1997, Fryer et al, 2000, Tsai et al, 2002) Оценка антиишемического действия уридина и его нуклеотидов Определение амплитуды Т-волны на ЭКГ Запись ЭКГ осуществляли до окклюзии и на 3, 30 и 60 мин после окклюзии во И стандартном отведении со скоростью 50 мм/сек на кардиографе ЭК-2Т-02 (Россия) Одной из особенностей ЭКГ крыс является отсутствие выраженного ST- сегмента (Norman et al, 1961) Поэтому для оценки степени ишемических нарушений использовали измерение амплитуды Т-волны по отношению к изолинии (Bemfield, Lehr, 1968)

Определение объема поврежденного миокарда. Объем поврежденного миокарда оценивали с помощью планиметрии серийных срезов желудочков сердца после гистохимического определения в них фермента гликоген-фосфорилазы по методу Лойда и соавторов (Loida et al, 1982) Через 60 мин после окклюзии сердца крыс замораживали в криостате при - 20°С в течение 30 мин, затем разрезали на 4 сегмента от верхушки к основанию и с каждого сегмента изготавливали по 1 срезу толщиной 50 мкм В каждом срезе планиметрически определяли площадь участка с потерей ферментативной активности Индекс ишемического повреждения миокарда (ИПМ) рассчитывали по формуле ИПМ= Х3|.4/лин вел2 х вес сердца, где S1.4- сумма площадей зоны повреждения

Определение нарушений сердечного ритма Антиаритмическое действие препаратов оценивали по изменению частоты возникновения, выраженности и длительности ранних постокклюзионных аритмий Для их регистрации запись ЭКГ производили в течение 30 мин после окклюзии в непрерывном режиме со скоростью 25 мм/сек На ЭКГ определяли время до начала аритмий (латентный период), их общую продолжительность, количество желудочковых экстрасистол (ЭС), суммарную продолжительность желудочковой тахикардии (ЖТ) и суммарную продолжительность фибрилляции желудочков (ФЖ), а также частоту возникновения нарушений сердечного ритма Модель энергозависимого набухания митохондрий

Определение энергозависимого входа калия в изолированных митохондриях Митохондрии выделяли из гомогената сердца крыс общепринятым методом дифференциального центрифугирования Среда выделения митохондрий содержала 300 мМ сахарозы, 2 мМ этиленгликольтетрауксусной кислоты

б

(ЭГТА), 10 мМ гидроксиэтилпиперазинэтана (Hepes), 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (БСА), рН 7 2

Действие уридина и его нуклеотидов на митохондриальные АТФ-зависимые К+ каналы оценивали на модели энергозависимого набухания митохондрий Проницаемость митохондриальной мембраны для калия определяли спектрофотометрическим методом по скорости набухания митохондрий в гипотонической среде с КС1 Кинетику набухания регистрировали по изменению оптической плотности суспензии митохондрий при длине волны 520 нм при постоянном перемешивании и термостатировании при 30°С на спектрофотометре «Uvikon» (Италия)

Ход определения В кювету (контроль) добавляли следующие реагенты среду набухания (КС1 50 мМ, Hepes 5 мМ, NaH2P04 5 мМ, янтарная кислота 5 мМ, ЭГТА 2мМ, MgCl2 0 5 мМ), цитохром С 5мкМ, ротенон 2мМ и митохондрий - 10 мкл После регистрации показаний спектрофотометра в другую кювету со средой набухания добавляли 10 мкл ЮОмМ АТФ и 10 мкл митохондрий и вновь регистрировали показания при отсутствии набухания митохондрий Уридин, УМФ, УДФ и УТФ добавляли в кювету в количестве 30 мкМ после АТФ Скорость набухания измеряли в единицах изменения оптической плотности раствора за единицу времени при длине волны 520 нм по формуле V= [ДЕ520НМ/МИН Б мх], где Б мх - кол-во белка митохондрий (мг)

Концентрацию белка определяли по методу Лоури (Loury, 1951) Колориметрию растворов проводили на спектрофотометре Baclcman-35 при длине волны 750 нм, используя бычий сывороточный альбумин (БСА) в качестве стандарта

Реконструирование каналообразующей субъединицы митохондриального АТФ-зависимого К+ канала в бислойные липидиые мембраны (БЛМ) Ион-транспортирующую активность белка изучали путем измерения электрических характеристик БЛМ, модифицированных исследуемым митохондриальным АТФ-зависимым К+ каналом БЛМ формировали методом Мюллера (Muellei et al, 1964) из смеси 90 % общих липидов мозга и 10 % кардиолипина в н-декане на перегородке тефлоновой кюветы Наблюдение за формированием БЛМ вели в отраженном свете с помощью микроскопа МБС- 1

После образования БЛМ оба отсека кюветы заполняли раствором, содержащим по 3 мл ЮОмМ КС1, 20 мМ трис- НС1 буфера, рН 7 4 В один из отсеков с инкубационной средой добавляли К+- транспортирующий белок и модуляторы канала Проводимость немодифицированной мембраны составляла 1-3 пСм Свойства модифицированной мембраны оценивали по потенциалу, возникающему на мембране при создании градиента ионов между двумя сторонами мембраны Величину тока и потенциал измеряли с использованием операционного усилителя МАХ406 Регистрация тока на выходе усилителя осуществлялась с помощью компьютера IBM РС/АТ286, соединенного с экспериментальной установкой аналого-цифровым преобразователем Эксперименты на изолированных митохондриях и БЛМ выполнены в лаборатории митохондриального транспорта (рук - профессор Г Д Миронова) Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино)

7

Статистическую обработку результатов производили с использованием пакета прикладных программ Б1а1§гар1нсз (Версия 3,0) Вычисляли среднюю арифметическую и среднюю квадратичную ошибку полученных данных (М± ш) Достоверность различий между средними двух выборок оценивали по критериям Стьюдента и Фишера Различия между группами считали статистически достоверными при р<0 05

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние уридина и его нуклеотидов на сократительную способность изолированных перфузируемых сердец крыс при регионарной ишемии

Уридин и его нуклеотиды (50 мкмоль/л) ослабляли угнетение инотропной функции миокарда в условиях регионарной ишемии изолированных перфузируемых сердец крыс К 60-й мин ишемии величина развиваемого давления (РД) в полости левого желудочка во всех подопытных группах превышала соответствующий показатель в контроле в 2-2 5 раза, а максимальная скорость сокращения миокарда (+dP/dt max) была выше, чем в контроле в 5 раз (табл 1) Необходимо подчеркнуть, что, несмотря на некоторые особенности, в динамике изменения показателей сократительной функции миокарда, которые наблюдались при введении препаратов, к концу срока наблюдения различия в их эффективности были незначительными Так, к 60 минуте значения +dP/dtmax составляли 57, 61, 59 и 70 % от исходного уровня для уридина, УМФ, УДФ и УТФ соответственно

Уридин и его нуклеотиды различным образом влияли на процессы расслабления ишемизированного миокарда Уридин и УМФ поддерживали максимальную скорость расслабления и конечное диастолическое давление на исходном уровне в течение всего эксперимента УДФ был мало эффективен, в то время как УТФ ускорял развитие нарушений по сравнению с контролем(табл 1) Уридин и УМФ достоверно не влияли на коронарный кровоток (КТ) При действии УДФ КТ уменьшался на 64%, а в ответ на УТФ -лишь на 37% по сравнению с 82% в контроле Уридин и его нуклеотиды незначительно влияли на ЧСС, которая во всех группах имела тенденцию к снижению и на 30-60-й минуте была достоверно меньше, чем до окклюзии коронарной артерии

Таким образом, все испытуемые соединения предотвращали депрессию сократительной функции миокарда при ишемии, а уридин и УМФ препятствовали нарушению процессов расслабления миокарда, возможно, вследствие предотвращения развития контрактуры УДФ и в большей степени УТФ усиливали коронарный кровоток, т е оказывали коронародилатирующее действие

Таблица 1 Показатели работы изолированных сердец крыс при регионарной ишемии левого желудочка и перфузии раствором Кребса-Хенселейта, содержащим уридин, УМФ, УДФ или УТФ в концентрации 50 мкмоль/л (М±т)

показа- Группа Исходные Время после начала ишемии, мин

тель значения 5 10 20 30 | 60

1, 1 рт CT Контроль Уридин УМФ УДФ УТФ 94±5 ioat6 96±6 90±3 84±4 61 ±7" 76±5* 82±6* 52±4# 50±3Й 52±8" 81±10 85±7* 48±4* 45±б" 24±5* 106±8* 62±10** 58±7** 40±5*§ 16±6* 42±6*" 55±7** 4U5*" 30±5*# 13±4* 27±3*" 33±8*" 24±5** 26±3*"

IP/dW л рт CT Контроль Уридин УМФ УДФ УТФ 1782±31 1850±54 1806±40 1764±29 1771±36 1085±17" 1692±31*' 1566±30** 1237±23*# 1033±12*" 1264±2б" 1883±27* 1934±18** 1474±19*" 1397±20*" 467±18" 1772±32* 1458±27*" 1211±22*я 1298±21*# 267±10" 1076±19*" 1332±16*" 1263±15*" 1265±17*" 214±9" 1063±14** 1100±18*# 1037±13*" 1232±12*"

Р/dW, л рт CT Контроль Уридин УМФ УДФ УТФ 1291±25 1353±29 1310±33 1322±26 1314±12 1032±10* 1403±33** 1283±14* 1027±11* 777±10** 1002±10" 1369±16* 1378±14* 898±17** 949±14** 774±7* 1350±12* 1318±15* 1096±13*# 750±11* 426±10" 1334±22* 1327±18* 990±10*я 710±9** 619±16* 1315±19* 1302±22* 628±7* 589±15*

ад, ч рт CT Контроль Уридин УМФ УДФ УТФ 10±1 10±2 10±1 10±1 10±2 12±3 9±1 10±2 11±3 17±4* 14±2 10±2 10±2 10±3 15±2* 17±3" 10±1* 10±2* 12±2 15±4* 19±2" 9±2* 10±2* 15±3 16±4* 18±3Я 10±1 11±2 1б±4 18±4"

т, л/мин Контроль Уридин УМФ УДФ УТФ 15 5±2 3 16 0±2 9 17 1±3 4 16 2±3 8 16 9±2 0 9 3±1 5" 10 4±1 8* 11 6±2 0* 15 2±2 1* 15 4±1 8* 9 1±1 4" 9 3±1 б" 10 0±1 9* 10 8±1 7* 14 2±2 1* 6 0±1 2" 7 7±1 6* 9 1±1 5* 8 8±1 f 12 9±2 3* 3 4±1 0" 5 9±2 1* 6 0±1 7" 6 5±2 6* 12 3±1 8* 2 8±07" 4 3±1 2* 5 2±1 4* 5 9±1 5*" 10 6±1 8*"

СС, l/мин Контроль Уридин УМФ УДФ УТФ 216±10 218±5 220±6 210±12 200±8 208±11 218±5 228±10 201±12 204±8 197±4 204±12 207±12 198±7 200±б 186±6* 202±10 197±8# 176±9* 206±11 168±12" 180±11* 187±8* 170±10* 174±9* 149±7* 160±9* 1б4±б" 162±8* 159±5#

Примечание различия статистически достоверны (р<0 05) * - по сравнению с контролем, *- по сравнению с исходными данными

Влияние уридина, УМФ, УДФ и УТФ на сократительную функцию левого желудочка и коронарный ток при реперфузии изолированного сердца крысы после тотальной ишемии

При реперфузии изолированных сердец крыс после тотальной ишемии развивалась постишемическая депрессия миокарда (ПДМ) в течение 30 мин

реперфузии величина развиваемого давления (РД) в полости левого желудочка была на 55-73%, максимальная скорость сокращения миокарда (+с!Р/сктах)- на 60-68%, а максимальная скорость расслабления миокарда (-с!Р/с11:тах) - на 3360% ниже исходных значений Конечное диастолическое давление (КДД) превышало исходный уровень в 2 раза, а величина коронарного кровотока (КТ) была ниже на 14-20% (рис 2) Добавление в перфузат уридина сопровождалось быстрым восстановлением функций сокращения и расслабления миокарда Через 10 мин после начала реперфузии РД, КДД и -с1Р/с11та)1 достигали исходного уровня и поддерживались на нем до конца эксперимента Уридин не влиял на КТ УМФ оказывал сходное с уридином по силе и направленности действие Оба препарата вызывали резкое увеличение +с1Р/сктгх через 10 мин после начала реперфузии, однако к 30 мин максимальная скорость сокращения уменьшалась, оставаясь в 2 раза больше, чем в контроле

Под влиянием УДФ незначительно увеличивались РД, +с1Р/сктах и -с1Р/сктах, несколько снижалось КДД, и практически не изменялся КТ по сравнению с таковыми в контрольной группе УТФ проявлял отрицательный эффект, ухудшая показатели сокращения и расслабления миокарда, а также значительно уменьшая КТ

Таким образом, только уридин и УМФ предупреждали развитие миокардиального станнинга при постишемической реперфузии УДФ оказался малоэффективным, а УТФ усиливал проявление постишемической реперфузи-онной дисфункции сердца

Влияние уридина, УМФ, УДФ и УТФ на развитие ранних

постокклюзионных аритмий при регионарной ишемии изолированных перфузируемых сердец крыс

Острая ишемия миокарда сопровождается развитием ранних постокклюзионных аритмий Перфузия сердец раствором, содержащим уридин, способствовала ослаблению возникающих нарушений сердечного ритма снижению количества желудочковых экстрасистол (ЭС) на 78%, продолжительности желудочковых тахикардий (ЖТ) - на 85% и фибрилляции желудочков (ФЖ) - на 87% (табл 2) Добавление в перфузат УМФ также приводило к снижению количества ЭС и длительности ЖТ в 2 и 8 раз соответственно по сравнению с контрольными значениями и препятствовало возникновению ФЖ

Антиаритмический эффект УДФ проявлялся в уменьшении экстрасистолии и сокращении длительности ФЖ и был сопоставим с действием уридина В отличие от последнего УДФ сокращал длительность ЖТ лишь на 44% УТФ оказывал антиаритмическое действие, несколько превосходящее эффект уридина и УМФ количество ЭС и длительность ЖТ уменьшались в 8-9 раз по сравнению с контролем, а возникновение ФЖ полностью предотвращалось Помимо этого частота возникновения ЖТ и ЭС была соответственно в 2 3 и в 2 раза меньше, чем в контроле

ю

Таблица 2 Влияние уридина и уридиновых нуклеотидов на развитие ранних постокклюзионных аритмий на модели регионарной ишемии изолированных перфузируемых сердец крыс

Группа Показатели ранней постокклюзионной аритмии

Экстрасистолы (ЭС) Желудочковая тахикардия (ЖТ) Фибрилляция желудочков (ФЖ)

Частота, % Кол-во, N Частота, % Продолжительность, сек Частота, % Продолжительность, сек

Контроль 100 674±98 88 240±28 75 320±57

Уридин 88 147±10* 50 37±6* 50 40±5*

УМФ 75 162±38* 50 29±4* 0 0

УДФ 88 119±54* 75 105±13* 63 56±8*

УТФ 50* 84±9* 38* 25±2* 0 0

Примечание * - отличия от группы контроля статистически достоверны (р<0 05)

Таким образом, уридин и его нуклеотиды активно влияли на выраженность желудочковых аритмий на модели регионарной ишемии изолированного сердца крыс Наибольшую антиаритмическую активность проявили УМФ и УТФ, которые наряду с ослаблением экстрасистолии и тахикардии полностью предотвращали развитие фибрилляции желудочков сердца По антиаритмической активности соединения можно расположить в следующем порядке УТФ > УМФ > уридин > УДФ

Влияние уридина, УМФ, УДФ и УТФ на развитие реперфузионных аритмий на моделях регионарной и тотальной ишемии изолированных перфузируемых сердец крыс

Развитие реперфузионных аритмий на модели регионарной ишемии отмечались через 4-5 мин после снятия лигатуры По сравнению с ранними постокклюзионными аритмиями они характеризовались менее выраженной экстрасистолией и ЖТ и увеличением продолжительности ФЖ (табл 3) Добавление в перфузат уридина приводило к уменьшению количества ЭС на 55%, длительности ФЖ - на 82% и предотвращало возникновение эпизодов ЖТ Антиаритмический эффект УМФ практически не отличался от уридина Добавление в перфузат УДФ не сопровождалось позитивными изменениями по сравнению с контролем Наоборот, наблюдалось увеличение длительности ЖТ УТФ незначительно уменьшал продолжительность ФЖ, но в его присутствии было отмечено усиление экстрасистолии и ЖТ

При тотальной ишемии, вызванной прекращением подачи перфузата, до момента исчезновения сердечных сокращений регистрировались только единичные ЭС Через 3-4 мин после возобновления перфузии возникали нарушения ритма преимущественно в виде ЭС и ФЖ, которые прекращались к 25-27-ой мин реперфузии Добавление в перфузат уридина и УМФ существенно сокращало проявления реперфузионной аритмии Уридин предотвращал

развитие ЖТ и ФЖ и уменьшал количество ЭС в 2 5 раза (табл 4) УМФ уменьшал частоту возникновения и выраженность экстрасистолии и ФЖ, предотвращал развитие ЖТ УДФ не вызывал значительных изменений в характере и выраженности нарушений сердечного ритма При перфузии сердец УТФ наблюдалась тенденция к усилению всех компонентов реперфузионной аритмии, особенно- ЖТ

Таблица 3 Влияние уридина и уридиновых нуклеотидов на развитие реперфузионных аритмий на модели регионарной ишемии изолированных перфузируемых сердец крыс

Группа Показатели реперфузионной аритмии

Экстрасистолы Желудочковая тахикардия Фибрилляция желудочков

Частота, % Количество, п Частота, % Продолжительность, сек Частота, % Продолжительность, сек

Контроль 100 212±15 88 40±10 88 373±37

У рицин 100 95±11* 0 0 63 67±9*

УМФ 88 80±7* 0 0 50 55±12*

УДФ 100 202±17 75 84±11* 75 305±21

УТФ 100 265±24 100 94±9* 88 207±12*

Примечание * - отличия от группы контроля статистически достоверны (р<0 05)

Таблица 4 Влияние уридина и уридиновых нуклеотидов на развитие реперфузионных аритмий на модели тотальной ишемии изолированных перфузируемых сердец крыс

Группа Показатели реперфузионной аритмии

Экстрасистолы Желудочковая тахикардия Фибрилляция желудочков

Частота, % Количество, п Частота, % Продолжительность, сек Частота, % Продолжительность, сек

Контроль 88 268±19 50 21±4 75 163±13

Уридин 75 105±12* 0 0 0 0

УМФ 38* 32±4* 0 0 25 8±3*

УДФ 88 159±18* 38 20±6 50 148±10

УТФ 100 353±22 75 49±4* 75 195±12*

Примечание * - отличия от группы контроля статистически достоверны (р<0 05)

Таким образом, при реперфузии после регионарной и тотальной ишемии изолированных сердец крыс были выявлены следующие закономерности выраженную антиаритмическую активность продемонстрировали уридин и УМФ, в то время как УДФ и УТФ были неэффективны и, более того, УТФ проявил проаритмогенное действие

Кардиопротекторное действие уридина и его нуклеотидов в остром периоде экспериментального инфаркта миокарда у крыс Антиишемический эффект уридина, УМФ, УДФ и УТФ. Степень ишемнческого повреждения миокарда крыс оценивали по индексу ишемического повреждения и величине амплитуды Т- волны на ЭКГ крыс через 60 мин после окклюзии левой коронарной артерии (ЛКА) (табл 5)

Уридин, введенный до окклюзии, снижал индекс ишемического повреждения миокарда на 50% (табл 5) Введение препарата сразу после окклюзии было значительно менее эффективным ИПМ был лишь на 27% меньше, чем в контроле, и это изменение было статистически недостоверно (р>0 05)

Таблица 5 Антиишемическое действие уридина, УМФ, УДФ и УТФ в остром периоде инфаркта миокарда у крыс

Группа Антиишемический эффект (60 мин после окклюзии)

индекс повреждения миокарда амплитуда Т-волны, мВ

Контроль (острый инфаркт миокарда) 1 27±0 04 0 53±0 04

Уридин -до окклюзии -после окклюзии 0 63±0 08* 0 92±0 12 0 37±0 03* 0 47±0 06

УМФ -до окклюзии -после окклюзии 0 30±0 10*# 0 83±0 11* 0 34±0 02* 0 42±0 04

УДФ -до окклюзии -после окклюзии 0 94±0 07 0 91±0 19 0 53±0 02 0 56±0 03

УТФ -до окклюзии -после окклюзии 0 90±0 11 0 82±0 15 0 64±0 09 0 51±0 03

Примечание *- отличия от группы контроля статистически значимы (р<0 05), " отличия от группы уридина статистически значимы (р<0 05)

При введении УМФ наблюдалась такая же закономерность в проявлении антиишемической активности максимальный эффект был отмечен в условиях превентивного применения препарата (уменьшение ИПМ на 76%), а при его введении после окклюзии антиишемический эффект был в два раза слабее (35%) Сравнение активности уридина и УМФ показало, что при введении препаратов до окклюзии эффективность УМФ была достоверно выше, чем у уридина (р>0 05) УДФ и УТФ оказались в одинаковой степени мало эффективными Они снижали ИПМ только на 26% и 29% при введении до окклюзии и на 28% и 35% при введении после окклюзии соответственно Введение уридина и УМФ до окклюзии ЖА позволило снизить амплитуду Т-волны в 1 5 раза Это указывает на ограничение развития ишемического

14

повреждения миокарда в течение первого часа острого инфаркта миокарда у крыс Введение обоих препаратов после окклюзии не снижало амплитуду Т-волны

Таким образом, на ранних этапах развития острой ишемии миокарда из четырех изученных препаратов только уридин и УМФ проявили выраженную антиишемическую активность Этот эффект наблюдался при их превентивном применении Учитывая тот факт, что при использовании УМФ зона ишемического повреждения была в 2 раза меньше, чем при введении уридина, то в ряду антиишемической активности УМФ можно поставить на первое место

Антиаритмический эффект уридина, УМФ, УДФ и УТФ Окклюзия ЛКА у крыс приводила к развитию нарушений ритма у 100% контрольных животных Из всех изученных препаратов только УМФ достоверно (р<0 05) уменьшал частоту возникновения постокклюзионных аритмий (табл 6)

Таблица 6 Влияние уридина, УМФ, УДФ и УТФ на частоту возникновения нарушений сердечного ритма у крыс в остром периоде инфаркта миокарда

Частота возникновения, %

Группа

аритмий ЭС ЖТ ФЖ

Контроль 100 100 100 86

Уридин -до окклюзии 100 100 100 43*

-после окклюзии 100 100 86 57*

УМФ

-до окклюзии 43* 100 100 33*

-после окклюзии 100 100 100 29*

УДФ

-до окклюзии 100 100 100 100

-после окклюзии 100 100 100 100

УТФ

-до окклюзии 100 100 100 22*

-после окклюзии 100 100 100 67

Примечание * - отличия от группы контроля статистически достоверны (р<0 05)

Применение уридина, УМФ и УТФ значительно уменьшало число животных, у которых развивалась ФЖ Этот эффект не зависел от времени введения уридина и УМФ Максимальный антифибрилляторный эффект УТФ наблюдался при его превентивном введении Уридин, УМФ, УДФ и УТФ не влияли на частоту возникновения ЭС и ЖТ, однако они в значительной степени ослабляли тяжесть протекания аритмий (табл 7) Уридин и УМФ в 2-3 раза уменьшали число экстрасистол, в 3-4 5 раза - продолжительность ЖТ и ФЖ Статистически значимой разницы в положительном действии препаратов при разных вариантах введения не установлено По совокупности показателей УТФ проявлял максимальную антиаритмическую активность, но только при

введении до окклюзии Применение препарата после перевязки привело к усилению ФЖ и не изменило другие показатели по сравнению с контролем УДФ, введенный животным как до, так и после окклюзии ЛКА, не оказывал эффекта в отношении данного типа аритмий

Таким образом, в остром периоде инфаркта миокарда у крыс наибольшую кардиопротекторную активность проявляют уридин и УМФ, которые оказывают как антиишемическое, так и антиаритмическое действие

Таблица 7 Влияние уридина и уридиновых нуклеотидов на выраженность ранних

Показатели аритмии

Группа Экстрасистолы, п Желудочковая тахикардия, сек Фибрилляция желудочков, сек

Контроль 395±38 89 7±18 8 26 5±6 9

Уридин -до окклюзии -после окклюзии 189±43* 146±7* 32 2±4 б* 410±83 9 5±3 4* 13 7±4 9

УМФ -до окклюзии -после окклюзии 134±39* 127±9* 20 0±9 9* 14 8±1 9* 6 08±2 3* 10 2±3 5*

УДФ -до окклюзии -после окклюзии 339±48 318±27 113 6±35 1 95 3±23 8 36 4±19 1 32 9±8 7

УТФ -до окклюзии -после окклюзии 76±17* 356±30 27 0±4 8* 58 0±152 1 0±0 0* 43 5±5 4*

Примечание * - отличия от группы контроля статистически достоверны (р<0 05)

Именно уридин и УМФ являются наиболее перспективными в плане защиты от ишемических повреждений миокарда и коррекции их последствий Оптимальным условием для проявления указанных эффектов является введение уридина и УМФ до окклюзии В первую очередь это касается предупреждения или ограничения возникновения в результате ишемии структурно-функциональных изменений миокардиальной ткани Полученные результаты дают основание предполагать, что в данном случае мы наблюдаем положительный результат «фармакологической прекондиции», те уридин и УМФ могут активизировать эндогенный механизм антиишемической защиты миокарда, конечным эффекторным звеном которого являются АТФ-зависимые К+ каналы

Влияние ингибиторов митохондриальных АТФ-зависимых К+ каналов на антиишемическую активность уридина и УМФ

Взаимосвязь антиишемических и антиаритмических эффектов уридина и УМФ с активностью митоКАТФ и цитоКдтф каналов изучена на модели острой

16

ишемии миокарда левого желудочка крысы. Использовали неселективный ингибитор Кдтф каналов глибенкламид (1 мг/кг, в/в) и селективный ингибитор митоКдтф каналов 5-гидроксидеканоат (5-НВ) {5 мг/кг, в/в).

Предварительное введение животным глибенкламида (за 30 мин до уридина) и 5-НО (за 5 мин до уридина) блокировало проявление положительного эффекта уридина, введенного до окклюзии (рис.3). У животных этих групп объем поврежденного миокарда был таким же, как в контроле. Аналогичный эффект ингибиторов Кдтф каналов наблюдался и по отношению к УМФ. Тот факт, что 5-НВ способен блокировать положительное действие уридина И УМФ, указывает на первостепенную роль митоКдт® канала в реализации защитного действия этих препаратов при ишемии.

Рис.З. Зависимость влияния уридина и УМФ на индекс ищемического повреждения миокарда (ИПМ) от активности митохондриальных АТФ-зависимых К каналов.

Предварительное введение уридина и УМФ до окклюзии крысам приводило к снижению амплитуды Т-волны на ЭКГ (табл.8). При совместном введении глибенкламида с уридином или УМФ положительный эффект препаратов не проявлялся. 5-НЕ) также полностью блокировал положительную активность уридина и УМФ, Эти данные подтвердили роль митоКАт<ь канала в защите сердца от шиемических повреждений.

Таблица 8 Зависимость влияния уридина и УМФ на амплитуду Т-волны на ЭКГ крыс с экспериментальным инфарктом миокарда от активности Катф каналов

Группа Амплитуда Т-волны (млВ)

Исходная После окклюзии НВЛКА

3 мин 30 мин 60 мин

Кои роль 019±0 01 0 54±0 04 0 59±0 02 0 55±0 03

5 Н1>, 5 мг/кг 017±0 02 0 63±0 03 0 65±0 04 0 59±0 04

Глибенкл амид, 019±0 01 0 70±0 Об* 0 65±0 05 0 59±0 05

1 мг/кг

Уридин, 30 мг/кг 018±0 01 0 34±0 03* 0 40±0 02* 0 35±0 03*

ГлиОенкламид + 0 18±0 01 0 57±0 04 0 51±0 04 0 47±0 03

Уридин

5 НГ> + Уридин 0 20±0 01 0 54±0 00 0 58±0 01 0 53±0 04

УМФ, 30 мг/кг 017±0 02 0 41±0 03* 0 38±0 03* 0 34±0 02*

Глибенкл амид + 0 20±0 01 0 74±0 07* 0 72±0 04* 0 68±0 06*

УМФ

5 Ш) + УМФ 018±0 01 0 67±0 Об 0 66±0 03 0 64±0 03

Примечание уридин и УМФ вводили за 5 мин до окклюзии коронарной артерии, глибенкл амид - за 30 мин, 5-ЬГО — за 5 мин до тестируемых препаратов В качестве контроля были вз5ггы животные с окклюзией левой коронарной артерии без введения модуляторов канала "- р<0 05, по сравнению с контролем

Влияние ингибиторов АТФ-зависимых К+каналов на антиаритмическую активность уридина и УМФ

Влияние ингибиторов АТФ-зависимых К+ каналов на антиаритмическую активность уридина и УМФ оценивалось по частоте возникновения, времени начала и общей длительности постокклюзионных нарушений ритма сердца, количеству ЭС, продолжительности ЖТ и ФЖ, а также по частоте возникновения фибрилляций (табл 9, рис 4) Введение крысам глибенкламида (1 мг/кг) за 35 мин до окклюзии ЛКА не приводило к изменению основных характеристик ранних постокклюзионных аритмий кроме тенденции к сокращению длительности ФЖ 5-НО в дозе 5 мг/кг, введенный за 10 мин до окклюз ли, также не проявлял собственной антиаритмической активности

Введение глибенкламида за 30 мин до уридина или УМФ блокировало антиаритмическое действие последних (табл 9, рис 4) Неизменненным оставался лишь антифибрилляторный эффект уридина и УМФ В первом случае длительность ФЖ составила 7 ±4с, во втором - 5 ±3с по сравнению с 43±11 в контроле В то же время частота возникновения ФЖ увеличивалась, оставаясь, однако ниже контрольных значений (р<0 05)

Предварительное введение 5-НО оказывало слабовыраженное блокир /тощее действие на антиаритмическую активность уридина и УМФ Прежде всего, оно проявлялось в отношении начала и общей длительности нарушений ритма (табл 9) Блокатор митохондриальных АТФ-зависимых К+ каналов не влиял на ослабление экстрасистолии и уменьшение длительности

ЖТ под действием уридина и лишь незначительно ослаблял аналоги -шые эффекты УМФ (рис 4) Так же как и глибенкламид он не менял антнфибриляторную активность обоих препаратов

Таблица 9 Влияние ингибиторов АТФ-зависимых К+ каналов на антиаритмическую активность уридина и УМФ___ __

Ранние постокклюзионные нарушения ритма Частота возникно-

Группа Начало, после окклюзии ЛКА, с Длительность, сек Частота возникновения, % вения ФЖ, %

Контроль 260±15 844±73 100 86

Глибенкламид, 1 мг/кг 281±17 778±30 100 70

5-НО,5 мг/кг 259±9 842±51 100 67

Уридин,30 мг/кг 296±19 469±42* 88 37*

Уридин+глибенкламид Уридин+5-Ш 286±12 323±18 744±63° 710±54° 89 80 62*° 60*"

УМФ, ЗОмг/кг 400±33* 457±75* 43* 29*

УМФ+глибенкламид УМФ+5-1ГО 346±2б 2б1±11* 843±57# 749±82* 89* 82" 55*" 54*'

Примечание уридин, УМФ (30 мг/кг) вводили за 5 минут до окклюзии коронарной артерии, глибенкламид (1 мг/кг) — за 30 мин, 5-ШЭ (5 мг/кг) - за 5 мин до введения уридина или УМФ *р<0 05, по сравнению с контролем,-" р<0 05, по сравнению с УМФ, - ° р<0 05, по сравнению с

уридином

Таким образом, в отличие от антиишемического дейс гвия, антиаритмический эффект уридина и УМФ блокировался, главным обргсзом, глибенкламидом 5-НГ) оказывал лишь незначительный эффект Этот факт говорит о том, ягго в отличие от антиишемического, в осуществл ;нии ангиаритмического действия уридиновых препаратов более важную роль играет активация цитоплазматического АТФ-зависимого К+ канала При этом ни глибенкламид, ни 5-НО не блокировали положительное действие уридиновых препаратов на длительность ФЖ, но в 2 раза снижали защи"ный эффект уридина и УМФ в отношении частоты возникновения фибрилляций

Влияние уридина и его нуклеотидов на активность митохондриальнсго АТФ-зависимого К+ канала изолированных митохондрий кардиомиоцитов и активность каналообразующей субъединицы митохондриалыюго А'ГФ-зависимого К+ канала в модельной системе

Исследование проводили на нативных митохондриях, выделенных из кардиомиоцитов, где митохондриальный АТФ-зависимый К+канал был неизмененным и состоял из двух субъединиц - канальной и регуляторной

| 400 I

| 350 ! о

| 300 !

£ 250 п

о 200

8 150

! 100 5 50

0

Контроль Урид и н -- -----УМФ ___ -——

Глиб. 5-Н0 Глиб. 5-НО

5 140

0

£ 120 с и

1 я 100

£ 3

г1 К

® г

60 40 20

Контроль ур1ШИН_____уМф

Гпмб. 5-НО Глиб. 5-НО

60 , | 50 1

§ и 10 |1

30-

8 ? 1 1 20-|

1 § 10 о! 1___I

Контроль Уридин —— --- УМФ — ---— | Глиб. 5-НО Глиб 5-НО ,

Рис.4. Влияние ингибиторов КАТ-Ф каналов на антиаришичеекую активность урндина и УМФ а - ЭС, б - ЖТ, в - ФЖ

Об активности канала судили по скорости входа ионов К'. После добавления митохондрий в гипотоническую инкубационную среду, содержащую КС1, начинался активный транспорт ионов К' и воды через митохондриальную мембрану, что приводило к набуханию митохондрий и уменьшению оптической плотности раствора. В течение 1 мин в контрольных образцах она изменялась с 0.315 ±0.002 до 0.208 ±0.010 относ.ед. (р<0.001). Скорость входа К+ составила 0.156 ±0.006 отн.ед./мин/мг белка (рис.5). Добавление в инкубационную среду 50 мкМ АТФ приводило к ингибированию митохондриальных АТФ-зависимых К+ каналов и снижению скорости эпергозависимого входа К+ в митохондрии до 0.043±0.012 отн.ед./мин/мг белка (р<0.001 по сравнению с контролем). Добавление в инкубационную среду наряду с АТФ уридина и УМФ не влияло на вызываемое ею уменьшение скорости входа К+. УДФ в концентрации 30 мкМ в присутствии АТФ способствовал восстановлению транспорта К+ (0.125 ±0.012, р<0.05 по сравнению с пробами, содержащими только АТФ). При совместном добавлении в инкубационную среду селективного ингибитора митохондриальных АТФ-зависимых К+ каналов 5НГ> и УДФ активирующее действие последнего не проявлялось, что свидетельствует об его специфичности в отношении данных каналов.

0,2 -1

0.1

Рис.5 Влияние уридина и его фосфонуклеотидов на активность митохондриальных АТФ-зависимых К' каналов в нативных митохондриях. Среда инкубации для исследования энергозависимого входа калия: 50 мМ КО, Нерез, 5 мМ ШН2Р04, 5 мМ янтарной кислоты, 0,5 мМ МёСЬ, 0.1 мМ ЭГТА, 5 цМ цитохрома С, 2 ¡дМ циклоспорина А, 50 мкМ АТФ, рН 7.2. Каждая проба содержала 0.1 мг/мл митохондрий.

Тестируемые соединения добавляли в следующих количествах: уридин, УМФ и УДФ -по 30 мкМ, 5-НИ - ] 00 мкМ. Скорость входа К* = (¡Б/мин на мг белка

0.0

Контроль

Исследование влияния уридина и его нуклеотидов на активность митохондриального АТФ-зависимого К* канала проводили на бислойной липидной мембране (БЛМ), в которую встраивали каналообразующую субъединицу митохондриального АТФ-зависимого К+ канала, выделенную из митохондрий кардиомиоцитов крыс и представляющую собой белок с м.м. 55 кДа. На этой модельной системе подтвердился активирующий эффект УДФ. Как видно из рисунка 6, УДФ в концентрации 20 мкМ, реактивировал

реконструированную в БЛМ субъединицу после ингибирующего действия АТФ (1мМ) Использование УДФ в концентрации 10 мкМ было неэффективно

■>0 с АТФ 1 мМ

ЖГП-U

-MI-* ■ ■■ i-

-Г'

УДФ 20 мкМ

АТФ 1 мМ

УДФ 10 мкМ

jU—-

JilfflliLlULLi

Рис 6 Влияние УДФ на проводимость канальной

субъединицы, реконструированной в БЛМ, на фоне ее предварительного ингибирования АТФ

У,Е,Ф активировал каналообразующую субъединицу митохондриального АТФ-зависимого К+ канала и без предварительного ее ингибирования АТФ (рис 7). Однако в этом случае действующие концентрации нуклеотида были на порядок выше (100-200мкМ)

10О пОм

удф -ioo мкм

и

J,—1-

.... tfy-

УДФ, мкМ

Рис 7 В шяние УДФ на проводимость канальной субъединицы, реконструированной в БЛМ, не ингиС ированной АТФ

УМФ, а также уридин не оказывали влияния на канальную субъединицу, реконс [руированную в БЛМ (рис 8)

Таким образом, на основании полученных данных можно предположить, что в кардиомиоцитах именно УДФ осуществляет активацию митохондриального АТФ-зависимого К+ канала Концентрация УДФ, активирующая канал, является физиологической и значительно (на 2 порядка) меньше концентраций, влияющих на цитоплазматический АТФ-зависимый К+ канал (Alekseev et al, 1998) Экзогенный уридин и УМФ, кардиопротекторный эффест которых установлен in vitro и in vivo, могут рассматриваться как предшественники внутриклеточного синтеза УДФ

О 5 мМ АТФ

Рис 8 Влияние УМФ на реконструированную в БЛМ канальную субъединицу м итоКдтф канала,_- закрытое состояние

В процессе исследовательской работы, которую проводили m vivo на животных, in vitro на изолированных сердцах и на нативных сердечных митохондриях крыс нами показано, что уридин и его нуклеотиды могут являться потенциальными средствами терапии для коррекции структурно-функциональных нарушений при патологии сердечно-сосудистой системы, в частности, при инфаркте миокарда, а также постишемическом реперфузионном повреждении сердца Из четырех изученных препаратов (уридин, УМФ, УДФ и УТФ) можно выделить наиболее активные - уридин и УМФ Эти соединения оказывают выраженное кардиопротекторное действие, которое проявляется в улучшении сократительной функции миокарда, антиишемическом и антиаритмическом эффектах при ишемических и реперфуз ионных повреждениях

ВЫВОДЫ:

1 Уридин и его нуклеотиды в равной степени ограничивают развитие нарушений сократительной функции миокарда при регионарной ишемии изолированных перфузируемых сердец крыс Уридин и УМФ предотвращают изменение фазы расслабления ишемизированного миокарда, УТФ усугубляет его

2 Уридин и УМФ предупреждают развитие постишемической дисфункции миокарда, возникающей при реперфузии изолированных сердец кры: после тотальной ишемии, УДФ не влияет на этот процесс, а УТФ усугубляет его

3 Уридин и УМФ обладают антиаритмической активностью в отношении ранних постокклюзионных и реперфузионных аритмий УТФ проявляет антиаритмическую активность в постокклюзионном периоде, но оказывает проаритмогенное действие в условиях реперфузионного повреждения миокарда

4 В раннем периоде острой ишемии миокарда у крыс только уридин и УМФ оказывают антиишемическое действие

5 УДФ активирует митохондриальный АТФ-зависимый К+ канал в нативных митохондриях сердца крыс и его каналообразующую субъединицу, реконструированную в бислойную липидную мембрану

6 Механизм антиишемического действия экзогенного уридина и УМФ связан с активацией митохондриальных АТФ-зависимых K-каналов вследствие усиления внутриклеточного синтеза УДФ

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1 Влияние уридиновых соединений на развитие миокардиального станнинга при постишемической реперфузии сердца крысы // Бюлл эксперим биолог - 2000 - Т 130,№ 10 -С 411-414 (соавторы Сапронов Н С .Елисеев В В )

2 Антиаритмическое и проаритмогенное действие уридина и уридиновых нуклеотидов // Вестник аритмологии - 2000 - №20 - С 66-69 (соавторы Елисеев В В , Сапронов НС)

3 Хронотропное действие уридина и уридиновых нуклеотидов на миокард крыс // Нейрофармакология в XXI веке Конф, посвященная 110-летию академика АМН СССР С В Аничкова Матер Всероссийской научной конференции С -Пб , 2002 -С 378 (соавторы Крылова И Б, Евдокимова HP)

4 Влияние уридина и уридиновых нуклеотидов на работу изолированного сердца крыс при регионарной ишемии // Пат физиология и эксперим терапия - 2002 - №2 -С 13-15 (соавторы Елисеев В В , Сапронов Н С, Селизарова НО)

5 Влияние уридиновых фосфонуклеотидов на митоКдтф канал и их кардиопротекторное действие при острой ишемии миокарда // Рецепция и внутриклеточная сигнализация Матер Международной научной конференции Пушино, 2003 - С 262-264 (соавторы Негода А Е, Скарга Ю Ю, Крылова И Б, Евдокимова Н Р, Сапронов Н С, Миронова Г Д)

6 Экспериментальное изучение кардиопротекторного действия уридина при острой ишемии // Фундаментальные исследования и прогресс в кардиологии Матер Конгресса ассоциации кардиологов стран СНГ С -Пб , 2003 - С 144-145 (соавторы Крылова И Б, Евдокимова Н Р, Сапронов Н С, Негода А Е, Скарга Ю Ю, Миронова ГД)

7 Сравнительная характеристика антиаритмической активности уридина и уридиновых нуклеотидов // От исследований к стандартам лечения Матер Российского национального конгресса кардиологов Москва, 2003 - С 177 (соавторы Крылова И Б, Евдокимова Н Р, Сапронов Н С, Негода А Е, Скарга Ю Ю, Миронова Г Д)

8 Mitochondrial Катр Channel openers and their antnschemic and antiarrhythmic action // Biological motihty International Symposium Pushchmo, 2004 -P 51-52 (Negoda А E, Kachaeva E V, Krylova I B, Evdokimova N R, Sapronov N S, Miionova G D )

9 Митохондриальный АТФ-чувствительный калиевый канал структурная организация и роль в кардиопротекции // Регуляция и внутриклеточная сигнализация Матер Международной конференции Пущино, 2005 - С 268-271 (соавторы Негода А Е, Качаева Е В, Батина М И, Крылова И Б, Сапронов Н С, Миронова Г Д)

10 The meiabohc activators of mitochondrial ATP- dependent potassuim Channel and its role in cardioprotection // Mitochondnal physiology 4ft Conference on mitichondrial physiology Vorarlberg, Austria In Mitochondrial Physiology Network, 2005 - P 95 (Mironova G D, Krylova I B, Negoda А E, Kachaeva E V, Evdokimova N R, Sapronov N S )

11 The cardioprotective effect of uridine and uridme-5-monophosphate the role of the mitochondrial ATP-dependent potassium channel // Experimental gerontology - 2006 - V 41 (7) - P 697-703 (Krylova I B, Kachaeva E V, Negoda A E, Evdokimova N R, Bahna M I, Sapronov N S, Mironova G D)

12 Effect uridine nucleotides on adaptation of myocardium to ischemia Матер 8 Международного конгресса по адаптационной медицине Москва, 2006, - С 149 (соавторы Kachaeva Е Y, Krylova I В , Sapronov N S , Mironova G D )

13 Comparative study on the cardioprotective properties of the uridine and uridine nucleotides Матер 2-ой Российско-Китайской научной конференции по фармакологии "Фундаментальная фармакология и фармация - клинической практике" Пермь, 2006, - С 144-145 (соавторы Sapronov N S , Krylova I В , Evdokimova N R, Kachaeva E Y , Mironova G D)

14 Митохондриальный АТФ-чувствительный калиевый канал II Роль канала в защите сердца от ишемии // Вестник АМН - 2007, №2, с 34-43 (соавторы Миронова Г Д , Качаева Е В , Крылова И Б, Балина М И , Евдокимова Н Р , Сапронов Н С )

Подписано в печать 18 04 07 Формат 60*84 1/16 Бумага офсетная Печать офсетная Печ л 1,5 Тираж 100 экз Заказ 44

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Издательства СПбГЭТУ "ЛЭТИ"

Издательство СПбГЭТУ "ЛЭТИ" 197376, С -Петербург, ул Проф Попова, 5

Актуальность проблемы. „..

Актуальность поиска новых кардиотропных препаратов определяется широкой распространенностью заболеваний сердечнососудистой системы. По данным Всемирной Организации Здравоохранения около половины всех причин человеческих смертей в высокоразвитых странах и почти 60% в России приходится на болезни системы кровообращения, среди которых первое место занимает острая ишемия миокарда (Захаров, 2001).

Наряду с традиционными подходами к поиску новых эффективных препаратов для коррекции патологических состояний, развивающихся вследствие ишемии, современные достижения в области исследования механизмов патогенеза и сущности обменных реакций на молекулярном уровне определяют все возрастающий интерес к использованию в кардиофармакологии эндогенных регуляторов. Важный этап в развитии фармакотерапии - систематическое исследование возможностей лечебного применения природных метаболитов, являющихся естественными факторами адаптации миокарда к экстремальным и патологическим воздействиям (Галенко-Ярошевский, Гацура, 2001). К числу таких соединений можно отнести нуклеозиды и нуклеотиды, которые обладают большим набором регуляторных функций, реализующихся на рецепторном уровне, на уровне регуляции метаболических процессов и пластического обмена. В настоящее время хорошо изучены кардиотропные . свойства таких представителей этого класса соединений, как аденозин, аденозинмонофосфат (АМФ), аденозинтрифосфат (АТФ), гуанозинмонофосфат (ГМФ), инозин, а созданные на их основе лекарственные препараты используются в клинике (Николаева и др., 1975; Stanley et al., 1997; Lopaschuc, 1998).

Потенциальными средствами терапии для коррекции нарушений метаболизма при патологии сердечно-сосудистой системы, в частности при инфаркте миокарда, а также постишемическом реперфузионном повреждении сердца могут выступать пиримидиновый нуклеозид уридин и его фосфонуклеотиды: уридин-5-монофосфат (УМФ), уридин-5'-дифосфат (УДФ) и уридин-5'-трифосфат (УТФ). В экспериментальных и клинических исследованиях установлена высокая терапевтическая активность уридина и его нуклеотидов при центральной и периферической нейропатиях, дисфункции печени, нарушении репродуктивной функции, при врожденной оротоацидурии и цистическом фиброзе (Connolly, Duley, 1999). Однако, фармакологическая активность этих соединений в отношении сердечно-сосудистой системы малоизученна.

Нарушения в энергоснабжении сердца являются ведущим фактором • его повреждения при коронарной недостаточности и характеризуются дисфункцией основного окислительного пути синтеза АТФ в митохондриях (Хитров, и др., 1999). Единственно значимым источником продукции АТФ в миокарде становится анаэробный гликолиз. АТФ, образующемуся в процессе гликолиза, отводится важная роль в синтезе креатинфосфата (Сакс и соавт., 1986), в энергообеспечении продолжительности потенциала действия мембраны миокардиальной клетки, в стабилизации процессов биосинтеза нуклеиновых кислот и белков, в осуществлении сократительной функции и работы кальциевого насоса в условиях гипоксии (Галенко-Ярошевский, Гацура, 2001). Установлено, что окисление глюкозы и стимуляция ресинтеза гликогена играют ведущую роль в обеспечении функционирования ишемизированного миокарда. В то же время при ишемии протекание гликолитических реакций лимитируется ограничением притока глюкозы и быстрым истощением гликогена в кардиомиоцитах (Taegtmaeyer et al., 1997). Уридин и его нуклеотиды могут оказывать терапевтическое действие благодаря активации процесса ресинтеза гликогена и поддержанию энергетического обмена в поврежденных кардиомиоцитах, особенно в условиях дефицита кислорода (Меерсон, 1984; Aussedat et al, 1984).

При гипоксии уридин усиливает также липидный обмен (Зайчик, Чуринов, 2000), а метаболиты уридиновых соединений (р-аланин) могут способствовать активации окислительно-восстановительных процессов в сердце (Елисеев и др., 1985).

В последнее время у исследователей возрос интерес к УДФ и УТФ, поскольку доказано, что они являются селективными агонистами пиримидиновых Р2и-рецепторов (O'Connor et al., 1991; Abracchio, Burnstock, 1998). Активация нуклеотидами этих рецепторов приводит к улучшению кровотока в кардиоваскулярной системе (Froldi et al., 1994; Зигашпин и др., 1998; 1999). Известно, что в клетке уридиновые нуклеотиды синтезируются de novo и участвуют в синтезе РНК и биомембран, что является важным элементом в регуляции как нормального физиологического, так и патологического состояний (Connolly, Duley, 1999).

Перечисленные пути возможного влияния уридина и его производных на миокард делают актуальным и перспективным изучение их кардиотропных эффектов при ишемическом и реперфузионном повреждении сердца, в частности, при постишемической дисфункции миокарда и реперфузионном нарушении ритма. Эта проблема приобрела особую актуальность в связи с широким применением тромболитической терапии и хирургического лечения ишемической болезни сердца (Bolli, 1992; Вах et al., 1997; Pagano et al., 1999). Принципиально новый подход в лечении и предупреждении сердечных заболеваний, развиваемый в последнее время, основывается на активации АТФ-зависимых калиевых каналов (Кдтф каналов), которые являются конечным эффектором в реализации кардиопротекторных влияний ишемической. адаптации (прекондиции) (Garlic! et al., 1997; Liu et al., 1998; Fryer et al., 2000; Маслов и др., 2002). Известно, что в качестве эндогенных регуляторов этих каналов выступают некоторые нуклеотиды аденозина и гуанозина (АДФ, ГДФ), а также имеется предположение о наличии таких свойств у нуклеотидов уридина (Mironova et al., 1999).

Способность уридина проникать внутрь клетки и включаться в различные метаболические пути, наличие у уридиновых нуклеотидов рецепторного механизма действия, а также предположение о возможности реализации с их помощью фармакологической адаптации делают этот класс соединений перспективным для разработки новых кардиотропных лекарственных препаратов.

Цель исследования

Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение кардиотропных эффектов уридина, УМФ, УДФ и УТФ при ишемическом и реперфузионном повреждении миокарда.

В задачи исследования входило:

1. Сравнительное исследование действия уридина и уридиновых нуклеотидов на сократительную способность изолированных перфузируемых сердец крыс на моделях регионарной и тотальной ишемии с последующей реперфузией.

2. Оценка антиаритмического и проаритмогенного действия уридина и уридиновых нуклеотидов на изолированных перфузируемых сердцах крыс при моделировании ишемических и реперфузионных аритмий.

3. Сравнительное изучение антиишемического и антиаритмического действия уридина, УМФ, УДФ, УТФ на модели острого инфаркта миокарда у крыс.

4. Изучение возможного участия уридина и его нуклеотидов в регуляции митохондриальных АТФ-зависимых К+ каналов.

Научная новизна

Впервые проведено сравнительное изучение кардиопротекторного действия уридина, УМФ, УДФ и УТФ при ишемическом и реперфузионном повреждении миокарда. Показано, что все испытуемые соединения препятствуют депрессии сократительной функции миокарда при регионарной ишемии изолированных перфузируемых сердец крыс. Уридин и УМФ предотвращают развитие контрактуры. УДФ и УТФ усиливают коронарный ток.

Впервые показано, что уридин и УМФ на модели регионарной и тотальной ишемии изолированных перфузируемых сердец • крыс уменьшают развитие реперфузионных повреждений миокарда, ограничивая возникновение реперфузионных аритмий и- препятствуя развитию миокардиального станнинга.

На модели острого инфаркта миокарда у крыс впервые обнаружено, что наибольшей кардиопротекторной активностью обладают уридин и УМФ, которые оказывают как антиишемическое, так и антиаритмическое действие. Показано, что антиишемическая активность уридина и УМФ связана с активацией митохондриальных АТФ-зависимых каналов. i

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Уридин и его нуклеотиды ограничивают снижение сократительной функции миокарда при регионарной ишемии изолированных перфузируемых сердец крыс.

2. Уридин и УМФ предупреждают развитие миокардиального станнинга при реперфузии после тотальной ишемии.

3. Уридин и его нуклеотиды обладают антиаритмическим действием в отношении ранних постокклюзионных аритмий. Уридин и УМФ проявляют антиаритмический, а УТФ проаритмогенный эффект при реперфузионных нарушениях сердечного ритма.

4.Уридин и УМФ оказывают антиишемическое действие на ранних сроках острой ишемии миокарда. б.Механизм кардиопротекторной активности уридина и УМФ связан с активацией АТФ-зависимых К+ каналов.

Личный вклад соискателя.

Соискателем были выполнены анализ литературы по теме исследования, планирование и проведение экспериментов, статистическая обработка и анализ полученных результатов, а также основные публикации по теме работы. Автор выражает признательность профессору Г.Д. Мироновой - руководителю лаборатории митохондриального транспорта Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (Пущино) за помощь в проведении работы на нативных митохондриях и на модельной системе бислойных липидных мембран (БЛМ).

Научно-практическая значимость работы.

Полученные положительные данные свидетельствуют о перспективности дальнейшего доклинического углубленного изучения уридина и УМФ с целью разработки на их основе новых кардиопротекторных средств.

Апробация работы

Основные положения диссертации представлены на Всероссийской научной конференции "Нейрофармакология в XXI веке" посвященной 110летию академика АМН СССР С.В.Аничкова (Санкт-Петербург, 2002 г.), на Международных конференциях "Рецепция и внутриклеточная сигнализация"(Пущино, 2003, 2005г.), на Конгрессе кардиологов стран СНГ (Санкт-Петербург, сентябрь 2003 г.), на Российском национальном конгрессе кардиологов (Москва, октябрь 2003 г.), на Международной конференции "Biological Motility" (Пущино, 2004 г.), на 4 Международной конференции. Mitochondrial Physiology. (Vorarlberg, Austria, 2005 г.), на 8 Международном конгрессе по адаптационной медицине (Москва, 2006 г.), на 2-ой Российско-Китайской научной конференции по фармакологии «Фундаментальная фармакология и фармация - клинической практике» (Пермь, 2006), на 6 Международной конференции «Hypoxia in Medicine» (Milan, Italy, 2006).

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста, иллюстрирована 17 рисунками, содержит 12 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы, содержащей результаты собственных исследований и их обсуждения, а также выводов и списка цитированной литературы, из которых 40 отечественных и 174 иностранных.

ВЫВОДЫ:

1. Уридин и его нуклеотиды в равной степени ограничивают развитие нарушений сократительной функции миокарда при регионарной ишемии изолированных перфузируемых сердец крыс. Уридин и УМФ предотвращают изменение фазы расслабления ишемизированного миокарда, УТФ усугубляет его.

2. Уридин и УМФ предупреждают развитие постишемической дисфункции миокарда, возникающей при реперфузии изолированных сердец крыс после тотальной ишемии, УДФ не влияет на этот процесс, а УТФ усугубляет его.

3. Уридин и УМФ обладают антиаритмической активностью в отношении ранних постокклюзионных и реперфузионных аритмий. УТФ проявляет антиаритмическую активность в постокклюзионном периоде, но оказывает проаритмогенное действие в условиях реперфузионного повреждения миокарда.

4. В раннем периоде острой ишемии миокарда у крыс только уридин и УМФ оказывают антиишемическое действие.

5. УДФ активирует митохондриальный АТФ-зависимый канал в нативных митохондриях сердца крыс и его каналообразующую субъединицу, реконструированную в бислойную липидную мембрану.

6. Механизм антиишемического действия экзогенного уридина и УМФ связан с активацией митохондриальных АТФ-зависимых К+ каналов вследствие усиления внутриклеточного синтеза УДФ.

•• . • • l • • • ■ I i